ILEANA STOICA

TATIANA VASSU

ELENA SSRMAN

BIOLOGIA I TAXONOMIA MOLECULAR A MICROORGANISMELOR COLECIA DE CULTURI MICROBIENE

Ilustraie: Oana Iftime

Ileana Stoica Coperta: Oana Iftime Redactor: Oana Iftime Ileana Stoica

Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a Romniei STOICA, ILEANA Biologia i taxonomia molecular a microorganismelor: Colecia de culturi microbiene / Ileana Stoica, Tatiana Vassu-Dimov, Elena Ssrman Bucureti: Arvin Press, 2002 p. ; cm. ISBN 973-96090-3-8 I. Vassu-Dimov, Tatiana II. Ssrman, Elena 579.8

CAPITOLUL VII

Taxonomia molecular a bacteriilor

VII.1. Definiii. Generaliti
Taxonomia, cunoscut i sub denumirtea de (bio)sistematic, reprezint tiina clasificrii i reunete de fapt, trei domenii tiinifice: (1) Clasificarea gruparea organismelor n grupe distincte (denumite taxoni) pe baza unor caractere de asemnare; (2) Nomenclatura atribuirea de nume (nomen) taxonilor definii de clasificare; (3) Identificarea poziionarea unui organism necunoscut ntr-una din grupele definite de clasificare i denumite de nomenclatur. n taxonomia modern au fost integrate/asociate dou alte domenii tiinifice: filogenia i genetica populaiilor. Ca urmare, n ultimii 15 ani, este unanim acceptat ideea conform creia clasificarea bacteriilor ar trebui s reflecte, ct mai apropiat posibil, relaiile naturale dintre taxonii bacterieni. Pentru a stabili i defini grupe n cadrul clasificrii microorganismelor, Vandamme (1996) a propus utilizarea aa-numitei taxonomii polifazice. n acest scop, taxonii sunt definii pe baza informaiilor obinute de diverse discipline, reunind astfel att date fenotipice (cunoscute ca facnd parte din taxonomia convenional), ct i date de nivel molecular (taxonomia molecular, chemotaxonomie). La bacterii, taxonomia convenional se bazeaz pe o serie de trsturi morfologice, structurale, fiziologice i biochimice: forma i mrimea celulei, morfologia coloniilor, ultrastructura celulei, constituenii peretelui celular, tinctorialitate, motilitate, incluziuni celulare, surse de carbon, azot i energie, produse de fermentaie, range-ul de temperaturi/pH optime, tolerana osmotic, metabolizarea oxigenului, sensibilitatea la o serie de inhibitori metabolici i la antibiotice. Taxonomia molecular se ocup cu studiul variaiilor chimice n organismele vii i folosirea acestor caractere, att pentru clasificarea i identificarea unui organism necunoscut, ct i pentru evidenierea relaiilor filogenetice, evolutive, dintre diverse organisme. Multe dintre caracterele fiziologice i biochimice prezint dezavantaje majore: variaz, att calitativ, ct i cantitativ, funcie de condiiile de cultivare. La rndul lor, acestea variaz n mod obiectiv datorit necesitilor nutriionale diferite de la o grup la alta de bacterii. Ca urmare, este dificil de elaborat sisteme standard de analiz a unor asemenea parametri, sisteme care s fie universal valabile pentru toate bacteriile. Pe de alt parte, cercetrile din ultimii 15 ani au demonstrat c, cel puin parte din caracterele morfologice i fiziologice, reprezint adaptri ale populaiilor bacteriene la diverse nie ecologice i nu exprim dect n mic msur gradul de nrudire real dintre diveri taxoni bacterieni. Nu n ultimul rnd este de subliniat faptul c n ultimul deceniu au fost descrise din ce n ce mai multe specii bacteriene ce nu sunt cultivabile. n contrast cu aceste dezavantaje ale taxonomiei convenionale, taxonomia molecular i, n mod particular, acizii nucleici, prezint o serie de avantaje generale: (1) dei cantitatea de ADN per celul poate varia funcie de diveri factori (condiii de cultivare, faz a ciclului celular, numrul de copii ale unui replicon per celul), totui

ADN-ul nu variaz din punct de vedere calitativ, adic nu variaz secvena de nucleotide; (2) gradul de nrudire ntre diveri taxoni bacterieni este exprimat cel mai bine la nivel de ADN; (3) n prezent, moleculele ADN pot fi analizate i la microorganisme necultivabile.

VII.2. Conceptul de specie n lumea bacterian

Grupul taxonomic de baz n sistematica bacterian modern este specia. Definirea conceptului de specie bacterian a ridicat i nc ridic probleme deosebite. Astfel, de-a lungul anilor conceptul de specie bacterian a suferit o serie de transformri. Astfel, Mayr (1957) oferea o abordare practic uor de folosit n laboratoarele de microbiologie din perioada respectiv, considernd c speciile bacteriene reprezint entiti statice (ce nu evolueaz) definite prin trsturi fenotipice. Nu se inea seama de faptul c speciile bacteriene sunt compuse din populaii naturale aflate n proces de evoluie molecular. Pe de alt parte, conceptul de specie biologic descris de Mayr se baza pe interbreeding i, ca atare, acest concept este aplicabil la speciile de eucariote la care exist fenomenul de sexualitate. Astfel, conform sistematicii eucariotelor, specia reprezint un grup de organisme a cror divergen este contrabalansat de o for de coeziune ce se bazeaz din punct de vedere genetic pe fenomenul de sexualitate (Cohan, 2002). n contrast, conceptul lui Mayr este dificil de aplicat la organisme asexuate cum sunt procariotele (D.M.Ward, 1998). La sfritul anilor 50, specia bacterian era definit doar pe criterii morfo-fiziologice, rezultatele testelor fiind supuse unor analize multivariate sub forma taxonomiei numerice. Este totui de aminit i faptul c n 1961 Simpson (citat de Ward, 1998) elaboreaz conceptul de specie evolutiv, concept conform cruia o specie reprezint o secven (temporal) de populaii cu ascendent comun i care evolueaz separat de alte populaii. Anii 60 sunt cunoscui ca fiind debutul analizelor de tip molecular. Punerea la punct a unor tehnici fezabile de izolare i purificare a moleculelor de ADN cromozomal (Marmur, 1961) i, mai apoi, i a celor de ADN plasmidial, au condus i la primele analize taxonomice pe acizi nucleici. Primul criteriu de taxonomie molecular ce a fost utilizat n sistematica bacterian a fost compoziia total n nucleotide, altfel exprimat procentul molar de guanin + citozin (%mol GC) (De Ley J., 1963 i 1970). Tulpinile bacteriene a cror %mol GC diferea semnificativ erau considerate ca aparinnd la taxoni diferii specii, sau chiar genuri diferite. Cercetrile n aceast direcie au avansat n ultimii 20 de ani, punndu-se la punct tehnici din ce n ce mai acurate, dar i mai rapide, i elaborndu-se un ntreg aparat matematic conex (Franck, 1971; Owen, 1985; Diaz, 1989). n prezent, procentul molar de guanin + citozin este un parametru listat n toate manualele internaionale i cerut la orice descriere de specie bacterian nou, rmnnd ns un criteriu negativ, de excludere taxonomic. Compoziia global n baze azotate (exprimat n %mol GC) era totui o informaie destul de superficial, simindu-se necesitatea diferenierii mai precise a genomurilor bacteriene. Ca urmare, de la jumtatea anilor 70, n tehnicile de taxonomie molecular i-a fcut apariia metoda hibridizrii ADN : ADN (De Ley, 1970), metod ce exprim gradul de omologie de secven ntre doi cromozomi bacterieni ce aparin la tulpini con-specifice sau din specii diferite. i n acest caz au fost dezvoltate tehnici din ce n ce mai precise i mai rapide. Esenial este ns faptul c s-a constatat c acest parametru are valoare taxonomic mult mai mare, permind diferenierea speciilor bacteriene. Astfel, i n prezent este nc oficial acceptat de ctre Comitetul Internaional de Sistematic Bacterian, definiia speciei

