Sunteți pe pagina 1din 28

Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj-Napoca

Facultatea de Medicină Veterinară

Disciplina: Zoonoze transmise prin alimente de origine animală

Metode biotehnologice de diagnostic al


protozoarelor parazitare

Masterandă: Ficuţ Ioana Maria

An I: Controlul şi Expertiza Produselor de Origine Animală


Cuprins:

1. Rolul biologiei moleculare în parazitologia veterinară.......................... 3

2. Toxoplasmoza ............................................................................................ 8

3. Giardioza ……………………………....................................................... 15

4. Criptosporidioza……………………......................................................... 21

Bibliografie........................................................................................................................ 27

2
1. Rolul biologiei moleculare în parazitologia veterinară

Biologia moleculară constă în manipularea ADN şi ARN în laborator şi operează


prin mijloace specifice ca: enzime de restricţie, recombinarea şi clonarea ADN, ADN
complementar, secvenţierea ADN, reacţia în lanţ a polimerazei (PCR) etc.

PCR este implicat în:

a) depistarea, identificarea, compararea speciilor, suselor, varietăţilor, hibrizilor de


paraziţi;

b) studiul ciclului vital;

c) epidemiologia parazitozelor;

d) imunitatea antiparazitară;

e) studiul rezistenţei gazdei şi paraziţilor,

f) precizarea diagnosticului;

g) controlul parazitozelor, etc.

În a doua jumătate a secolului trecut oamenii de stiinţă au recunoscut paraziţii ca


excelente sisteme model pentru descoperirea principiilor de bază a biologiei eukariotelor.

Un număr de descoperiri au stimulat intens cercetări similare ale altor sisteme,


cum ar fi biochimia, biologia moleculară, imunologia parazitară. O semnificativă
schimbare în parazitologie a marcat-o introducerea tehnologiilor moderne din biologia
moleculară.

Biologia moleculară este un termen general, ce se referă la manipularea ADN şi


ARN în laborator. Această manipulare este deja aplicată în producţia de vaccinuri, în
diagnostic, în detectarea purtătorilor de gene dăunătoare şi în terapia genetică. În viitor va
fi foarte dificil de a găsi domenii în medicina veterinară şi în producţia animalelor care să
nu fie substanţial beneficiare ale acestei tehnologii. Biologia moleculară operează cu
câteva mijloace specifice ca: enzime de restricţie, recombinarea şi clonarea ADN, ADN
complementar, secvenţierea ADN, reacţia în lanţ a polimerazei (PCR) etc.

3
În 1970 s-a descoperit că bacteriile produc enzime capabile de a degrada ADN
străin ajuns intrabacterian. Activarea acestor enzime joacă un rol cheie în fenomenul
cunoscut ca ,,restricţia gazdei” (ce constă în autoprotecţia bacteriilor faţă de virusuri, prin
fragmentarea ADN-ului viral), ele sunt denumite enzime de restricţie sau enzime
restrictive. Azi sunt cunoscute sute de asemenea enzime. Aceste enzime se fixează pe
secvenţele specifice ale ADN, fenomen denumit ,,recunoaşterea secvenţelor” şi fiecare
enzimă scindează ADN într-un loc specific de clivaj, localizat de obicei în secvenţa
recunoscută. Când o enzimă de restricţie este fixată pe ADN, acesta este clivat în mai
multe locuri şi astfel ADN este fragmentat. Dacă locurile de clivaj nu sunt poziţionate la
intervale regulate, de-a lungul moleculei de ADN, fragmentele rezultate au lungimi şi
greutăţi diferite. Electroforeza pe gel a acestor fragmente evidenţiază migrarea
fragmentelor cu o rată invers proporţională cu logaritmul greutăţii lor.

Astfel de enzime bacteriene obţinute în laborator sunt, de exemplu: enzima


BamHI, din Bacillus amyloliquefaciens, susa H şi I (prima enzimă obţinută), EcoRI din
Escherichia coli, Hind III din Haemophilus influenzae, etc.

Un alt mijloc prin care operează biologia moleculară este producţia unui număr
nelimitat de copii ale unui anumit segment de ADN. Această producţie de masă, a unui
segment de ADN este o condiţie necesară pentru determinarea secvenţei de bază a
segmentelor şi pentru multe alte tehnici moleculare. Obţinerea copiilor se poate realiza pe
două căi:

a) clonarea genelor sau clonarea ADN;

b) reacţia în lanţ a polimerazei (PCR).

Clonarea ADN se realizează prin sudarea ADNului ce urmează a fi clonat (numit


ADN străin, sau ADN inserat) cu un vector capabil de replicare într-o gazdă. Cerinţa
iniţială pentru acest proces este ca ADN inserat şi ADN vector să aibă capete compatibile
(obţinute cu ajutorul unei enzime restrictive adecvată). Când ADN inserat şi ADN vector
sunt puse în contact direct cu o enzimă, ADN-ligaza, capetele celor două tipuri de ADN
se unesc printr-un proces de legare sau îmbinare (ligation sau splicing).

Molecula ADN rezultată este un exemplu de ADN recombinat (termenul se aplică


legării a două segmente de ADN din diferite surse). Există o clasă de virusuri a căror

4
întreg genom este format numai din ARN. Deoarece ARN nu este capabil de replicare,
singura cale posibilă de replicare a acestor virusuri este ca ele să-şi propage propriul
ARN, prin reconversia lui în ADN, motiv pentru care se numesc ,,retrovirusuri”. ADN-ul
se replică şi acţionează ca un şablon pentru sinteza unei cantităţi mai mari de ARN.
Enzimele care catalizează transcripţia inversă a ARN în ADN sunt numite ,,revers
transcriptaze”. Aceste enzime sunt extrem de importante în biologia moleculară pentru că
permit izolarea rapidă a regiunilor codificate ale genelor.

Un ţesut care produce polipeptide conţine relativ o mare concentraţie de ARN


mesager (mARN) pentru aceste polipeptide. Dacă mARN este extras din acel ţesut şi sunt
adiţionate (adăugate) nucleotidele şi enzima revers transcriptaza, poate fi sintetizat un
lanţ complementar de ADN (ADN complementar, sau copie ADN, cADN). Ulterior, prin
adăugarea mai multor nucleotide şi enzime ADN-polimeraze, un singur cADN poate fi
replicat într-un dublu cADN. Acesta corespunde genelor care au fost active în ţesut în
momentul când mARN a fost extras. Fragmentele de ADN pot fi clonate la rândul lor
creându-se o adevărată bibliotecă cADN.

Una din cele mai importante realizări ale biologiei moleculare a fost dezvoltarea
metodelor pentru o rapidă secvenţiere a fragmentelor de ADN. Această separare a fost
folosită în scop diagnostic şi s-a realizat prin două metode:

a) metoda Sanger, sau dideoxy (chain-terminating) şi

b) metoda Maxam-Gilbert, sau metoda chimică.

Prima este folosită mai des în practică. Pe această cale se alcătuieste genomul unei
specii. Astfel se ajunge la stabilirea genomului paraziţilor si al altor agenţi patogeni.
Genomul poate fi un nou potenţial mijloc de control al acestor organisme.

