Curs 7

Electroforeza

 Analiza si detectarea acizilor nucleici este realizata in cateva moduri. Electroforeza pe gel si cea capilara sunt cele mai practicate si frecvent folosite metode. ADN-ul poate fi detectat folosind sonde specifice de hibridizare. Electroforeza Constituie deplasarea moleculelor sub influenta unui curent electric. Aceasta poate aparea in solutie, dar practic este realizat intr-o matrice pentru a limita migratia, si contine materialul migrator. Electroforeza este aplicata in analiza proteinelor si a acizilor nucleici. Fiecare grupare fosfat dintr-un polimer ADN, este ionizata, facand ADN-ul o molecula incarcata negativ. Sub influenta unui curent electric, ADN-ul va migra catre polul pozitiv (anod).

 Cand ADN-ul este aplicat ca intr-o cusca n macromolecule de agaroza sau poliacrilamida, migratia sub influenta curentului electric este impiedicata, depinzand de marimea ADN-ului si spatiile din gel. Fragmentele de ADN vor migra la viteze invers proportional cu marimea lor. Electroforeza poate fi realizata in tuburi, in cuve sau capilare. Electroforeza pe gel in cuve, poate avea un format orizontal sau vertical (Fig. 5-1)

 Sistemele Gel Matricile gel dau rezistenta la miscarea moleculelor sub forta curentului electric. Ele previn difuzia si reduc curentii de convectie in asa fel incat moleculele separate sa formeze grupuri definite sau benzi. Gelul poate servi apoi ca suport pentru analiza componentelor separate. Aceste matrici sunt simplu de preparat si maleabile la modificari. Agaroza si poliacrilamida, intrunesc aceste criterii.

 Gelurile de agaroza Agaroza este un polimer polizaharidic extras din iarba de mare (alga). Este o componenta a agarului folosit in mediile de cultura pentru bacterii. Geluri de agaroza hidratate pot fi procurate pentru folosire in concentratii si marimi variabile. Alternativ, agaroza poate fi procurata si stocata in laborator, sub forma unei pudre. Pentru folosire, agaroza pudra este suspendata in solutie tampon, incalzita si turnata intr-o matrita. Concentratia agarozei, dicteaza marimea spatiilor din gel si va determina astfel marimea ADN-ului de studiat. (Tabelul 5-1).

 Fragmente mici de ADN (50-500 bp) sunt determinate in geluri de agaroza mult mai concentrate, ex: 2% - 3% (Fig. 5-3). Fragmentele mai mari de ADN (2000-50 000) sunt determinate mai bine in concentratii de agaroza mai scazute, ex: 0.5 1%. Concentratiile de agaroza peste 5% si sub 0.5% nu sunt practice. Concentratiile mari de agaroza vor impiedica migratia, iar cele scazute vor produce un gel slab cu integritate limitata.

 Electroforeza pe gel in camp pulsat Fragmentele foarte mari (ex: 50000 250 000bp) de ADN nu pot fi decelate prin electroforeza simpla pe agaroza. Chiar si in cele mai reduse cantitati de agaroza, fragmentele mari de baze sunt sever impiedicate de a avea o rezolutie corecta (cunoscuta si ca limitare a mobilitatii). Mobilitatea limitata este atinsa atunci cand moleculele de ADN se pot misca doar in lungime printre porii succesivi ai gelului, proces numit reptatie.

 Pentru moleculele de ADN genomic, impulsurile de curent aplicate gelului in cantitati alternative, sporesc migratia. Acest proces este numit electroforeza pe gel in camp pulsat (PFGE)(Fig. 5-4). Cea mai simpla abordare a acestei metode este electroforeza pe gel in camp inversat (FIGE)(1).

 FIGE functioneaza prin schimbarea alternativa a electozilor pozitivi si negativi in timpul electroforezei. In acest tip de separatie, ADN-ul merge periodic inainte si/sau inapoi. Aceasta metoda necesita un control al temperaturii si un mecanism de schimbare. Electroforezele in camp pulsat pot fi in: camp electric omogen sferic inchis, camp transvers alternant, gel rotativ (4,5) si cu reorientarea transversa a unghiului. Aceste sisteme necesita o cutie speciala cu gel cu electrod special si configuratie a gelului, la fel si un control electronic adecvat pentru schimbarea campurilor electrice in timpul electroforezei.

 Folosind PFGE, fragmentele mari sunt decelate nu numai prin cernerea prin spatiile din polimer dar si prin reorientarea lor si timpul necesar pentru a se realinia si a se muta in a doua dimensiune, de obicei un unghi 120 (180 pentru FIGE) fata de directia originala a migratiei. ADN-ul de decelat prin aceste metode trebuie protejat de rupere si forfecare. Prin urmare, specimenele sunt imobilizate in agaroza inaintea lizei celulare. Tratamentul ulterior al ADN-ului, ex: cu enzime de restrictie, este realizat deasemenea in timp ce ADNul este imobilizat in agaroza. Dupa tratament, ADN este introdus direct in agaroza, pentru electroforeza.

 Instrumentele PFGE sunt proiectate sa aplice curent in directii alternative in timpi specifici (numiti interval de schimbare) setati de catre operator. Acesti parametri sunt bazati pe marimea generala a fragmentelor de analizat ex: un fraagment mai mare va necesita un timp de schimbare mai mare. PFGE este o metoda de migrare lenta. Deplasarea probelor poate dura 24 ore sau mai mult. Electroforeza in camp alternant este folosita pentru aplicatii ce necesita decelarea fragmentelor de ADN ale cromozomilor bacterieni in scopuri epidemiologice.

