DIAGNOSTICUL PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE INTERES CLINIC Ziua I

Frotiu coloratie Gram

Exsudat
nasofaringian
(2 tampoane)

Insamantare Geloza sange

Examinare macroscopica (culoare, sediment, turbiditate, miros)

Examen citologic calitativ
din sedimentul urinar (centrifugare la 1200-1800
rpm/10 min.) pe preparat lama/lamela si frotiu colorat
Gram
Urocultura

Urina
Repartizare sterila a cate 2 ml
in 2 tuburi sterile

Din dilutii 1/10 si 1/100 insamantat cate 0.1

ml cu pipeta de sticla sau cu ansa calibrata pe
mediu Mac Conkey (MC) si Geloza sange

Examinare macroscopica: consistenta, paraziti, melena

Preparat
(GS) lama/lamela

Materii
fecale
Suspensie in AFS

Examinare microscopica

Frotiu coloratie Gram

Frotiu coloratie albastru metilen (fungi)

Coprocultura
insamantare direct din coprorecoltor

Insamantare pe Geloza sange

(GS)
Insamantare pe Geloza simpla
Insamantare pe Mac Conkey fara inhibitor
Insamantare pe Mac Conkey cu inhibitor
Insamantare pe Bile Salts Agar (BSA)
Insamantare pe Tioglicolat Citrat Bile Salts (TCBS)

DIAGNOSTICUL PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE INTERES CLINIC Ziua II

Exsudat faringian

Examinare

placa

Geloza

sange (aspect mono sau

polimorf,

prezenta

hemolizei, tipul hemolizei

Frotiu din colonii hemolitice

Pe geloza simpla (G)

Repicare numai colonii

hemolitice
(, hemoliza)
in cazul microbiotei polimorfe

Pe mediu (BP) Baird-Parker, Chapmann

Pe mediu Cetrimide Agar (CTA)
Pe mediu King A, King B
Pe mediu Geloza sange (GS)
Pe geloza sange (GS)

Repicare orice tip de colonie

(in cazul microbiotei
monomorfe)

Pe mediu BP, Chapmann

Pe mediu CTA
Pe mediu King A, King B

Urocultura

Examinare aspect placi (prezenta/absenta

microorganismelor, monocultura sau
polimorfism)

Crestere pe GS monocultura, absenta pe MC

Crestere pe GS, polimorfism, absenta pe MC
Crestere pe GS si MC, policultura

Crestere pe GS si MC, monocultura

Determinare UFC, coloratie Gram

Contaminare, eliminarea probei

Contaminare, eliminarea probei

Determinare UFC de pe MC
Identificare prin insamantare pe mediu
TSI, MIU, MILF, Citrat
API 20 E
Insamantare pe Geloza simpla (G)

DIAGNOSTICUL PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE INTERES CLINIC Ziua II-bis

Coprocultura

Examinare Geloza simpla

Microorganisme polimorfe

Examinare Geloza sange

(prezenta coloniilor
hemolitice)

Frotiu

Examinare BSA
(testul oxidazei din toate
tipurile de colonii dezvoltate)

Identificare prin insamantare pe mediu

TSI, MIU, MILF, Citrat
API 20 E
Insamantare pe Geloza simpla (G)

Identificare prin insamantare pe mediu

TSI, MIU, MILF, Citrat si
API 20 E pentru colonii oxidazo (-)
API 20 NE pentru colonii oxidazo (+)

Schema minima de teste biochimice pentru

identificarea vibrionilor holerici:

Examinare TCBS
(colonii galbene, de tip S)

fermentarea glucozei (tub Durham)

LDC, ODC, ADH + martor pentru decarboxilaze
Lactoza, zaharoza, manoza, manita, inozita, arabinoza,
adonita
Pentru colonii oxidazo (+)
Suspiciune Vibrio cholerae

DIAGNOSTICUL PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE INTERES CLINIC Ziua III

Testul catalazei/oxidazei din colonii crescute pe mediu geloza simpla

Examinarea cresterii pe BP, Chapmann

Prezenta cresterii

Exudat faringian

Examinarea cresterii pe CTA, King A, King B

Citirea rezultatelor de la testele biochimice:
Urocultura

TSI, MIU, MILF, Citrat, testul oxidazei de pe

geloza simpla

IIDENTIFICARE

Citire rezultate de la testele API 20E

Citirea rezultatelor de la testele biochimice:

Coprocultura

TSI, MIU, MILF, Citrat, testul oxidazei de pe

geloza simpla

Citire rezultate dela testele API 20E,

API 20 NE

IDENTIFICARE
Identificar
e

Identificare factori de virulenta prin

testul coagulazei libere,
coagulazei legate, termonucleazei

Evidentierea caracterelor biochimice ale microorgansimelor

Bacteriile prezint o mare diversitate biochimic i nu exist practic un substrat pe care ele s nul poat metaboliza, convertindu-l la nutieni sau metabolii eseniali. n cursul evoluiei, datorit
adaptrii lor specifice la biotopi foarte diveri, unele specii au pierdut anumite ci de sintez devenind
incapabile de a sintetiza anumii metabolii eseniali denumii factori de cretere (aminoacizi, vitamine,
baze purinice sau pirimidinice etc). Aportul acestor factori de cretere n mediul de cultur este
indispensabil pentru creterea bacteriilor auxotrofe, fa de cele protrotrofe, care sunt capabile s-i
sintetizeze toi constituenii proprii, fr aport exterior de factori de cretere.
Studiul proprietilor nutriionale i al metabolismului energetic bacterian permite diferenierea
diverselor categorii fiziologice de bacterii i st la baza identificrii bacteriene pe baza testelor
biochimice.
Principiul testelor biochimice: utilizarea unui substrat cunoscut coninut n mediul de cultur cu
compoziie cunoscut (glucide, proteine, aminoacizi, lipide etc.) sub aciunea exo- sau endoenzimelor
bacteriene, conduce la obinerea unor produi intermediari sau finali de metabolism evideniai prin
modificarea aspectului mediului de cultur, virajul indicatorilor de pH coninui n mediu sau prin
adugarea de reactivi.

Ilustrarea schematica a principiului testelor biochimice.

n functie de numrul caracterelor biochimice care se pot evidenia ntr-un anumit test, testele
biochimice se clasific n (I) teste conventionale, (II) sisteme multitest i (III) sisteme microtest.