Reacţia în lanţ a polimerazei (Polymerase chain reaction - PCR) Unul din cele
mai importante instrumente de lucru în biologia moleculară este PCR, folosit larg în
prezent pentru cercetare şi diagnostic în detectarea genelor particulare (atât benefice cât şi

dăunătoare) la animalele domestice. În viitor se va extinde folosirea acestei metode în


multe domenii ale practicii veterinare. ADN-ul pe care se execută PCR (numit ADN
şablon, model) poate fi ADN genomic (extras din celulele albe sangvine, sau din splină,

5
ori alte ţesuturi), sau un fragment de ADN din orice altă sursă. Prin PCR s-au creat
aproximativ un milion de copii ale unor segmente mici de ADN şablon, suficient pentru a
permite ca segmentul să fie clonat sau analizat. Cerinţa de bază este cunoaşterea
secvenţei fragmentului sau ordinea la fiecare capăt al segmentului pe care dorim să-l
amplificăm. Folosind această informaţie sunt sintetizate două lanţuri de nucleotide
(numite oligonucleotide sau oligo, prescurtat), fiecare cu o lungime de 20 de baze, unul
este complementar capătului al treilea al segmentului ce trebuie amplificat, iar altul este
complementar unui alt capăt trei al altui segment. Deoarece rolul acestor oligonucleotide
este de a amorsa sinteza de noi lanţuri (strands) de ADN, ele sunt numite ,,primeri”.

ADN şablon este plasat într-un tub împreună cu primerii, cu o cantitate de


deoxinucleotide şi cu ADN-polimerază. Amestecul este încălzit până la 95°C pentru a
separa (denatura) cele două lanţuri de ADN şablon (ADN polimeraza este stabilă termic,
aşa că ea rezistă la temperaturi mari din faza de denaturare). O formă obişnuit folosită
este Taqpolimeraza, numită aşa pentru că provine din bacteria termofilă Thermus
aquaticus. Temperatura este apoi scăzută la 50-60°C pentru a permite primerilor să se
lege la secvenţele lor complementare din ADN şablon (de exemplu la capătul
segmentului care dorim să îl amplificăm). Odată ce primerii s-au legat, temperatura este
crescută la 70°C, aceasta find optimă pentru ADN-polimerază, care adună nucleotidele
specifice la capătul 3 al fiecărui primer, extinzând, astfel, lanţurile de ADN. După ce a
trecut suficient timp pentru ca noile lanţuri să fie sintetizate, temperatura va creşte din
nou la 95°C, începând astfel un nou ciclu de denaturare, legare şi extensie. Lungimea
unui ciclu (numit ciclu de amplificare) este de 5 minute: 15 secunde pentru denaturare, 30
secunde pentru sudare, 90 secunde pentru extensie, plus timpul minim necesar schimbării
temperaturii între faze (30-60 secunde pentru fiecare schimbare). Ciclul se poate repeta
de 30-35 ori într-un automat (thermal cyclers) care poate fi programat exact pentru
fiecare fază. Teoretic se pot realiza 230-235 copii identice (numit PCR product) ale

segmentului.

În practică amplificarea exponenţială nu este perfectă. Este posibil să se repete de


1x106 cicluri si să se obţină 1 µg de PCR product. Limita şi puterea PCR sunt
remarcabile. De exemplu, produşii PCR pot fi obţinuţi din ADNul microorganismelor vii,

6
din produsele animale (carne, ouă), sau din specimenele din muzee sau arheologice.
Probele pot fi la fel de mici ca un spermatozoid, sau un folicul pilos. Produşii PCR pot fi
obţinuţi chiar din lapte, deoarece laptele conţine celule somatice.

Există mai multe variaţii ale PCR de bază. De exemplu, câteva perechi de primeri
pot fi incluşi într-o reacţie PCR multiplex. O altă variantă este cea care dă naştere la
ADN polimorfic amplificat la întâmplare (RAPD) (polimorfic se referă la existenţa a mai
mult decât un tip de formă). La câteva specii RAPD sunt o sursă utilă de markeri ADN
pentru hărţile genetice sau (în cazul paraziţilor) pentru identificarea speciilor.

O altă variantă implică transcripţia inversă a unei probe de ARN, pentru a produce
cADN, care este apoi amplificată prin PCR, metodă cunoscută ca transcripţia inversă a
PCR (reverse transcription PCR) (RT-PCR). Este un eficace mijloc de identificare şi
studiu al genelor, fără a recurge la procesul de clonare.

Se mai cunosc şi alte metode de cercetare în biologia moleculară ca: analiza


Southern, delecţia variaţiei secvenţelor de bază (diferenţierea alelelor). Prin aceasta se
poate diferenţia animalele homozigote de heterozigote.

Tehnicile citate anterior (PCR, PCR multiplex, ADN polimorfic amplificat la


întâmplare, transcripţia inversă a ARN - revers transcription PCR, analiza Southern etc.),
au implicaţii în cercetarea fundamentală, în diagnostic, în supravegherea epidemiologică,
în imunitatea antiparazitară, în controlul paraziţilor, etc. Aceste tehnici au creat o
revoluţie în diagnostic, înlocuind tehnicile inexacte şi consumatoare de timp cu teste
bazate pe manipularea ADN. Ele sunt foarte rapide (5 minute) şi foarte sensibile. Multe
dintre aceste teste sunt bazate pe PCR şi pot fi executate pe probe prelevate de la animale
vii, produsele animale, cadavre proaspete, vechi sau autolizate, fetuşi, avortoni, apă
suspectă de contaminare, aer, blocuri tisulare în parafină.

Prin alegerea primerilor potriviţi şi/sau a probelor, testele bazate pe manipularea


ADN sunt implicate în:

1. depistarea speciilor, suselor, serogrupelor, varietăţilor şi hibrizilor de virusuri,

retrovirusuri, bacterii, fungi, protozoare, nematode, cestode etc.;

2. identificarea speciilor şi suselor de paraziţi;

7
3. compararea speciilor din acelaşi gen, sau suselor din aceeaşi specie;

4. depistarea paraziţilor vii sau morţi;

5. diferenţierea metacestodelor ce parazitează o singură gazdă sau gazdă comună;

6. precizarea fazelor ciclului vital al unor protozoare;

7. investigarea specificităţii pentru gazdă a unui parazit;

8. detecţia gazdelor definitive infestate cu cestode;

9. evidenţierea căilor de infestare a gazdei;

10. investigarea interacţiunii gazdă-parazit;

11. investigarea domeniului imunităţii antiparazitare;

12. cuantificarea citokinelor şi interferon gama;

13. facilitarea supravegherii epidemiologice a efectivelor;

14. facilitarea investigării rezistenţei gazdei la invazie;

15. precizarea unui diagnostic de certitudine;

16. controlul parazitozelor;

17. investigarea rezistenţei paraziţilor;

18. identificarea şi diferenţierea cărnii diferitelor specii animale.

Cel mai simplu test de diagnostic implică amplificarea unui anumit segment de
ADN, urmată de electroforeză pe gel şi colorarea gelului în bromură de etidium

2. Toxoplasmoza

Zoonoză parazitară cu implicaţii grave sociale şi medicale, toxoplasma afectează


toate speciile de mamifere şi păsări, evoluînd grav la tineretul animal, cu manifestări
nervoase, pulmonare, iar la femele cu mortinatalitate, avorturi şi malformaţii congenitale.

Produsă de Toxoplasma gondii, se întîlneşte pe întreg globul cu frecvenţă


variabilă condiţionată de o multitudine de factori social-economici.(parazitologie clinică)

8
Boala este produsă de Toxoplasma gondii, încadrat în familia Sarcocystidae,
subfamilia Toxoplasminae, genul Toxoplasma.