 Contactul ADN-ului genomic cu enzime de restrictie va produce fragmente specifice pentru fiecare organism Prin compararea acestor fragmente poate fi evaluata similitudineaa organismelor izolate din surse variate. Aceasta tehnica este utila in special in determinarea epidemiologiei bolilor infectioase

 Gelurile de poliacrilamida Fragmentele de ADN foarte mici si ADN-ul monocatenar sunt decelate cel mai bine prin electroforeza in gel de poliacrilamida (PAGE). Acrilamida in combinatie cu metil bisacrilamida polimerizeaza intr-un gel consistent, ideal pentru decelare (Fig.) Poliacrilamida a fost folosita initial pentru separarea proteinelor, dar acum este folosita de obicei pentru analiza acizilor nucleici.

 Gelurile de poliacrilamida sunt folosite pentru secventierea acizilor nucleici, detectarea mutatiilor, a testelor de protectie a nucleazelor. Acrilamida pudra este o neurotoxina si trebuie manipulata cu atentie. Amestecul format din acrilamida si bis-acrilamida este mai putin periculoas si mult mai usor de manevrat. Gelurile preformate (precast) sunt cele mai convenabile, deoarece procedura pentru prepararea gelurilor de acrilamida este mult mai solicitanta decat cea pentru formarea gelurilor de agaroza.

 Un alt avantaj al poliacrilamidei provenienta sintetica. Modificarea T si C in gelurile de poliacrilamida poate schimba marimea porilor si prin urmare, proprietatile de migrare, intr-o maniera predictibila si reproductibila. T-ul crescator descreste proportionalitatea marimii porilor. Marimea minima a porilor (rezolutia maxima pentru molecule mici) intervine la o valoare C de 5%. Variatia C peste sau sub 5% va creste marimea porului. De obicei, C este setat la 3,3% (29:1) pentru ADN-ul natural si 5% (19:1) pentru ADN-ul standard si gelurile ARN.

 Electroforeza capilara In acest tip de electroforeza, proba de analizat este separata intr-un capilar de sticla subtire (siliciu topit) ce are 30-100cm lungime si un diametru de 25-100 micrometri. Siliciul topit este acoperit cu un invelis de poliamida, pentru protectie. Exista si o fereastra neacoperita unde lumina este reflectata peste fragmente, pe masura ce acestea trec de detector. Siliciul topit are sarcini negative de-alungul peretilor capilarului (generate de disocierea ionilor de hidroxil din moleculele de silicon). Acestea stabilesc un flux electro-osmotic atunci cand un curent este introdus de-alungul capilarului.

 Sub forta acestui curent, moleculele mici si incarcate negativ migreza mai repede decat moleculele mai mari si incarcate pozitiv. In general 1-50nL de acid nucleic denaturat (in solutie tampon ce contine formaldehida) este introdus in capilar, tinut la temperatura de denaturare in timpul migratiei. Proba este introdus in capilar prin injectare electrokinetica, hidrostatica sau pneumatica. Pentru analiza acizilor nucleici este folosita injectarea electrokinetica.

 Electrodul de platina apropiat de capatul capilarului prezinta sarcini tranzitorii pozitive care atrag probele spre capatul capilarului. Sub influenta curentului stabilit, fragmentele migreaza prin capilar. Pentru decelarea acizilor nucleici, electroforeza capilara este analoaga cu cea pe gel in ceea ce priveste parametrii electroforetici. Volumul mic al capilarului comparativ cu matricea de gel, poate disipa caldura mult mai eficient in timpul procesului de electroforeza. Disiparea termica mult mai eficienta permite tehnologilor sa ruleze probe la o sarcina mai mare per surpafata, migrarea este mai repida, deci scade timpul de rulare.

 Decelarea acidului nucleic prin eletroforeza capilara este folosita intensiv in aplicatii criminalistice si testele de paternitate realizate prin analiza polimorfismului repetitiv. Are si alte aplicatii in laborator: testele de clonare, detectarea instabilitatii microsatelitilor cromozomiali si analizele grefelor de maduva osoasa. Softwareuri proiectate special pot folosi sonde marcate fluorescent cu greutate moleculara diferita (markeri alelici) care migreaza in capilar alaturi fragmente de interes, care vor fi identificate prin hibridizarea cu sonda specifica.

 Sistemul capilar are avantaje comparativ cu tehnicile de electroforeza traditionale pe matrice de gel, fiind cu senzitivitate crescuta astfel incat cantitatile mici de acid nucleic pot fi analizate iar benzile dorite sa fie detectate imediat.

 Desi instrumentatia pentru electroforeza capilara, softwareurile analitice sunt costisitoare iar detectarea necesita marcarea fluorescenta a sondelor, munca si timpul de rulare scade semnificativ comprativ cu electroforeza pe gel. In plus, se pot analiza automat rezultate ce sunt adunate de catre detectorul electroforezei capilare. Sistemele tampon Scopul sistemelor tampon este acela de a conduce curentul si de a proteja probele in timpul electroforezei, datorita caracteristicilor electrochimice pe care le poseda.

 pH-ul unei solutii tampon ramane constant. Moleculele din solutia tampon atrag sau elibereaza protoni eliminati sau absorbiti de alte solutii. Controlul pH-ului unui gel de catre solutia tampon protejeaza moleculele probei. Crescand concentratia tampon, creste si conductivitatea electroforezei, generand mai multa caldura la un voltaj dat. Acest lucru influenteaza stabilitatea gelului si poate creste denaturarea probei. Concentratiile tampon ridicate trebuie asadar sa fie compensate prin voltaj scazut. Pentru ca acizii nucleici sa migreze corect, sistemele de gel trebuie imersate in solutii tampon ce conduc eficient curentul electric

 Componentele sol. tampon ca baza Tris sau boratul sunt preferate deoarece raman partial nancarcate la pH-ul dorit acest fapt ducand la un pH constant . Solutiile Tris borate EDTA TBE; 0.089 M Trisbase, 0.089 M boric acid, 0.0020 M EDTA), Tris fosfatul (TPE); 0.089 M Tris-base, 1.3% phosphoric acid, 0.0020 M EDTA) si Tris acetatul EDTA (TAE; 0.04 M Tris-base, 0.005 M sodium acetate, 0.002 M EDTA) sunt cele mai folosite pentru electroforeza ADN. Ph tamponului in cazul migrarii ADN trebuie sa fie 8. Migrarea ionilor solutiei tampon nu este impiedicata de matricea de gel, deci viteza miscarii sub influenta unui curent este guvernata strict de marimea ionilor si incarcarea acestora (raportul incarcare/masa).

