UNIVERSITATEA ”ALEXANDRU IOAN CUZA” DIN IAȘ I

FACULTATEA DE BIOLOGIE
MASTER BIOTEHNOLOGII CELULARE SI MICROBIENE

Reacția de polimerizare în lanț (PCR)

Proiect realizat de
Jîtcă Estera-Alice (că s. Aurică )

IAȘ I
2020
Cuprins
Introducere................................................................................................................................................. 1

Reacția de polimerizare în lanț (PCR).............................................................................................. 2

1.1. Principii generale................................................................................................................ 2

1.2. Denaturarea........................................................................................................................... 4

1.3. Atașarea primerilor la ADN............................................................................................. 5

1.4. Extensia................................................................................................................................... 6

1.5. Amplificarea genei tinta de ADN................................................................................... 8

1.6. Validarea și secvențierea ampliconilor......................................................................8

1.7. Reacția de secvențiere....................................................................................................... 9

Componentele reacţiei PCR............................................................................................................... 11

Variante tehnice şi aplicatii ale tehnologiei PCR....................................................................... 12

Concluzii.................................................................................................................................................... 15

Bibliografie:.............................................................................................................................................. 16
 Introducere
Progresele realizate în domeniul biologiei moleculare au necesitat extinderea și
aprofundarea cunoștințelor în domenii conexe (biochimia, microbiologia, genetica, fizica,
matematica).
Printre metodele specifice biologiei moleculare cu aplicabilitate, în investigarea
acizilor nucleici o importanță majoră prezintă secvențierea ADN, hibridizarea, detectarea
prin sonde moleculare, evaluarea polimorfismului lungimii fragmentului de restrictive
(RELP), metoda utilizată pentru prima dată de David Botstein (1978), determinarea
fragmentelor de acizi nucleici, reacția de amplificare prin polimerizare în lanț (PCR).
Reacția de polimerizare în lanț, descoperită de Mullins în anul 1986, a schimbat pe
deplin cursul studiilor în domeniul geneticii populaționale și al biologiei conservă rii.
Metoda a permis caracterizarea unui numă r mare de fragmente de ADN (marker genetici)
la numeroși indivizi, într-un timp relativ scurt (Bertorelle et al, 2009).
Pornind de la descoperirea tehnicii PCR, un pas important pentru genetica
moleculară , numeroase tehnici s-au dezvoltat rapid ulterior și au fost folosite cu succes
pentru identificarea pă rinților, a urmașilor sau a indivizilor înrudiți atâ t din populațiile
aflate în captivitate, câ t și din cele să lbatice.
Reacţia PCR (Polymerase Chain Reaction = Reacţie de Polimerizare în Lanţ) este o
metodă de amplificare enzimatică in vitro a unei anumite secvenţe de ADN. În prezent a
fost dezvoltată o adevarată tehnologie PCR care este folosită într-o varietate foarte mare de
domenii: biologie moleculară , ştiinţele mediului, criminalistică , ştiinţe medicale,
biotehnologie, microbiologie, industria alimentară , epidemiologie etc.

