Diagnosticul genetic molecular

Diagnosticul molecular al bolilor genetice umane

se bazează pe identificarea unor mutații
patogenice în structura ADN-ului și/sau ARN-ului
în vederea diagnosticului, subclasificării, stabilirea
prognosticului și monitorizarea răspunsului la
tratament.

Utilizarea tehnicilor de biologie moleculară a

permis diagnosticul bolilor genetice prin depistarea
mutațiilor implicate în apariția unui fenotip
particular, cunoașterea evoluției bolilor genetice,
identificarea persoanelor care au risc de a 1

dezvolta o boala genetică.

Diagnosticul molecular: consecințe
 Revoluția informațiilor din biologia
moleculară a avut consecințe asupra
tuturor aspectelor activității medicale
 A crescut exponențial depistarea
mutațiilor genice implicate în bolilor
genetice umane ceea ce a facilitat
înțelegerea bolii la nivel molecular
 Îmbunătățirea posibilităților de diagnostic
 Predicția evoluției bolii
 Posibilitatea de a folosi tratamente
2
preventive.
 Testarea genetică
 Confirmarea diagnosticului sau ca test de
predicție (persoane cu risc de a dezvolta o
boală genetică).
 Testarea moleculară a ADN:
 Stabilirea tipului de mutație implicată în
apariția bolii

Heterogenitate genetică
 Heterogenitate alelică si a locusurilor: mutații
diferite în aceeași genă sau în gene diferite
determină aceeași afecțiune.
 Mutații în genele BRCA1 și BRCA2 determină
 Cum analizăm structura ADN?
Electroforeza în gel
 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Secvențiere
 Analiza RFLP
 Hibridizare cu probe oligonucleotidice
 Dot blot
 Microarray
Electroforeza în gel
Istoric al diagnosticului molecular
Revoluția introdusă de tehnica PCR

Kary Mullis
1985 41 ani a inventat tehnica PCR
și a primit Premiul Nobel în 1993

Un număr imens de copii ale unei

secvențe țintă este obținut prin
amplificare exponențială ceea ce va
permite identificarea unei mutații
7
cunoscute intr-o singură zi
 Tehnica PCRR
• PCR este o tehnică în care o secvență scurtă de
ADN este amplificată de peste 1 milion de ori în
cîteva ore in vederea analizei secvenței sale
nucleotidice.
•
• Etapele metodei:
– ADN-ul amplificat este flancat de secvențe scurte
oligonucleotidice (primeri) care vor hibridiza cu
secvențele țintă de pe cele 2 monocatene
complementare ale ADN.
– Sinteza ADN este obținută cu ajutorul enzimei
Taq polymeraza (izolată din bacteria Thermus
aquaticus), care este stabilă termic și în prezența
celor 4 deoxinucleotide.
– La sfârșitul fiecărui ciclu se obțin 2 noi
monocatene complementare de ADN, copii ale
Polymerase
Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Etape:
 Adăugarea primerilor compuși din ~30
perechi de baze ce au secvență
complementară cu o secvență situată la
extremitatea 3` a regiunii ce dorim să o
amplificăm
 Adăugarea ADN-polimerazei și a dNTP
 Inițierea sintezei ADN
 Depistarea ADN-ului amplificat pe baza
mărimii (electroforeza în gel) sau dot
blot
 PCR (Polymerase Chain Reaction)

aatcgaatgtgcccgtacgattcgatgcgaaactaggagccctatcgat
ttagcttacacgggcatgctaagctacgctttgatcctcgggatagcta
 PCR

aatcgaatgtgcccgtacgattcgatgcgaaactaggagccctatcgat

ttagcttacacgggcatgctaagctacgctttgatcctcgggatagcta

Denaturare termică
94°C
 PCR

aatcgaatgtgcccgtacgattcgatgcgaaactaggagccctatcgat
cgggcat
aactagg
ttagcttacacgggcatgctaagctacgctttgatcctcgggatagcta

Hibridizare cu primerii
58°C
 PCR

aatcgaatgtgcccgtacgattcgatgcgaaactaggagccctatcgat
cgggcat gctaagctacgctttgatcctcgggatagcta
aatcgaatgtgcccgtacgattcgatgcga aactagg
ttagcttacacgggcatgctaagctacgctttgatcctcgggatagcta