 Tris este o molecula relativ mare, deci ratia incarcare-masa este scazuta, si se deplaseaza prin curent cu o viteza relativ scazuta chiar si la concentratii crescute, dand o capacitate de tamponare crescuta.

 Aditivi tampon Aditivii tampon sunt adesea folositi la modificarea moleculelor de proba care le afecteaza migratia; ex. formamida, urea si detergenti variati. Agentii de denaturare ca formamida sau ureea, rup legaturile de hidrogen dintre catenele complementare sau din cadrul aceleasi molecule de ADN si ARN. Formamida si caldura aplicate ADN-ului si ARN-ului, rup legaturile de hidrogen, impiedicand renaturarea secventelor complementare. Rezultatul, moleculele se alungesc, devin drepte si formeaza lanturi monocatenare. Ureea si caldura aplicate gelului mentin conformatia, incat hibridizarea dintre moleculele de acid nucleic nu afecteaza viteza de migratie, iar separarea poate interveni strict in conformitate cu marimea si lungimea moleculelor. Electroforeza ARN-ului necesita conditii diferite oferite de aditivi.

 Deoarece ARN-ul este monocatenar si tinde sa se plieze si renatureze, trebuie sa fie complet denaturat pentru a preveni plierea inainte de a-si determina marimea si migratia intr-un sistem de gel. Structurile secundare formate in ARN sunt puternice si mult mai dificil de denaturat decat ADN-ul omolog. Unul din denaturantii folositi pentru ARN este hidroxidul metilmercuric (MMH), ce reactioneaza cu gruparile amino ale ARN prevenind imperecherea bazelor dintre nucleotidele omoloage si aldehide (formaldehida, glioxal). MMH nu este folosita de obicei din cauza toxicitatii extreme.

 Proba de ARN este incubata in dimetil sulfoxid, 1.1 glioxal (etan 1.2 diona) si 0.01 M fosfat de sodiu, pH 7, pentru a denatura ARN-ul inainte de incarcarea probei pe gel. Din cauza modificrii pH-ului (descresterea pHului la catod {-} si cresterea pH-ului la anod {+}) in timpul rularii, soluia tampon ar trebui sa fie recirculata de la capatul anod la catod(Fig.5-8) Acest lucru poate fi indeplinit fie folosind o pompa peristaltica sau prin oprirea gelului la diverse intervale precum si transferarea solutiei tampon de la capatul catod la cel anod.

 Echipamente pentru electroforeza Electroforeza pe gel poate fi realizata in una sau doua forme, orizontala sau verticala. In general gelurile de agaroza sunt rulate orizontal iar cele de poliacrilamida, vertical. Gelurile orizontale sunt rulate in containere de acril numite cutii de gel sau bai ce sunt divizate in doua parti cu o platforma in mijloc pe care gelurile sunt dispuse . Electrozii sunt formai din fire de platin, sunt conectate la o sursa de curent prin conectori fixai in peretii containerului. Gelul din cutie este scufundat in solutia tampon de electroforeza ce umple ambele compartimente si formeaza un sistem continuu prin care trece curentul.

 Grosimea gelului si volumul de sol tampon influeneaz migratia, astfel incat parametrii ar trebui sa fie pastrati constant pentru rezultate corecte. Deoarece gelul este scufundat in timpul incarcarii si electroforezei, gelurile orizontale sunt denumite adesea geluri submerse. Sursa de curent va da voltajul, stabilind curentul care va strabate prin gelul si solutia tampon, purtand proba incarcata prin matrice la o viteza corespunzatoare cu raportul incarcare/masa a moleculelor.

 Gelurile orizontale de agaroza se prezint sub aspect de matrici patrate sau rectangulare de marimi variabile. Cutiile cu gel se comercializeaz mpreun cu tavi de turnare n care se modeleaza gelul corespunztor aparatului. Volumul solutiei se stabilete n funcie de grosimea si suprafaa gelului. Agarul, comecializat ca o pudra se amesteca intrun anumit procent (W/v) cu solutia tampon pentru electroforeza si incalzit (microunde) pentru a fi dizolvat si topit. Agarul topit este racit la 55-65 grade C iar un anumit volum este turnat in tavile de modelare.

 Apoi, este introdus un pieptene in capatul cutiei cu gel pentru a creea godeurile in gel in care vor fi incarcate probele. Marimea dintilor va determina volumul de proba folosita iar numarul dintilor godeurile din gel pregatite sa primeasca probele. Gelul se las la racit pn la solidificare. Dupa ce gelul a polimerizat, pieptenele este extras usor, gelul ramane in cutia speciala si este scufundat in solutia tampon.

 Cutiile verticale cu gel au camere separate ce sunt conectate de catre gel. Electrozii sunt atasati in camerele superioare si inferioare pentru a stabili curentul ce va strabate gelul. Gelul trebuie pozitionat inaintea umplerii camerei cu solutie tampon. Unele sisteme au o placa metalica atasata in spatele gelului pentru a mentine temperatura constanta dealungul gelului. Mentinand temperatura constanta prin gel, marginile extreme se racesc mai repede decat centru, incetinind migratia spre margini comparativ comparativ cu zona centrala.