1
 Reacția de polimerizare în lanț (PCR)

1.1. Principii generale

Reacția de polimerizare în lanț – PCR (Polymerase Chain Reaction) constituie o

tehnică dezvoltată relativ recent pentru amplificarea in vitro a secvențelor de ADN. Într-un
timp foarte scurt tehnica s-a transformat într-o unealtă atâ t de analiză a genelor câ t și a
tehnicilor de recombinare, permițâ nd detectarea ADN din celule individuale și
determinarea secvențelor provenite chiar și de la speciile dispă rute. Aceasta se datorează
sensibilită ții extrem de ridicate a acestei metode, capabilă de a detecta chiar și o singură
moleculă de ADN dintr-o secvență specifică , în prezența unui exces de secvențe de ADN de
106 ori mai mare (Schleif, 1993).
Principiul de bază al reacției enzimatice a fost pentru prima dată descris de că tre
Kleppe și Khorana în anul 1970, însă ei nu aveau posibilitatea de a realiza această tehnică
în forma procesului automat în care se desfă șoară astă zi (Kleppe et al., 1971). Metoda a fost
introdusă în anul 1985 de că tre Kerry B. Mullins , în California, și a pornit de la o schemă
teoretică menită să realizeze secvențe dideoxinucleotidice limitate ale unei gene umane
folosind oligonucleotide sintetice, în scopul diagnostică rii mutaților apă rute în bolile
comune umane (Mullins, 1990). Această metodă a fost mai întâ i folosită pentru
amplificarea ADN codificant pentru β-globină și pentru diagnosticul prenatal al siclemiei
(Saiki et al., 1985). La început pentru extinderea primerilor atașați s-au folosit fragmente
Klenow din ADN polimeraza I de la Escherichia coli, însă enzima a fost inactivată de
temperaturile ridicate necesare pentru denaturarea ADN bicatenar. De aceea în timpul
fiecă rui ciclu trebuia adă ugată enzimă proaspă tă . În ceea ce privește polimeraza utilizată în
prezent, ea are o caracteristică specială ce o face superioară enzimelor utilizate la început și
anume faptul că este stabilă la temperaturi mari. Datorită acestui aspect, nu mai trebuie
adă ugată în fiecare ciclu de amplificare, deoarece enzima nu este inactivată . Această

2
polimerază a fost izolată dintr-o bacterie numită Thermophilus aquaticus, care tră iește în
izvoarele termale. De aici ea a primit și numele de Taq-polimeraza.
Tehnica PCR se bazează pe de o parte pe capacitatea organismelor de a-și replica
propriul ADN, iar pe de altă parte, pe comportamentul specific al majorită ții polimerazelor
de a recunoaște și a se atașa temporar la ADN monocatenar, într-un punct adiacent unei
porțiuni bicatenare. Odată atașate, aceste polimeraze utilizează deoxi-nucelosid-trifosfații
adă ugați în mediul de reacție precum și energia stocată în legă turile fosforice pentru
atașarea nucleotidelor la catena de ADN , sintetizâ nd astfel un nou lanț bicatenar (Hillis et
al., 1996). Întregul proces implică de asemenea repetarea unor cicluri termice, fiecare ciclu
fiind alcă tuit din 3 pași: primul pas constă în denaturarea ADN dublu-catenar, la o
temperatură mai mare de 90oC, urmează apoi o scă dere a temperaturii pentru atașarea
primerilor, iar în cele din urmă temperatura este ușor ridicată pentru extinderea catenei de
ADN cu ajutorul polimerazei și a deoxi-nucleosid-trifosfaților (Pü hler, 1993).
Orice genă , chiar și din genomurile cele mai complexe poate fi amplificată în mod
specific prin această metodă , atâ ta timp câ t secvențele de nucleotide care flanchează
regiunea țintă sunt cunoscute (Nguyen et al., 2006).
Primerii constituie perechi de secvențe nucleotidice de dimensiuni mici sintetizate
artificial, complementare fiecă rei regiuni care flanchează gena de interes, unul dintre ei
fiind complementar catenei directe, iar celă lalt fiind complementar catenei reverse.
Reguli de desemnare a primerilor:
 lungimea primerilor trebuie să fie cuprinsă între 20 şi 35 de nucleotide,
acest lucru permiţâ nd
 selectarea unei temperaturi de hibridizare ridicate.
 primerii trebuie să conţină un numă r aproximativ egal din cele patru baze
azotate, evitâ ndu-se pe câ t posibil regiunile cu repetiţii de nucleotide
(evitare structuri hairpin).
 perechile de primeri trebuie alese astfel încâ t să nu prezinte
complementaritate la nivel intra- şi interindividual (evitarea dimerlor de
primeri).

3
  distanţa dintre doi primeri la nivelul matriţei trebuie să fie mai mică de 5-
10 kpb, dar s-a observat o eficienţă foarte scă zută a reacţiei în cazul în care
lungimea produsului de amplificare depă şeşte 3 kpb.
 determinarea cu exactitate a temperaturii optime de hibridizare (annelare)
prin realizarea unei reacţii PCR în gradient de temperatură .
Pentru realizarea reacției PCR, mici cantită ți de ADN (de ordinul microgramelor)
sunt combinate cu primerii, deoxinucelotid trifosfații, tampon de reacție, Taq-polimeraza,
precum și co-factori pentru polimerază , cum este magneziul, în general adă ugat sub formă
de clorură de magneziu. Tot acest amestec funcționează în mod repetat, copiind secvența
de ADN dintre primeri la o viteză de reacție și specificitate determinate în special de
temperatură , iar rezultatul amplifică rilor va depinde de interacțiunile eficiente dintre toți
acești compuși.
Un ciclu de amplificare este alcă tuit, după cum am precizat, din 3 pași: denaturarea
ADN, atașarea primerilor și elongarea.