Sursele de infecţie sunt foarte numeroase, însă principala o reprezintă pisicile, în


oarecare măsură şi felidele sălbatice, care sunt coproeliminatoare de oochisturi. Acestea
poluează solul, vegetalele, apa, alimentele şi furajele.

Ciclul biologic al Toxoplasmei gondii este unul diheteroxen avînd ca şi gazdă


definitivă pisica iar ca şi gazdă intermediară mamiferele şi omul:

contaminarea gazdelor intermediare (mamifere, păsări şi om) se realizează în principal pe


cale bucală prin ingerarea de oochisturi, odată cu alimentele şi apa contaminate, sau
consumul de chisturi de către speciile carnivore şi omnivore. Este posibilă şi
contaminarea genitală – cu material seminal contaminat (la rumegătoare mici) şi
transplacentară – la femele gestante (femeie, oaie, scroafă, căţea, pisică). Contaminarea
galactogenă a fost demonstrată la oaie, iar calea transcutanată prezintă importanţă redusă;

gazdelor definitive (pisicile) se realizează prin consum de organe, cadavre, carne ce


conţin chisturi sau trofozoiţi.

Numărul de specii afectate este foarte mare. Cu toate acestea, boala cu manifestări
clinice este rară, predominînd infecţiile subclinice. Toxoplasma gondii având o
specificitate strânsă pentru gazda afectează peste 200 de specii de vertebrate homeoterme
şi chiar heteroterme. Cele mai receptive sunt: şoarecele, iepurele, cobaiul, apoi oaia,
carnivorele, mai rezistente fiind bovinele şi cabalinele.

În cadrul speciilor, animalele tinere sunt cele mai receptive, acestea prezentând
manifestări clinice (toxoplasmoză), în timp ce adulţii realizează infecţii subclinice. De
asemenea, sunt mai receptive animalele cu rezistenţă scăzută, mai ales cele
imunosupresate.

Mecanismele patogenetice în toxoplasmoză sunt determinate de multiplicarea


sistemică a protozoarului Toxoplasma gondii, în toate tipurile de celule şi organe (cu
excepţia ţesutului osos, epiteliului malpighian, cartilaje).

Modificările anatomopatologice sunt în funcţie de forma evolutivă a bolii şi organele


afectate:

9
Forma acută - se constată: pneumonie fibrinoasă; focare necrotice miliare,
albicioase şi granuloame diseminate în ficat, encefal, limfonoduli; uneori se poate găsi
degenerescentă hepatică, miocardică şi splenomegalie; enterită, ulcere gastro-intestinale,
ulcerele având marginile regulate şi centrul granular; sub membrana bazală a epiteliului
vilozităţilor se găsesc chisturi toxoplasmice, înconjurate de o reacţie limfohistiocitară;
ulcere gingivale, pe buze şi pe marginile limbii la câine; echimoze cutanate şi musculare,
coroidită, glioame în creier, pericardită, miocardită, hepatită şi splenomegalie;

Forma cronică – leziunile au caracter necrotic, asociate cu calcifieri, cu localizări


limitate în diverse organe: ficat, splinǎ, pumon, miocard, creier, şi limfonoduri şi însoţite
de hidrocefalie,nefrozǎ cronicǎ, angiocolitǎ şi cirozǎ.

Simptomele apar după o incubaţie variabilă, cuprinsă între 4 – 40 zile, boala


prezentând două forme evolutive: acută şi cronică. În cea acută prodomină: sindromul
nervos, cardiopulmonar sau oftalmopatiile. La femele apare avortul, mortalitatea
neonatală, metrite cu infecunditate. La pisică boala evoluează cu formă intestinală, cu
subfebrilitate, edeme ale capului, tulburări nervoase (ataxie, opistotonus) şi oculare
(opacifierea corneei în jumătatea inferioară). Forma cronică se caracterizează prin semne
clinice şterse sau necaracteristice şi cu o evoluţie latentă.

Metodologia de diagnostic comportă diverse demersuri şi tehnici, din cauza


aspectului evolutiv al toxoplasmozei extrem de polimorf.

Examenele histopatologice de amprente, de organe, colorate M.G.G., sunt de


certitudine cînd se evidenţiază formele evolutive de Toxoplasma.

Examene microscopice pentru identificarea toxoplasmelor se pot efectua şi pe


frotiuri de lichide (L.C.R., sînge, lapte) din materiale de biopsie limfonodulară, de splină,
ficat, măduvă osoasă, colorate M.G.G. sau Giemsa. Toxoplasmele se observă cu
citoplasma albastră şi nucleul roşu.

Diagnosticul prin bioteste se recurge la prelevarea de material patologic şi


inocularea la animale de laborator- şoarece, pisică, ouă şi embrionate, culturi celulare.

Diagnostic serologic se bazează pe evidenţierea diverşilor anticorpi: IgG, IgM,


IgE şi IgA. Există mai multe metode, unele deja considerate clasice, iar altele moderne.

10
Dintre testele clasice, în laboratoarele de diagnostic se utilizează:

Testul Sabin – Feldman ( Dye-Test, D.T., testul de liză al toxoplasmelor).


Principiul constă în pierderea însuşirii de colorabilitate a toxoplasmelor extracelulare şi
liza lor parţială în soluţie alcalină de albastru de metilen în prezenţa serului imun şi a unui
factor activator, accesoriu, format de ser uman proaspăt. Reacţia este evidenţiată la
microscop;

Testul de hemaglutinare (H) este utilizabil în două forme: hemaglutinare directă


(H.D.) şi indirectă (H.I.D.).

Testul de H.D.- principiul se bazează pe aglutinarea toxoplasmelor fixate prin


formolare sub formă inelară sau în bloc compact în prezenţa anticorpilor specifici:
antigenul, format din toxoplasme formate din exsudat peritoneal de şoarece, se purifică şi
se fixează cu formol. Reacţia, pretabilă cu seruri de orice specie, este rapidă şi uşor de
executat.

Testul de H.I.D.- se utilizează în laboratoare mai mult decît H.I. Metoda se


bazează pe reacţia de aglutinare dintre hematii de animale (oaie) stabilizate cu tanin şi
sensibilizate cu antigen specific de toxoplasme, în contact cu anticorpii serici specifici.

Reacţia de fixare a complementului (R.F.C.) se bazează pe relevarea reacţiei


dintre antigen şi anticorp prin intermediul unui sistem hemolitic format din hematii de
oaie şi hemaglutinine antihematii de oaie;

Testul de imunofluorescenţă indirectă (I.F.I.) se bazează pe vizualizarea reacţiei


dintre anticorpii serici specifici şi antigenele toxoplasmice fixate în prealabil pe lame de
sticlă. Reacţia este vizibilă la microscop cu fluorescenţă prin intermediul unui indicator
fluorescent: antiglobulină specifică conjugată cu izotiocianat de fluoresceină.

11
Fig. 1 Fig. 2
Preparate fixate în formalină, coloraţie imunofluorescentă (IFA): fig. 1 – reacţie pozitivă IFA pentru
tachizoiţi de T. gondii (anticorpi anti-IgG marcaţi fluorescent legaţi de anticorpii cuplaţi cu tachizoiţi); fig.

2 – reacţie IFA negativă pentru T. gondii.

Metodele moderne încearcă să înlăture unele din dificultăţile persistente în


realizarea metodelor clasice.