I. TESTE BIOCHIMICE CONVENIONALE (INDIVIDUALE)

Metabolismul respirator
Testele biochimice din aceast categorie determin capacitatea unui microorganism de a utiliza n
mod specific un substrat de C, pe cale oxidativ la bacteriile aerobe stricte sau fermentativ la cele aeroanaerobe facultativ i la bacteriile strict anaerobe. Producerea de acizi este evideniat prin utilizarea de
indicatori de pH, cei mai frecvent utilizai fiind Rou-metil i Albastru de Brom-timol.
Sursa de C poate fi reprezentat de:
- oze : pentoze (lactoza, maltoza, zaharoza) sau hexoze (fructoza, manoza, galactoza);
- derivai de oze: alcoolii rezultai din reducerea ozelor (manitol, sorbitol, dulcitol, adonitol); derivaii
metilai ai pentozelor (metil pentoze), cel mai utilizat fiind L(+)-ramnoza;
- ozide: dihilozide (lactoza, maltoza, zaharoza); trihilozidele (rafinoza); poliozidele (inulina, polimer
al fructozei);
- heterozide: reprezentate de oze asociate la substane non-glucidice (esculina, amigdalina, salicina).
Respiraia aerob
Lanul respirator (sau lanul citocromic de transfer de electroni) este constituit din proteine de oxidoreducere localizate n membrana citoplasmatic care funcioneaz ca transportori

de electroni

(citocromi) sau ca oxidoreductaze (dehidrogenaze, citocrom-oxidaze).

Evidenierea enzimelor respiratorii citocromice
Testul

oxidazei. Detecteaz citocromul c, care determin albstrirea hrtiei de filtru impregnat cu

oxalat de dimetil-parafenilen-diamin (acceptor artificial de e -). Banda de hrtie de filtru

impregnat cu oxalat de dimetil-parafenilen-diamin se depune pe o lam microscopic curat i se
hidrateaz cu ap fiziologic steril (evitndu-se excesul de lichid). Ulterior, cu ajutorul ansei cu fir
de platin sau al unei pipete Pasteur nchise (se evit folosirea ansei cu fir metalic), se depune sub
form de spot cultura bacterian dezvoltat pe un mediu fr zaharuri. Apariia culorii albastre ntrun interval de cel mult 30 de secunde, indic o reacie pozitiv. Albstrirea tardiv a hrtiei de
oxidaz nu se consider reacie pozitiv.
Control de calitate: Pseudomonas aeruginosa - martor sigur (+); Salmonella spp., Proteus sp. - martor
sigur (-).

 Testul

rezistenei la KCN. Detecteaz citocromul d, natural rezistent la KCN, prezent la E. coli i la

alte enterobacterii.
Evidenierea enzimelor respiratorii non-citocromice (enzime de detoxifiere care protejeaz celula
bacterian fa de produii de reducere parial a O2-: ioni peroxid, superoxid etc)
Superoxid

dismutaza (SOD) transform radicalul SO n H2O2 (prezent la toate bacteriile, cu

excepia celor strict anaerobe).

Catalaza

- convertete H2O2 n O2 (nu este produs de bacteriile strict anaerobe i aerotolerante).

Producerea de catalaz se studiaz prin adugarea de solutie H 2O2 3% peste o cultur bacterian de
24h dezvoltat pe un mediu solid uzual (geloz simpl), iar reacia pozitiv se vizualizeaz prin
apariia efervescentei ca urmare a bulelor de O2 degajat.
Respiratia aeroba:

1/2O2 + 2H+ + 2eH2O2

catalaza

2H2O
H2O + 1/2 O2

Studiul catalazei este util n diferenierea genurilor Streptococcus sp. i Staphylococcus sp., Bacillus sp
i Clostridium sp.
Peroxidaza (catalaza) convertete H2O2 n H2O (nu este produs de bacteriile strict anaerobe).
Respiraia anaerob
Respiraia anaerob reprezint o cale energetic facultativ asociat ntotdeauna cu sistemul respirator
aerob i/sau fermentativ.
Respiraia nitrailor implic 2 enzime terminale distincte:
- nitrat reductaza de tip A (NAR A) este o enzim membranar cu rol n respiraie, a crei sintez este
indus n prezena nitrailor i clorailor i este reprimat n prezena O2:

2NO3H

2NO2H

2N-OH

N2O

N2

acid hiponitros

ClO3-

ClO2hipoclorit toxic ( determin oprirea creterii bacteriene)

- nitrat reductaza de tip B (NAR B) este o enzim solubil, citoplasmatic, constitutiv, care
funcioneaz att n aerobioz, ct i n anaerobioz, cu rol n asimilarea nitrailor cu formare de
NH4OH. Este inhibat de prezena clorailor n mediu:

2NO3H

2NO2H

2NOH
acid hiponitros

NH2OH

NH4OH
surs de N2 pentru bacterii

Evidenierea reductazelor bacteriene

Respiraia nitrailor: geloz profund cu NO3 (geloz gelatin Legroux)

- dezvoltarea uniform a culturii n tot tubul indic prezena respiraiei nitrailor, n timp ce absena
indic de dezvoltarea culturii exclusiv la suprafata mediului.

Reducerea nitrailor la nitrii: bulion simplu cu 1 nitrai

Reactivul Griess reveleaz prezena nitriilor n mediu: acid sulfanilic (Griess I) i -naftilamin (Griess
II) formeaz cu NO2 un complex de culoare roz-roie, prin formarea unui complex diazoniu (parasulfobenzen-azo- -naftilamin).
Absena culorii roii indic:
-

absena nitrat-reductazei; pentru a verifica prezena nitrailor se adaug Zn n mediu. Acesta va

reduce nitraii la nitrii, cu apariia unei culori roii-brune, datorate reducerii srii de diazoniu n arilhidrazin.

reducerea avansat a nitrailor, dincolo de stadiul de nitrii.

Rezultate fals negative sunt generate de lectura tardiv cu dispariia culorii roii prin evaporarea -

naftilaminei, de faptul ca unele specii, dei posed NAR, utilizeaz nitriii pe msur ce se formeaz,
mpiedicnd acumularea lor n mediu (ex. Salmonella sp., Pseudomonas sp., Brucella suis) sau de
adugarea unei cantiti mari de Zn care determin degajarea de H 2 gazos care reduce nitriii formai la
NH3.
Pentru detectarea nitrit-reductazelor se efectueaz reacia Griess, n mod similar, dar pe un mediu ce
conine nitrii.