1.2. Denaturarea

În această fază ADN bicatenar este denaturat la ADN monocatenar, datorită

temperaturii ridicate (Figura 1). Trebuie folosită o temperatură de peste 90°C, în general
preferâ ndu-se temperatura de 94°C. Încă lzirea insuficientă sau exagerată pe parcursul
etapei de denaturare duce la imposibilitatea desfă șură rii reacției de polimerizare. De
asemenea și timpul de denaturare este foarte important, deoarece o denaturare prelungită
poate reduce activitatea enzimei Taq-polimeraza. Spre exemplu, după 30 de cicluri de
denaturare a câ te 60 de secunde fiecare, Taq polimeraza își pierde aproape jumă tate din
activitate. În general, echilibrul optim între temperatură și durată , este de 30 de secunde la
94°C. Este foarte important însă ca reacția să atingă o temperatură și durată la care să se
producă complet separarea lanțurilor, astfel că de multe ori este recomandată o durată de
60-120 de secunde pentru temperatura de 94-95°C.

4
 Figura 1 Etapa de denaturare a ADN din timpul reacției PCR
(http://backtobiobasics.blogspot.com/)

1.3. Atașarea primerilor la ADN

Acest proces se realizează prin scă derea temperaturii soluției la 50-60oC timp de 15
secunde pâ nă la 2 minute. Temperatura la care are loc atașarea se calculează în funcție de
structura primerilor. Expunerea limitată la temperaturi înalte ajută la menținerea activită ții
polimerazei la cote maxime pe parcursul reacției. Atașarea primerilor poate depinde de
concentrația primerilor, disponibilitatea locurilor de atașare sau prezența unor poziții de
atașare non-ideale. În timpul în care temperatura este coborâ tă de la etapa de denaturare,
primerii se mișcă aleator în mediul de reacție, conduși de mișcarea browniană (Figura 2).
Dacă temperatura de aliniere este prea mare nu toate moleculele de primer se vor atașa de
ADN, iar dacă este prea mică pot avea loc alinieri nespecifice, generâ nd astfel produși PCR
nedoriți (Hillis et al., 1996).

Figura 2 Atașarea primerilor la matrița de ADN

(http://backtobiobasics.blogspot.com/)

5
 1.4. Extensia

Fiecare ciclu se termină cu câ teva minute (15 secunde pâ nă la 3 minute), la 68oC, în

cursul că rora ADN polimeraza specială alungește secvența primerilor, sintetizâ nd replicile
catenelor ADN țintă , adă ugâ nd deoxiribonucleotide la capă tul 3ʼ al fiecă rui primer (Figura
3). În ce privește temperatura, polimeraza Taq funcționează bine la 72°C.

Figura 3 Extensia ADN

(http://backtobiobasics.blogspot.com/)

Taq polimeraza se leagă atâ t de matrița de ADN monocatenar câ t și de deoxi-

nucleotid-trifosfații care se gă sesc în mediul de reacție și utilizează energia stocată în
legă turile trifosfat pentru a cataliza reacția de atașare a nucleotidelor la a doua catenă a
ADN. Enzima se mută apoi la noul capă t dublu-catenar procesul fiind repetat de sute și
chiar mii de ori pe secundă . ADN polimeraza este unidirecțională . Începe prin a sintetiza
capă tului 3' al moleculei dublu catenare și sintetizează ADN nou în direcția 5'-3'. Cu toate
acestea, natura bipolară a celor două catene complementare ale helixului standard, face
posibil ca o polimerază să sintetizeze oricare din catene.
Cele mai multe reacții PCR au 20 - 40 asemenea cicluri. Termocycler-ul ridică și
coboară ciclic temperatura amestecului de reacție, sub coordonarea riguroasă a unui
computer. De obicei, rata de încă lzire este de 0,3°C pe secundă și cea de ră cire de 1°C pe
secundă , pentru un singur ciclu de aproximativ 3,55 minute. Teoretic, după 30 de cicluri,
fiecare genă țintă este amplificată de 230ori.