Testul E.L.I.S.A. (Enzyme Linked Immuno-Sorbant Assay) sau testul


imunoenzimatic. Datorită uşurinţei de utilizare, raportului cost eficienţă şi înaltei
specificităţi şi sensibilităţi, testul ELISA a înlocuit în multe laboratoare vechile teste cum
ar fi imunofluorescenţă indirectă, fixarea complementului şi hemaglutinarea indirectă.

Principiul metodei are la bază reacţiile dintre antigene (Ag) toxoplasmice şi


anticorpii serici specifici , evidenţiabile prin mijlocirea anticorpilor (Ac), anti IgG sau
IgM, conjugate cu o enzimă şi relevate prin hidroliză cu o substanţă chimică. Obişnuit se
folosesc Ag citoplasmatice şi/sau membranare, iar Ac variază cu conjugatul
antiimunoglobulină al speciei folosite.

Antigenele se obţin prin tehnici diferite şi sunt standardizate. Antiglobuline


conjugate se prepară din seruri de iepure sau de capră şi marcate cu peroxidază şi
respectiv fosfataza alcalină. Sistemul revelator este format dintr-o soluţie de acid

12
aminosalicilic sau de paranitrofenilfosfat. Pentru fiecare ser de cercetat se efectuează
două teste la aceeaşi diluţie.

Procedeul se realizează etapizat, în care complementul Ag + serul de cercetat se


incubează la 37º C timp de 20 de minute; după spălare se adaugă conjugatul anti-Ig de
specie şi enzima, urmate de o reincubare. După respălare se adaugă substratul revelator
care sub influenţa enzimei se transformă în 30-60 minute în derivat colorat. Rezultatele se
obţin la spectrofotometru, dar se poate vizualiza şi direct.

Azi, pentru a uşura munca şi pentru a cîştiga timp se folosesc kiturile. Un astfel de
exemplu este ImmunoComb. Acesta este un test ELISA calitativ şi este un card de plastic
de forma unui pieptene, alcătuit din 12 dinţi, pe care sunt ataşate antigene purificate de T.
gondii şi Clamydia, fiecare dinte corespunzând unei singure probe. Acesta se introduce
succesiv în cuvele unei plăci multicompartimentate, care conţin: ser de cercetat, soluţie
de spălare, anticorpi anti- IgG cuplaţi cu enzimă şi substrat.

Testul E.L.I.S.A.D.S. ( Double Sandwich). Se foloseşte pentru evitarea rezultatelor


fals-pozitive şi fals-negative. În primă fază a reacţiei se absoarbe antiimunoglobulina M
de specie pe materialul plastic; se adaugă serul de la aceeaşi specie pentru titrare pentru
aderarea IgM, în eventualitatea că există, la anti-IgM, urmate de spălare. Se adaugă Ag
toxoplasmice care, la incubaţie, reacţionează cu IgM, urmat de spălare. Se adaugă ser
antitoxoplasmic de iepure conjugat cu enzima şi se incubează la 37º C timp de o oră,
după care se adaugă substratul chimic. După un răgaz de 60 de minute, în laborator se
citesc rezultatele.

Prin această metodă se îmbunătăţeşte sensibilitatea şi specificitatea reacţiilor. În


cazul serurilor provenite de la nou-născuţi infectaţi, după eliminarea IgG maternă, circa
75-80% devin seropozitive. Serurile ce conţin Ac antinucleari negativează.

Reacţia de polimerizare în lanţ (P.C.R - Polymerase Chain Reaction )

Aplicarea tehnicii PCR a detectat rapid şi cu acurateţe T.gondii într-o varietate de


diferită de specimene clinice, incluzînd ţesuturi fixate în parafină. Cu toate că, tehnica
PCR are o mare sensibilitate cînd se utilizează ţesuturi proaspete decît cele conservate,
studii pe diluţii seriate au demonstrat un grad înalt de sensibilitate pentru T.gondii în
ţesuturi fixate în parafină. Analiza toxoplasmozei bazată pe PCR utilizează fie gena

13
codificatoare a antigenului major de suprafaţa P30 prezentă într-o singură copie pe
organism, sau gena B1 înalt repetitivă (o genă specifică T.gondii care codifică o proteină
reactivă necunoscută din serul sanguin). Aproximativ 35 de copii a genei B1 sunt
prezente în genomul T. gondii , dar această genă este absentă în celulele de mamifere.

Tehnica PCR este o metodă de detecţie rapidă si de acurateţe pentru T.gondii din
ţesuturile animale, în special atunci cînd doar o mică cantitate de ţesut este disponibilă.
Metoda a fost folosită cu succes pe sânge periferic, lichid cefalorahidian, lichid amniotic,
ţesut cerebral, corp vitros, umoare apoasă, lavaj bronhoalveolar şi urină.

Tehnica PCR este cea mai utilă, mai ales în stabilirea diagnosticului de infecţie
acută. Diagnosticul toxoplasmozei acute nu trebuie făcut numai pe baza unui test PCR
pozitiv, el trebuie coroborat cu prezentarea clinică şi alte metode.

Intradermoreacţia cu toxoplasmină (I.D.R.T) evidenţiază starea de


hipersensibilitate întîrziată; reacţia devine pozitivă la 3-4 săptămâni de la infecţie şi se
menţine astfel toată viaţa.

Testul RIF (Remington) care decelează anticorpii IgM, este folosit pentru
diagnosticul infecţiei acute. Anticorpii IgM apar în primele 5 zile de la infecţie şi dispar
precoce. Reacţii fals pozitive pot fi date de factorul reumatoid, de IgG anti-toxoplasma
care pot bloca detectarea anticorpilor IgM. Unii bolnavi cu imunodepresie, cu
toxoplasmoză acută şi majoritatea celor cu toxoplasmoză oculară activă, pot să nu aibă
anticorpi IgM, evidenţiaţi prin RIF.

Testul de aviditate

Măsurarea avidităţii IgG specifice pentru T. gondii, s-a dovedit a fi foarte utilă în
diferenţierea infestaţiilor recente de cele vechi. Definită ca fiind puterea cu care se leagă
IgG de antigen, aviditatea IgG se maturează cu odată cu timpul scurs de la infecţia
primară. Astfel, IgG produse în primele luni după infecţia primară au o aviditate scăzută,
faţă de IgG produse după mai multe luni sau chiar ani, care au o aviditate mult mai mare.
O serie de cercetători au arătat că detectarea IgG specifice T. gondii avînd aviditate mică,
reprezintă un indicator de încredere pentru o infecţie nu mai veche de 8 luni. Însă,
detectarea IgG specifice pentru T. gondii cu aviditate mare, este mai mult informativ

14
pentru stadiul clinic, astfel prezenţa lor nu indică vechimea exactă a bolii, ci faptul că
boala este mai veche de 5 luni.

3.Giardioza

Este o zoonoză digestivă cu tabloul clinic polimorf la om, dar puţin cunoscută la
animale. În ultimii ani sunt semnalate îmbolnăviri la tineret (căţel, pisică, iezi, miei) cu
sindrom diareic.

Răspândirea pe glob este variabilă: în Europa este semnalată la capre, oi,


carnivore, rozătoare, bovine; în America de Nord şi Africa la unele specii de mamifere.