bacteriene ca grup de tulpini bacteriene (inclusiv tulpina tip) ce prezint cel puin 70% omologie de secven ADN, cu o valoare a Tm de cel mult 5oC (Wayne, 1987). Dezvoltarea tehnicilor de biologie molecular (i, n mod special, a tehnologiei PCR i a tehnicilor de secveniere ADN) n ultimii 20 de ani a culminat cu studiul secvenelor ARNr, mai corect spus, a genelor ce codific aceste molecule. S-a constatat c, din punct de vedere taxonomic, dintre cele 3 tipuri de ARN ribozomal de la bacterii (5S, 16S i, respectiv, 23S), cele mai utile sunt cele de dimensiune medie (16S). Moleculele de ARNr 16S (ca, de altfel, i celelalte dou tipuri) prezint o structur modular, coninnd domenii ce prezint grade diferite de variabilitate de secven. Pe baza analizelor acestor molecule au fost obinute foarte multe informaii utile din punct de vedere taxonomic i filogenetic. Astfel, grupul Archaea (cunoscut anterior ca Archaebacteria) a fost recunoscut ca grup independent, separat de Bacteria (anterior denumit Eubacteria) (Woese, 1990 i 2000; Wheelis, 1992; Olsen, 1994). A existat o perioad cnd s-a crezut c studiul acestor molecule reprezint punctul ultim n taxonomia bacteriilor. Mai mult chiar, pe baza analizei moleculelor ARNr de dimensiune medie au fost propui noi arbori filogenetici universali i, respectiv, de grup (Olsen, 1994). n ceea ce privete ns diferenierea taxonomic a speciilor bacteriene, s-a constatat c moleculele ARNr 16S nu ofer o rezoluie suficient de bun, sau chiar pot conduce la interpretri eronate. S-a concluzionat astfel c cea mai complet surs de informaii taxonomice de nivel molecular este genomul bacterian ca ntreg. Nici una din gene luate separat, nici mcar cele ce codific pentru ARNr, nu ofer suficiente informaii pentru diferenierea speciilor bacteriene (Schloter, 2000). Pe de alt parte, dei este nc oficial acceptat definirea speciei bacteriene pe baza omologiei de secven la nivel de genom ntreg, totui n ultimii 5 ani au fost realizate o serie de studii ce tind s demonstreze faptul c gradul total de omologie ADN este totui un parametru mult prea grosier. Coeziunea genetic n interiorul speciilor bacteriene s-ar baza pe existena unor clusteri genetici (filogenetici) cu structur suficient de conservat n interiorul speciilor bacteriene, i diferit ntre specii (Embley, 1997; Gest, 1999; Liu, 1999). Cu totate acestea, pn n prezent, majoritatea celor ce lucreaz taxonomie bacterian consider c analiza moleculelor ARNr 16S ofer un cadru satisfctor pentru clasificarea procariotelor. Pe plan internaional, sunt recomandate studiile de taxonomie polifazic, n mod special pentru taxonii bacterieni inferiori, cum este de altfel i specia (Vandamme, 1996). Cu ajutorul taxonomiei polifazice sunt reunite criterii dintre cele mai diverse, fenotipice i genotipice. n prezent, descrierea unei noi specii procariote este acceptat numai dac este descris att din punct de vedere genetic (i, n mod obligatoriu, %mol GC i grad de omologie ADN fa de speciile apropiate), ct i din punct de vedere fenotipic (att trsturi fenotipice ce o ncadreaz ntr-un gen bacterian alturi de alte specii, ct i trsturi ce o difereniaz de acestea). O problem de loc neglijabil n taxonomia bacterian o reprezint aa-numita izolare sexual. Nu ne referim la proto (para) sexualitatea bacteriilor, aa cum era denumit fenomenul de conjugare bacterian n anii 50 (bacteriile F+ erau numite bacterii mascule, iar cele F - bacterii femele). Dac la organismele eucariote se poate vorbi de sexualitate propriuzis, la procariote conceptul de sex i lrgete accepiunea, putnd fi comparat cu schimbul de material genetic pe orizontal (ntre indivizi aparinnd acelorai generaii) (Majewski, 2001). n lumea bacterian acest fenomen de transfer se realizeaz practic prin 3 tipuri principale de mecanisme: transformare genetic, conjugare i transducie (de la Cruz, 2000). n cazul transformrii genetice, bacteriile includ molecule ADN ce provin de la ali indivizi biologici, fr intervenia unor elemente genetice specializate (Dreiseikelmann, 1994; Lorenz, 1994). n conjugarea bacterian, transferul de gene cromozomale de la o bacterie la alta este

realizat de plasmide conjugative sau de transpozoni conjugativi (Amabile-Cuevas, 1992; Cohen, 1993). n transducie, genele cromozomale sunt transferatede la o bacterie la alta de ctre bacteriofagi (Campbell, 1992). S-a constatat c unele specii bacteriene favorizeaz anumite tipuri de transfer. De exemplu, Bacillus subtilis este n mod natural uor transformabil cu ADN exogen, prezentnd n cursul ciclului celular o etap de competen genetic natural. n contrast, bacteriile din specia Escherichia coli nu desfoar n mod natural transformare genetic, n schimb favorizeaz evenimentele de transducie. La o extrem se afl genul Pseudomonas, la care toate cele 3 tipuri de fenomene de transfer genetic orizontal par s fie extrem de frecvente, determinnd o versatilitate catabolic i o capacitate adaptativ foarte mare a acestui grup de bacterii. Indiferent de varianta de transfer, se pune problema izolrii speciilor bacteriene : dac aceste evenimente de transfer au loc doar n interiorul speciilor bacteriene, sau i ntre bacterii aparinnd la specii diferite. Cercetrile efectuate pn n prezent au evideniat nc o dat extrema variabilitate n lumea bacterian. Astfel, din punct de vedere al transformrii genetice, anumite specii bacteriene (de exemplu, cele aparinnd genurilor Neisseria, Haemophilus) accept doar ADN nrudit, deci aparinnd la aceeai specie; exist ns i specii bacteriene (din genurile Streptoccus, Pseudomonas) care pot accepta i molecule ADN de la specii ndeprtate filogenetic. Un alt exemplu l reprezint plasmidele conjugative de antibiorezisten care traverseaz barierele de specie, rspndindu-se global ntre bacteriile patogene. n mod similar acioneaz i plasmidele conjugative ce poart gene catabolice, plasmide ce se pot rspndi rapid ntre diverse specii bacteriene cu capaciti xenodegradative. Nu n ultimul rnd, este de amintit faptul c au fost evideniate fenomene de transfer de material genetic chiar i ntre bacterii i plante, bacterii i drojdii, bacterii i alte tipuri de organisme eucariote (Young, 2001). n concluzie, conceptul de specie n lumea bacterian reprezint o problem extrem de dezbtut n ultimul deceniu. Este ns necesar acumularea de mult mai multe informaii pentru a putea defini aceste noduri cu existen temporar ntr-un continuum de schimbare i evoluie.

VII.3. Analiza proteinelor citoplasmatice

Analizele taxonomice ale proteinelor citoplasmatice pot fi realizate prin dou categorii mari de tehnici: a) comparaii ntre molecule individuale; acest tip de analize se realizeaz, fie prin secvenierea comparativ a aminoacizilor din componena proteinelor, fie prin reacii de tip serologic; b) evaluarea global a proteinelor totale: se realizeaz prin compararea mobilitilor electroforetice ale unor seturi de proteine. 1. Serologia comparativ a proteinelor Reaciile de tip serologic pot detecta asemnri structurale ntre enzime din diverse tulpini bacteriene. De regul, se alege o enzim purificat din cteva tulpini de referin, pentru a obine astfel antiserurile. n continuare, antiserurile sunt folosite n imunodifuzie bidimensional pentru a compara antiserurile cu enzimelor izologe din diverse tulpini bacteriene.

Aceast tehnic se bazeaz pe faptul c orice variaie n secvena de aminoacizi a unei proteine se va reflecta n structura sa secundar i, deci, i n antigenicitate. Serologia cantitativ reprezint o tehnic rapid, ce ofer date preliminare pentru identificarea taxonomic a tulpinilor bacteriene. Majoritatea studiilor de serologie comparativ s-au centrat pe bacterii lactice (Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus), iar ca enzime: fructozo- aldolaza, glucozo-6-fosfatdehidrogenaza, lactat-dehidrogenaza. 2. Electroforeza comparativa a proteinelor n general, un genom bacterian codific n medie aproximativ 2000 de proteine, parte cu funcii structurale, parte cu funcii enzimatice. S-a constatat c n condiii standard de cultivare complementul proteic este relativ constant. Prin electroforeza proteinelor totale n gel de poliacrilamid se obine o separare parial a proteinelor, n sensul c fiecare band din gel reprezint, de fapt, mai multe clase de proteine; pattern-ul total reprezint ns o amprent (fingerprint) a tulpinii bacteriene respective. Electroforeza comparativ a proteinelor totale constituie o analiz echivalent, din punct de vedere al informaiilor taxonomice, cu analizele de reasociere ADN:ADN (grad de omologie de secven de nucleotide), ambele oferind rezultate congruente. Diferena const n faptul c electroforeza proteinelor este o tehnic mult mai rapid dect reasocierea ADN:ADN. n ansamblu, dei electroforeza proteinelor totale prezint reproductibilitate nalt n acelai laborator, s-au nregistrat totui diferene ntre rezultate obinute n laboratoare diferite. 3. MultiLocus Enzyme Electrophoresis (MLEE) n ultimii ani, MLEE reprezint cel mai folosit tip de analize de taxonomie molecular pe proteine. Cu ajutorul acestei metode, diverse tulpini bacteriene pot fi clasificate n grupe, pe baza prezenei sau absenei anumitor enzime, i prin compararea mobilitilor lor electroforetice. Ca principiu, tehnica se bazeaz pe faptul c diferenele n secvenele de aminoacizi din diverse proteine determin diferene n sarcina electrostatic a moleculelor respective i, ca atare, diferene de mobilitate n cmp electric. Variantele moleculare de mobilitate electroforetic au fost denumite electromorfe (sinonim cu electrotipuri, ET) sau alozime i sunt echivalente cu alelele de la eucariotele superioare (n contrast cu izozimele ce reprezint un acelai tip de enzim codificat ns de loci diferii). S-a demonstrat c distanele genetice estimate prin MLEE se coreleaz strns cu cele estimate prin studii de reasociere ADN:ADN. Pe de alt parte, s-a constatat c tehnica MLEE este util n mod special n decelarea variabilitii genetice intra-specifice, i mai puin pentru a compara tulpini ce aparin la specii diferite. Tehnica MLEE presupune ca principale etape: obinerea extractului proteic celular, electoforez n gel de poliacrilamid; se aplic apoi o coloraie pentru o anumit enzim (sau clas de enzime). Mobilitile electroforetice ale enzimelor din diverse tulpini bacteriene se compar cu mobilitile electroforetice a enzimei dintr-o tulpin bacterian standard. Se consider c enzimele ce prezint aceeai mobilitate electroforetic fac parte din aceeai electromorf (n contrast cu enzimele ce au mobiliti diferite i care se consider c fac parte din electromorfe diferite). n acest mod, fiecare tulpin bacterian este caracterizat prin combinaia sa de electromorfe.