 Acest fapt este denumit gel smiling deoarece benzile de marimi similare din benzile extreme (reci) vor migra mult mai incet decat aceleasi benzi din zonele interioare. Asigurand o temperatura constanta de-alungul gelului, se previne gel smiling-ul.

 Sistemele verticale cu gel variaza de la sisteme mari de secventiere (35 cm x 26 cm) la mini sisteme (8 cm x 10 cm). Unele mini sisteme sunt destul de mari pentru acomodarea a doua geluri in acelasi timp (Fig. 5-10). Mini sistemele sunt folosite extensiv pentru analize ce nu necesita rezolutia unei perechi de baze.

 Electrodul pozitiv va fi in contact cu capatul de jos al gelului si a solutiei tampon, umpland aprozimativ o treime din baia de gel. Electrodul negativ va fi in contact cu partea de sus a gelului si cu un compartiment separat de solutie tampon in partea de sus a insertiei. Sistemele mai mari sunt folosite pentru secventiere sau alte proceduri ce necesita decelarea unei singuri baze. Gelurile sunt incarcate pe la varf, dedesubtul unui strat de solutie tampon in camera superioara. Tipsurile pipetelor de incarcare plaseaza esantionul la baza, crescand decelarea benzilor si recuperarea probelor.

 Gelurile verticale sunt modelate intre placile de sticla separate de delimitatoare. Acestea determina grosimea gelului, variind intre 0.05 mm. Baza gelului este securizata cu banda sau cu o garnitura in tavile cu gel special proiectate. Dupa adaugarea agentilor de polimerizare acrilamida lichida este turnata intre placile de sticla cu ajutorul unei pipete sau a unei seringi. Pieptenele este apoi plasat in capatul gelului. In timpul acestui proces este important sa nu se introduca aer in gel sau sub gel. Bulele vor forma discontinuitati in gel iar oxigenul va inhiba polimerizarea acrilamidei.

 Pieptenele este de o grosime egala cu cea a delimitatoarelor astfel incat gelul va avea aceeasi grosime. Ca si la gelurile orizontale, marimea si numarul dintilor pieptenului va determina numarul fantelor din gel si volumul ce poate fi adaugat in fiecare. Pieptenii specifici denumiti piepteni dinti de rechin sunt adesea folositi pentru secventierea gelurilor (Fig. 5-11).

 Cand pieptenii standard sunt retrasi din gel, trebuie avuta grija ca urechile formate de spatiile dintre dintii pieptenului si fantele de gel, sa nu fie dislocate.

 Incarcarea gelului Inainte de incarcarea probei ce contine acid nucleic izolat pe gel, colorantul de urmarirealbastru de bromfenol si un agent de densitate sunt adaugate in proba. Agentul de densitate (Ficoll, sucroza sau glicerol) cresc densitatea solutiei comparativ cu solutia tampon de electroforeza. Colorantul migreaza la viteze specifice intr-o concentratie de gel data, ruland adesea inaintea fragmentelor mai mici de ADN. Nu sunt asociate cu probele de ADN neafectand separarea probelor de ADN.

 Miscarea colorantului de urmarire este monitorizata, iar cand se apropie de capatul fantelor, electroforeza este terminata.

Albastrul bromofenol este coolorantul de urmarire folosita pentru multe aplicatii. Verdele xilen cianol este un alt exemplu de cromofor ce este utilizat ca i colorant de urmarire atat pentru gelurile de agaroza cat si pentru cele de poliacrilamida.

 Sisteme de detectie Statusurile probelor din timpul si dupa electroforeza este desavarsit folosind coloranti ce se asociaza specific cu acizii nucleici. Agentii folositi cel mai des pentru aceste aplicatii sunt coloranti artificiali si cu argint. Coloranti acid-nucleic specifici Se utilizeaz agenti de intercalare , intre bazele azotate ale acizilor nucleici bicatenari. Bromura de etidium (EtBr) este unul dintre acesti agenti. Sub lumina UV la 300nm, EtBr din ADN emite lumina vizibila la 590nm. Prin urmare, ADN-ul separat in agaroza sau acrilamida si expus la EtBr va emite lumina portocalie cand este expusa la lumina UV la 300nm.

 EtBr a fost cea mai des utilizata in analizele initiale ale ADN si ARN. Trebuie avuta grija in manipularea EtBr deoarece este cancerigen. Dupa electroforeza, gelul de agaroza sau acrilamida poate fi hidratat in solutie de 0.1 1mg/ml EtBr in solutie tampon (TAE,TBE sau TPE) sau TE. Alternativ, colorantii pot fi adaugati in gel inaintea polimerizarii sau n sol tampon. Colorantul adaugat in sol tampon produce o colorare mult mai intensa generand resturi mult mai periculoase. Unele sisteme inchise cu gel contin EtBr in cadrul unei casete inchise limitand expunerea sau irosirea.

 Dupa hidratarea sau rularea in EtBr, ADN-ul expus la UV va aparea ca benzi portocalii in gel. Imaginea poate fi capturata cu o camera sau prin transfer digital catre softwareul analitic. Sybr verde este unul din colorantii introdusi in 1995 ca un alt tip de sistem de coloranti specifici acizilor nucleici. Difera de EtBr deoarece nu se intercaleaza intre baze; se dispune in deschiderea mica a dublu helixului. Sybr verde in asociere cu ADN sau ARN emite deasemenea lumina in spectrul portocaliu.