6
7
 1.5. Amplificarea genei tinta de ADN

Amplificarea secvenţei ADN ţintă folosind primeri specifici nemarcaţi fluorescent

prin reacţie PCR clasic. Fragmentul amplificat trebuie să aibă maxim 1500 pb şi pentru o
amplificare corectă trebuie optimizată temperatura de anelare.
Procesul de amplificare a constat în 3 etape prezentate în Figura 4, temperatura de
aliniere a primerilor fiind de 52°C.

Figura 4 Etapele programului de amplificare a genei COI

1.6. Validarea și secvențierea ampliconilor

Electroforeza produșilor PCR în gel de agaroză

La încheierea programului PCR, are loc verificarea prin electroforeza în gel de
agaroză a produșilor obținuți.
Viteza migrării ADN în gelul de agaroză depinde de:
 mărimea moleculară a fragmentelor de ADN: ADN dublu-catenar
migrează în gelul de agaroză invers proporțional cu log10 al numă rului
perechilor de baze (Higgins, 1994). Astfel moleculele mai mari vor migra mai
puțin, în timp ce cele mai mici vor migra mai mult.

8
  concentrația gelului de agaroză: există o relație liniară între logaritmul
mobilită ții electroforetice a ADN(μ) și concentrația gelului (t) descrisă prin
ecuația:
 log(μ) = log μ0 - Kt x t,
 unde μ0 este mobilitatea electroforetică liberă a ADN iar Kt este coeficientul
de întâ rziere, o constantă legată de proprietă țile gelului și mă rimea și forma
moleculelor ce migrează .
 conformația ADN: ADN circular superspiralizat (forma I), ADN circular
întrerupt (forma II) și ADN liniar (forma III) migrează în rate diferite în gelul
de agaroză (Thorne, 1966). Mobilitatea relativă a celor 3 forme de ADN
depinde atâ t de concentrația și tipul de agaroză utilizată în prepararea
gelului câ t și de voltajul curentului aplicat și puterea ionică a tamponului.
 prezența bromurii de etidiu: intercalarea bromurii de etidiu poate cauza o
scă dere a încă rcă rii negative a ADN dublu catenar și o creștere a durită ții și
lungimii lui (Sharp et al, 1973).
 Migrarea ampliconilor de interes în gel de agaroză a fost realizată diferențiat
în funcție de lungimea acestora și de concentrația gelului electroforetic.

1.7. Reacția de secvențiere

Această etapă are ca scop identificarea ordinii bazelor azotate, (adenina, guanina,
citozina și timina), din cadrul genelor de interes, ordine care influențează dezvoltarea și
funcționarea organismelor vii. Rezultatul secvențierii îl constituie obținerea unor
fragmente de ADN, aparținâ nd catenelor directă și reversă , care trebuie să se suprapună ,
putâ nd fi ulterior ală turate într-o secvență unică (Lewin, 2004).
Secvențierea ADN prin metoda finaliză rii lanțului (Chain Termination) a fost
dezvoltată de Sanger, în 1975. Aceasta se realizează in vitro utilizâ nd un template ADN
purificat în prealabil, în prezența polimerazei, a primerilor oligonucleotidici, a unor
amestecuri de deoxinucleotid trifosfați (dNTP) și a unor dideoxinucleotid trifosfați marcați
fluorescent (ddNTP). Polimereaza sintetizează lanțul polinucleotidic adiționâ nd dNTP,
pâ nă în momentul încorporă rii unui ddNTP, moment în care elongarea lanțului se oprește.