Studii extinse realizate pe foarte multe tulpini bacteriene Gram-negative au condus la 3 concluzii generale: (1) Majoritatea speciilor bacteriene au structur clonal Conform acestei afirmaii, speciile bacteriene sunt compuse din grupuri de tulpini identice, sau cvasi-identice, denumite clone. Membrii unei clone se caracterizeaz prin: - au pattern MLEE identic - sunt stabile pe perioade lungi de timp - din punct de vedere geografic, au rspndire global Se consider totodat, c este foarte puin probabil ca dou tulpini bacteriene din dou stocuri genetice diferite, s convearg spre un pattern MLEE identic, ci probabil c au derivat din acelai parental. Studiile au mai constatat faptul c din punct de vedere al structurii clonale, exist 2 tipuri principale de specii bacteriene: a) specii bacteriene cu structur clonal stringent La asemenea specii, clonele sunt extrem de diferite ntre ele i este de presupus evenimentele de transfer de gene ntre clone sunt foarte sporadice. Cele mai cunoscute exemple de asemenea specii bacteriene sunt Escherichia coli, Haemophilus, Legionella specii cunoscute ca fiind greu transformabile cu ADN exogen. b) specii bacteriene cu structur clonal relaxat La asemenea specii (de ex. Neisseria gonorhoeae, Bacillus subtilis), evenimentele de transfer de gene pe orizontal, ntre clone, sunt foarte frecvente, astfel nct are loc un fenomen de randomizare a alelelor. Era de ateptat ca cele dou specii menionate s aib structur clonal slab, pentru c amndou sunt, n mod natural, fiziologic, uor transformabile cu ADN exogen. (2) n interiorul speciilor cu structur clonal, numrul clonelor este redus Analize moleculare pe un numr mare de specii i tulpini bacteriene au condus la concluzia c numrul de clone din interiorul unei specii este destul de mic. De exemplu, un studiu pe proteine corespunztoare la 12 loci la 2000 de tulpini de Escherichia coli a evideniat existena a doar 300 de electromorfe, toate avnd rspndire geografic global. (3) La microorganismele patogene, foarte puine clone sunt asociate cu mbolnviri grave. n general, s-a constatat c patogenitatea variaz mult n interiorul unei specii bacteriene, i numai puine clone au evoluat prin creterea virulenei. Pe de alt parte, s-a demonstrat i faptul c la speciile ce pot infecta gazde diferite, exist o corelaie ntre organismul gazd i tipul clonal. Astfel, la Bordetella bronchiseptica, clona ET-1 este izolat numai de la porc, n timp ce clona ET-6 este izolat numai de la cine. n concluzie, cu ajutorul analizelor MLEE, s-a constatat c diversitatea intraspecific gsit la majoritatea speciilor bacteriene este mult mai mic dect cea ateptat (dac alelele s-ar fi combinat randomizat i independent una de cealalt), existnd o tendin pronunat de a se asocia anumite combinaii de alele. Se poate spune, deci, c la foarte multe specii bacteriene exist tendina meninerii unui linkage la nivelul ntregului cromozom (chromosome-wide).

VII.4. Analiza nveliului celular

nveliul celular al bacteriilor prezint o compoziie i o structur suficient de variabil pentru a putea oferi informaii cu valoare taxonomic. 1. Peptidoglicanul

Peptidoglicanul intr n compoziia peretelui celular la marea majoritate a bacteriilor, existnd diferene n structura sa, mai ales n diaminoacidul lanurilor tetrapeptidice i n structura unor peptide. La bacteriile Gram-negative, peptidoglicanul are o structur relativ uniform i, ca atare, nu prezint interes pentru studiile de taxonomie. n contrast, el este extrem de util la bacteriile Gram-pozitive, n mod special la actinomicete (i la bacteriile nrudite cu acestea), care au fost clasificate n 8 chemotipuri de perete celular. 2. Lipidele n celulele bacteriene exist 4 clase importante de lipide: acizi grai cu lan lung, acizi micolici, lipide polare i, respectiv, quinone izoprenoide. Acizii grai cu lan lung La acest tip de molecule pot s varieze mai muli parametri: lungimea lanului de carbon (ntre 8 i 26 atomi de carbon), prezena/absena ramificaiilor (ramificaiile sunt predominante la bacteriile Gram-pozitive). Este de menionat faptul c aceti doi parametri determin gradul de fluiditate a membranei celulare. Ali parametri ce variaz sunt gradul de saturare a legturilor chimice dintre atomii de carbon i prezena/absena structurilor chimice inelare. Acizii micolici Acizii micolicii reprezint forme moleculare de acizi grai i au fost identificai doar la foarte puine genuri bacteriene: Mycobacterium, Corynebacterium, Nocardia. n acizii micolici numrul total de atomi de carbon este foarte mare (ntre 24 i 90), fapt pentru care ei creeaz un nveli ceros, impermeabil. Lipide polare Lipidele polare intr n structura membranei celulare. Unele din ele sunt mult prea comune i, ca atare, nu prezint valoare taxonomic. Altele sunt ns mai specifice: fosfatidilinozitol-manozidele sunt specifice actinomicetelor; pe de alt parte, Archaea au lipidele eterificate, i nu esterificate. Quinone izoprenoide Acest tip de molecule exist n membrana tuturor bacteriilor aerobe; exist ns variaii de gen i chiar de specie bacterian. 3. Produse metabolice

Analizele moleculare a produselor metabolice sunt valoroase din punct de vedere taxonomic mai ales pentru bacteriile anaerobe, care au un pattern complex de produse metabolice. 4. Celule ntregi

n acest tip de analiz, celulele sunt cultivate n condiii standard, apoi sunt degradate termic la 3 - 400oC. Produsul este analizat prin gaz-cromatografie sau prin spectrometrie de masa i reprezint o amprent a tulpinii respective.

VII.5. Analize taxonomice pe ADN cromozomal

In analizele de chemosistematic s-a constatat c compoziia chimic a majoritii microorganismelor depinde substanial de condiiile de mediu, fiind astfel necesar stabilirea unor condiii standard de testare. In contrast, s-a mai constatat c moleculele acizilor nucleici, i n mod special ADN cromozomal, nu sunt afectate calitativ de condiiile de cretere. S-a concluzionat deci, c acizii nucleici reprezint singurele molecule standard prin care pot fi comparate i clasificate o gam larg de microorganisme. In prezent, s-au dezvoltat o serie ntreag de analize de nivel molecular pe ADN cromozomal, ce pot oferi informaii cu valoare taxonomic despre microorganisme. 1. Procentul molar de guanin + citozin

Una dintre cele mai folosite tipuri de analize este reprezentat de determinarea compoziiei ADN cromozomal, n ceea ce privete coninutul n cele 4 baze azotate adenin (A), timin (T), guanin (G) i citozin (C). Complementaritatea bazelor azotate (A = T i G = C), precum i structura n duplex (dublucatenar) a moleculei ADN, asigur cantiti echivalente de guanin fa de citozin i, respectiv, adenin fa de timin. In acest sens, n prezent, coninutul n baze azotate a unei molecule ADN este exprimat ca procent molar de guanin + citozin (mol% GC) (Marmur, 1962 ; DeLey, 1963, 1970a i b ; Siedler, 1971 ; Johnson, 1985). Studiile realizate pe foarte muli taxoni bacterieni au condus la concluzia c acest parametru variaz ntre limite foarte largi: ntre 25 %mol GC la unele micoplasme, i 75 %mol GC la unele streptomicete (Vandamme, 1996). Pe de alt parte, s-a mai constatat c dei bacteriile difer ntre ele foarte mult n ceea ce privete compoziia n baze azotate, valoarea procentului molar de guanin + citozin este constant pentru fiecare tip de microorganism n parte. Este important de subliniat faptul c similaritatea n compoziia n baze azotate nu nseamn n mod necesar c dou microorganisme sunt nrudite, pentru c pot avea aceeai valoare a procentului molar de guanin + citozin, dar secvene diferite de nucleotide. Un exemplu (dintre foarte multe) l ofer speciile Spirochaeta halophila i Pseudomonas testosteroni, care au amndou 62 %mol GC, dei cele dou microorganisme nu sunt apropiate din punct de vedere filogenetic.