Etiologie. Sunt mai multe specii din genul Giardia (din fam. Hexamitidae) însă
datele recente de literatură pun sub semnul incertitudinii specificitatea parazitismului,
considerând posibilă transmisibilitatea interspecifică. Astfel, prin analize comparative de
ADN la Giardia provenite de la specii de animale, s-au stabilit că unele au afinitate,
evidenţiind trei genotipuri. Unul, cu speciile de la cal, porc şi rumegătoare,
nediferenţiabile de Giardia intestinalis, parazit la om. Acest tip are spectru larg de
specificitate de gazdă, cu risc zoonotic pentru om. Alte izolări de Giardia de la şoarece,
cal şi oaie au slabă afinitate de genotipul de G. intestinalis. Al treilea genotip, semnalat la
rumegătoare, purcel, alpaka, diferă distinct de G. Intestinalis. Giardiile se prezintă ca
trofozoiţi, în faza endogenă şi chisturi, formele de rezistenţă, exogene.

- Giardia lamblia parazitează la om, câine, Macaco;

- G. canis, G. cati, G. Bovis, G. Caprae, G. Cuniculi, G. muris- la muride ;

- G. psittaci- la papagal.

Trofozoiţii, piriformi, cu faţa dorsală convexă şi cea ventrală concavă, plană,


prevăzută cu disc adeziv, au simetrie bilaterală. Prezintă doi nuclei situaţi în treimea
anterioară şi 4 perechi de flageli liberi care au la bază 4 perechi e blefaroplaşti.citoplasma
conţine granule de glicogen, reticul endoplasmatic şi vezicule. Dimensiunile, cu mici
variaţii specifice, sunt de 10-20/7-15 µm.

15
Chistul oval, cu dublă membrană transarentă, conţine 2-4 nuclei şi falgelii dispuşi
în diagonală cu aspect sinuos. Chisturile măsoară 10-15/7-10 µm. Există chisturi atipice,
cu contur neregulat, considerate degenerate.

Trofozoiţii se dezvoltă la nivelul intestinului subţire, pe suprafaţa, dar uneori


ajung şi în profunzimea mucoasei, frecvent în duoden, uneori chiar şi în colon. Se
hrănesc prin endosmoză, pe toată suprafaţa corpului şi pinocitoză. Sunt foarte mobili şi se
multiplică prin diviziune binară.

Contaminarea are loc prin ingerarea de chisturi odată cu hrana. Rezistanţa


chisturilor în mediu umed şi la regim termic în jur de 18º C este de 3 luni, cu conservarea
capacităţii infectante. În medii cu procese de putrefacţie trăiesc mai puţin. Muscidele
vehiculează chisturile la distanţă.

Epidemiologie. Sursele de infecţie sunt formate de persoane bolnave sau


purtătoare, animale tinere bolnave şi adulte purtătoare de paraziţi. Incidenţa este ridicată
la câine ajungând la peste 20%, sporadic la pisică 3%. În mecanismele de transmitere o
importanţă medicală câştigătot mai mult câinele, implicat ca sursă de contaminare umană,
şi cu nivelul infecţiei ridicat în unele colectivităţi pe glob.

Există variaţii specifice de receptivitate, în primul rând situându-se câinii,


caprinele, şoarecii, mai refractare par canibanele, bovinele. În cadrul aceleiaşi specii
tineretul contractă forme ciclice, dar animalele cu afecţiuni diverse sunt infectate mai
frecvent şi mai grav. Este posibilă transmiterea interspecifică. La om se transmit: G.
canis, G. cati, G. muris.

Patogeneză.Densitatea giardiilor fiind foarte mare, ajung să învelească zone


întinse din mucoasa intestinală, provocând iritaţii şi inflamaţii datorită mobilităţii,
produşilor de metabolism, enzimelor şi toxinelor. Concomitent se perturbă mecanismul
digestiei cu malasorbţie, stază şi dischinezie biliară, datorită inflamaţiei sfincterului Oddi.
Uneori giardiile pătrund printre clulele mucoasei intestinale, , formând cuiburi,
producând procese de necrobioză şi inocularea florei bacteriene. Infecţiile produc reacţii
alergice şi stări imunodepresive.

16
Imunitate. Giardiile elimină antigene de secreţie şi excreţie ce induc reacţii
mediate velular şi umoral, ca imunoglobuline: locale IgA, serice IgG şi IgM. Au şi efect
hipersensibilizant datorită IgE.

Morfopatologic: cadavrele sunt slăbite, cu părul murdărit în jurul anusului,


mucoasa duodenală este congestionată; duodeno-jejunită catarală sau hipertrofică, rareori
degenerescenţei hepatică şi stază biliară.

Histologic, se constată procese de necrobioză a enterocitelor, congestie în


submucoasa intestinală, cu infiltraţie limfohistocitară. Giardiile pot pătrunde prin spaţiile
intercelulare ale mucoasei la câine si să formeze cuiburi în submucoasă la rozătoare.

Simptome. Obişnuit, boala trenează subclinic, animalele adulte fiind purtătoare


latente, dar la tineretul animal apar îmbolnăviri cu sindrom diareic acut sau cronic,
recidivant.

La iezi apare la vârsta de 4-6 săptămâni, cu diaree profundă, deshidratare, apetitul


modificat, slăbire şi mortalitate, circa 3%.

La viţei, în ferme de vaci infectate (circa 10%), boala se manifestă la vârsta de 1-5
luni, prin diaree şi slăbire.

La miei, infecţiile cu Giardia sunt însoţite de stagnare în creştere şi diaree


pasageră.

La căţei, îmbolnăvirile pot să apară la vârsta de 1-12 luni, ca sindrom de diaree


conică recidivantă. Fecalele sunt apoase, cu fragmente de mucoasă, uneori sanguinolente.
Trenarea simptomelor induce modificări hematologice-anemie.

Mulţi dintre copiii sau adulţii infectaţi cu Giardia lamblia nu prezintă simptome
de giardioză, chiar dacă sunt infectaţi şi parazitul este prezent în materiile fecale. Aceste
persoane pot transmite boala.

Când sunt prezente, cele mai frecvente simptome sunt:


- diaree care de obicei durează 7-10 zile. Poate dura mai mult dar de asemenea poate să se
amelioreze şi mai repede în 2-4 zile. La început este prezentă o diaree apoasă, urmată
apoi de steatoree (prezintă grăsimi), scaune urât mirositoare care pot pluti. Acest lucru

17
este un semn că grăsimile nu sunt digerate corespunzator şi sunt transferate din organism
în scaun

- crampe şi sensibilitate abdominală

- greaţă şi pierderea apetitului alimentar

-flatulenţă (gaze) sau balonare

- fatigabilitate.

De cele mai multe ori, persoanele infectate nu caută un tratament pentru aceste
simptome. De cele mai multe ori simptomele se amelioreaza de la sine. Dar dacă
giardioza nu este tratată de la apariţia primelor simptome, boala poate dura o perioadă
lungă de timp şi se poate croniciza. Persoanele cu giardioza cronică prezintă atacuri
diareice care apar şi dispar însoţite de simptomele descrise. Aceste episoade alternează cu
perioade de constipaţie sau un tranzit intestinal normal şi durează doar câteva zile când
apar.
Din aceste motive, aceştia nu se adresează la medic pentru tratament. Simptomele
de giardioza cronică sunt:

• scaune moi, grase, nelegate (nu mereu lichide sau apoase), uneori scaunele pot fi
urât mirositoare sau spumoase şi de cele mai multe ori în cantitate mică

• disconfort abdominal sau iritaţii gastrice care sunt mai frecvente după mese

• crampe abdominale, balonare sau durere

• flatulenţă

• halenă fetidă (miros urât în respiraţie) persistentă, uneori cu miros de sulf

• dureri de cap ocazional

• scăderi în greutate

• stare generală proastă, astenie, fatigabilitate, stare generală de disconfort.