Extensie a lanțului
72°C
 PCR

aatcgaatgtgcccgtacgattcgatgcgaaactaggagccctatcgat

cgggcatgctaagctacgctttgatcctcgggatagcta

aatcgaatgtgcccgtacgattcgatgcga aactagg

ttagcttacacgggcatgctaagctacgctttgatcctcgggatagcta

Denaturare termică
94°C
 PCR

aatcgaatgtgcccgtacgattcgatgcgaaactaggagccctatcgat
cgggcat

aactagg
cgggcatgctaagctacgctttgatcctcgggatagcta

aatcgaatgtgcccgtacgattcgatgcgaaactagg
cgggcat

aactagg
ttagcttacacgggcatgctaagctacgctttgatcctcgggatagcta

Hibridizare
58°C
 PCR

aatcgaatgtgcccgtacgattcgatgcgaaactaggagccctatcgat
cgggcatgctaagctacgctttgatcctcgggatagcta

gcccgtacgattcgatgcgaaactagg
cgggcatgctaagctacgctttgatcctcgggatagcta

aatcgaatgtgcccgtacgattcgatgcga aactagg
cgggcat gctaagctacgctttgatcc

aatcgaatgtgcccgtacgattcgatgcga aactagg
ttagcttacacgggcatgctaagctacgctttgatcctcgggatagcta

Extensie
72°C
 Thermocycler

În tubul pentru PCR se introduc toate ingredientele

necesare reacției.
 PCR
Numărul de copii ale unui segment ADN crește
exponential
Testarea genetică în fibroza chistică utilizând
PCR
• Fibroza chistica: cea mai frecventă
afecțiune A.R. letală la albii americani;
mutațiile apar în gena CFTR care
controlează transportul transmembranar al
ionilor de clor.
• Cea mai frecventă mutatie este ΔF508, o
deleție a 3 nucleotide care are ca rezultat
pierderea fenilalaninei (F) din poziția 508 a
proteinei CFTR.
• Această mutație este implicată în 70%
din cazurile de FC.
• PCR poate fi utilizat pentru diagnostic
 Cea mai comună mutație în FC este o
deleție de 3 nucleotide

Three-base deletion in the common cystic fibrosis (CF) allele results in synthesis
of a protein that is missing amino acid 508 (phenylalanine). Because the deletion
is a multiple of three, this is not a frameshift mutation. (From Thompson MW, et al:
Thompson and Thompson Genetics in Medicine, 5th ed. Philadelphia, WB
Saunders, 1991, p. 135.)
Downloaded from: Robbins & Cotran Pathologic Basis of Disease (on 18 July 2005 09:03 PM)
© 2005 Elsevier
Testarea genetică pentru FC utilizând PCR
 Tehnica Blot
Permite identificarea și vizualizarea unor
molecule specifice de ADN, ARN sau
proteine dintr-un complex de molecule.
• Fragmentele de analizat (ADN, ARN sau
proteine) sunt separate prin electroforeză în
gel.

 Cele mai mici molecule migrează mai rapid

și apar în partea superioară a gelului.
Benzile din gel sunt transferate (blotted) pe
suprafața unei membrane.

• Membrana este introdusă la incubator

împreună cu probe marcate (frecvent
radioactiv) care vor recunoaște molecula
pentru care s-a construit proba.

• Vizualizarea probei marcate (frecvent prin

Tipuri de analize
blot
 Southern Blots

• Southern blotting este un procedeu de transfer a ADN-ului

denaturat din gelul de agaroză pe un filtru suport unde va
hibridiza cu o probă ADN complementară
• Fragmentele de ADN sunt separate în funcție de mărime și
pot fi identificate
• Procedură:
– Enzimele de resticție fragmentează ADN-ul în fragmente de
diferite mărimi
– Migrarea în gelul de agaroză separă aceste fragmente în
funcție de mărime
– Doarece doar ADN-ul monocatenar se poate lega de filtru el
trebuie denaturat (NaOH).
Southern Blot

