IZOLAREA ADN GENOMIC Izolarea ADN genomic este o procedur folosit n vederea obinerii materialului genetic al diverselor tipuri

de organisme, n scopul utilizrii acestuia n analizele moleculare ulterioare. Orice protocol de extracie a ADN genomic are 4 etape principale: 1. Distrugerea (liza) celulelor, pentru ca moleculele de ADN s fie expuse tratamentelor ulterioare. n general, liza celulelor se obine prin mojararea sau sonicarea probei, precum i prin tratamentul cu soluii tampon specifice, n funcie de peretele celular/membrana celular n cauz. 2. ndeprtarea membranelor lipidice folosind detergeni. 3. ndeprtarea proteinelor cu ajutorul anumitor enzime numite proteaze (ex: Proteinaza K), opional. 4. Precipitarea ADN folosind alcooli (etanol, izopropanol etc.). n funcie de tipul celulelor din care se urmrete izolarea ADN, se impune includerea unor etape adiionale celor sus-amintite. Unele celule conin perete celular, al crui coninut poate s difere de la un organism la altul. De asemenea, mediul n care se gsesc celulele din care se dorete izolarea ADN poate s ngreuneze urmarea pailor necesari (ex: izolarea ADN genomic al unor bacterii aflate n sol). n unele situaii numrul de celule disponibile pentru extracia ADN este foarte mic, motiv pentru care se impun anumite tehnici n vederea unei izolri foarte eficiente. Alteori celulele secret substane mucilaginoase care fac foarte dificil centrifugarea (unele bacterii, cianobacterii etc.), caz n care este necesar folosirea adiional a unor soluii-tampon. Dup extracie, se impune estimarea calitatii ADN genomic. Aceast estimare se poate efectua: spectrofotometric, prin msurarea extinciei probei la 260 nm (maximul de absorbie pentru ADN), sau prin raportul extinciilor 260/280 nm (280 nm maximul de absorbie n cazul proteinelor). Electroforetic, prin migrarea ADN genomic n gel de agaroz.

ELECTROFOREZA ADN Este o tehnic folosit pentru separarea i vizualizarea fragmentelor de ADN n funcie de mrimea acestora. Moleculele de ADN de dimensiuni diferite sunt ncrcate ntr-un mediu vscos (gel de agaroz), la un capt al cruia se aplic un curent electric. ntruct ADN are sarcin general negativ (-), moleculele acestuia vor migra prin gel, nspre anod (+). Separarea fragmentelor se realizeaz pe baza migrrii pe distane diferite a acestora, din cauza dimensiunilor diferite. Astfel, moleculele de ADN mai mari (mai lungi) vor migra mai puin prin porii gelului, n timp ce fragmentele mai scurte vor migra mai mult. Dup o perioad de timp, care variaz n funcie de mrimea i concentraia gelului, curentul electric aplicat este oprit, iar gelul este colorat cu o substan fluorescent (bromur de etidiu*). Bromura de etidiu poate fi adugat i n timpul preparrii gelului, nainte de polimerizarea acestuia. Mrimea moleculelor de ADN de interes este estimat prin compararea cu poziia n gel a benzilor de ADN ale unor markeri de greutate molecular (fig 1). Bromura de etidiu poate fi nlocuit cu alte substane fluorescente, non-mutagene i noncancerigene (Ex. RedSafe, produs de INTRON).

Fig. 1 Electroforegrama obinut n urma migrrii n gel de agaroz a genei pentru ARNr 18S, la 2 tulpini ale algei verzi Botryococcus braunii i la 2 specii aparinnd genului Allium. n stnga se observ markerul de greutate molecular, cu 4 benzi vizibile: 5000 pb, 2000 pb, 850 pb i 400 pb.

* Bromura de etidiu este un agent de intercalare, fixndu-se ntre cele dou catene ale ADN, motiv pentru care este considerat o substan mutagen. De asemenea, unele studii au relevat posibile efecte cancerigene. De aceea, este obligatorie manipularea cu mare grij a acesteia, folosirea mnuilor de laborator fiind obligatorie.