Evidenierea tipului de nitrat-reductaz

NAR A - Geloz profund:

NAR B - Geloz profund:
Fr clorai
Cu clorai
Fr clorai
Cu clorai
Cretere uniform n Cretere intens la suprafa i Cretere omogen n toat masa
toat masa mediului

mai slab n profunzime (n mediului, NAR B nu utilizeaz

absena O2, NAR A utilizeaz cloraii i nu este inhibat de
cloraii genernd hipoclorit cu prezena O2
efect bactericid)

Aplicaii
Testele de reducere a nitrailor i nitriilor sunt indispensabile pentru caracterizarea enterobacteriaceelor
care, cu rare excepii reprezentate de mutante, posed nitrat-reductaze, ca i genurile Moraxella i
Vibrio, pentru diferenierea speciilor de Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium, Neisseria,
Campylobacter.

Alte reductaze detectate n practic:

-

Tetrationat reductaza (TTR) catalizeaz reducerea tetrationatului n tiosulfat cu acidifierea

mediului i virajul culorii de la albastru la galben (ap peptonat + Tetrationat + albastru de bromtimol):

S4O62-

S2O32-

Tiosulfat reductaza catalizeaz reducerea tiosulfatului la H2S:

S2O32-

H2S

H2S este detectat prin adugarea n mediu a unor sruri de Pb sau de Fe, care interacioneaz cu H 2S
i genereaz sulfuri de culoare neagr.
-

Fumarat reductaza

METABOLISMUL FERMENTATIV
Fermentaia este un ansamblu de reacii anaerobe de oxidare i reducere, generatoare de compui bogai
n energie, prin fosforilri la nivelul substratului. Glucoza reprezint un substrat fermentescibil universal
care poate fi metabolizat pe diferite ci.
La enterobacterii exist 2 tipuri de fermentaie a glucozei:
-

fermentaia acid mixt: produii majori de fermentaie sunt reprezentai de acetat, lactat, etanol i
formiat, molecule acide care determin acidifierea mediului de cultur (reacia RM pozitiv). Acest
tip de fermentaie este caracteristic enterobacteriilor VP-negative. Dac bacteriile posed formiat
hidrogen-liaz, are loc producere de gaz (HCOOH CO2 + H2O). Dac mediul conine nitrai sau
fumarat, formiatul nu este clivat, ci va fi oxidat pe alte ci de ctre o formiat dehidrogenaz tip I (FDH
I).

fermentaia butandiolic: n afar de fermentaia acid mixt, la aceste bacterii mai exist o cale
specific care va produce un compus final neutru, 2-3 butandiol, ceea ce determin meninerea pHului mediului la un nivel ridicat (reacie RM negativ). Aceast cale este caracteristic
enterobacteriilor VP-pozitive (Vibrio sp., Aeromonas sp., Bacillus sp.)

calea accesorie de fermentaie a glicerolului (cu formare de 1-3 propandiol) prezent la Klebsiella
pneumoniae, care permite reoxidarea coenzimei NADH+H+ excedentare.

Studiul practic al metabolismului fermentativ: atacul glucidelor

Glucidele studiate trebuie s constituie unica surs fermentescibil prezent n mediu. n aceste condiii,
utilizarea glucidului respectiv se traduce prin acidifierea mediului i virajul indicatorului colorat. Dac
pentru bacteriile care prezint metabolism fermentativ se utilizeaz de preferin Albastru de Brom-timol,
pentru bacteriile cu metabolism oxidativ se utilizeaz Rou fenol (rou la pH>8.4, galben la pH>6.8).

Testul de difereniere ntre cile de metabolizare oxidativ i

fermentativ a glucozei
Mediu Hugh Leifson sau MEVAG (Milieu pour lEtude de Voies dAttaque de Glucose): mediu
gelozat care conine peptone + glucoz + Rou fenol
- se regenereaz 2 tuburi de mediu la bain Marie timp de 20 minute i se adaug glucoza n
concentraie final de 1%. Mediul se solidific prin rcire sub jet de ap rece si se nsmneaz prin
nepare cu ansa cu fir drept, utilizndu-se pentru inoculare o suspensie bacterian dens realizata n AFS
( etalon 2/ 3 MacFarland). Pentru unul din tuburi, se acoper mediul cu un strat de ulei de parafin de 2
cm. Ambele tuburi se incubeaz 24 de ore la temperatura corespunztoare exigenelor de cretere ale
bacteriei respective.
Ap peptonat + substrat fermentesciblil + tub Durham + Albastru de Brom-timol (pH alcalin
albastru, pH acid galben) sau rosu fenol (pH alcalin rosu, pH acid galben).
Metabolizarea substratului (glucide, polialcooli) antreneaz acumularea de produi de fermentaie (acizi
sau nu). Acidifierea mediului cu/ fr producere de gaze (CO 2, H2) este vizualizat prin virajul culorii
indicatorului de pH la galben. Tubul Durham permite vizualizarea producerii de gaz (Fig.70.).
Metabolism:
Oxidativ

fr ulei de parafin
Galben n partea superioar,

Oxidativ + fermentativ

rou n partea inferioar

Galben

Inert/ inactiv vis a vis de

Absena culturii

Cultur dezvoltat

Rou

Rou cu o uoar alcalinizare la

glucoz

cu ulei de parafin
Rou

Galben

suprafa (albastru)

NB - Absena acidifierii mediului nu nseamn c substratul nu a fost metabolizat. Metabolismul

moleculelor reduse (inositol, adonitol) genereaz produi de fermentaie neutri (n principal etanol), iar
catabolismul peptonelor antreneaz o realcalinizare a mediului.
-

apa peptonat nu este adecvat pentru studiul bacteriilor cu metabolism oxidativ sau cele cu
metabolism fermentativ neacidifiant sau puin acidifiant (Staphylococcus sp.).

Fig.70. Fermentaia carbohidrailor. (A) Rosu

fenol este rou ntr-o soluie cu pH neutru sau
alcalin. (B) n prezena acizilor are loc virajul
culorii indicatorului la galben. (C). Producerea
de gazele se evideniaza prin colectarea n tubul
Durham inversat, n timp ce rou fenol indic
producerea de acid.