 Colorarea SyBr este de 25-100 de ori mai senzitiva decat EtBr (nivel de detectie: 60 pg de ADN bicatenar vs. 5ng pentru EtBr). Aceasta este datorata in parte fundalului fluorescent a EtBrului in agaroza. O dilutie a solutiei 10.000 solutie de SyBr verde in TAE,TBE sau TE poate fi utilizat in metodele descrise pentru EtBr. O dilutie 1:100 de SyBr verde poate fi adugata deasemenea direct in proba de ADN inaintea electroforezei. Precolorarea ADN-ului descreste cantitatea de colorant necesar pentru vizualizarea ADN dar micsoreaza senzitivitatea detectiei iar la cantitati mari de ADN poate interfera cu migratia ADN-ului prin gel. (6). Deoarece SyBr verde nu este un agent intercalant, nu este mutagen (7).

 Desi SyBr verde are unele avantaje comparative cu EtBr, multe laboratoare continua sa-l foloseasca pe cel din urma din cauza cerintelor pentru filtrele optice speciale necesare detectarii SyBr verde. Echipamentele de scanare si fotografiere optimizate pentru EtBr ar trebui sa fie modificate pentru detectarea optima a colorantilor SyBr verde. Instrumentele noi cu sisteme de detectie mult mai sensibile, permit utilizarea colorantilor SyBr verde. Sybr verde este coloratia preferata pentru metodele de Real-time PCR.

 Colorarea cu argint Un sistem mai senzitiv de colorare dezvoltat initial pentru vizualizarea proteinelor, este colorarea cu argint. Dupa electroforeza, proba este fixata cu metanol sau acid acetic. Gelul este impregnat apoi cu solutii de argint amoniacal (silver diamine) sau nitrat de argint intr-o solutie slaba de acid. (8) Interactiunea ionilor de argint cu gruparile acidice sau nucleofilice, rezulta in cristalizarea sau depozitarea argintului metalic sub conditii optime de pH. Sarea de argint negru insolubila, precipita odata cu introducerea formaldehidei intr-o solutie de acid slab sau o solutie alcalina pentru nitratul de argint. Din cele doua proceduri, diamina de argint este mai buna pentru gelurile subtiri, in timp ce nitratul de argint este considerat a fi mult mai stabila. (9)

 Colorarea cu argint evita pericolele agentilor de intercalare. In plus, colorarea cu argint este mult mai complicata decat intercalarea simpla. Dezvoltarea culorii trebuie observata atent deoarece precipitatul se acumuleaza in ordinea opririi reactiilor odata ce semnalul optim este atins. Supraexpunerea gelului va rezulta in fundaluri adanci si mascheaz rezultatele. Senzitivitatea crescuta a procedurilor de colorare are limitele sale. Este utila in mod special pentru analizarea proteinelor si pentru detectarea cantitatilor limitate de produs.

Tehnici de hibridizare
Analizele clinice si judiciare necesita caracterizarea unor gene sau regiuni genomice specifice la nivel molecular. Datorita activitatii specifice secventiale , endonucleazeale de restrictie reprezinta o unealta potrivita pentru caracterizarea moleculara a ADN- ului. Enzimele de restrictie utilizate in mod obisnuit in laborator au capacitatea de a recunoaste patru sau sase perechi de baze numite locuri sau situs-uri de restricie i secioneaz ADN. Orice situs de restricie apare la intamplare intr-o secven suficient de lunga de ADN. Cartografierea locurilor de restrictie, (sau determinarea acestora intr-o secventa AND) a fost initial facuta utilizand plasmide bacteriene.

 Hartile rezultate au fost folosite pentru a identifica si pentru a caracteriza plasmidele, ce apar in mod natural si pentru a proiecta constructia plasmidelor recombinante. Pentru a face o harta de restrictie, ADN-ul este expus separat unor enzime de restrictie. De exemplu, un fragment liniar de ADN este taiat cu enzima PstI. Dupa incubarea cu enzima, fragmentele rezultate sunt separate prin electroforeza in gel. Imaginea gelului dezvaluie patru fragmente marcate A, B, C, si D, produse de PstI. Din numarul de fragmente se pot deduce numarul de locuri PstI: trei.

 Marimea fragmentelor, determinate prin comparatie cu standarde de greutati moleculare cunoscute, indica distanta dintre aceste locuri si distanta de la un loc la capatul fragmentului. Cu toate ca analiza PstI a acestor fragmente dezvaluie un model caracteristic de restrictie cu patru benzi, nu indica ordinea celor patru produsi de restrictie din fragmentul original. Pentru determinarea ordinii fragmentelor de restrictie, este folosita o alta enzima, de exemplu BamHI.

 Fragmentul este mai intai taiat cu enzima PstI. Patru fragmente sunt evidentiate cu ajutorul electroforezei cu gel in agaroza aflandu-se astfel distanta dintre locurile de restrictie. O a doua taiere cu BamHI (dedesubt) ofera doua fragmente, indicand un singur loc. Din moment ce fragmentul BamHI (E) este foarte mic, locul BamHI trebuie sa fie langa un capat al fragmentului. Taierea cu ambele enzyme indica faptul ca locul BamHI este in fragmentul A PstI.)

 Sectionnd acelasi fragment cu BamHI se obtin doua piese, indicand un loc BamHI in acest fragment liniar. Se poate observa ca un produs de restrictie (F) este mult mai mare decat cealalt (E), ceea ce inseamna ca locul BamHI este aproape de un capat al fragmentului. Cand fragmentul este taiat in mod simultan cu PstI si BamHI, sunt obtinute cinci secvene, produsul A PstI taiat in doua fragmente de catre BamHI. Acest fapt arata ca A este la un capat al fragmentului de ADN. Prin calcularea numarului si lungimii produsilor de restrictie realizate de diferite enzyme, locurile de restrictie pot fi plasate intr-o ordine liniara de-a lungul secventei de ADN.