Reciproca ns nu este valabil. Astfel, dou microorganisme cu valori foarte diferite ale procentului molar G+C, n mod necesar au i secven diferita de nucleotide. Deci, compoziia n baze azotate exprimat ca %mol GC reprezint un criteriu taxonomic de excludere i nu de includere. In ansamblu, se poate aprecia c procentul molar de G + C reprezint o msur a gradului de heterogenitate genetic. S-a constatat astfel, c la majoritatea genurilor bacteriene, acest parametru variaz ntre limite destul de nguste (10-12 procente). Exist ns i genuri bacteriene n interiorul crora heterogenitatea genetic este foarte mare ( Tabelul 7.1), o extrem fiind reprezentat de genul Flavobacterium, n interiorul cruia %mol GC variaz ntre 31 i 68%. Alte astfel de genuri bacteriene sunt Lactobacillus (32 52 %mol GC), Bacillus (33 64 %mol GC), Haemophilus (37 55 %mol GC). Ca urmare, s-a sugerat necesitatea diferenierii unor asemenea taxoni n mai multe genuri bacteriene. In concluzie, acumularea informaiilor privind procentul molar de guanin + citozin a condus la propunerea (Priest, 1994) ca ncadrarea taxonomic a microorganismelor s fie realizat astfel nct variaia genetic maxim permis n interiorul unui gen bacterian s fie de 10-12 procente, iar cea din interiorul unei specii bacteriene s fie de 5%. Nu n ultimul rnd, subliniem faptul c manualele Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (Krieg, 1984), Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (Holt, 1994), The Prokaryotes (Starr, 1981), includ valorile %mol GC la un numr foarte mare din taxonii descrii.

Tabelul 7.1 Compoziia n baze azotate la cteva genuri bacteriene (dup Priest, 1994) GEN BACTERIAN (GRAM-NEGATIVE) %MOL GC GEN BACTERIAN (GRAM-POZITIVE) %MOL GC

Acetobacter Aeromonas Cytophaga Enterobacter Escherichia Haemophilus Klebsiella Pseudomonas Rhodospirillum

51-65 57-63 29-45 52-60 48-52 37-44 53-58 58-70 60-67

Bacillus Clostridium Corynebacterium Lactobacillus Micrococcus Mycobacterium Staphylococcus Streptococcus Streptomyces

33-64 22-55 51-63 32-52 66-75 62-70 30-37 34-46 69-77

Variante tehnice de determinare a %mol GC In ceea ce privete variantele tehnice de determinare a compoziiei n baze azotate, exist n prezent 3 metode principale: hidroliza moleculelor ADN pn la nivel de baze azotate i cuantificarea acestora prin cromatografie n faz lichid, de nalt performan (HPLC High PerformancePressure Liquid Chromatography); aceast metod este extrem de acurat, dar laborioas i foarte costisitoare;

ultracentrifugarea probei de ADN cromozomal n gradient de densitate de CsCl; se calculeaz apoi densitatea de plutire a moleculelor de ADN din prob cu ajutorul densitii de plutire a unei probe standard de ADN; procentul molar G + C se calculeaz pe baza relaiei: densitatea de plutire = 1.66 + 0.098 x %mol GC i aceast metod este laborioas i costisitoare, dei nu la fel de acurat ca HPLC.

denaturarea termic - n prezent cea mai folosit variant tehnic pentru estimarea procentului molar de guanin + citozin dintr-o prob de ADN. In aceast tehnic, moleculele de ADN sunt nclzite ntre 20 i 100 oC, timp n care este msurat spectrofotometric variaia absorbanei la lungimea de und = 260 nm (A260). Datorit creterii temperaturii, are loc denaturarea termic a moleculelor ADN. Procesul const n ruperea legturilor de hidrogen dintre cele dou catene i, deci, ADN trece din form dublucatenar n form monocatenar. In timpul denaturrii termice, valoarea A260 crete cu pn la 40%, proces denumit shift hipercromic. Temperatura la care jumtate din cantitatea de ADN se afl deja sub form monocatenar este denumit temperatur de topire Tm i este corelat linear cu procentul molar de guanin + citozin din prob. De-a lungul anilor, au fost elaborate mai multe ecuaii de corelaie ntre aceti doi parametri - %mol GC i Tm funcie de ncrctura ionic a tamponului n care a fost dizolvat ADN (n mod special, funcie de concentraia ionilor Na+), precum i funcie de tipul de microorganism. Astfel, pentru bacterii au fost elaborate dou ecuaii de corelaie: (1) %mol GC = 2.44 x Tm 169 (Franck, 1971) util cnd ADN este dizolvat n 0.1X SSC (NaCl 15 mM, citrat trisodic 1.5 mM), deci la o concentraie mai mare a ionilor Na+. (2) %mol GC = 2.44 x Tm 131.5 (Diaz, 1989) util cnd ADN este dizolvat n tampon TE pH 8.0 (Tris 10 mM EDTA 1mM), deci la concentraie mic a ionilor Na+ Owen (1985) a elaborat o alt ecuaie de corelaie: (3) %mol GC = 2.08 x Tm 106.4 util n mod special pentru ADN din drojdii.

Din curbele de shift hipercromic se calculeaz valorile temperaturii de topire Tm, folosindu-se acelai program SWIFT-Tm v1.05. Indiferent de formula aplicat, este necesar folosirea unui ADN de referin, de cele mai multe ori ADN cromozomal de Escherichia coli, care are mol% GC = 51 (Figurile 7.1, 7.2). Literatura de specialitate (Starr, 1981; Krieg, 1984; Holt, 1994) listeaz n tabelele de identificare, alturi de criteriile morfo-fiziologice i biochimice, i compoziia n baze azotate, exprimat ca procent molar de G + C. Dei valoarea taxonomic a acestui parametru molecular este indiscutabil inferioar secvenei de nucleotide a genelor pentru ARNr (i, la bacterii, n mod special 16S ARNr), %mol GC este n prezent acceptat ca parametru cvasiuniversal de taxonomie molecular.

Subliniem valoarea taxonomic a acestui parametru de nivel molecular, n contextul unor abordri de tip polifazic n taxonomia bacterian. Mai mult dect att, determinrile de procent molar G+C au contribuit substanial i la studiile de filogenetic. Astfel, s-a confirmat i pe aceast cale c bacteriile Gram-negative sunt distincte filogenetic de cele Gram-pozitive. Totodat, s-a demonstrat c bacteriile Grampozitive formeaz o linie filetic care se divide n dou ramuri ce pot fi distinse una de cealalt pe baza compoziiei n G+C : (a) linia actinomicete bacterii corineforme, ce se caracterizeaz printr-un %mol GC de mai mare de 55% ; (b) linia Bacillus Clostridium Streptococcus, cu un %mol GC mai mic de 55%. Totodat, s-a constatat c o serie de taxoni asociai anterior cu actinomicetele, de fapt, fac parte din cea de-a doua linie filetic : Eubacterium este nrudit cu Clostridium, Kurthia este nrudit cu bacteriile lactice, iar Thermoactinomyces cu familia Bacillaceae.

Figura 7.1. Curba de denaturare termic a ADN cromozomal din E. coli B. (Tm = 74.9 %molGC = 51.27)

2. Omologia de secven ADN

Una din proprietile fizice deosebite ale acizilor nucleici este capacitatea monocatenelor de a reasocia prin reformarea legturilor de hidrogen, pe baz de complementaritate ntre bazele azotate. Hibridizarea acizilor nucleici reprezint, deci,

procesul prin care dou monocatene ADN sau ARN din surse biologice diferite, reformeaz configuraia dublu-catenar. Din punct de vedere chimic, procesul se bazeaz pe: - principiul complementaritii dintre cele dou catene ale unui duplex ADN sau ARN; - eventuala omologie de secven dintre cele dou surse ADN. n principal, exist dou modaliti de determinare a omologiei de secven ADN: (a) determinri n soluie, cu ADN liber; (b)determinri pe suport solid pe care sunt imoblizate moleculele de ADN.