Simptome la copil

Copiii cu giardioza pot să nu prezinte alte simptome decât tulburări de creştere,


scădere în greutate.

18
Dacă sunt prezente simptome, acestea sunt:

• scaune diareice spumoase, galbene, urât mirositoare

• scăderi în greutate sau pierderea apetitului alimentar

• dureri abdominale, greaţă sau vărsături

• deficite nutriţionale cauzate de incapacitatea absorbţiei unor nutrienţi.

Alăptarea este considerată că protejează sugarii de a face giardioza. Laptele de mama


conţine nutrienţi care omoară paraziţii. Aceste simptome de giardioză sunt comune şi
altor infecţii intestinale. Durata simptomelor şi testul de identificare a parazitului, pot fi
singurele care fac diagnostic diferenţial al acestor boli.

Simptomele de giardioza apar de obicei la 7-10 zile după infectare, deşi uneori pot
dura 35 de zile sau mai mult. Odată ce au apărut, simptomele durează cel puţin 7
săptămâni:

• la copiii sau adulţii care nu au afecţiuni, simptomele pot să dispară şi fără


tratament

• diareea pe termen lung poate să producă pierderi în greutate, deshidratare sau


probleme de nutriţie întrucât alimentele nu sunt absorbite în mod corespunzător în
organism. Uneori aceste afecţiuni se ameliorează şi fără tratament. Dacă nu se
întamplă acest lucru, se pot trata corespunzător.

Multe persoane care sunt infectate cu Giardia intestinalis nu prezintă simptome; se


poate produce infectarea altor persoane chiar dacă nu există simptome, întrucât parazitul
există încă în scaun (materiile fecale).

Dintre persoanele ce prezintă simptome de giardia, 20% până la 40% dezvoltă o


intoleranţă temporară la lactate sau alte produse pe baza de lapte (deficit de lactaza sau
intoleranţă la lactoza). Această problemă poate să dureze până la o lună după terminarea
tratamentului pentru giardia. Acest lucru semnifică faptul că tratamentul nu este eficient
sau că s-a produs reinfecţia.

Nou născuţii şi sugarii care fac giardioza pot refuza alimentele şi se pot opri din
creştere până în momentul în care se vindecă boala. Creşterea normală şi dezvoltarea

19
organismului nu se produc imediat dar pot să reînceapă în câteva săptămâni sau luni.
Studiile au arătat că este posibil ca o persoană care a fost infectată cu giardioză să
dezvolte o imunitate pe termen scurt faţă de parazit.

Există riscul contaminării cu giardia pentru:

• cei ce lucrează în centre de îngrijire pentru copii, mai ales dacă majoritatea nu ştiu
să folosească toaleta

• părinţii sau familiile cu copiii mici

• cei care înnoată în ape de agrement cum ar fi râuri, lacuri, ape curgătoare, mai
ales în timpul verii sau toamnei când există riscul cel mai mare de expunere.
Riscul apare în momentul înghiţirii apei în timpul înotului

• cei care consumă apă netratată sau tratată insuficient, mai ales din apele
curgătoare, râuri, lacuri

• cei care locuiesc sau lucrează în diferite amplasamente sau centre de îngrijire sau
sunt rude cu unul dintre aceşti angajaţi

• cei care au contact oro-anal şi oro-genital cu o persoană infectată.

Factorii de risc care duc la apariţia simptomelor dupa infectare:

• existenţa unei scăderi a imunităţii. Există două afecţiuni, care sunt considerate că
produc modificări ale sistemului imun şi cresc în special riscul de apariţie a
simptomelor de giardioza, numite imunodeficienţă comună variabilă şi
agamaglobulinemia X- linkata

• existenţa unor boli care afectează tranzitul intestinal şi fac intestinul mai
susceptibil la infecţie cum ar fi boala Crohn sau fibroza chistică existenţa
malnutriţiei înainte de infectare tratamentul chirurgical pentru stomac cu o
perioadă scurtă înaintea infectării sau tratamentul medicamentos cu antiacide
gastrice. Acest lucru constituie o problemă întrucât stomacul secretă o cantitate

20
mai mică decât normalul de acid (aciditatea gastrică omoară unele
microorganisme).

Diagnostic. Clinic, boala poate fi suspicionată la animalele tinere cu tulburări


digestive-diaree, inapetenţă, -în forme cronice, cu recăderi, neredresabile prin antibiotic

Diagnosticul de giardioza se pune pe următoarele:

- anamneza istoricului medical sau examen obiectiv. Dacă acestea sugerează simptome de
giardioză, unii doctori prescriu un singur tip de tratament până a recomanda alte
investigaţii
-analizele scaunului (examen coproparazitologic)
-teste antigenice care detectează proteine (antigene) de Giardia
-recoltarea directă din intestin, care se face dacă examenul coproparazitologic este
neconcludent. Acest test recoltează o probă din intestinul subţire astfel încât poate fi
examinat pentru a se observa parazitul. Acest test se face foarte rar.
Lichidele din partea superioară a intestinului subţire (lichidul duodenal) poate fi
de asemenea examinat la microscop pentru a se vizualiza parazitul sau se face un test de
identificare a antigenelor parazitare. Lichidul duodenal este colectat prin endoscopie.
Alte investigaţii care determină giardioza sau alte boli asemănatoare se vor face dacă
persistă simptomele pe o perioadă lungă de timp, mai ales dacă apar probleme în urma
malabsorbţiei. Aceste teste se fac pentru a se examina intestinul subţire (partea superioară
gastrointestinală) sau pentru a se preleva o probă (biopsie) din partea superioară a
intestinului subţire pentru a se izola microorganismul care produce infecţia.

Profilaxie. Se impun măsuri generale privind respectarea condiţiilor de igienă din


adăposturi şi de nutriţie. Se vor efectua periodic dezinfectări şi deratizări în adăposturi.

4.Criptoporidioza.

Este o sporozoonoză neonatală oportunistă, cu caracter antropozoonotic, se


caracterizează prin tulburări digestive mai ales prin sindrom diareic, determinată de
sporozoare din genul Cryptosporidium. La tineretul aviar manifestările digestive sunt
însoţite de bursită şi bronşită. Această spooroză a reţinut atenţia cercetătorile şi a

21
medicilor în ultimele decenii, de când este mai des diagnosticată la copii şi animale cu
imunodeficit.

Etiologie. Cryptosporidium sp. aparţine clasei Sporozoasida, ordinul


Eucoccodiorida, familia Cryptosporidiidae, genul Cryptosporidium. În primele descrieri
ale parazitului s-a considerat că există mai multe specii, pe criteriul speciilor-gazdă
afectate: C. muris – la şoarece, C. agnii – la miel, C. bovis – la vitel, C. cuniculi – la
iepure, C. meleagridis – la curcă, C. anserinum – la boboci. Cercetări recente şi
concluziile frotiurilor de resort au stabilit că există o singură specie de Cryptosporidium.
Totuşi lucrările unor specialişti cosnsideră că la mamifere există C. Parvum şi C. muris
iar la păsări C. baileyi.

Cryptosporidium se prezintă sub multiple forme evolutive, cele endogene


cuprinzând fazele shizogonică, gameto- şi sporoginică, formate din: trozofoiţi, schizonţi,
merozoiţi, macro- şi microgametociţi, macro- şi microgameţi şi respectiv oochistul cu 4
sporozoiţi, forma exogenă fiind reprezentată de oochisturi.

