LP10.

Tehnici moleculare utilizate pentru detectarea mutaiilor

A. Detectarea mutaiilor prin tehnici PCR.
Marea majoritate a metodelor de diagnostic folosite pentru detecia mutaiilor i a
polimorfismelor mononucletidice (SNP Single Nucleotide Polymorphism) necesit
amplificarea unei secvene prin PCR urmat de determinarea variantelor specifice prin
utilizarea unor sonde scurte de hibridizare sau a endonucleazelor de restricie. Tehnicile
de hibridizare includ: ASO - Analiza mutaiilor punctiforme folosind sonde
oligonucleotidice specifice unei alele (Allelic point mutation-Specific Oligonucleotidic
probe), TaqMan PCR, PCR-RFLP - Polimorfisme ale lungimii fragmentelor de
restricie (RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism). Aceste metode sunt
frecvent folosite pentru diagnosticul molecular al tumorilor familiale.
a) ASO. Metoda folosete sonde ce corespund unei secvene mici (20pb) din structura
genei, permind depistarea unor mutaii specifice, cunoscute deja ntr-o anumit
boal genetic. Aceste sonde scurte sunt cu mult mai sensibile la alterrile minime ale
secvenei genice, putnd depista modificri ale unei singure perechi de baze.
n aceast metod, o soluie apoas de ADN genomic nefracionat este depus, sub
forma unei pete, direct pe o membran de nitroceluloz (dot-blot) sau indirect, printro fant (slot-blot); pictura este uscat i ADN imobilizat pe membran este
denaturat (prin tratarea filtrului cu alcali) i expus la o soluie ce conine sonda
monocatenar marcat; aceasta se va hibridiza, formndu-se un heteroduplex intsond ce va fi pus n eviden autoradiografic.
Aplicaie.
Utilizarea ASO n diagnosticul fibrozei chistice (Mucoviscidoza).
Mucoviscidoza este o boal genetic cu transmitere autozomal-recesiv, determinnd
afectarea glandelor exocrine care produc o secretie anormal de vscoas, sarac n ap i
substane organice. Secretiile vscoase obstrueaz lumenul bronsic, ductele pancreatice,
cile biliare, ductele organelor reproductive, iar glandele seroase, glandele sudoripare
produc o secreie anormal prin coninutul crescut de electrolii. Cea mai comun alel
pentru mucoviscidoz conine o deleie de 3pb a genei CF (ce codific o protein
CFTR). Statusul pacienilor suspectai a fi afectai de aceast boal poate fi evaluat
folosind 2 sonde ASO: normal, respectiv mutant (vezi fig.1).
Fig.1. Autoradiogram obinut prin
hibridizarea sondelor oligonucleotidice
alele-specifice cu ADN genomic de la
7 pacieni suspeci de fibroz cistic.
Sondele ASO normale (ASOn) au
secvena:
5CACCAAAGATGATATTTTC3.
Sondele ASO mutante (ASOm) au
secvena:
5CACCAATGATATTTTC3.

Pacieni

ASOn

ASOm

ntrebare: Pornind de la aspectul autoradiogramei ce putei spune despre statusul

pacienilor (homozigot/heterozigot/sntos)?
b) TaqMan PCR este o metod de evaluare n timp real a acizilor nucleici folosind
sonde dublu-marcate fluorogenic. Tehnica necesit un termocicler similar celui folosit
n reaciile PCR obinuite prezentnd n plus un sistem de stimulare i detecie a
fluorocromilor avnd diferite lungimi de und. n timpul reaciei PCR, n momentul
iniierii sintezei ADN, activitatea 5 3exonucleazic a Taq polimerazei determin
degradarea sondei dublu-marcate ataate la ADN int (de aici i numele Taq
polymerase + PacMan). n plus fa de cei 2 primeri PCR convenionali, P1 i P2,
care sunt specifici secvenei int, cel de-al treilea primer, P3, este destinat legrii
specifice la un situs din secvena int n aval fa de situsul de legare P1. P3 este
marcat cu doi fluorofori, un colorant reporter (R), ataat la captul 5, i un colorant
fluorescent de anihilare a reporterului (Q - quencher) care are o lungime de und de
emisie diferit de cea a reporterului i care este ataat la captul 3. Pentru c are
captul 3 blocat primerul P3 nu poate servi drept amors n sinteza ADN, el fiind
degradat de Taq polimeraz n momentul extensiei P1 (vezi fig.2).

Fig.2. TaqMan PCR. n timpul reaciei PCR,

Taq ADN polimeraza sintetizeaz o nou
caten ADN pornind de la P1 iar n
momentul n care ajunge la nivelul P3
activitatea sa 5 3 exonucleazic
determin degradarea progresiv a acestuia
ncepnd de la captul 5. La sfritul
ciclului de amplificare catena de ADN nou
sintetizat va cuprinde i secvena ocupat
iniial de P3 iar cei doi colorani R i Q nu se
vor mai gsi pe aceeai molecul. Rezultatul
reaciei este reprezentat de creterea evident
a intensitii semnalului emis de reporterul ce
nu se va mai gsi n imediata vecintate a
quencher-ului. Trebuie subliniat faptul c
nvecinarea iniial a reporterului cu
quencher-ul nu anihileaz complet semnalul,
observndu-se un background fluorescent.

c) PCR-RFLP reprezint o metod de detectare a polimorfismelor ADN ce implic

utilizarea endonucleazelor de restricie. Aceste enzime bacteriene taie specific ADN
la nivelul unor situsuri de recunoatere determinnd apariia unui set caracteristic de
fragmente ce pot fi separate prin electroforez n gel. Unele dintre polimorfisme
altereaz secvenele de recunoatere, astfel enzimele fie nu recunosc un situs fie

recunosc o alt secven. Aceast fapt duce la apariia unui nou set de fragmente ce pot
fi comparate cu secvenele normale n vederea detectrii diferenelor. Aceste diferene
sunt denumite polimorfisme ale lungimii fragmentelor de restricie (RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism). Procesul de identificare a
polimorfismelor genetice individuale este cunoscut sub numele de genotipare (fig.3).

Fig.3. Polimorfismele lungimii fragmentelor de restricie (RFLP) pot fi identificate

prin electroforez n gel. Schimbarea unui singur nucleotid (A*C) poate determina
pierderea situsului de restricie.