Figura 7.2. Curba de denaturare termic a ADN cromozomal din P.aeruginosa ATCC 27853 (Tm = 81.6 %molGC = 67.6).

Determinri n soluie, cu ADN liber Asemenea determinri se pot realiza n mai multe variante tehnice: 1. determinri n soluie, cu ADN de referin marcat - se folosesc molecule de ADN dintr-o tulpin de referin (ADN de referin), digerate n fragmente de dimensiuni mici (oligonucleotide), monocatenare i marcate cu 14C (Figura 7.3) i, respectiv, molecule ADN din tulpina de analizat (ADN prob), tot sub form monocatenar, dar nemarcate (ADN-ul prob se introduce ntr-o concentraie mult mai mare fa de cel de referin) ;

- dup amestecarea celor dou tipuri de monocatene, hibrizii dublucatenari pot fi separai de cele dou tipuri de monocatene, fie prin cromatografie pe hidroxiapatit (doar moleculele de ADN d.c. se vor lega de hidroxiapatit), fie prin digestie cu nucleaz SI (acest tip de enzim diger doar monocatenele) ; - n final, se efectueaz o determinare a concentraiei de 14C cu ajutorul unui contor de tip Geiger-Muller. 2. determinri n soluie, cu ADN nemarcat Determinrile de reasociere ADN :ADN, n soluie, nu necesit n mod obligatoriu, molecule de ADN marcat. n general, procesul de reasociere a unor molecule monocatenare de ADN este nsoit de o reducere a absorbanei la = 260 nm (A260). Ratele iniiale de reasociere a unui amestec echimolar de molecule ADN din dou surse biologice diferite (dintre care una este lcunoscut din punct de vedere taxonomic) se compar cu ratele iniiale ale reaciilor omoloage. Este evident faptul c moleculele din amestec vor reasocia mai ncet dect n cazul reaciilor omoloage. Exist deja formule de corelare pentru estimarea omologiei de secven ADN. Acest tip de tehnic prezint o serie de avantaje : este foarte rapid, nu necesit ADN marcat, poate realiza comparaii ntre diverse perechi de microorganisme (nu neaprat ntre o tulpin necunoscut i una de referin) i este suficient de acurat.

Figura 7.3. Reprezentarea schematizata a hibridizarii ADN: ADN in solutie

Determinri pe suport solid i n acest caz exist dou variante tehnice : 1. reasociere direct ( direct binding ) 2. reasociere competitiva

n cazul reasocierii directe, pe suportul solid se fixeaz ADN prob monocatenar (denaturat) nemarcat (Figura 7.4). Peste acesta se adaug o soluie ce conine ADN de referin monocatenar marcat cu 14C. Dup realizarea etapei de hibridizare (urmat apoi de cea de splare), gradul de radioactivitate al filtrelor se citete ntr-un contor de tip Geiger-Muller, un numr ridicat de impulsuri semnificnd un grad ridicat de omologie de secven ntre ADN prob i ADN de referin utilizat.

Figura 7.4. Reprezentarea schematizata a hibridizarii ADN : ADN prin legare directa (pe suport solid)

n reasocierea competitiv (Figura 7.5) se folosesc 3 tipuri de molecule de ADN : - ADN de referin m.c. marcat, de lungime mic ; - ADN de referin m.c. nemarcat, de lungime mare ; - ADN prob m.c., nemarcat, de lungime mare. Pe filtru se fixeaz ADN de referin mare ; peste acesta se adaug celelalte dou tipuri de ADN, care vor intra n competiie unul cu cellalt pentru a hibridiza cu ADN-ul fixat. Dup hibridizare i splare, filtrele se citesc n contor Geiger-Muller. De data aceasta, corelaia este invers proporional : un numr mare de impulsuri semnific un grad sczut de omologie, n timp ce un numr mic de impulsuri semnific un grad ridicat de omologie ntre ADN prob i ADN de referin.

Figura 7.5. Reprezentare schematizata a hibridizarii ADN : ADN de tip competitiv

Pentru a obine rezulate repreductibile, este necesar ca toate determinrile experimentale de reasociere ADN:ADN s fie standardizate. n principal, exist 5 factori ce afecteaz aceste determinri: (1)lungimea fragmentelor de ADN prob Cu ct aceste fragmente sunt mai mari, cu att rata de reasociere este mai mare (fragmentele foarte mici de aproximativ 15 nucleotide lungime - nu pot participa eficient n procesele de renaturare); totui, cu ct crete vscozitatea soluiei, cu att scade rata renaturrii; n final se ajunge la un compromis tehnic: fragmentele sunt micorate (fie prin sonicare, fie cu ajutorul unei prese franceze) pentru a avea o greutate molecular uniform, de aproximativ 1 5 x 105 dal. (2) rata renaturrii crete proporional cu tria ionic a tamponului de incubare Prezena srurilor este esenial n procesele de renaturare a moleculelor de ADN. Astfel, n absena srurilor ADN-ul nu va renatura datorit repulsiei dintre sarcinile negative ale gruprilor fosfat. Pe de alt parte, duplexurile de acizi nucleici formate la trii ionice nalte au specificitate mai redus. Ca urmare, se folosesc tampoane de ractie standard, bazate de regul pe SSC (NaCl 0.15M citrat trisodic 0.015M pH 7.0). Ionii de Na + acoper gruprile fosfat, iar citratul reprezint un agent chelator pentru cationii bivaleni, inhibnd astfel activitatea nucleazelor. (3)puritatea preparatelor ADN

n procesele de renaturare ADN este extrem de important puritatea probei. Astfel, prezena moleculelor de ARN, de carbohidrai, interfer cu reasocierea ADN:ADN. Pe de alt parte, moleculele de ADN trebuie s fie complet denaturate (monocatenare), ceea ce este realizat de obicei prin fierbere i rcire rapid pe ghea. (4)concentraia ADN i timpul de incubare Formarea duplexului este o funcie doi parametri (Cot): concentraia iniial a moleculelor de ADN (Co) i timpul de incubare (t). Schimbarea concentraiei substratului n timp este proporional cu ptratul concentraiei: dc/dt = k x c2. Forma integral a ecuaiei este: C / Co = 1 / (1 + k x Cot) C / Co = raportul ntre concentraia ADN m.c. la timpul t i concentraia iniial (Co) a ADN m.c. la timpul to. Ca urmare, C / Co este o funcie ce exprim procentul de reasociere a ADN m.c. Valoarea Cot1/2 reflect mrimea sau complexitatea genomului i este atins mai rapid n cazul genomurilor mai mici. (5) temperatura de incubare a amestecului n general, rata optim de renaturare este la 25 oC sub Tm (melting temperature = temperatura de topire) a amestecului. La temperaturi mai mici de [T m 25oC] prin reasociere ntre secvene neomoloage se formeaz hibrzi nespecifici. La temperaturi mai mari de [Tm 25oC] procesul de renaturare este stringent, iar rata reaciei scade foarte mult. n general, dac se examineaz bacterii nrudite, este recomandabil s se lucreze la temperaturi de aproximativ [Tm 10-15oC]. Valoarea taxonomic a studiilor de reasociere ADN:ADN Studiile de reasociere ADN:ADN sunt recomandate pentru evaluarea relaiilor fenetice, din mai multe motive: (1) Compoziia ADN a unei celule este constant indiferent de condiiile de cretere (i deci, de stadiul fiziologic). Din acest motiv clasificrile bazate pe reasociere ADN sunt mai stabile. (2) Estimarea nrudirii dintre organisme se bazeaz pe genotipul ntreg. De regul, comparaiile fenetice se fac analiznd o mic partea genotipului (5 20%). n cazul reasocierii ADN, se utilizeaz ntreg genomul i, ca atare, informaiile au o mai mare valoare. Pe de alt parte, reasocierea ADN i fenetica numeric dau rezultate (clasificri) similare. (3) Analizele de reasociere ADN pot fi realzate cu o finee mai mare, estimnd stabilitile termice ale duplexelor reasociate. Datorit secvenelor mperecheate greit sau nemperecheate, moleculele ADN hibride rezultate n urma unui proces de reasociere au, n general, o valoare Tm mai mic dect valoarea Tm a duplexurilor parentale. Experimentele realizate au dus la concluzia c fiecare scdere a Tm cu cte 0.7 oC reprezint 1% baze mperecheate greit. Msurnd reducerea Tm (Tm) putem estima gradul de divergen a celor dou secvene. De exemplu, hibridul Escherichia coli : Serratia marcescens are Tm = 13 14oC