Trozofoiţii, de formă ovală, sferică, au diametrul de 2-4 µm, atingând în faza


matură 6-7 µm. Se găsesc în jejun, mai frecvent în ileon şi intestinul gros ataşaţi de
celulele epiteliale.

Schizontul – rotund, cu diametrul de 7-8 µm, se află în faze diferite de


multiplicare, conţinând în final 8 merozoiţi de formă ovală, în prima generaţie, şi 4
merozoiţi, în generaţiile următoare. Centrul conţine corpi reziduali.

Merozoiţii eliberaţi din schizont sunt alungiţi, ovali, semilunari şi măsoară între 2-
3/0.7 µm.

Microgametocitul, cu diametrul de 5/3.5 µm, formează în interior, prin diviziune,


16 microgameţi subţiri şi alungiţi, cu dimesiunile de 1/0.5 µm.

Macrogametocitul, oval sau rotund, de 4.5 µm, formează un singur macrogamet.


Gameţii conţin granule mari, formate din substanţe polizaharide.

Zigotul, rezultat prin fecundare, se transformă în lumenul intestinal în oochist.

Oochistul, oval, rotund, cu diametrul de 4.5-5.5 µm este înconjurat de o


membrană dublă. La eliminare prin fecale conţine 4 sporozoiţi în formă bacilară de circa

22
1 µm şi un corpuscul rezidual. Sunt ataşaţi marginal în formă de U. Unele oochisturi nu
conţin sporozoiţi, interiorul lor este vacuolar, cunoscute “oochisturi fantomă” .

Ciclul evolutiv. Omul şi animalele- numeroase specii de mamifere: rumegătoare,


ecvine, suine, rozătoare, păsări- se contaminează ingerând cu hrana şi apa oochisturile
infectante. Faza endogenă începe cu eliberarea sporozoiţilor din oochist- sub influenţa
sucurilor gastro-intestinale, care pătrund în micrivili şi se ataşează pe suprafaţa în perie a
enterocitelor şi formează microcratere. Membrana externă a trofozoiţilor fuzionează cu
membrana celulelor parazitare. Localizarea formelor schizogonice – trofozoiţi, schizonţi
şi merozoiţi- are loc pe mucoasa jejunală, mai frecvent pe cea a ileonului şi a intestinului
gros. Trofozoiţii se hrănesc prin intermediul unor organite nutritive şi formează shizonţii
de primă generaţie care se divid schizogonic, generând 8 merozoiţi. Prin ruperea
membranei merozoiţii se dispersează şi se lipesc de alte enterocite, cresc şi formează
generaţia a doua de schizonţi care produc prin aceeaşi diviziune schizogonică un număr
de 4 merozoiţi. Desprinşi prin ruperea membranei, se dezvoltă şi se vor diferenţia în
elemente sexuale – formând macro- sau microgametociţi. Aceştia se vor dezvolta şi prin
diviziune microgametociţii formează 16 microgameţi, iar macrogametociţii câte un
macrogamet. Rezultatul fazei gametogonice îl constituie fecundaţia şi formarea zigotului.
După formarea oochistului, gametogenia se realizează tot pe micrivili. Oochistul se
divide şi frmează 4 sporozoiţi. Ciclul integral se realizează în 2-4 zile. Oochisturile
infectate se elimină în marea lor majoritate prin fecale în mediul exterior. Există şi un alt
tip de oochisturi, cu peretele mai subţire şi care se poate sparge eliberând în intestinul
aceleiaşi gazde sporozoiţiî care pot relua ciclul evolutiv. Se întâlneşte, în acest caz, o
reinfecţie autogenă, care prelungeşte infecţia în absenţa aportului exogen de oochisturi. În
mediul exterior oochistul nu suferă procese evolutive; are loc doar actul dispersării în
diverse biotipuri şi contaminarea omului şi animalelor.

Răspândire geografică. Criptosporidioza este extinsă pe întreg globul, fie sub


formă inaparentă sau exprimată clinic sporadic, fie n episoade epidermice, atât la om cât
şi la animale. Din Ţările Scandinave până în Australia, in S.U.A., Europa până în
Japonia, este semnalată, ceea ce denotă caracterul evolutiv mondial. Absenţa în unele
regiuni geografice se poate datora fie indemnităţii acestora, fie – în cele mai multe cazuri-
lipsei controalelor sanitare sau metodologiei neadecvate de investigaţie.

23
Epidermiologie. Se cunoaşte că infecţiile criptosporidiene sunt foarte răspândite
pe tot globul, afectând diverse grupe de vertebrate, cu contagiozitate accentuată. Sursele
de contaminare le constituie tineretul animal de fermă şi de apartament, precum şi copiii.
Animalele adulte şi omul sunt mai rar infectate, când este vorba de cazuri
imunodeficitare. Forma de contaminare o constituie oochistul care se transmite pe cale
bucală, dar este posibilă şi autoinfecţia enterală.

Referitor la cuanumul de poluare a mediului cu oochisturi, se cunoaşte a la unele


specii tineretul elimina 105 -107 OPG. Eliminările se produc după 405 zile p.i. şi durează
5-20 de zile. Rezultate experimentale obţinute prin infecţii la iezi şi miei axenici,
gnotoxenici ş i haloxenici, relevă că animalele axenice au eliminat cantitatea cea mai
mare de oochisturi (circa 100 de oochisturi pe câmp), timp de 6-19 zile, cele
gnotobiotice, mai moderată şi foarte scăzută la holoxenice.

Rezistenţa oochisturilor în condiţii ambientale ajunge la 3 luni, în condiţii termice


favorabile (5-10 ºC). La 50 ºC supravieţuiesc circa 15 minute. În masa fecalelor de viţei,
conservată la 5 ºC, oochisturile îşi pierd capacitatea infectantă după 3 luni, la 18 ºC după
24 ore, la 40 ºC după 15 minute, iar la peste15 ºC după câteva minute. Nu este bine
cunoscută acţiunea antisepticelor şi dezinfectantelor uzuale. Dintr-o serie de
dezinfectante testate numai soluţia salină de formol are efect distructiv asupra
oochisturilor, după 18 ore de contact.

Receptivitatea omului şi animalelor este ondiţionată de un complex de factori:


specie şi vârstă, cei mai afectaţi fiind viţeii, mieii, iezii, purceii; apoi vurnelabilitatea este
moderată – pui, pisici, căţei. Copii sunt cu receptivitate crescută. Clinic, boala se exprimă
la 5-45 zile postnatal. Omul şi animalele adulte cu stări imunodeficitare sunt mai
receptive decât cele normoreactive.

Patogenitate. Multiple procese patogene induse de dezvoltarea criptosporidiilor


sunt cunoscute, dar mai există şi aspecte necunoscute. În unele circumstanţe intervin
asupra gazdelor imunodeficitare ca germeni oportunişti, în altele ca agenţi primari sau
secondând alţi agresori virali, bacterieni sau parazitari. Acţiunea patogenă este gravă
asupra subiecţilor imunodecifitari (SIDA, tratamente imunodepresoare), datorită
dezvoltării şi multiplicării fazelor endogene pe bordura microvilă şi pe vilozităţile

24
intestinale producând procese atrofice, de necrobioză, cu dispariţia enterocitelor fuzionale
şi hipertrofia celor limitrofe. Dezvoltarea criptosporidiilor pe segmentele intestinului
subţire şi gros induce sindrom de diaree care se caracterizează prin fenomene de
hipermotilitate, hipersecreţie, hiperpermeabilitate şi malabsotbţie.