Mediul CTA (Cistein-Tripticar-Agar) permite studiul metabolismului bacteriilor exigente, fr a

necesita adugarea de factori de cretere.
Mediu Clark-Lubs (pepton, glucoz, K2HPO4) permite evidenierea acetoinei, precursor al 2-3
butandiolului (Reacia VP), precum i msurarea grosier a pH-ului mediului (Reacia RM).
Reacia Rou Metil (RM) detecteaz acumularea produilor de fermentaie acid mixt acizi (acid
lactic, acetic, succinic, formic), CO2, H2O si etanol, care determin acidifierea mediului (apa peptonata
+glucoza 1%) (pH <4.3) i virajul culorii indicatorului de pH (Rou metil 1%) la rou.
formiat
HCOOH dehidrogenaza
CO2 + H2

Aplicatii: diferentierea bacteriilor enterice (Escherichia sp., Salmonella ssp., Proteus sp.,
Aeromonas sp.)
1.6. Reacia Voges Proskauer (VP - metoda Barritt) permite evidenierea acetoinei (acetil
metil carbinolul), precursor al 2-3 butandiolului, care este mai greu de detectat (Fig.71.). Acetoina se
oxideaz n prezena oxigenului molecular la diacetil (butandion), care n prezena NaOH i creatinei
(coninut n peptonele din mediul Clark-Lubs) genereaz un complex de culoare roie (are loc o
condensare a diacetilului cu o grupare NH2 a unei grupri guanidil proteice (reziduu arginil), a unei
arginine libere sau a creatinei). -naftolul accelereaz formarea acestui complex de culoare roie (joac
rol catalitic n oxidarea acetoinei la diacetil), fr a diminua specificitatea reaciei. Mediul Clark-Lubs se
nsmneaz cu o suspensie de densitate 0,5 MacFarland (sau mai mare pentru germenii fastidioi.

Fermentarea glucozei. (a) Prin fermentatie pot rezulta acizi organici (ex. acidul lactic) sau produsii neutri (ex.
acetoina). (b) Detectarea acetoinei se realizeaza prin adaugare de KOH si -naftol.

Reacia se efectueaz dup 48h de incubare la temperaturi corespunztoare bacteriilor respective.

Se preia 1.0 ml de cultur bacterian i se repartizeaz ntr-un tub de hemoliz steril peste care se adaug
n ordine: 0,5 ml -naftol i 0,5 ml KOH. Se agit uor 30 sec-1 minut, dup care se las tubul n repaus
10-15 minute n poziie nclinat, pentru a favoriza contactul cu oxigenul atmosferic. Reacia pozitiv se
traduce prin apariia culorii roii la suprafaa mediului, uneori difuznd chiar n mediu. Pentru
accelerarea reaciei, se introduc cultura i reactivii ntr-un tub de dimensiuni mari care permit agitarea
puternic i nclzirea tubului.
Rezultatele fals-negative pot apare n cazul unor bacterii care metabolizeaz acetoina i 2-3
butandiolul.

Aplicaii
Reaciile RM i VP sunt utilizate pentru diferenierea genurilor i speciilor de enterobacterii. n general
aceste 2 teste au rezultate complementare, bacteriile VP (+) fiind RM () i invers.
Pentru bacteriile anaerobe, produii de fermentaie sunt studiai prin cromatografie n faz gazoas
(CPG) sau n faz lichid (HPLC).

Fermentarea heterozidelor
Esculina (hidrolizat la glucoz + esculetol). n prezena citratului de Fe3+ (FeC6H5O7) din
mediu, esculetolul eliberat sub aciunea unei beta-galactozidaze genereaz formarea unui precipitat
negru de esculetin feric, compus de Fe fenolic cu strcutur chimic incert.
Reacia pozitiv se poate confunda cu producerea de H2S de ctre bacteriile respective. Absena
fluorescenei msurate la 365 nm indic hidroliza esculinei.
Pentru bacteriile anaerobe stricte (Bacteroides sp.), pe lng testul de hidroliz a esculinei se
poate utiliza i testul de fermentare a esculinei (de fapt de fermentare a glucozei rezultate n urma
hidrolizei esculinei).
Se utilizeaz un mediu care conine peptone de casein, esculin 1 i FeC 6H5O7 1 ca
revelator.
Pentru Lactobacillus se utilizeaz un mediu lichid adaptat exigenelor speciei de Lactobacillus
(pepton tripsic de cazein, extract de levuri, Mg2+, esculin etc).
Pentru bacteriile anaerobe stricte se utilizeaz bulion neglucozat TY (Tripticase Yeast) cu esculin 1%.
Hidroliza esculinei este revelat dup 24 de ore de incubaie prin adugarea de cteva picturi de
citrat feric amoniacal 1%.
Test i lectur:
Mediul se nsmneaz prin nepare cu ansa cu fir drept sau cu ansa cu bucl.
Inoculul poate fi reprezentat de o cultur dezvoltat pe mediusolid, de o suspensie slab cu densitate de
0.5 Mac Farland sau de o cultur de 24h pe mediu lichid.
Se incubeaz la 37oC, 30oC sau 20oC, timp de 5 zile, urmrindu-se apariia culorii negre.
n cazul bacteriilor productoare de H2S, tubul se examineaz n lumin UV la 365 nm.
Control de calitate al testului: Enterobacter aerogenes - reacie sigur negativ; Proteus mirabilis,
Staphylococcus epidermidis - reacie sigur pozitiv.
Aplicaii practice:

Testul esculinei se utilizeaz n identificarea streptococilor de grup D, Listeria monocytogenes,

Erysipelothrix rhusiopathiae esculin(+), pentru izolarea selectiv

i diferenierea speciilor de

Enterococcus, a speciilor de Streptococcus non-grupabili, Lactobacillus, Pseudomonas, Xanthomonas,

Aeromonas, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium.
Amigdalina (hidrolizat la gentobioz + benzaldehid + HCN). Gentobioza este un dizaharid
care poate fi hidrolizat la 2 molecule de glucoz. Se urmrete detectarea produilor de acidifiere a
mediului, a gruprii benzenice sau a picratului alcalin.
Utilizarea

substraturilor

organice

similare

lactozei:

ONPG

(orto-nitrofenil--D-

galactopiranozid) i omologul acestuia PNPG (para-nitrofenil--D-galactopiranozid).

Permite cercetarea ONPG- si PNPG-hidrolazelor, denumite n mod curent, dei impropiu, betagalactozidaze sau lactaze. Aceste enzime sunt enzime intracelulare (endoenzime), inductibile, care
catalizeaz hidroliza lactozei la galactoz i glucoz. Aceste enzime nu sunt specifice pentru substratul
reprezentat de lactoz, ci pentru legtura -1-4 ozidic i pentru restul beta-galactozil, de aceea ele pot
ataca i substraturi artificiale ca ONPG i PNPG.
ONPG

ONP

ONP (orto-nitrofenol) rezultat sufer modificri tautomerice care stau la originea culorii galbene.
Exist 2 tipuri de enzime care hidrolizeaz ONPG-ul:
-

Beta-galactozidaza tipic, solubil, inductibil de IPTG (isopropil tiogalactozid);

ONPG-aza care nu fermenteaz lactoza, cu localizare membranar, represat de IPGT.