(fa de parentali), valoare ce corespunde la aproximativ 20% divergene de secven n moleculele hibridului. Hibridul E.coli : Shigella dysentariae are Tm = 1 6oC (fa de parentali), valoare ce corespunde la aproximativ 4% divergene de secven n moleculele hibridului. Dac Escherichia coli reprezint ancestorul comun, atunci probabil c Serratia marcescens s-a desprins mai devreme dect Shigella dysentariae. (4) Omologia ADN ofer un concept unificator al speciei bacteriene. De regul, o specie bacterian reprezint un grup de tulpini ce au foarte multe trsturi comune, tulpini care, la rndul lor, difer de alte grupuri de tulpini. Aceast definiie este extrem de subiectiv, datorit faptului c multe specii bacteriene sunt foarte heterogene. Aparent, organismele din cadrul speciilor bacteriene deja definite ar trebui s prezinte o nalt omologie a moleculelor de ADN; i invers, organismele din specii diferite ar trebui s aib omologie slab. n urma experimentelor i a dezbaterilor, s-a stabilit ca limita inferioar a omologiei ADN din cadrul speciei bacteriene s fie de 70%, n condiii optime de hibridizare ADN. Ca urmare, organismele din cadrul unei specii ar trebui s aib cel puin 70% nrudire ADN i cel mult 5% divergen de secvene ADN, ambele msurate prin Tm. Aceasta reprezint, n final, o definiie universal a speciei genomice procariote. (5) Aplicarea unor tehnici cu sonde ADN reprezint o extensie a experimentelor de reasociere ADN; n acest caz, detectarea i identificarea bacteriilor se realizeaz mult mai rapid i specific. Exist foarte multe exemple n care studiile de reasociere ADN au modificat sistematica bacterian. Cea mai cunoscut situaie o reprezint specia Bacillus sphaericus. n cadrul acestei specii, unele tulpini sunt patogene pentru larvele de nari, ceea ce a permis elaborarea unor strategii de control biologic al numrului de nari. Aceast specie bacterian este diferit de ali bacili prin faptul c poate diferenia endospori sferici (n timp ce la ceilali bacili, endosporii sunt ovali). Au un metabolism strict oxidativ, prefernd ca surs de carbon i energie, acetatul i ali acizi organici. n mod tradiional, toate bacteriile ce formeaz endospori sferici erau ncadrate n Bacillus sphaericus. Studiile de reasociere ADN au demonstrat existena a cel puin 5 grupe de omologie, deci 5 specii genomice, dintre care cele mai importante sunt: Grupa I Bacillus sphaericus sensu stricto Grupa II - include toate tulpinile patogene pe nari Pe de alt parte, tehnicile de reasociere ADN au i limitri. Astfel, se recomand comparaii cu tulpini test din taxonul studiat, n caz contrar putnd aprea erori de interpretare. Totodat, se mai recomand folosirea metodelor de reasociere ADN n combinaie cu o alt tehnic, de exemplu cu taxonomia numeric tradiional.

VII.6. Analiza unor gene cromozomale

Cronometre moleculare n 1965, Zuckerkandl i Pauling (Zuckerkandl, 1965) au publicat articolul devenit clasic n care lansau conceptul de cronometru molecular. Ipoteza existenei unor cronometre moleculare ale evoluiei s-a bazat pe opbservaia c numrul de aminoacizi schimbai ntr-o anumit protein pare s fie proporional cu timpul scurs de la separarea celor dou organisme comparate. Astfel, o molecul a crei secven se schimb randomizat n timp poate fi considerat un cronometru molecular al evoluiei. Cantitatea de secven schimbat pe care o acumuleaz o asemenea molecul (aceast cantitate fiind formal denumit distan) este egal cu produsul dintre rata de fixare a mutaiilor i timpul n care a avut loc schimbarea (Ayala, 1997). Este ns de menionat faptul c nu avem la dispoziie ancestorii i, ca atare, aceast distan o msurm ntre reprezentanii biologici actuali.

n urma analizelor realizate s-a constatat c nu toate moleculele au valoare egal n determinarea relaiilor filogenetice ntre specii biologice. Pentru a fi un cronometru folositor, o molecul trebuie s ndeplineasc urmtoarele caractere: (a) s aib comportament de ceas molecular, adic schimbarea n secvena sa s aib loc ct mai randomizat posibil; (b) s aib un range ct mai mare: ratele schimbrii s acopere distane evoluionare suficient de mari; (c) s aib o dimensiune suficient de mare.
Comportamentul de ceas molecular

S-ar putea crede c cel mai bun cronometru ar fi un segment genetic asupra cruia nu acioneaz presiunea seleciei naturale. Ca atare, schimbrile ntr-o asemenea molecul ar avea loc complet randomizat de-a lungul segmentului i toate mutaiile ar fi fixate n molecul, transmindu-se la descendeni. Totui, asemenea molecule nu prezint nici o valoare pentru msurtorile filogenetice, pentru c ele se schimb att de rapid, nct acoper doar range-uri filogenetice foarte restrnse i pot msura doar evenimente evolutive pe termen scurt. Cel mai cunoscut exemplu este reprezentat de nucleotidele din poziia a treia a codonilor n diverse gene structurale (datorit degenerrii codului genetic aceste nucleotide se pot schimba fr s afecteze secvena de nucleotide a proteinei codificate). Moleculele cu un bun comportament de ceas molecular sunt cele cu funcii foarte conservate, deci supuse unei puternice presiuni selective. Asemenea molecule au o rat de schimbare att de sczut nct pot acoperi un spectru evolutiv foarte mare. Aceast caracteriastic prezint ns i dezavantajul c poate mri n mod artificial distanele filogenetice dintre dou specii. Cel mai cunoscut exemplu este gena ce codific citocromul c.
Range-ul filogenetic

Trebuie luat n considerare faptul c timpul n care bacteriile au existat i, respectiv, evoluat, este mult mai mare dect timpul n care au evoluat organismele eucariote. Acest lucru este amplificat i de faptul c, n general, timpul n care are loc evoluia biologic se numr n numr de generaii i nu n numr de ani; ori, se tie c procariotele au un timp de generaie foarte mic i, ca atare, au avut la dispoziie un numr imens de generaii. Ca urmare, range-ul cronometrelor folositoare pentru msurarea relaiilor filogenetice dintre bacterii trebuie s fie mult mai mare dect cel al cronometrelor utilizate la organisme metazoare. Astfel, citocromul c poate oferi o rezoluie filogenetic suficient de bun pentru o serie de eucariote. Pentru bacterii ns, aceast molecul are un range restrns la nivel de subdiviziune: poate ordona filogenetic bacteriile din subdiviziunea -proteobacterii, dar nu le poate lega pe acestea de alt subdiviziune a proteobacteriilor.
Dimensiunea

n afar de necesitatea unei dimensiuni destul de mari, mai important este ca moecula s fie alctuit dintr-un mare numr de domenii sau uniti funcionale; acestea ar putea fi reprezentate de regiuni relativ independente una de cealalt din punct de vedere evolutiv, astfel nct eventuale schimbri ne-randomizate ntr-una din uniti s nu afecteze celalalte uniti.

Analize pe ARNr In ultimii zece ani, dezvoltarea progresiv a tehnicilor de analiz molecular i, n mod special, a tehnicilor de amplificare in vitro a unor secvene de acizi nucleici (PCR = Polymerase Chain Reaction), precum i a tehnicilor de determinare a secvenelor de nucleotide, a condus la acumularea unor informaii importante privind caracteristicile moleculare ale genomurilor unor extrem de diverse organisme. S-a ajuns astfel la concluzia c, dintre toate moleculele existente n sistemele vii, speciile de ARN ribozomal constituie cele mai bune cronometre moleculare. Ele sunt prezente la toate organismele i, ca urmare, pe baza analizelor acestor molecule, pot fi realizate comparaii ntre foarte diverse organisme. Pe de alt parte, moleculele de ARN ribozomal prezint, n scar evolutiv, un grad foarte ridicat de constan funcional, fapt ce le asigur un bun comportament de ceas molecular. Mai mult dect att, analizele moleculare au relevat faptul c moleculele de ARN ribozomal sunt alctuite din domenii, grupate n 3 clase de variabilitate genetic: domenii relativ constante secvena lor de nucleotide variaz foarte puin, acoperind un range filogenetic foarte mare ; domenii cu variabilitate moderat - acoper distane filogenetice mai restrnse, putnd distinge ntre genuri biologice; domenii hipervariabile secvena lor variaz suficient de mult pentru a putea diferenia chiar specii ale aceluiai gen sau tulpini bacteriene conspecifice. Analiza extensiv a moleculelor de ARN ribozomal de la foarte multe specii biologice a determinat acumularea unei impresionante cantiti de informaii, fapt ce a condus la elaborarea unui alt model de evoluie filogenetic a vieii pe Terra. Conform acestui model (Woese, 1990), organismele au fost clasificate n 3 mari domenii: Bacteria, Archaea i Eukarya (Figura 7.6).