Enzime de restricție

Fragmente ADN
de diferite
mărimi
Electroforeza în gel de agaroză

gel

Denaturare-transfer pe hârtia
de filtru

blot
Denaturare-transfer pe filtru

blot

Hibridizare cu proba

Vizualizare
Southern Blot
 Probe ADN
Proba: segment scurt de ADN complementar cu o
secvență de ADN monocatener

Cele 2 monocatene
de ADN sunt separate
prin încălzire termică

La scăderea
temperaturii probele
vor hibridiza mai rapid
cu lanțul monocatenar
Probe decât lanțurile lungi
de ADN
 Probe ADN
Abilitatea de hibridizare a probelor depinde de:
*Complementaritatea cu lanțul de ADN cu care va
hibridiza…
-O singură diferență de 1 nct poate afecta
hibridizarea în funcție de…
*Stringența condițiilor de hibridizare
-Temperatură & Buffer

Stringență redusă

Stringență crescută
• Hibridizarea cu
oligonucleotide specifice alelelor
(Allele-specific oligonucleotides -ASO)

– Sunt probe relativ scurte de ADN care în

condiții de stringență permit diferențierea
între alelele unei gene.

– Pentru a folosi tehnica ASO trebuie să

cunoaștem mutația implicată în apariția
bolii.
 Probele ASO în Fibroza chistică

• PCR poate fi combinat cu analiza ASO

pentru a identifica rapid indivizii ce au risc
de a moșteni mutația ΔF508
• ADN-ul genei CFTR este amplificat la
indivizii testați prin PCR și ADN-ul este
transferat pe un filtru.
• 2 probe ASO marcate sunt sintetizate în
laborator, fiecare hibridizând doar cu o
anumită alelă a genei (normală sau ce
prezintă mutația ΔF508).
• Analiza dot blot va identifica tipurile de
alele prezente la un individ.
• ASO poate fi utilizată și pentru alte boli
 Utilizarea probelor ASO în
diagnosticul Fibrozei chistice
Metoda ASO in siclemie
 Analiza RFLP
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
se bazează pe utilizarea enzimelor de restricție
care recunosc secvențe specifice de ADN și vor
taia lanțul ADN strict la nivelul secvenței
recunoscute.
Restriction Fragment Length Polymorphism
(RFLP)
Polimorfismul lungimii fragmentelor de restricție

EcoRI
Alela 1
AGAGCCTCAACTTGAATTCGTTTAGTAA
Alela2
AGAGCCTCAACTTGAATTTGTTTAGTAA

Enzima de restricție EcoRI recunoaște și taie secvența

5’-GAATTC-3’
Alela 1 prezintă un situs EcoRI, alela 2 nu
 Analiza RFLP
 RFLP: sunt polimorfisme care sunt determinate de numărul diferit
de situsuri de restricție (și ca urmare diferențe în lungimea
fragmentelor obținute) pe care le are fiecare individ. În cazul unui
individ obținem 4 fragmente după digestie.

Dacă o mutație elimină un situs de restricție se vor obține doar 3

fragmente unul fiind mult mai mare. Dacă această mutație se
asociază cu boala, analiza RFLP poate fi utilă pentru depistarea
purtătorilor de mutație patogenă în familie.
 Analiza RFLP-urilor

ADN-ul genomic conține un nr. PCR permite obținerea

mare de situsuri de restricție unui nr. mare de copii
ale unei anumite
secvențe de ADN care
facilitează analiza RFLP
Siclemia: mutație punctiformă în gena ce
codifica lanțul ß al hemoglobinei
 Analiza genetică prin metoda Southern Blot a
polimorfismului lungimii fragmentelor de restricție
Restriction Fragment Length Polymorphisms -
RFLP
• Analiza Southern blot a fost utilizată pentru identificarea
mutațiilor genice cum ar fi cele din Coreea Huntington.
• Inițial scopul a fost de a identifica un marker RFLP care
este foarte apropiat de gena implicată.
• Mecanismele care creează aceste polimorfisme în genomul
uman:
– Mutații în situsurile de restricție a endonucleazelor cum ar fi
enzima MstII
– Expansiunea unor secvențe repetitive (minisateliți sau
VNTR-variable number of tandem repeats) în ADN.
Ulterior după identificarea acestui marker, analiza Southern blot
poate fi utilizată pentru a afla care membru al familiei a
moștenit alela asociată cu boala.
 Depistarea purtătorilor și
diagnosticul prenatal în
siclemie