Principiul utilizrii PNPG este similar, cu meniunea c PNP rezultat nu este volatil, iar utilizarea sa este
de rpeferat n galeriile API NE.

Auxanograma
Unele bacterii pot utiliza citratul ca unic surs de carbon i energie. Aceste bacterii posed n
echipamentul lor enzimatic citrat-permeaze i enzimele implicate n catabolismul ciratului. Pentru a se
putea dezvolta pe mediul Simmons, bacteriile trebuie s utilizeze srurile de amoniu ca unic surs de
azot. Utilizarea citratului se realizeaz pe 2 ci: aerob i fermentativ.
Tehnica i lectur:
Asimilarea citratului se evidentiaza pe mediul Simmons - un mediu sintetic (fr peptone), tamponat cu
fosfai i care conine o surs de azot reprezentat de sruri de amoniu, ioni, citrat de Na + i albastru de
Brom- timol.

Mediul se nsmneaz cu un inocul reprezentat de o suspensie realizat n ap distilat, iar

dopul tubului se nchide slab, pentru a permite eliminarea CO 2. Citratul este un triacid care sufer o
decarboxilare oxidativ n condiii de anaerobioz. Pierderea gruprilor acide antreneaz o alcalinizare a
mediului care devine albastru, dac bacteria a utilizat citratul i dac nu este auxotrof pentru citrat.
Se mai practic studiul utilizrii acetatului (mediu sintetic Trabulski) i a malonatului
(mediu sintetic cu extract de levuri), utilizarea galeriilor de auxanogram pentru studiul utilizrii de
carbohidrai, acizi organici/ aminoacizi ca unic surs de C.
Fermentarea citratului (n anaerobioz)
Se studiaz pe ap peptonat cu citrat sau pe citrat Christensen: mediu complex cu Rou fenol i citrat.
Fermentarea citratului duce la acidifierea mediului care devine rou.

Aplicaii
Se utilizeaz pentru diferenierea enterobacteriilor (specii pozitive: Salmonella, cu excepia speciilor S.
typhi i S. paratyphi A, grupul KES), a speciei Vibrio cholerae (+) i Pseudomonas aeruginosa (+).

Metabolismul azotat
HHHH
ornitinNH2-C-C-C-C-COOH decarboxilaza

H H H NH2
Ornitina
purpur de bromcrezol
(galben)

HHHH
NH2-C-C-C-C-NH2 + CO2
HHHH
Putresceina
purpur de bromcrezol
(mov)

Studiul decarboxilazelor: lizin-decarboxilaza (LDC), ornitin-decarboxilaza (ODC), arginindihidrolaza (ADH)

Decarboxilazele sunt active n anaerobioz la pH acid, i catalizeaz, n prezena coenzimei
fosfat de piridoxal, reacia de decarboxilare a lizinei i ornitinei (aminoacizi diamino-monocarboxilici),
antrennd formarea diaminelor corespunztoare:
Arginina este catabolizat prin intermediul a 2 sisteme enzimatice: sistemul arginin-dihidrolaza (ADH)
i sistemul arginin-decarboxilaz (ADC), care sunt foarte greu de difereniat.

n practic, detectarea ODC, LDC i ADH se realizeaz pe baza evidenierii unei variaii de pH a
mediului.
Se utilizeaz mediile Falkow fr pepton (extract de drojdii care aduce aportul de piridoxal,
glucoz a crei fermentaie duce la acidifierea mediului i inducerea decarboxilazelor, un aminoacid,
purpur de brom crezol, pH 6.3 n anerobioz), Hajna-Kliger, Moeller.
Fermentarea glucozei de ctre bacteriile cu metabolism fermentativ antreneaz acidifierea
mediului i virarea la galben a culorii mediului. Dac bacteria nu prezint decarboxilaze n echipamentul
lor enzimatic, mediul rmne galben, iar n prezena acestor enzime, are lor o realcalinizare secundar a
mediului datorit formrii diaminelor (revenirea mediului la culoarea violet).
LDC se mai poate evidenia i prin extracia diaminei cu cloroform din din cultura dezvoltat pe
mediul Hajna-Kliger.
Unele bacterii dau rezultate pozitive tardiv, dup 5-6 zile de incubare, datorit unei permeabiliti
sczute pentru Orn (ex. Salmonella gallinarum, Escherichia coli).
Bacteriile VPpozitive pot genera rezultate fals-pozitive pe mediul Falkow, datorit accenturii
caracterului acid prin producerea i acumularea de acetoin.

Aplicaii
Cercetarea LDC, ODC i ADH este indispensabil pentru identificarea germenilor din familiile
Enterobacteriaceae, Vibrionaceae i a bacililor Gram-negativi strict aerobi: Pseudomonaceae,
Acinetobacter, Alteromonas.

Evidenierea triptofanazei
Triptofanaza reprezint de fapt un complex multienzimatic care produce indol din triptofan (Trp).
Trp este dezaminat, genernd o molecul de indol, piruvat i NH3. Piruvatul rezultat n urma acestei
reacii este reutilizat n ciclul Krebs, n timp ce NH3 este utilizat n calea anabolic a aminoacizilor.
Astfel, calea triptofanazei este o cale generatoare de energie, existent doar la bacteriile cu metabolism
de tip fermentativ. Producerea de indol este optim la pH cuprins ntre 7.4-7.8, fiind deci inhibat de

produii acizi rezultai n urma fermentaiei, de aceea cercetarea indolului se va efectua pe un mediu care
nu conine glucoz. Degradarea indolului este inhibat de prezena nitriilor n mediu. Mediul nu trebuie
s conin nici nitrati, nici nitrii. Producerea de indol este favorizat n prezena O2. Indolul eliberat este
evideniat cu reactivul Kovacs (paradimetilaminobenzaldehid + HCl + alcool isolamilic) care extrage
indolul i genereaz apariia unui inel rou la suprafaa mediului. Structura pirolic a nucleului indolic
exist sub o form tautomer i reacioneaz cu funciunea aldehidic a paradimetilaminobenzaldehidei,
genernd compusul chinoidal colorat n rou. Producerea de indol se poate evidenia practic ap
peptonat sau mediu Uree-indol Ferguson.
Dup incubare 48h la temperatur corespunztoare se adaug reactivul Kovach sau Ehrlich,
evideniindu-se apariia unui inel rou la suprafaa mediului.
Control de calitate:
-

Escherichia coli (+);

Klebsiella pneumoniae (-).