Figura 7.6. Arbore filogenetic universal construit prin analize comparative de secvene ARNr (dup Woese, 2000)

Dei analiza ARN-urilor ribozomale este util i n studii pe organisme de nivel eucariot superior, aceste molecule devin aproape indispensabile n cercetrile pe microorganisme. La Bacteria exist 3 categorii principale de molecule de ARN ribozomal: 5S ARNr are 115 120 nucleotide i este considerat o molecul prea mic (incorporeaz prea puin informaie) pentru a putea fi un bun indicator de nrudire filogenetic; 16S ARNr (Figura 7.7) n medie are 1500 nucleotide i este alctuit din 3 domenii majore i din 50 de helixuri. Aceast molecul este considerat cea mai bun pentru estimarea gradului de nrudire filogenetic dintre dou tulpini bacteriene; 23S ARNr are o dimensiune mai mare (aproximativ 2500-3000 nucleotide), fiind mai dificil de manipulat. In concluzie, se poate aprecia c, dintre cele 3 categorii de ARNr de la Bacteria, molecula de 16S ARNr este suficient de mare pentru a oferi informaii utile i, n acelai timp, suficient de mic pentru a putea fi manipulat relativ uor ( Giovannoni, 1991 ; Lane, 1991 ; Stackebrandt, 1994 ; Palleroni, 1997). O lung perioad de timp, analiza moleculei 16S ARNr reprezenta chiar o provocare din punct de vedere tehnic, necesitnd purificarea i concentrarea moleculelor ARN. Dezvoltarea tehnicilor de tip PCR a simplificat foarte mult aceste studii, permind n prezent, obinerea relativ rapid, a unor cantiti suficient de mari din gena pentru 16S ARNr (16S ADNr) (Tabelul 7.2). Mai mult dect att, folosind diverse perechi de primeri se pot obine, fie gena n totalitatea ei, fie anumite fragmente (n acest caz, se analizeaz de obicei, regiunile cu structur hipervariabil) (Embley, 1994; Hugenholtz, 1996).

Figura 7.7. Structura moleculei de 16S ARNr de la Escherichia coli (dup Lane, 1991).

Tabelul 7.2 Secvene de nucleotide din gena pentru 16S ARNr ce pot fi utilizate ca primeri n tehnici PCR sau de secveniere (dup Lane, 1991)

SECVENA

COMENTARII

27f* 342r** 357r 519r 530f 907r 926f 1100r 1114f 1392r 1406f 1492r 1525r

5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 5- CTGCTGCGCCCCGTAG 5- CTCCTACGGGAGGCAGCAG 5- GAATTACCGCGGCGGCTG 5- GTGCCAGCCGCCGCGG 5- CCGTCAATTCCTTTAAGTTT 5- AAACTCAAAGGAATTGACGG 5- GGGTTGCGCTCGTTG 5- GCAACGAGCGCAACCC 5- ACGGGCGGTGTGTAC 5- TGCACACACCTCCCGT 5- TACGGCTACCTTGTTACGACTT 5- AAGGAGGTGATCCAACC
* f = forward (direcia de sintez a catenei noi) ** r = reverse

PCR i secveniere, majoritatea eubacteriilor majoritatea eubacteriilor majoritatea eubacteriilor majoritatea eubacteriilor, eucariotelor, arhebacteriilor majoritatea eubacteriilor, eucariotelor, arhebacteriilor majoritatea eubacteriilor, eucariotelor, arhebacteriilor majoritatea eubacteriilor, eucariotelor, arhebacteriilor majoritatea eubacteriilor majoritatea eubacteriilor majoritatea eubacteriilor, eucariotelor, arhebacteriilor majoritatea eubacteriilor, eucariotelor, arhebacteriilor PCR i secveniere, majoritatea eubacteriilor, arhebacteriilor PCR i secveniere, majoritatea eubacteriilor, arhebacteriilor

Odat amplificat gena de 16S ARNr, ea poate fi investigat n diverse moduri: fie prin secveniere (direct, sau clonat n prealabil ntr-un vector adecvat), fie prin digestie cu endonucleaze de restricie (Figura 7.11), tehnic denumit ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) (Vanneechoutte, 1995). n ultimii ani, secvenierea moleculelor de ARNr 16S este abordat n din ce n ce mai multe laboratoare. Pe de alt parte, dezvolaterea de programe de calculator a permis construcia unor baze de date (GenBank, EMBL-Bank) ce conin n prezent secvena de nucleotide a peste 20.000 de molecule ARNr 16S (Wuyts, 2002) (Figurile 7.8, 7.9, 7.10).

Figura 7.8. Secventa de nucleotide si structura secundara a moleculei ARNr 16S de la Escherichia coli, ca reprezentant al Domeniului Bacteria

Figura 7.9. Secventa de nucleotide si structura secundara a moleculei ARNr 16S de la Haloarcula marismortui, ca reprezentant al Domeniului Archaea

Figura 7.10. Secventa de nucleotide si structura secundara a moleculei ARNr 16S de la Saccharomyces cerevisiae, ca reprezentant al Domeniului Eukarya

Analizele de tip ARDRA realizate n ultimii ani la diverse microorganisme, au relevat faptul c informaiile obinute cu ajutorul acestei tehnici au valoare taxonomic, de multe ori cu o rezoluie taxonomic egal cu cea a tehnicilor de secveniere ( de Baere, 2002; Amann, 1995;; Vaneechoutte, 1995 i 1999; Snaidr, 1997; Widmer, 1998; Dunbar, 1999; Mahenthiralingam, 2000; Ross, 2000). Mai mult dect att, Moyer (1996), ntr-un studiu extensiv de restricie enzimatic (cu 10 endonucleaze de restricie) simulat pe calculator, pe secvene 16S ADNr aparinnd la 106 taxoni din ntregul domeniu Bacteria, avanseaz urmtoarele recomandri pentru analizele ARDRA: folosirea pentru stabilirea pattern-urilor ARDRA pe ct posibil, a ct mai multor endonucleaze de restricie; utilizarea a cel puin 3 endonucleaze de restricie diferite, n reacii de digestie separat a ampliconilor 16S ADNr, astfel: - utilizarea Rsa I (5-GTAC-3), pentru diferenierea genurilor i speciilor bacteriene; - utilizarea Hae III (5-GGCC-3), i Hinf I (5-GANTC-3) pentru diferenierea tulpinilor conspecifice In final, Moyer (1996) introduce conceptul de OTU ( Operational Taxonomic Units = Uniti Taxonomice Operaionale) ca grup de microorganisme cu pattern ARDRA identic, recomandnd stabilirea unui OTU cu cel puin 3 enzime de restricie.

g e n a p e n tru A R N r 16S P C R c u p rim e ri u n iv e r s a li n x a m p lic o n u l g e n e i 16 S A D N r c lo n a re in v e c to ri s e c v e n tie re d ire c ta p G E M -T re c o m b in a n t 16S A D N r d ig e s tie c u d iv e r s e e n d o n u c le a z e d e re s tric tie p a tte r n A R D R A 1 iz o la re a 16S A D N r s e c v e n tie re 2 3

Figura 7.11. Posibiliti de investigare a genei pentru 16S ARNr

Pentru amplificarea ntregii genei de ARNr 16S de la majoritatea tulpinilor din Bacteria se folosete perechea de primeri : 8f 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 1492r 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 Aceste secvene sunt complementare cu dou regiuni cvasi-universale ale moleculei de 16S ADNr, plasate aproape de marginile genei ( Heyndrickx, 1995; Snaidr, 1997; Moesender, 1999). Astfel, prin utilizarea acestor doi primeri se poate amplifica aproape ntreaga gen 16S ADNr (aproximativ 1484 bp) din orice reprezentant al domeniului Bacteria. In urmtoarea etap a tehnicii ARDRA, ampliconii sunt digerai (n reacii separate) cu endonucleaze de restricie, iar fragmentele se separ prin electroforez n gel de agaroz 2% ( Figurile 7.11, 7.12, 7.13).