9
Această oprire, duce la formarea unui mix de lanțuri ADN cu lungimi diferite, care pot fi
separate prin electroforeză capilară . Kitul de secvențiere GenomeLab Dye Terminator Cycle
Sequencing (Beckman Coulter) conţine ddNTP marcate fluorescent, care sunt încorporate
în poziția finală a lanțului polinucleotidic de ADN sintetizat, fiecare ddNTP (A, C, G, T)
avâ nd o fluorescență diferită . Catenele de ADN avâ nd încorporate nucleotidele fluorescente
sunt apoi separate, detectate și analizate, obținâ ndu-se la final secvența nucleotidică a
fragmentului de interes.
Etapele reacției PCR de secvențiere sunt prezentate în Figura 5

Figura 5 Etapele programului PCR a reacției de secvențiere

10
 Componentele reacţiei PCR
Rezultatul reacţiei PCR este dependent de determinarea experimentală a
concentraţiei optime a componentelor amestecului de reacţie.
1. Matriţa ADN poate fi: ADN genomic, mitocondrial, viral, ADNc (caz particular
ARN total – RTPCR).
2. Tamponul de reacţie: furnizează pH optim al polimerazei utilizate şi
concentraţia optimă a ionilor Mg2+, acivatorii ADN polimerazei (cantită ţile insuficiente de
Mg2+ duc la amplifică ri slabe, iar cantită ţile crescute conduc la cumularea de produşi de
amplificare nespecifici). Cel mai comun tampon (pH 8,3) folosit conţine: Tris-HCl KCl şi
gelatină .
3. dNTP: sunt livrate fie sub forma a patru soluţii stoc individuale, fie sub forma
unui amestec al celor patru nucleotide. Soluţiile sunt ajustate la o valoare optimă de pH.
Concentraţia optimă de dNTP depinde de: concentraţia de MgCl2, conc. primerilor,
lungimea fragmentului ce urmează sa fie amplificat şi numă rul de cicluri de reacţie.
4. ADN polimeraza: iniţial s-a folosit fragmentul Klenow al ADN polimerazei din E.
Coli. Ulterior au fost descoperite şi utilizate ADN polimeraze termostabile ca:
 -Taq/Amplitaq ADN polimeraza – izolată din Thermus aquaticus. Viteza
optimă de polimerizare este de 35-100 nucleotide/s la 70-80°C. Enzimele au
o activitate 5’-3’ exonucleazică care permite înlă turarea nucleotidelor situate
în faţa lanţului de creştere.
 -AmpliTaq polimeraza are aceleaşi proprietă ţi cu Taq polimeraza dar este
produsă în E. Coli prin recombinare genetică . Reproductibilitatea şi puritatea
acesteia este mult mai mare decâ t a Taq polimerazei simple.
5. Apa ultrapură: se utilizează exclusiv apă ultrapurificată , nuclease-free, livrată de
firme specializate.
6. Primerii

11
 Variante tehnice şi aplicatii ale tehnologiei PCR
Marele avantaj al tehnicilor PCR îl reprezintă faptul că permite obţinerea unei
cantită ţi mari dintr-o anumită secvenţă ADN, fă ră a necesita clonarea acesteia în prealabil
într-o moleculă de tip vector. Pe de altă parte, tehnologia PCR a revoluţionat şi implicarea
geneticii moleculare în domenii în care se apelează la cantită ţi foarte mici de ADN.
Asemenea situaţii se întâ lnesc în :
 diagnosticul unor boli monogenice, precum şi detectarea de noi tipuri de
mutaţii în gene importante în anumite boli;
 diagnosticul unor infecţii umane: permite detectarea particulelor infecţioase
bacteriene şi virale chiar aflate într-o proporţie mică , chiar pentru specii ce
se cultivă dificil in vitro, chiar pentru patogeni cu variabilitate antigenică
mare, şi chiar pentru patogeni ce au perioadă mare de latenţă ; astfel, pot fi
identificaţi indivizii umani pozitivi înainte de seroconversie;
 studii privind mecanismele genetice ce acompaniază procesele maligne
(detectarea secvenţei şi ţesutului în care se exprimă anumite oncogene în
diverse procese maligne);
 studii de taxonomie, sistematică şi filogenie moleculară : obţinerea rapidă a
unei cantită ţi mari din secvenţe ADN cu valoare taxonomică şi/sau
filogenetică ;
 biologia populaţiilor, inclusiv la organisme mici: tehnologia PCR permite
secvenţierea rapidă a unor molecule de ADN de la foarte mulţi indivizi, fă ră a
necesita în prealabil clonarea acestora;
 -studii de antropologie: tehnica PCR permite în prezent recuperarea şi
analiza unor secvenţe ADN din fosile;
 medicină legală : cu ajutorul reacţiilor PCR pot fi în prezent analizate la nivel
molecular o serie întreagă de probe biologice. In afară de toate aceste
aplicaţii directe ale tehnologiei PCR, pornind de la reacţia iniţială de
amplificare, au fost imaginate o serie întreagă de variante tehnice ce permit
abordarea unor manipulă ri câ t mai acurate a moleculelor de acizi nucleici.