• În pedigree-ul următor ambii parentali sunt

heterozigoți și au un băiat afectat
 Un exemplu de analiză RFLP bazată pe
mutația într-un situs de restricție este
prezentat în acest caz clinic.
• Se utilizează situsul enzimei de restricție
MstII si metoda Southern blot pentru
fiecare membru al familiei.
Care este genotipul și fenotipul fătului II-3?
Riscul recurențial calculat doar în funcție de
pedigree:
• 25% risc de a fi afectat al fătului II-3 (SS)
Analiza Southern blot a evidențiat că în familie
alela normală (A) produce după acțiunea
enzimei de restricție un fragment de 1.15-kb
în timp ce alela pentru siclemie (S) gene
produce un fragment de 1.35-kb.

• Această diferență a apărut deoarece mutația

pentru siclemie a distrus un situs
intermediar al enzimei de restricție Mstll.
Ambii parentali produc 2 benzi la analiza
Southern blot deoarece sunt heterozigoți.
• Fiul lor II-1 afectat a prezentat doar o bandă
deoarece este homozigot pentru mutația
genică. Fiica II-2 prezintă de asemenea o
singură bandă deoarece ea este
homozigotă pentru alela normală .
În exemplul anterior mutația genică a distrus un
polimorfism de restricție dar această situație este
foarte rară. Frecvent, mutația și polimorfismul sunt 2
evenimente independente dar ele sunt localizate foarte
aproapepe pe ADN a.î. RFLP-ul poate fi folosit ca
marker surogat pentru identificarea mutației.
Analiza linkage-ului (co-transmiterea mutatiei și a
markerului RFLP) se face pentru cât mai mulți membri
ai familiei.
Atenție! Uneori alela normală se asociază cu
fragmente de lungimi diferite, uneori chiar și cu
fragmente de aceeași lungime cu cea asociată mutației
• Într-o familie se determină inițial care RFLP se
asociază cu mutația.
 “Analiza de linkage genetic ”
Co-segregarea genei și a markerului ADN în
familii (inițial RFLP-uri)
Pedigree-ul întocmit unei familii în care există
câteva cazuri de sdr. Marfan (afecțiune A.D.)
este prezentat mai jos împreună cu analiza
RFLP a ADN-ului genomic utilizând enzima Taq
I pentru toți membrii familiei și o probă
moleculară pentru gena implicata. În familie sunt
identificate 2 fragmente de restricție.
Secvențe înalt repetitive ale ADN-ului
• Câteva tipuri de secvențe înalt repetitive au fost identificate
în cromozomi; frecvent se găsesc în regiunea necodantă a
ADN-ului.
Există următoarele clase de secvențe repetitive:
• Sateliții: unitatea repetată conține între 20 și 175 bp, și
lungimea lor variază între 0.1 și 1 Mb. ADN satelit se găsește
în regiunea centromerică dar este utilizat rar în analize
genetice.

• Markeri minisateliți: unitatea repetată conține frecvent între

12 și 70 bpși lungimea lor poate atinge 20kb; ei contribuie la
pattern-ul RFLP din analiza Southern blot.