Consecinţa acestor procese constă în diminuarea timpului de contact între


conţinutul intestinal şi epitelial absorbant şi imposibilitatea totală sau parţială de
absorbţie a apei, electroliţilor şi nutrienţilor. Malaborbţia este consecinţa distrucţiei
enterocitelor sau a tulburărilor de permeabilitate ale microvilozităţilor şi mecanismelor
enzimatice. Enterotoxinele, cât şi creşterea numărului celulelor secretoare acţionează
sinergic, sporind fluidul intestinal. Hiperpermeabilitatea facilitează fie traversarea pasivă
a mucoasei de către apă şi electroliţi, fie atracţia acestora în lumenul intestinal printr-o
presiune osmotică puternică sau mucoasa distrusă pierde capacitatea de a le reţine.
Procesele intestinale finale constau în reducerea metabolismului enzimatic al
enterocitelor parazitare şi distrucţii masive ale micrivilozităţilor celulare.

Imunitate. Majoritatea cazurilor, atât la om cât şi la animale, sunt prezente la


indivizii tineri (la om înainte de vârsta de 2 ani; la viţei spre vârsta de 10-15 zile ),
relevând prezenţa unei rezistenţe legate de vârstă. Sistemul imunitar pare să joace un rol
determinant în controlul parazitismului (indivizii cu SIDA sunt foarte receptivi la
infecţie). Răspunsul imun se caracterizează prin producrea de anticorpi specifici serici şi
colostrali, dar efectul lor protector rămânr controversat. Un rol esenţial este jucat de
limfocite T, ceea ce explică gravitatea bolii la persoanele afectate de SIDA.

Tabloul clinic. Simptomatologia, indiferet de specia afectată, se manifestă


obişnuit prin sindrom diareic în perioada postnatală, rareori la păsări ca bursită şi sindrom
respirator. Perioada de incubaţie este de 5-10 zile, uramtă de diaree apoasă. Iniţial fecalel
sunt păstoase, apoi albicioase-gălbui, cu mucus, de consistenţă lichidă şi urât mirositoare.
Rareori se observă fecale striate cu sânge. Defecările sunt dese, apetitul este diminuat,
rareori anorexie. Animalele se deshidratează şi în 2-3 zileslăbesc, devin abătute,
miastenice. Terapia cu antibiotice este ineficace. Evoluţia poate fi letală în 3-7 zile, iar
subiecţii care supravieţuiesc prezintă accese de diaree repetate şi rămân subponderali. În

25
general tabloul clinic este mai grav când criptosporidioza se manifestă imultan cu
colibaciloza, eneteroviroze sau alte parazitoze digestive.

Morbiditatea, variabilă, cuprinde 5% sau alteori depăşeşte 50% din efectiv, mai
ales la viţei, purcei şi miei. Mortalitatea poate cuprinde 5-60%.

Diagnosticul. Este realizabil recurgând la colaborarea datelo clinice, morfo- şi


histopatologice şi paraclinice.

Clinic, apariţia sindromului diareic neonatal până în jurul vârstei de 35-40 de zile
este comună şi altor afecţiuni. Pentru certitudine se recurge la examenul microscopic al
fecalelor, prin metode selective. Din probele de fecale se fac frotiuri şi se colorează prin
metodele: Ziehl-Nielsen modificată (Henricksen) – oochisturile apar roşii pe fundal
albastru; Gunther – oochisturile sunt roşii-violete pe fond albastru; carbol-fuxină.

La cadavre frotiurile se fac din raclat de mucoasă lezionată, însă în sezonul cald
trebuie avut grijă a le efectua în primele ore de la moarte, deoarece procesele de
putrefacţie lizează în circa 5-6 oochisturile. Examenul microscopic se face cu obiectivul
de 40x. Histologic, pe probe din segmente intestinale, bursa Fabriciu sau pulmonare,
recoltate imediat după maorte şi colorate cu H.E., PAS Giemsa, albastru de toluidină,
Masson, se evidenţiază pe suprafaţa eneterocitelor forme evolutive ale crisposporidiilor.
Din metode selective, cea mai eficientă este metoda Henricksen.

Examenul de sondaj în colectivităţi de animale se poate realiza prin metode


coproscopice de concentrare a oochisturilor prin floataţie cu soluţie zaharată. Soluţia
suprasaturată de clorură de sodiu distruge oochisturile. Examenul preparatelor se face la
microscop optic sau cu contrast de fază.

Diagnosticul serologic este realizabil prin IFI (imunofluorescenţa indirectă) care


are sensibilitate şi specificitate, iar anticorpii persistă peste un an. Pentru dagnostic se
poate folosi antiser de iepure preparat prin inoculare de oochisturi şi frotiuri de fecale.

Diagnosticul etiologic se bazează pe existenţa triadei: manifestare clinică,


prezenţa lexiunilor şi a formaţiunilor evolutive ale criptosporidiilor.

Diagnosticul diferenţail se face enteropatii cu altă etiologie: colibaciloză - diareea


apare în primele 48 de ore de la naştere; enteroviroze- cu contagiozitate mai ridicată şi

26
evoluţie mai gravă; eimerioze – debutul clinic este mai tardiv, după 1-21 zile de la
naşterea animalelor, diareea adesea hemoragică, mortalitate mai ridicată. În cazul
evoluţiei criptospordiozei asociate cu alte maladii se impun investigaţii paraclinice
suplimentare.

O altă aplicare a PCR a fost în cazul stabilirii asemănărilor şi deosebirilor dintre


două specii ale aceluiaşi gen. Este cazul speciilor Cryptosporidium parvum şi C. wrairi.
În acest scop s-a folosit ADN din oochisturi

Bibliografie:

1. Hyman A. Jennifer, Johnson K. Linda, Tsai M.M., OʼLeary J.T., 1995, Specificity of
Polymerase Chain Reaction identification of Taxoplasma gondii infection in paraffin-
embedded animal tissues, J Vet Diagn Invest 7:275–278;

2. Johnson A.M., Roberts Helen, Terter M. Astrid, 1992, Evaluation of a recombinat


antigen ELISA for the diagnosis of acute toxoplasmosis and comparison with traditional
antigen ELISAs, J. Med. Microbiol., Vol. 37, pp. 404–409;

3. Şuteu I., Cozma V., 2004, Parazitologie Clinică Veterinară, Vol. 1, Ed. Risoprint,
Cluj-Napoca;

4. Technical Summary – Focus Diagnostics Reference Laboratory Services, Toxoplasma


IgG Avidity Testing – A powerful tool for distinguishing recent from past Toxoplasma
infection, Focus Diagnostics, Cypress, California, USA, www.focusdx.com;

5. United States Animal Health Association, ed. 2008, Foreighn Animal Disease, Ed.
Boca Publications Group Inc., Canada;

6. World Organisation for Animal Health, 2008, Manual of Diagnostic Tests and Animal
Vaccins for Terrestrial Animals, ed. a 6-a, vol. 2, Paris, Franţa;

7. Marinescu D., Gherman I. 2001, Mecanismepatogenetice în giardioză, Scienţia


Parasitologica 1, 11-14, Spitalul Clinic de Urgenţă din Bucureşti;

27
8. Dulceanu N. 2002, Rolul biologiei moleculare în parazitologia veterinară, Scienţia
Parasitologica 1, 35-42, Facultatea de Medicină Veterinară Iaşi;

9. www.3vet.ro;

10. www.wikipedia/criptosporidioza.com;

11. www.giardia.org.

28