Micrometoda de evideniere a indolului (metoda spotului)

Se depune o ans de cultur dezvoltat pe mediu solid bogat n Trp, pe o hrtie de filtru mbibat n
DMACA (paradimetilaminoacinnamaldehid), care va forma cu indolul un compus de culoare bleuverde.
Rezultate fals-negative: Providencia sp. i Clostridium sp. pot degrada indolul format (este indicat
scurtarea perioadei de incubaie).
Rezultate fals-pozitive:
-

pigmentul rou elaborat de anumite specii de Serratia pot clora reactivul (se recomand utilizarea de
benzi impregnate cu reactiv care permit realizarea testului, indolul fiind volatil);

utilizarea de medii colorate (Hektoen, MacConkey) care pot simula reacii pozitive.

Evidenierea dezaminazelor
Triptofan-dezaminaza (TDA) i fenilalanin-dezaminaza (PDA) catalizeaz dezaminarea oxidativ a Trp
la acid indol piruvic (TDA) sau la acid fenil piruvic (PDA). Acidul fenil-piruvic, n prezena perclorurii
de Fier genereaz un compus de culoare maron.
R-CH2-COOH + H-OH

dezaminaze

NH2

R-CH2-COOH + NH3
OH

complex portocaliu

NH3 + reactiv Nessler

Pentru detectarea TDA se utilizeaz Mediu Uree-indol care conine Trp. Dup incubare de 24h se
adaug reactivul reprezentat de FeCl3.
Acidul indol-piruvic, n prezena perclorurii de Fier genereaz un compus de culoare verde.
Detectarea PDA se realizeaz pe suspensii bacteriene dense realizate n ap distilat cu fenilalanin.
H
CH 2- C - COOH

CH 2- C

fenilalaninNH2 + 1/2O2
dezaminaza

L-Phe

O
COOH + NH
3

Acid fenilpiruvic (PPA)

PPA + Fe 2+

complex verde

Evidenierea cistein desulfhidrazei care produce H2S din cistein.

Se utilizeaz bulion cu adaos de 0.1% cistein
Incubare: 370C, 24-48h
Citire: banda impregnata cu acetat Pb
Interpretare: r(+) negru (PbS sau FeS).
Aplicatii: diferentiere enterobacterii ( Proteus vulgaris)

HSCH2CH (NH2) COOH

Cys-desulfuraza

H2S + NH3 + CH3COCOOH

cisteina

acid piruvic

H2S + FeSO4

FeS + H2SO4
negru

Ureaza
Ureea (NH2-CO-NH2) este hidrolizat sub aciunea unei enzime specifice denumite ureaza, la (NH4)2CO3
care este un compus alcalin. Pentru detectarea enzimei se utilizeaz mediul uree-indol (Ferguson) (Trp,
fosfat mono- i di-potasic, NaCl, uree, rou fenol), mediul Christensen (uree, glucoz, peptone, agar) sau
mediu Stuart. Se efectueaz o suspensie bacterian dens n acest mediu, iar dup o incubaie variabil

(de la cteva minute pn la 24h) alcanilizarea mediului va determina apariia culorii rou intens, care
indic prezena ureazei. Ureaza fiind o enzim constitutiv, hidroliza substratului se va efectua foarte
rapid (cteva minute-2h la Proteus). Totui, n unele cazuri, enzima poate fi inductibil n prezena ureei,
necesitnd prelungirea perioadei de incubare pn la 6 zile.
Testul rapid Ureaza Spot - detecteaz o ureaz constitutiv foarte activ, utiliznd un mediu concentrat
n uree, depus pe benzi de hrtie Whatmann, peste care se adaug cultur de cel puin 48h dezvoltat pe
gelozsnge sau geloz-chocolat, urmrindu-se virajul culorii de la galben la roz-violaceu.

H2N
H2N

C O + H2O

ureaza

2NH3 + CO2

uree
Rezultatele fals-pozitive pot fi datorate lipsei specificitii reaciei de culoare, datorate alcalinizrii
mediului, care poate rezulta i n absena ureazei, de exemplu n urma activitii proteolitice intense a
unor specii (ex. Pseudomonas sp.).

Proteaze
Proteazele sunt enzime extra-celulare cu specificitate sczut, care hidrolizeaz proteinele la peptide i
aminoacizi.
Pentru evidenierea proteazelor se utilizeaz diferite medii:
-

Geloza nutritiv: bulion nutritiv solidificat prin adugarea de gelatin. Se inoculeaz prin nepare i
se incubeaz la 20oC, iar dup incubare se vizualizeaz lichefierea gelatinei. Aceast metod prezint
dezavantajul c gelatina se lichefiaz la temperaturi crescute, fiind necesar rcirea mediului pentru
a diferenia hidroliza de fuziune.

Tehnica Frazier, este o metod mai sensibil, i const n inocularea gelozei nutritive cu gelatin
prin nsmnare n spot i se incubeaz 1, 2, 3 zile la 37 oC, dup care se precipit gelatina prin
inundarea plcii cu sublimat. n urma precipitrii, apare un halou n jurul coloniilor, datorit
hidrolizei gelatinei.

Tehnica filmului fotografic. Se taie un film fotografic expus i developat n benzi care se introduc
n tuburi de hemoliz cu suspensii bacteriene foarte dense i se incubeaz tuburile 24h n Bain Marie.
Hidroliza gelatinei se manifest prin eliberarea particulelor negre de Ag din constituia filmului. O

variant a acestei metode este metoda Kohn care utilizeaz discuri de gelatin saturate cu particule
fin pulverizate de C.
-

Mediu cu ser de bou coagulat se nsmneaz n striuri i se incubeaz cteva zile. Proteazele vor
determina digestia serului n regiunea striurilor de cultur. Acest mediu se utilizeaz pentru bacteriile
serofile.

Geloza cu adaos de lapte evideniaz hidroliza cazeinei din lapte. Geloza nutritiv cu lapte este
turnat n plci i inoculat n striuri sau n spot. Hidroliza cazeinei se traduce prin clarificarea
mediului n jurul culturii. Aceast metod nu este foarte sensibil deoarece hidroliza cazeinei ncepe
prin formarea paracazeinei insolubile care nu este vizibil pe mediul alb, opac. Este de preferat
utilizarea cazeinei solubile (solubilizate la pH alcalin) incorporate n geloz, caz n care mediul
rmne transparent, iar n jurul spotului de cultur se poate observa un inel de precipitare.