• Markeri microsateliți: unitatea repetată conține obișnuit 2-4

bp și lungimea lor în general este mai mică de 150 bp.
Această clasă este cunoscută și sub numele de STR (Short
Microsateliții și VNTR ca markeri genetici
 Diagnosticul distrofiei miotonice cu
ajutorul RFLP
• După descoperirea tehnicii PCR au apărut o
mulțime de tehnici rapide, foarte sensibile
bazate pe PCR care au înlocuit tehnica
Southern blot.
• Analiza RFLP își menține utilitatea în situațiile
în care polimorfismele sunt de dimensiuni prea
mari pentru a putea fi amplificate prin PCR.
• Este și cazul distrofiei miotonice în care
secvența amplificată se găsește intragenic (o
expansiune a trinucleotidului CTG la
extremitatea 3' netranslată a genei).
• În această afecțiune există fenomenul de
anticipație genetică: membrii familiei cu o
formă severă de distrofie miotonică au câteva
mii de copii repetate CTG.
Distrofia miotonică, afecțiune A.D. caracterizată prin
variabilitatea vârstei debutului clinic și a expresiei clinice.
Bunica prezintă cataractă, dar nu și slăbiciune
musculară. Fiica, mult timp aparent neafectată a
dezvoltat progresiv cataractă, miotonie și slăbiciune
musculară. Fiul ei este sever afectat.
Analiza RFLP realizată de enzima EcoRI într-
o familie cu distrofie miotonică
Microsateliții și minisatelitii ca markeri
genetici

 Avantajul acestei analize utilizând RFLP

este că numărul de alele în populație este
foarte mare, a.î. există șanse foarte mici ca
2 indivizi să fie identici d.p.d.v. genotipic
(markeri informativi).

 2 tehnici sunt utilizate:

 Southern blot si hibridizare cu probe
 Analiza genetică prin amplificare PCR a
markerilor microsateliți în medicina legală

• În general secvențele repetitive se găsesc

în zona ADN-ului necodant și se
caracterizează printr-un grad înalt de
polimorfism la nivel populațional, motiv
pentru care sunt folosiți ca amprente
genetice în medicina legală sau în testarea
paternității.
 Markerii genetici
în testele de
paternitate
Compararea VNTR poate
exclude un individ ca
fiind părintele unui copil
(copil/tatăl au alele
diferite).
• Multipli loci (diferite
VNTR) sunt examinați
în testele de paternitate
sau în medicina legala
pentru confirmare sau
excludere.
 Testarea paternității prin amplificare
PCR a markerilor microsateliți
• Microsateliții se găsesc distribuiți în tot
ADN-ul genomic
 Microsatelitul analizat este amplificat prin
utilizarea unei perechi de primeri ce
flanchează regiunea unde se găsește
markerul
• Fiecare persoană va prezenta maximum 2
benzi prin amplificarea secvenței unice
respective ce conține și markerul
 Microsateliții
(multialelici; frecvență~ 1/30000 pb; cei mai
utilizați în analiza linkage-ului și medicina legală)
ggctgcacacacacacacacacacacacatgctt

ggctgcacacacacacacacacacacatgctt

ggctgcacacacacacacacacacatgctt

ggctgcacacacacacacacacatgctt

ggctgcacacacacacacacatgctt
Testarea patenității
Poziția pe cromozomi a
markerilor microsateliți
 Secvențierea ADN
Determinarea ordinii și a numărului de nucleotide a
unei secvențe ADN .
• 2 metode au fost inventate în perioada anilor
1976 dintre care cea inventată de Fred Sanger -
metoda terminării lanțului – a fost foarte utilizată
 Actual un număr mare de tehnici mai rapide și mai
ieftine au fost puse la punct.
 Metoda de secvențiere Sanger
Este asemănătoare tehnicii PCR cu excepția:

Utilizează un singur primer și după polimerizare se obține o singură

nouă secvență monocatenară.

Include cele 4 nucleotide (A, C, G, T) pentru extinderea lanțului dar și

dideoxinucleotide.
Dideoxinucleotide
4 nucleotide
G A T C
G T G
A
T C
G
A C T C A
C G A T G
G A T A G
G T T A
A G
T T A
C G
C
A C C A 1. Marcate fluorescent
T AG
C 2. Terminarea lanțului
 Metoda de secvențiere Sanger

 Utilizează ADN polimeraza

pentru a sintetiza un lanț nou
ADN care este marcat.
Polimeraza adaugă noi baze la
extremitatea 3’ a primerului
utilizat pentru extensie.
 Utilizează pentru terminarea
lanțului dideoxinucleotide
(ddNTP), lipsiți de gruparea -
OH la carbonul 3' a
deoxiribozei.
 Când ADN polimeraza inseră
un ddNTP în lanțul în extensie
sinteza ADN se oprește pentru
că nu mai poate fi adăugată
Metoda de secvențiere Sanger

