Endonucleazele de

restrictie sunt
enzime care
recunosc secvene
de nucelotide
specifice din ADN
dublu catenar i
sunt un instrument
major al
biotehnologitilor.

Electroforeza este o metoda fizico-chimica

de analiza ce permite separarea proteinelor
pe baza diferentelor intre vitezele de
deplasare intr-un camp electric aplicat
mediului respectiv. Ca urmare a
caracaterului lor amfoter, proteinele poseda
o sarcina electrica ce depinde de natura
moleculei, pH si de compozitia mediului.
Moleculele incarcate electric, aflate in
solutie si supuse actiunii unui camp electric,
vor migra catre electrodul de polaritate
opusa.

Agaroz
Albumina seric bovin (BSA, 10mg/ml)
Ditiothreitol, 20x (DTD, 20mm)
Baloane Erlenmezer (250ml)
Bromur de etidiu (10mg/ml, )
Mnui
Ghea
Laboratorul de band

Marcatori de mrime Hindill, de

concerntrare furnizate de fabricant
(~0,5/~g/ml)
Tuburi de microcentrifug (0,5ml)
Micropipetor i sfaturi
Pipeta pasteur
Probe de reacie PCR
Folie de plastic
Film polaroid (tip 667)
pRY121 plasmid de ADN de la maxiprep
pRY121 plasmid de ADN de la miniprep

Electroforeza fragmentelor de
ADN este o metoda analitica
folosita pentru separarea
acestor fragmente in functie de
marimea lor

In solutie libera, la pH neutru

sau alcalin, acizii nucleici nu pot
fi separati

Pentru separarea lor se se

folosesc matrici de gel de
agaroza sau poliacrilamida

Gelurile de agaroza sunt

folosite pentru separarea
acizilor nucleici cu mase mari,
in timp ce diferentierea
moleculelor de acizi nucleici cu
mase moleculare mici se face in
geluri de poliacrilamida

Un camp electric determina

migrarea lor prin gel

Datorita numarului mare de

resturi fosfat, acizii nucleici au o
puternica incarcatura negativa,
migrand in campul electric spre
anod

Fragmentele se
separa
sub forma unor benzi
electroforetice
Mobilitatea unui
fragment de ADN este
invers proportionala cu
masa moleculara, fiind
de asemenea
influentata de o serie
de factori

In conditii ideale, viteza

de migrare a
fragmentelor este
direct proportionala cu
tensiunea aplicata
Vascozitatea gelului se
poate reduce in
momentul
cresterii temperaturii
ceea
ce produce distorsiuni ale
procesului de migrare

Tampoanele de
electroforeza au rolul de a
mentine un pH si o putere
ionica constante, la valori
optime pentru separare
Agentii denaturanti(ureea,
formamida, formaldehida)
indeplinesc functia de
combatere a fenomenelor
de agregare si adsorbtie a
moleculelor de acizi nucleici
pe matricea de gel, dar si
functia de inlaturare a
diferentelor conformationale

Dupa ce separatia este

completa, fragmentele
ADN
avand lungimi diferite
sunt
adesea vizualizate prin
utilizarea unui colorant
fluorescent precum
bromura
de etidiu
Marimea fragmentelor
este exprimata
in:nucleotide,perechi
de baze sau kbpentru o mie de
perechi de baze

Determinarea
marimii
fragmentelor
se face uzual
prin
compararea cu
DNA-ladders
ce contin
fragmente
liniare de ADN,
de lungimi
cunoscute

Electroforeza acizilor nucleici

este o etapa obligatorie in orice
protocol de analiza a acizilor
nucleici

Prin ea se realizeaza:
separarea fragmentelor ADN
rezultate in urma digestiei cu
enzime de restrictie; verficarea
amplificarii PCR; identificarea
si/sau determinarea
semicantitativa a fragmentelor
ADN rezultate in urma
amplificarii PCR; detectia si
determinarea semicantitativa a
ADN-ului genomic obtinut in
urma extractiei din tesuturi

Analizele ADN si ARN au

asadar roluri cruciale in
detectarea mutatiilor, in
diagnosticarea bolilor
genetice,
a cancerelor, in diagnosticul
microbiologic

Dar si in cadrul testelor

de
paternitate si de identificare
a
persoanelor

In determinarea
profilului
genetic al bolilor

In teste de filogenie

Toate aceste analize

cuprind in mod
obligatoriu si etapa de
electroforeza

De aici sesizam
cu
usurinta importanta
functie a utilizarii
tehnologiei ADN in
prognosticare,
diagnosticare,
monitorizare si
terapie

Tehnologia ADN
dispune de un larg
spectru de
aplicabilitate, in
cele mai diverse si
complexe domenii
ale medicinii, atat
in cercetarea
fundamentala ce
ne ofera
permanent noi date
si informatii, cat si
in cercetarea
aplicativa ce
ofera noi solutii
terapeutice