Metabolismul lipidelor
Poate fi abordat practic prin detectarea activitii lipazelor, esterazelor i lecitinazelor.

Detectarea lipazelor
n practic se urmrete de obicei prezena tributirin-lipazei, utilizndu-se drept mediu de cultivare
geloza cu adaos de tributirin. Cultura bacterian se inoculeaz n spot: Se va observa o clarificare a
mediului iniial opac n jurul spotului de cultur. Pentru o mai bun vizualizare, se poate aduga Rou
fenol care va vira de la rou la galben, n prezena acizilor grai rezultai n urma hidrolizei tributurinei.

Detectarea esterazelor
Se utilizeaz mediu gelozat cu adaos de TWEEN 80, 60 sau 40. Cel mai utilizat n practic este TWEEN
80 (monooleat de sorbitol). Se nsmneaz mediul n spot, iar prezena TWEEN-esterazei duce la
apariia cristalelor de oleat de Ca2+ insolubile (cristale formate ntre acizii grai eliberai i ionii de Ca2+).

Amilazele
Amidonul este polizaharid de glucoz cu mas molecular mare care nu poate fi transportat prin
membran la interiorul celulei bacteriene, fiind necesara secreia de amilaze extracelulare pentru a fi
hidrolizat.
Amilazele se detecteaz utiliznd o geloz ordinar la care se adaug amidon de orez, iar hidroliza se
reveleaz prin inundarea plcii cu HCl (halou transparent n jurul spotului de cultur) sau soluie Lugol
(inel galben n jurul spotului de cultur, n timp ce restul mediului se coloreaz n albastru).

B. MEDII MULTITEST
Mediile multitest permit evidenierea simultana a mai multor caractere biochimice utile
n identificare, utiliznd un singur mediu complex.
Mediul Hajna-Kliger sau glucoz-lactoz-fier, este un mediu gelozat care conine pepton,
glucoz 0,1%, lactoz 1%, tiosulfat (sau hiposulfit) i rou fenol.
nsmnarea mediului se realizeaz prin neparea poriunii drepte cu ansa cu bucl i a pantei prin
striuri n zig-zag.
Citirea se realizeaz dup incubare de 18 h la 37oC.

 n primele ore are loc fermentarea glucozei. Dup 18h, dac este fermentat i lactoza, ntregul
mediu (pant i poriune dreapt) va avea culoare galben. Dac bacteria nu fermenteaz lactoza,
acidifierea slab a mediului datorat fermentrii glucozei va fi neutralizat prin catabolizarea
oxidativ a peptonelor care antreneaz alcalinizarea mediului la suprafa (panta roie, poriunea
dreapt galben).
Detectarea tiosulfat-reductazei cu producere de H2S din hiposulfit se va traduce prin apariia unui
precipitat negru de sulfur de fier la limita dintre pant i poriunea drepat a mediului.
Prezena gazului ntreruperea sau dislocarea coloanei de mediu
Testul ONPG se poate realiza cu cultur de la suprafaa pantei
Cercetarea LDC-peptonele coninute n mediu conin lizina, asupra creia poate aciona LDC cu
producere de cadaverin. Cadaverina se extrage cu cloroform i este evideniat prin adugare de
ninhidrin (culoare violet).
Mediul T.S.I. (Triple Sugars Iron) (geloza + Glucoz, Lactoz, Zaharoz, FeSO4, Rou
Fenol)
Interpretarea se face similar cu mediul Hajna Kliger, cu excepia faptului c acest mediu permite
evidenierea capacitii de fermentare a 3 zaharuri (glucoza- nglbenirea mediului n poriunea dreapt;
glucoza i zaharoza sau lactoza- nglbenirea poriunii drepte i panta portocalie; glucoza, zaharoza i
lactoza- nglbenirea complet a mediului).
Mediul M.I.L.F. (Mobilitate, Indol, Lizin-decarboxilaza, Fenilalanin-dezaminaza).
Mediul repartizat n tuburi conine geloza + Trp, Lys, Phe, purpur de brom-crezol i o band de hrtie de
filtru impregnat cu reactiv Ehrlich.
Mediul se nsmneaz prin nepare cu ansa cu fir drept i se incubeaz la 370C timp 24h, dup care se
vizualizeaz:
mobilitatea: bacteriile mobile determin opacizarea uniform a mediului, spre deosebire de bacteriile
imobile care se dezvolt doar pe traseul striului de nsmnare
producerea de indol (volatil) se vizualizeaz prin nroirea benzii de hrtie de filtru.
mediul conine glucoz care va fi fermentat cu producere de acizi care acidific mediul i determin
virajul indicatorului la galben (LDC-); prezena LDC determin acumularea de cadaverin care
realcalinizeaz mediul i determin apariia culorii violet (LDC +).
producerea de Phe-dezaminaza: se determin prin adugarea de cteva picturi de FeCl 3 10% care
va determina apariia unui precipitat de culoare verde (reacie +).
Mediul M.I.U. (Mobilitate, Indol, Ureaza)