 Figura arata doua harti posibile bazate pe rezultatele taierii fragmentului cu PstI si BamHI. Utiliznd enzime combinate adecvate poate fi generata o harta detaliata a acestui fragment. Cartografierea unei plasmide circulare este usor diferita, deoarece nu exista nici un capat liber . Exemplul aratat in aceasta figura este o plasmid circular 4-kb de cu un loc BamHI si doua locuri XhoI. Taind plasmida cu BamHI va rezulta un singur fragment. Marimea acestui fragment este de marimea plasmidei. Doua fragmente eliberate de XhoI indica faptul ca sunt doua locuri XhoI in plasmida si ca aceste locuri sunt la o distanta de 1,2 si 2.8 kb perechi una de cealalta.

 Ca si cu cartografia liniara, taierea plasmidei cu XhoI si BamHI in acelasi timp va incepe sa stabileasc locurile intr-un mod potrivit pe plasmida. Un aranjament posibil este aratat in figura 6. Cu cat sunt utilizate mai multe enzyme, harta devine mai detaliata. Datorita succesiunii diferite a nucleotidelor n secventele de AND mostenite, numarul locatiilor situsurilor de restrictie pentru o enzima de restrictie data nu sunt aceleasi la toti indivizii. Localizarea si ordinea locurilor de restrictie enzimatica pe un fragment de ADN este o caracteristica moleculara a acelui ADN.

 Diferentele rezultate in ceea ce priveste marimea si numarul fragmentelor de restrictie sunt numite polimorfisme de lungime ale fragmentului de restrictie (RFLPs). RFLPs au fost primele baze ale metodelor de identificare si cartografiere umana la nivel molecular. RFLPs pot fi de asemenea folosite pentru analiza clinica a schimbarilor structurale in cromozomi associate cu anumite boli (translocatii, deletii, insertii, etc.).

 Tehnologii de hibridizare Procedurile realizate in laboratoarele de clinica moleculara sunt indreptate spre tinte specifice in ADN-ul genomic. Aceasta necesita vizualizarea sau detectearea unor gene specifice sau a unor portiuni de ADN din gene. Sunt mai multe cai de a gasi o anumita regiune de ADN din care se va izola proba de ADN. Metoda initiala pentru analiza moleculara a locurilor specifice de ADN dintr-o multime complexa a fost transferul Southern. Modificarile transferului Southern sunt aplicate analizei ARN-ului si proteinelor pentru a studia expresia genelor si reglarea.

 Transferul Southern Transferul Southern este numit dupa Edwin Southern, care a descoperit prima data tehnica.1 In transferul Southern, ADN-ul este izolat si taiat cu enzimele de restrictie. Fragmentele sunt separate prin electroforeza cu gel, depurinate si denaturate si apoi transferate pe un support solid cum ar fi nitroceluloza. In pasul final al procedurii, fragmentele de ADN sunt expuse la o sond marcata (ARN sau ADN complementar) care este specific secventei de interes. Sondele nehibridizate sunt inlaturata, si semnalul specific al sondei este detectat pentru a indica prezenta sau absenta (lipsa semnalului) a secventei de interes.

 Metoda originala determina hibridizarea unei sonde marcat radioactiv pentru a detecta regiunea de ADN care trebuie analizata. Atata timp cat exista o sond cu o identitate cunoscuta, aceasta procedura poate analiza orice gena sau regiune a genei in genom la nivel molecular. Se vor descrie etapele tehnicii de transfer Southern in detaliu dar si adaptarea pentru a analiza ARN-ul si proteinele. Taierea cu enzima de restrictie Dupa izolarea ADN-ului, primul pas in procedura de transfer Southern este digestia ADN-ului cu enzyme de restrictie. Alegerea enzimelor folosite va depinde de aplicatie.

 Pentru teste de rutina in laborator, hartile de restrictie a regiunilor de ADN tinta vor fi determinate anterior, si se vor recomanda enzimele potrivite. Intre 10 si 50 g de ADN genomic sunt folosite pentru fiecare digestie cu enzima de restrictie pentru analiza Southern. Mai mult sau mai putin ADN poate fi folosit in funcie de sensibilitatea sistemului de detectie, volumul si configuratia placilor, si abundenta ADN-ului tinta. Dupa digestia cu enzyme de restrictie, fragmentele rezultate sunt supuse electroforezei cu gel. Compoziia i natura gelului depinde de marimea regiunilor de ADN care vor fi analizate. In primul godeu se pune un AND cu o greutate moleculara standard iar n restul AND de analizat.

 Prepararea ADN-ului activat pentru transfer Scopul procedurii de transfer Southern este de a analiza o regiune specifica a probei de ADN. In primul rand, proba de ADN este digerata, folosind diverse endonucleaze de restrictie; fragmentele de ADN sunt separate prin electroforeza. Fragmentele de restrictie rezultate ce contin secventa tinta trebuiesc analizate, deoarece nu sunt distincte in gel comparative cu alte fragmente care nu au secventa tinta.

 Fragmentele tinta pot fi detectate prin hibridizare cu o secventa omoloaga a unui ADN sau ARN, marcat cu un marker detectabil. Pentru a obtine o legatura de hydrogen optima intre sond si secventa ei complementara in ADN fragmentat, ADN dublu catenar din gel trebuie sa fie denaturat si transferat pe o membrane de nitroceloluza. Depurinarea Inainte de transferul fragmentelor din gel pe membrane, fragmentele de ADN cu dubla secventa trebuie sa fie denaturate, sau separate, in AND monocatenar. Acest lucru este facut in timp ce ADN-ul ramane in gel.

 Cu toate ca fragmentele mici pot fi denaturate direct, fragmentele mai mari (>500 bp) sunt denaturate mai efficient daca sunt depurinate inainte de denaturare. De aceea, pentru fragmente mai mari , gelul este mai intai tratat cu solutie de HCL, un process ce inlatura bazele purinice din coloana de zahar fosfat. Acest lucru va largi spatiul dintre catenele fragmentelor mai mari pentru o denaturare mai completa.