4 etape:
1. Denaturare
2. Atașarea primerului și extensia lanțului
3. Terminarea sintezei
4. Electroforeza în gel
 Metoda
dideoxi

• Simultan 4
reacții separate,
fiecare cu un alt
ddNTP
• 4 electroforeze
în gel în 4 linii
diferite
• Se citește gelul
de jos în sus
 Sanger Sequencing
Primer
5’
r
T G C G C G G C C C A
A C G C G C C G G G T ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
3’ 5’
 Metoda de secvențiere Sanger
Primer
5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T
A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G
3’ 5’
 Metoda de secvențiere Sanger
Primer
5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A G C G C
A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G
3’ 5’

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T 21 bp
 Sanger Sequencing
Primer
5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A
A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G
3’ 5’

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T 21 bp

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A G C G C 26 bp
 Sanger Sequencing
Primer
5’
T G C G C G G C C C A G
A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G
3’ 5’

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T 21 bp

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A G C G C 26 bp

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A 22 bp
 Metoda de secvențiere Sanger
Primer
5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C
A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G
3’ 5’

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T 21 bp

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A G C G C 26 bp

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A 22 bp

5’
T G C G C G G C C C A G 12 bp
 Metoda de secvențiere Sanger
Primer
5’
T G C G C G G C C C A G T C T T
A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G
3’ 5’

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T 21 bp

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A G C G C 26 bp

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A 22 bp

5’
T G C G C G G C C C A G 12 bp

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C 20 bp
 Metoda de secvențiere Sanger

A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G
3’ 5’

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T 21 bp

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A G C G C 26 bp

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A 22 bp

5’
T G C G C G G C C C A G 12 bp

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C 20 bp

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T 16 bp
 Metoda de secvențiere Sanger

A C G C G C C G G G T ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
3’ 5’

5’
T G C G C G G C C C A ? ? ? ? ? ? ? ? ? T 21 bp

5’
T G C G C G G C C C A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? C 26 bp

5’
T G C G C G G C C C A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? A 22 bp

5’
T G C G C G G C C C A G 12 bp

5’
T G C G C G G C C C A ? ? ? ? ? ? ? ? C 20 bp

5’
T G C G C G G C C C A ? ? ? ? T 16 bp
 Metoda de secvențiere Sanger

5’

5’
T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A 20
21
19
13
17
22
16
14
15
12
bp
18
T G C G C G G C C C A G T C T T G G bp
Cromatograme obținute în metoda Sanger
Fiecare cromatogramă conține ~600-1000 pb:
Costurile tehnicilor noi de
secvențiere (NGS)
 Consimțământul informat semnat de
pacient pentru secvențierea
întregului genom:variante oferite
(în cazul noilor tehnici de secvențiere)
 Obținerea tuturor informațiilor
 Obținerea informațiilor relevante / a celor pentru care
s-a cerut secvențierea
 Obținerea informațiilor medicale pentru care riscul este
important sau care pot fi prevenite în funcție de vârsta
pacientului
 Comunicarea acestor informații rudelor
 Dileme etice în utilizarea
secvențierii întregului genom

 Comunicarea informațiilor asupra tuturor

mutațiilor descoperite
 În multe cazuri afecțiunea genetică nu poate fi
prevenită sau tratată
 Identificarea cazurilor de nonpaternitate,
consangvinitate, incest
 Costurile consultului genetic
 Stocarea datelor
 Număr imens de variante missens
 Tehnica Microarray
(Dot blot multiplu. Permite testarea mai multor mutații
diferite)
Fiecare godeu din
microarray conține o
probă pentru analiza
dot blot; împreună
realizează un “chip”
care permite
depistarea simultană
a mai multor mutații
diferite
 Microarray
• Un chip ce conține mii de
segmente monocatenare
de ADN
• ADN-ul izolat de la pacient
este marcat fluorescent și
folosit pentru hibridizări în
microarray
• Măsurarea cu ajutorul unui
scanner cu raze laser a
intensității fluorescenței
indică legarea ADN-ului
pacientului la secvența
genică din microarray
 Tehnica Microarray
(Dot blot multiplu. Permite testarea mai multor mutații
diferite)

Tehnica este automată; chipul este tratat

ca in analiza dot blot;
ADN-ul pacientului este fragmentat cu
enzime de restricție, denaturat și marcat
fluorescent.
 Tehnica microarray
Legarea ADN-ului pacientului de o anumită probă este depistată
automat prin măsurarea intensității fluorescenței din acel spot. O
persoană homozigotă pentru mutația F508 din fibroza chistică va
determina o fluorescență mult mai puternică în spotul aferent
mutației comparativ cu un heterozigot pentru această mutație.