12
  bază pentru tehnica PCR-RFLP prin care se detectează mutaţii punctiforme şi
SNPs
 bază pentru tehnica de secvenţiere prin care se pot detecta mutaţii
punctiforme şi SNPs

Poate cel mai important avantaj al tehnologiei PCR este capacitatea sa de a

cuantifica acizii nucleici pe un interval dinamic extraordinar de larg (cel puțin 5 unită ți).
Aceasta este cuplată la o sensibilitate extremă , permițâ nd detectarea a mai puțin de cinci
exemplare (poate doar o copie în unele cazuri) dintr-o secvență țintă , ceea ce face posibilă
analiza eșantioanelor mici, cum ar fi biopsiile clinice sau lizații miniscule din microdisecția
cu captura laser. Cu standarde și calcule interne adecvate, coeficienții medii de variație
sunt de 1-2%, permițâ nd analiza reproductibilă a modifică rilor subtile ale expresiei genice
chiar și la niveluri scă zute de expresie (22, 29).
Probabil că cea mai mare limitare actuală a PCR-ului în timp real nu este inerentă
tehnologiei, ci mai degrabă rezidă în eroarea umană : dezvoltarea incorectă a testului,
analiza incorectă a datelor sau concluziile nejustificate. În experiența noastră folosind PCR
în timp real pentru analiza expresiei genice, seturile de primer PCR în timp real trebuie să
fie proiectate și validate după criterii stricte pentru a asigura specificitatea și acuratețea
rezultatelor. Pentru microbiologie, trebuie să se ia în considerare falsele pozitive sau
negative atunci câ nd se proiectează un test pentru detectarea agenților patogeni. Curbele
de amplificare și topire trebuie inspectate vizual, în timp ce calculele independente pe baza
acestor curbe trebuie verificate de două ori.
În afară de toate aceste aplicaţii directe ale tehnologiei PCR, pornind de la reacţia
iniţială de amplificare, au fost imaginate o serie întreagă de variante tehnice ce permit
abordarea unor manipulă ri câ t mai acurate a moleculelor de acizi nucleici.
În prezent, PCR poate detecta o mare varietate a infecţiilor, inclusiv, infecţiile
“ascunse” ale că ilor genitale, care nu se manifestă prin niciun simptom.

13
 În cele mai multe centre de diagnostic prin PCR este posibilă detectarea
urmă toarelor infecţii:

Denumirea bolii Ce microb este detectat?

Hepatita B şi C Virusul hepatitei B, C

Clamidioza organelor respiratorii Chlamydia trachomatis

şi genitale

Ureaplasmoza organelor genitale Ureaplasma urealiticum

Ureaplasma parvum

Micoplasmoza că ilor respiratorii Mycoplasma hominis,

şi a organelor genitale Mycoplasma genitalium

Candidoza genitală Candida albicans

Vaginita bacteriană (Gardnerella) Gardnerella vaginalis

Tricomonaza Trichomonas vaginalis

Mononucleoza infecţioasă Virusul Epstein-Barr (EBV)

Tuberculoza Mycobacterium tuberculosis

Infecţia cu papilloma virus uman Papilloma virus uman (inclusiv,

(HPV) tipurile lui oncogenice: 16, 18,
31, 33, 45, 51, 52, 56, 58, 59)