 Denaturarea Dupa depurinare, ADN-ul este denaturant prin expunerea ADN-ului intr-un gel cu agent denaturant de ex. hidroxid de sodiu. Baza puternica (NaOH) promoveaza ruptura legaturilor de hidrogen ce tin secventele lipite una de cealalta. Secventele de AND monocatenar rezultate sunt apoi disponibie legaturilor de hidrogen cu sonde (monocatenare). Mai mult, ADN-ul monocatenar se va lega mai bine decat un ADN dublucatenar de o membrana de nitroceluloza in urma unui transfer.

 Transferul Inaintea expunerii AND denaturant sondelor, ADN-ul trebuie sa fie transferat, pe un substrat solid ce va facilita legarea sondei si detectarea semnalului. Acest substrat este de obicei nitroceluloza, pe un support inert, nylon sau celuloza modificata cu un dietil amino etil, sau cu o grupare chimica carboximetil (CM). Membrane de alt tip, difluor polivinil (PVDF), sunt folosite pentru imobilizarea proteinelor pentru evidenierea cu anticorpi (transfer Western).

Autoradiography -means of detecting radioactive compounds with a photographic emulsion (x-ray film)

develop film

 Tipuri de membrane ADN-ul monocatenar se leaga de membranele de nitroceluloza prin legatura necovalenta dar ireversibila. Legturile sunt hidrofobe si electrostatice intre ADN ul incarcat negativ si incarcatura pozitiv a membranei. Membranele bazate pe nitroceluloza leaga 70150 g de acizi nucleici pe centimetru patrat. Marimea porilor membranei (0.05 microni la 0.45 microni) este potrivita pentru fragmente mici de ADN pana la > 20,000 bp lungime.

 Nitroceluloza pura are o capacitate mare de legare pentru proteine dar si pentru acizi nucleici. Este mediul cel mai instabil, scimbtor pentru aplicatii ale trensferului molecular. Este de asemenea compatibil cu diferite tampoane de transfer si sisteme de detectie. Nitroceluloza nu este la fel de rezistenta ca alte medii si devine fragil dupa multiple utilizari; reintarita este mai potrivita pentru aplicatii unde sunt necesare mai multe sonde. Aceste membrane au o capacitate de legare foarte mare (< 400 g /cm2 ), ceea ce creste sensibilitatea. O atasare covalenta a acizilor nucleici la aceste membrane este obtinuta prin cross-link-ul cu UV.

 Legaturile dintre ADN i membrane sunt mult mai puternice decat legaturile de hydrogen ce tin secventele complementare impreuna. Acest lucru permite inlaturearea sondelor si retestarea fragmentelor imobilizate daca este necesar. Membranele cu o incarcare pozitiva leaga mai eficient fragmentele mici da ADN. Aceste membrane, vor retine proteine sau alte elemente contaminante ce vor contribui la mediu dupa ce membrane este probata. Inainte de transferul probei, membranele sunt umezite prin scufundarea lor pe suprafata tamponului de transfer.

 Orice loc uscat (locuri unde membrane nu s-au hidratat suficient) vor ramane albe in timp ce restul membaranei se innegreste datorita tamponului. Daca membrana nu se hidrateaza in mod egal, locurile uscate vor inhiba legarea de sond. Metode de transfer Transferul poate fi facut in mai multe feluri. Scopul tuturor metodelor este de a muta ADN-ul din gel pe un substrat membranar pentru testare.

Southern Bloting

Enzime restrictionate

AND-ul de diferite dimensiuni

Electroforez pe gel de agaroz gel Denatura - transfer la hrtie de filtru.

blot

Denatura - transfer la hrtie de filtru.

blot

Hibridiza la sonda

Vizualizati

 Celuloza conjugat cu dietilaminoetil (DEAE) leaga in mod efficient acizii nucleici si proteinele incarcate negativ. Difluor polivinilidena (PVDF) si membranele de celuloza incrcate carboximetili sunt folosite numai pentru transferul proteic (Western). Aceste membrane leaga acizii nucleici si proteinele de interactiuni ionice si hidrofobe cu o capacitate de legare de 20-40 g /cm2 pana la 150 g /cm2 pentru PVDF Transferul capilar este simplu si relativ ieftin, deoarece nu este necesar nici un instrument. Transferul, poate fi mai putin optim, mai ales cu geluri mari. Bule sau cristale dintre membrane si gel pot cauza pierderi de informatii sau artefacte de colorare. Procedura este de asemenea lenta, durand de la cateva ore pana la o noapte pentru fragmente mari.

 Metoda originala dezvoltata de Southern a folosit transferul de capilar. Pentru transferul capilar, gelul este plasat deasupra rezervorului cu tampon, care poate fi un container nu prea adanc sau foi de membrane imbibate in solutie de tampon cu salinitate mare, de exemplu, citrat de sodiu cu salinitate 10X (10X SSC:1.5 M NaCl, 0.15 M citrat de Na) sau solutie tampon de transfer disponibil commercial. Membrana de nitroceluloza este plasata direct pe gel, si membranele absorbante uscate sau prosoape de hartie sunt stivuite deasupra membranei. Tamponul este transportat prin actiunea capilarelor de la rezervorul de jos pe materialul uscat de deasurpra gelului.

 Miscarea tamponului prin gel va duce la transferul si denaturarea ADN-ul. Cand ADN-ul intra in contact cu membrane de nitroceluloza, ADN-ul se va lega de ea in timp ce tamponul va trece prin membrana sau prosoapele de hartie de deasupra.
O a doua metoda, numita transfer electroforetic, utilizeaza current electric pentru a transfera AND de pe gel pe membran. Acest system utilizeaza electrozi atasati deasupra (anod) de membrane si dedesubtul (catod) gelului. Curentul transporta ADN-ul transversal din gel spre membrana. Transferul electroforetic este efectuat prin dou metode bazin si semiuscata. In metoda bazinului, electrozii transfera current prin membrane prin tamponul de electroforeza.