Legarea de proba pentru

F508 a FC

Probă pentru mutația în gena de

susceptibilitate pentru cancer
de colon
Probă pt mutatia BRACA1 din
sindromul cancer de sân-cancer
ovarian
Identificarea mutațiilor din bolile
genetice prin microarray

• Analiza microarray
creată pentru
mutațiile genice
implicată în bolile
umane
• ADN-ul pacientului
este marcat
fluorescent și folosit
pentru hibridizări în
chip
• Hibridizările obținute
indică existența
mutațiilor pacientului
Limitări în utilizarea testelor genetice

Unele mutații genice nu determină

întotdeauna boli genetice
Testele genetice convenționale identifică
cele mai frecvente mutații; pentru
identificarea altor mutații mai rare
implicate in determinismul unui fenotip
particular e necesară utilizarea altor
teste.
Există o probabilitate redusă de eroare a
procedurii.
 Concluzii

 Peste 5000 afecțiuni au o componentă

genetică importantă
 Testele genetice cu sensibilitate și
specificitate crescută sunt utile în
confirmarea diagnosticului și devin
 proceduri standardizate și automatizate
 Costuri în scădere și rezultate rapideid
1. În stabilirea paternității tehnica utilizată se
bazează pe analiza amprentelor ADN dintre
care cele mai utilizate sunt:
A. Locii de histocompatibilitate
B. Centromerele
C. Markerii microsateliți
D. Situsurile unor enzime de restricție
E. Secvențe unice din genom
O femeie în vârstă de 22 ani diagnosticată cu
sindromul Marfan (afecțiune autosomal dominantă)
solicită consult genetic prenatal în cursul săptămânii
10 de sarcină. Pedigree-ul întocmit familiei sale este
prezentat mai jos împreună cu analiza RFLP a ADN-
ului genomic utilizând enzima Taq I pentru toți
membrii familiei și o probă moleculară pentru gena
fibrilinei. În familie sunt identificate 2 fragmente de
restricție.
Fătul IV-I are o probabilitate de a
dezvolta sdr. Marfan:
A. 100%
B. 25%
C. 50%
D. 0%.
4. Analiza moleculară a genei ce codifică
fibrilina asociată sdr. Marfan în
această familie sugerează că mutația
reprezintă o substituție a unui singur
nucleotid la extremitatea 3' a exonului
2. Rezultatul acestei substituții este o
deleție a exonului 2 din structura
ARNm, și consecutiv proteina fibrilină
va avea cu 41aa mai puțin. Această
mutație este cel mai probabil de tipul:
A. mutație cu sens schimbat
B. mutație nonsens
• Siclemia este cauzată de o mutație cu
sens schimbat în codonul 6 a genei β-
globinice.
• Un bărbat cu siclemie și soția sa fenotipic
normala solicită consult genetic și
efectuarea testelor pentru a depista
probabilitatea ca viitorul lor copil să aibă
această afecțiune. ADN-ul genomic de la
cei 2 parentali și ADN-ul fătului obținut
prin amniocenteză sunt analizate prin
PCR pentru a amplifica exonul1 al genei
β-globinice .
ADN-ul amplificat este supus analizei ASO ce
a evidențiat că fătul este heterozigot în
locusul β-globinic. Care din analizele dot
blot de mai jos reprezintă rezultatul obținut
pentru această familie?
 Care din următoarele secvente
nucleotidice pot fi utilizate ca probă
pentru identificarea mutației genice
pe baza complementarității cu alela
pentru siclemie ?

A. CCTCACCTCAGG
B. CCTGTGGAGAAG
C. GGACACCTCTTC
D. CTTCTCCACAGG
E. CTTCTCCTCAGG