Figura 7.11. ARDRA cu CfoI la micobacterii (de Baere, 2002)

Figura 7.12. ARDRA cu MboI la micobacterii (de Baere, 2002)

Figura 7.13. ARDRA cu RsaI la micobacterii (de Baere, 2002)

In ultimii ani, tehnicile bazate pe PCR fingerprinting (n mod special ARDRA) s-au dovedit din ce n ce mai utile, mai ales n caracterizarea structurii comunitilor bacteriene (Vaneechoutte, 1995; Snaidr, 1997; Dunbar, 1999; Fernandez, 1999; Mahenthiralingam, 2000; Ross, 2000). In esen, tehnica ARDRA prezint urmtoarele avantaje: permite analize moleculare i pe microorganisme greu cultivabile; abordeaz variaii ale secvenei de nucleotide din gena pentru 16S ARNr n prezent considerat gena ce poate oferi informaii de taxonomie i filogenie molecular de nalt acuratee; subliniem faptul c studiile pe ntreaga gen 16S ADNr (amplificat cu perechi de primeri universali) diminueaz semnificativ riscul de a nu evidenia o serie de microorganisme greu cultivabile (Snaidr, 1997) ; nu necesit secvenierea ampliconilor 16S ADNr, ci utilizeaz variante tehnice mai puin laborioase : digestie cu endonucleaze de restricie ; funcie de combinaia de endonucleaze de restricie utilizate, tehnica ARDRA poate distinge ntre genuri bacteriene, specii congenerice, sau chiar tulpini conspecifice ; mai mult dect att, n cercetri comparative (Moyer, 1996 ; Vaneechoutte, 1999), s-a constatat c ARDRA se nscrie ntre tehnicile cu putere discriminatorie (de tipare a tulpinilor bacteriene) dintre cele mai ridicate (95.8), alturi de tehnica RFLP pe ADN genomic.

Hae III

M1

Hinf I

M2

Rsa I__

Figura 7.14. Pattern-uri ARDRA evideniate prin electroforez n gel de agaroz 2% Godeuri: 1, 4, 7 P.aeruginosa ATCC 27853 digerat cu Hae III, Hinf I i, respectiv, Rsa I; 2, 5, 8 P.aeruginosa GMQ-1 digerat cu Hae III, Hinf I i, respectiv, Rsa I; 3 -ADN/Eco RI, Hind III (M1); 6 -ADN/Bst EII (M2).

Indiferent de modalitile prin care este studiat, gena pentru ARNr 16S a oferit foarte multe informaii : (1) o imagine logic a clasificrii procariotelor, indicnd i relaiile ce n-au putut fi stabilite pe baze fenotipice ; (2) concepte unificatoare asupra taxonilor de gen i superiori ; (3) estimarea posibilelor ci de evoluie pentru toate organismele.

VII.7. Variabilitatea genetic intraspecific la bacterii

Variabilitatea genetic reprezint o cerin a evoluiei biologice. Sursele generale ale variabilitii genetice sunt reprezentate de mutaie genetic, recombinare genetic, achiziie genetic i selecie. Mutaia genic este definit n prezent ca fiind orice schimbare n secvena de nucleotide. Astfel, mutaie poate fi schimbarea unei singure perechi de nucleotide (mutaie punctiform), rearanjarea unor secvene n cadrul unui acelai cromozom (rearanjamente cromozomale), conversii genice, duplicaii. Unii cercettori consider c recombinarea i achiziia genetic (achiziii de secvene ADN prin procese de transfer de gene pe orizontal) reprezint evenimente ce au ca efect tot o schimbare n secvena de nucleotide, deci mutaie. Indiferent de definire, este cert faptul c toate aceste procese genereaz variabilitate genetic. Asemenea evenimente de transfer de material genetic sunt suficient de dese n interiorul anumitor genuri bacteriene, astfel nct se poate vorbi de un adevrat flux de material genetic pe orizontal, ce favorizeaz

microdiversitatea pn la nivel de speciaie. De exemplu, tulpinile ne-toxigene de Bacteroides fragilis par s fi evoluat prin transfer genetic orizontal din organisme foarte diferite. Rate variabile de mutaie Experimentele clasice de genetic bacterian au concluzionat c mutaiile bacteriene sunt neutre, i nu direcionate de presiunea selectiv. Ele au o distribuie randomizat pe loci genetici, deci toate genele sunt egale ca probabilitate de mutaie. Ulterior, o serie de experimente (Cairns, 1988) au evideniat faptul c n condiii de stress fiziologic, genele ce sunt utile celulelor pentru a iei din starea de stress, sufer mutaii cu rate neobinuit de mari. S-a constatat astfel c la E.coli exist dou tipuri de mutaii : (a) mutaii spontane au distribuie randomizat pe loci genetici i nu apar ca rspuns la o serie de condiii de mediu; (b) mutaii direcionate (mutaii de tip Cairns) au loc cu o rat mai mare cnd ofer un avantaj celulei n anumite condiii de mediu. Pentru a explica frecvena mai mare a mutaiilor cairnsiene au fost propuse maii multe mecanisme posibile : (1) n celulele nfometate s-ar acumula diverse specii moleculare de ARNm, iar unele (i anume, cele care ar restaura capacitatea celulei de a supravieui) din acestea ar putea servi ca matri ntr-un proces de revers-transcriere; (2) Oprirea transcrierii (transcriere incomplet) Anumite condiii de mediu induc exprimarea anumitor gene; n unele situaii, transcrierea nu se poate realiza complet, tot din cauza acelorai condiii de mediu. Oprirea transcrierii poate determina ca ADN-ul din genele resoective s rmn ntr-o stare parial desfcut (despiralat), fiind astfel mai vulnerabil la evenimente mutaionale; (3) Fixarea unor mutaii temporare, tranzitorii Printr-un asemenea mecanism, mutaiile s-ar petrece cu aceeai frecven n toi locii genetici ai unor celule bacteriene supuse unui stress fiziologic; aceste mutaii sunt ns temporare. Pentru persistena lor n descenden (i nregistrarea lor ca atare de ctre experimentator) este necesar fixarea lor n cromozomul bacterian, proces ce are la baz replicarea ADN. Ori, replicarea ADN, ca i diviziunea celular, este terminat numai n celulele care au fixat mutaiile temporare avantajoase. Hall (1994) a emis ipoteza unui alt model care s explice apariia cu o frecven mrit a mutaiilor avantajoase. Hall a examinat apariia de mutaii punctiforme de reversie de tip trp+ din auxotrofi trp, n condiii de deprivare de triptofan. Modelul lui Hall presupune c, ntr-o asemenea populaie bacterian trp, un mic procent din populaie intr ntr-o stare hipervariabil, prezentnd o frecven mare a mutaiilor. ntr-o asemenea stare, unele din aceste celule vor acumula mutaii neutre sau letale i, ca atare, nu vor supravieui. Alte celule vor acumula mutaii utile i vor supravieui. Acestea din urm sunt, de fapt, celulele care vor fi identificate ca prezente. n modelul lui Hall, starea hipervariabil ar determina creterea frecvenei mutaiilor n toate genele. Ca urmare, supravieuitorii trp+ ar prezenta mutaii multiple i n alte gene n afar de operonul TRP. (4) Existena unor gene mutator n prezent se consider c genele cu efect mutator sunt reprezentate de un set de gene implicate n procesele de reparare ADN. Cele mai cunoscute sunt dou gene de la E.coli, mutT i mutY, care afecteat frecvena transversiilor. Astfel, mutantele mutT au frecven crescut a transversiilor AT CG, iar mutantele mutY au frecven crescut a transversiilor GC TA. Echilibrul dintre aceste dou forme va afecta compoziia final a ADN.

Variabilitatea genetic intraspecific difer de la o specie bacterian la alta : (a) Specii bacteriene cu variabilitate genetic intraspecific (VGI) mic genul Mycobacterium; s-a constatat c tulpini de Mycobacterium leprae izolate din zone geografice foarte ndeprtate (India, Africa, America de Nord) prezint genomuri aporape identice; lund n consideraie procentul de situsuri de restricie conservate, a fost estimat gradul de divergen de secven nucleotidic dintre aceste tulpini la 0.02 0.026%. Acelai tip de experimente a fost realizat i pe tulpini de E.coli, constatndu-se c divergena de secvene nucleotifdice variaz n limite mai largi: ntre 0.8% i 6.6%. - genul Rickettsia; tulpinile izolate de Rickettsia belli au un grad de divergen nucleotidic de zece ori mai mic dect cel ntlnit la tulpinile de E.coli. (b) Specii bacteriene cu variabilitatea genetic intraspecific mare Cele mai cunoscute asemenea specii aparin genurilor Streptomyces i Rhizobium. Aceste bacterii prezint multe plasmide cu structur variabil, secvene de inserie, precum i secvene repetitive. Toate aceste elemente genetice pot reprezenta vectori naturali pentru transferul de ADN la nivel intraspecific, crescnd astfel variabilitatea genetic. Pe de alt parte, bacteriile din genul Streptomyces prezint frecevnt n cromozom i fenomene de amplificare genic: secvene cuprinse ntre 5 i 24 kb se gsesc amplificate ntr-un numr de copii i pot ajunge s reprezinte ntre o treime i dou treimi din cromozom, i pot fi nsoite i de deleii de sute de kb. (c) Majoritatea eubacteriilor se situeaz ntre cele dou extreme, adic au o variabilitate genetic intraspecific medie n concluzie, se constat c cromozomul bacterian prezint o stabilitate de baz, pe care se grefeaz o serie de evenimente dinamice, recombinatorii i mutaionale. Se poate considera c cromozomul ca ntreg, ar fi un cadru n interiorul cruia segmente individuale ar putea avea asenden filogenetic diferit. -