 La metoda semiuscata, electrozii contacteaza direct sandwich-ul gel-membrana, necesitand doar destula solutie tampon pentru a imbiba gelul si membrana. Transferul electroforetic cu ajutorul bazinului este preferat pentru proteine mari activate pe geluri de acrilamid, in timp ce metoda semiuscata este utilizata frecvent pentru fragmente mici. Transferul in vid este a treia metoda de transfer al ADN-ului (Fig. 6-8). Aceasta tehnica de transfer foloseste suctiunea pentru a muta ADN-ul din gel pe membrane intrun tampon recirculant

 Ca si transferul electroforetic, aceasta metoda transfera ADN-ul mai rapid, de exemplu, in ore fata de zile cum se intampla in transferul prin capilare. De asemenea, trasnferul discontinuu datorat aerului prins intre membrane si gel este evitat. Un dezavantaj al celei de-a doua si de-a treia metode este costul si mentenanta echipamentului de vid si al electroforezei. Dupa legarea acizilor nucleici pe membrane, ADN-ul taiat si denaturant este imobilizat permanent pe membrane prin uscare lor intr-un cuptor cu vid (800 C 30-60 min) sau prin cross-linking-ul cu UV adica atasarea covalenta a ADN-ului pe nitroceluloza folosind energia luminii UV.

 Scopul uscrii sau cross-link-ului este de a preveni spalarea sau transferul pe membrane a fragmentelor de ADN. Dupa imobilizarea ADN-ului, un pas de prehibridizare este necesar pentru a preveni legarea sondei de locuri nespecifice de pe suprafata membranei ce va cauza un fond incarcat. Prehibridizarea implica incubarea membranei in aceeasi solutie tampon in care se va introduce ulterior sonde. In acest stadiu, solutia tampon nu contine sonde. Solutia tampon este alcatuita din agenti de blocare, solutia Denhardt (Ficoll, polivinil pirolidon, albumina din ser de bovina) si ADN din sperma de somon.

 Dodecil sulfat de sodiu (SDS, 0.01%) poate fi de asemenea inclus impreuna cu formaldehida, cea din urma in special pentru probele de ADN. Membrana este expusa tamponului de prehibridizare la o temperature de prehibridizare optima timp de 30 de minute pana la cateva ore, depinzand de protocolul specific. In acest stadiu mostra este gata pentru hibridizarea cu sonda, fapt care va permite vizualizarea genelor specifice sau a regiunilor de interes. Vizualizarea se realizeaz prin autoradiografie.

 Transferurile Northern Transferul Northern este o modificare a tehnicii de transfer Southern si a fost conceput pentru a investiga structura si cantitatea de ARN. Cu toate ca majoritatea analizelor Northern sunt facute pentru a investiga nivelul de expresie a genelor (transcriptia de pe ADN ) si stabilitatea, metoda poate fi folosita de asemenea si pentru a investiga anomaliile structurale ale ARN-ului din aberatiile de sinteza sau procesare, cum ar fi lipirea alternanta. Anomaliile de lipire sunt responsasbile pentru un numar de boli, cum ar fi beta talasemia si o deficienta familiala izolata a hormonului de crestere. Analiza structurii si cantitatii de ARN dezvaluie indirect mutatii in semnalele de activare si lipire in ADN.

 Trebuie extras ARN cu atenie pentru a mentine un mediu fara RNaze. Dupa izolarea si quantificarea ARN-ului, probele (de pana la 30 g de ARN sau 0.5-3.0 g de ARN poliA, depind de abundenta transcriptiei in timpul studiului) pot fi aplicate direct pe gelurile de agar. Sunt folosite de obicei concentratii de agar de 0.8%-1.5%. Gelurile poliacrilamidice pot fi de asemenea folosite, in special pentru transcriptiile mici; de exemplu, pentru analiza unei expresii genetice virale. 2

 Electroforeza pe gel a ARN-ului trebuie efectuata n conditii de denaturare pentru teste corecte de marime a trascriptiei. Denaturarea completa este de asemenea necesara pentru un transfer efficient al ARN-ului din gel pe membrane, ca si in cazul transferului de ADN in transferul Southern. Deoarece denaturarea este desfasurata in timpul electroforezei, un pas de denaturare separat nu este necesar pentru transferul Northern. Dupa electroforeza, benzile representative pot fi taiate din gel, inmuiate in acetate de amoniu pentru a inlatura denaturantul, si colorate cu portocaliu de acridina sau bromura de etidiu pentru a testa calitatea si incarcarea probei echivalente.

 Denaturantul cum ar fi formaldehida, trebuie inlaturat din gel inainte de transfer deoarece aceasta inhiba legarea ARN-ului de nitroceluloza. Acesta lucru este realizat prin clatirea gelului in apa deionizata. ARN-ul este transferat in 10X sau 20X SSC sau 10X SSPE (1.8 M NaCl, 0.1 M fosfat de sodium, pH 7.7, 10mM EDTA) pe nitroceluloza dupa cum s-a descries anterior pentru ADN.

 20x SSC ar trebui folosit pentru molecule de ARNm mici (500 de baze sau mai putin). Procedura de transfer pentru ARN in transferul Northern este indeplinita in 20X SSC similar cu procedura pentru transferul ADN-ului in transferul Southern. Prehibridizarea si hibridizarea in solutiile tampon formamida/SCC/SDS de prehibridizare/hibridizare sunt executate de asemenea ca si in cazul transferului Southern. Daca ARN-ul a fost denaturant in glicoxal, membrane trebuie inmuiata in solutie tampon calda Tris (650 C) pentru a inlatura denaturantul imediat inainte de prehibridizare.