HIV (SIDA) Virusul imunodeficienţei umane

Infecţia cu herpes Viruşii Herpes simplex de tipuri

1 şi 2

Helicobacterioza Helicobacter pylori

Gripa Virusurile gripei A și B

14
 Concluzii
Ca instrument de cercetare, o aplicație majoră a acestei tehnologii este evaluarea
rapidă și precisă a schimbă rilor în expresia genelor ca urmare a fiziologiei, fiziopatologiei
sau dezvoltă rii.
Această metodă poate fi aplicată la sistemele model pentru a mă sura ră spunsurile
la stimuli experimentali și pentru a obține o perspectivă asupra modifică rilor potențiale ale
nivelului și funcției proteice. Astfel fiziologia poate fi corelată cu evenimentele moleculare
pentru a obține o mai bună înțelegere a proceselor biologice.
Laboratoarele de diagnosticare pentru microbiologie clinică pot folosi PCR în timp
real pentru a detecta modifică rile încă rcă turii virale. Deoarece sarcina virală și severitatea
bolii sunt corelate, PCR în timp real poate mă sura progresia bolii și eficacitatea terapiilor
antivirale.
Detectarea rapidă a unor boli sau anolmalii permite clinicianului să prescrie
imediat terapii antibiotice mai bine direcționate și ar putea, pe termen lung, ajuta la
reducerea utiliză rii antibioticelor cu spectru larg, ceea ce poate încuraja apariția tulpinilor
rezistente la antibiotice.
Introducerea tehnologiei PCR în timp real a îmbună tă țit și simplificat semnificativ
cuantificarea acizilor nucleici, iar această tehnologie a devenit un instrument de neprețuit
pentru mulți oameni de știință care lucrează în diferite discipline. În special în domeniul
diagnostică rii moleculare, testele bazate pe PCR în timp real au câ știgat favoarea în trecutul
recent. Cu toate acestea, utilizarea pe scară largă a metodelor PCR în timp real a evidențiat,
de asemenea, unele dintre punctele critice și limită rile acestor analize. Aceste aspecte
trebuie luate în considerare pentru a crește fiabilitatea datelor obținute.

15
Bibliografie:
1. BENSON R, TONDELLA ML, BHATNAGAR J et al. 2008, Development and
evaluation a novel multiplex PCR technology for molecular differential
detection of bacterial respiratory disease pathogens.
2. CHEN, B-Y. si JANES, H. W. (2002), PCR Cloning Protocols (second edition),
Totowa, Neew Jersey: Humana Press
3. HEID CA, STEVENS J, LIVAK KJ, WILLIAMS PM. Real-time quantitative PCR.
Genome Res 1996; 10 : 986-94
4. HILLIS D. M., MORITZ C., MABLE M., BARBARA K., 1996 - Molecular systematics
– second edition, Sinauer Associates, Inc, 472-512
5. HILLIS D. M., MORITZ C., MABLE M., BARBARA K., 1996 - Molecular systematics
– second edition, Sinauer Associates, Inc, 472-512.
6. INNIS, M.A., GELFAND, D.H AND SNINSKY, J (1995) PCR strategies, Academic
Press, San Diego, California
7. KLEPPE K., OHTSUKA F., KLEPPE R., MOLINEUX I., KHORANA H. G., 1971 -
Journal of Molecular Biology, Studies on Polynucleotides, 56, 341-361
8. LEWIN B., 2004. Genes VIII. Ed. Pearson Prentice Hall
9. MARK A. VALASEK AND JOYCE J. REPA, 2005, Advances in Physilogy
Education,Vol 29, Nr 3, pag 151-159
10. MULLINS K. B., 1990 - Specktrum Wiss, Eine Nachtfahrt und die Polymerase-
Kettenreaktion, 6, 60-67.
11. NGUYEN T. T. T, HURWOOD D., MATHER P, NA-NAKORN N., KAMONRAT W.,
BARTLE D., 2006. Manual on application of molecular tools in aquaculture and
inland fisheries management. Part I: conceptual basis of population genetic
approaches, Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific, Bangkok, 29-35.
12. O’CONNELL J, 2002, RT-PCR Protocols in Methods in Molecular Biology, vol
193, Humana Press, Totowa, New Jersey.
13. PÜ HLER A., 1993. Genetic engineering of microorganisms. VCH, Weinheim,
Germany, p. 178.

16
14. Rapley, R. . (Methods in molecular medicine) (2008)PCR sequenching
protocols, Humana Press, Totowa, NJ.
15. SAIKI R. K., SCHARF S., FALOONA F., MULLIS K.B., HORN G.T., ERLICH HA.,
ARNHEIM N., 1985 - Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences
and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230,
1350-1356.
16. THOMPSON J. D., HIGGINS D. G. & GIBSON T. J., 1994 - CLUSTAL W: improving
the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence
weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic
Acids Res, 22(22), 4673-4680.

17