Mediul repartizat n tuburi conine geloza + Trp, uree, rou metil i o band de hrtie de filtru
impregnat cu reactiv Ehrlich.
Mediul se nsmneaz prin neapre cu ansa cu fir drept i se incubeaz la 370C timp 24h, dup care se
vizualizeaz:
mobilitatea: bacteriile mobile determin opacizarea uniform a mediului, spre deosebire de bacteriile
imobile care se dezvolt doar pe traseul striului de nsmnare
producerea de indol (volatil) se vizualizeaz prin nroirea benzii de hrtie de filtru
producerea de uree va determina nroirea mediului
Mediul manitol mobilitate nitrai- mediu semigelozat care conine peptone, nitrai, manitol, KNO 3
i rou fenol. Acest mediu conine nitrai care inhib activitatea enzimei formiat-hidrogen-liaz, n
scopul evitrii eliberrii de H2. Se citete mobilitatea, fermentarea manitolului i reducerea nitrailor.
Mediul IMViC (indol, rosu Metil, VP, citrat) se utilizeaz foarte mult n controlul microbiologic al
apei potabile, pentru identificarea i diferenierea indicatorilor microbiologici ai calitii apei (E. coli,
Enterobacter aerogenes).
C. SISTEME MICRO-TEST
Metodele moderne de identificare a microorganismelor utilizeaz galeriile microtest care permit
identificarea concomitent a unui numr mare de caractere biochimice cu consum minim de materiale i
inocul microbian (se lucreaz cu microvolume de prob). Aceste sisteme microtest reprezint de fapt
varianta modern, simplificat i standardizat a identificrii microbiene bazat pe tabele politetice,
fiecare test coninut n sistemul de identificare avnd aceeai contribuie la identificarea speciei.
Sistemele microtest constau n asocierea diferitelor teste individuale (ntre 12 i 52) care permite
identificarea unei anumite specii cu un coeficient de probabilitate ridicat. Galeriile microtest sunt
nsotite de cataloage de identificare a speciilor microbiene pentru care au fost concepute. Posibilitatea de
identificare statistic asistat de calculator cu ajutorul unor programe speciale asigur obinerea de
rezultate precise i reproductibile. Sunt disponibile la ora actual sisteme de identificare rapid foarte
sensibile care permit obtinerea rezultatelor dup 45h de incubare. Exista, de asemenea, sisteme de
identificare rapida cuplate cu determinarea rezistenei la antibiotice, foarte utile in Microbiologia clinic
(ex. sistemul Vitek).

Metodologia de baz este aceeai i const n nsmnarea simultan a

microvolumelor de prob (inocul bacterian standardizat) n mediile liofilizate sau hidratate coninute
ntr-o galerie de identificare. Dup o anumit perioad de incubare, care variaz in funcie de
sensibilitatea testului, se citesc rezultatele conform indicaiilor de utilizare care insotesc aceste teste.
Pozitivarea testelor consta in virajul culorii mediilor, direct sau dup adaugarea de anumiti reactivi, care

respecta principiul testelor biochimice clasice, individuale. Testele pozitive primesc un anumit punctaj,
care ulterior se nsumeaz pe grupe de teste rezultnd un numr final alctuit din mai multe cifre care
corespunde, n catalogul de identificare, unei anumite specii bacteriene. Numele speciei este nsotit i de
coeficientul de probabilitate al identificrii. Pentru asigurarea reproductibilitatii rezultatelor este
recomandabil ca identificarea unei tulpini microbiene s se fac simultan din cel putin 4 colonii. In cazul
n care coeficientul de identificare nu este satisfctor sau dac numrul obinut nu se regsete n
catalog, se repet testul, respectndu-se riguros indicaiile de realizare a testului. Dac pentru numrul
obtinut, catalogul indica 2 sau 3 specii posibile cu coeficieni de probabilitate apropiai, se realizeaz
testele suplimentare indicate n catalog care sa permit diferenierea respectivelor specii microbiene.
Cele mai utilizate sisteme de identificare la ora actual sunt reprezentate de:
- sistemele API - cu diferite variante pentru identificarea enterobacteriilor (API 20E), a bacililor Gramnegativi non-enterobacterii (API-NE, API-Listeria, API-Bacillus, API-Campy, API-Staph etc.);

Teste pozitive i negative obinute cu ajutorului istemului API 20E.

- sistemele MicroID 32 - pentru identificarea streptococilor (ID 32 Strep) i stafilococilor (ID 32

Staph);

Sistemul MICRO-ID de identificare a enterobacteriaceelor.

- sistemele Enterotube II i Oxi/Ferm tube - pentru enterobacterii i bacili Gram-negativi aerobi stricti;

Diferenele dintre sistemul neinoculat i testele positive pentru sistemul EnterotubeII.

Diferenele dintre sistemul neinoculat i testele pozitive pentru sistemul Oxi/Ferm TubeII.

BBL Crystal ID - pentru enterobacterii i bacili Gram-negativi non-fermentativi;

Siste
mul BBL Crystal.

- sistemele de identificare automatizat

Biolog, MicroScan i VITEK (Fig.80.),
acestea din urm permitnd testarea n
paralel

susceptibilitii

la

antibiotice a tulpinii testate.

Card de identificare Vitek.

In ciuda multiplelor avantaje oferite de aceste sisteme microtest, exist ns i limite, datorate mai
ales variaiilor individuale de tulpin (de exemplu, exist tulpini bacteriene cu metabolism lent care nu
produc cantiti de enzime suficiente pentru pozitivarea testelor n intervalul de incubaie recomandat,
astfel c aceste teste i inclusiv diagnosticul microbiologic vor fi interpretate eronat). De aceea, este
recomandabil ca n cazul n care tabloul clinic al bolii infecioase, caracterele de cultur i colonie sau
testele de screening nu converg cu rezultatele identificrii cu ajutorul sistemelor multitest, s se repete
identificarea cu ajutorul testelor individuale care pot fi mentinute timp de 7 zile.

Modul de lucru cu sistemele API 20E.

Modul de lucru cu sistemul EnterotubeII

Diagnosticul etiologic al infectiilor cu Staphylococcus

Stabilirea etiologiei unei infectii stfilococice se practica la bolnavul infectat si la purtatorul sanatos.
Etapele diagnosticului etiologic:
1.

Prelevarea produsului patologic: puroi, lichide purulente, sputa, urina, singe.

In momentul prelevarii produsului patologic se iau masuri de asepsie necesare prevenirii contaminarii
produsului prelevat cu stafilococi de pe tegumente.
Produsele patologice cu microbiota bogata (ex. materiile fecale) trebuie refrigerate sau insamantate
imediat, pentru a preveni modificarea proportiei initiale de specii bacteriene, prin inmultirea rapida a unora
dintre ele.
La prelevarea sangelui prin hemocultura se foloseste un antiseptic la nivelul punctiei venoase, pentru a
se evita introducerea unui stafilococ de pe tegumente.
Din produsul patologic prelevat se poate efectua un frotiu direct colorat cu albastru de metilen si care se
observa la microscop. Examenul microscopic direct al produsului patologic ne permite sa observam prezenta
cocilor fagocitati de leucocite si are o valoare orientativa asupra etiologiei infectiei stafilococice
2.

Insamantarea produsului patologic in nvederea izolarii in cultura pura.

In functie de gradul de contaminare, produsele patologice pot fi:

-

necontaminate (LCR, lichide de punctie, urina, sange corect recoltat)

moderat contaminate (sputa, tesuturi)

intens contaminate (materii fecale, alimente, voma).

Insamantarea produselor necontaminte si moderat contaminate poate fi facuta pe medii uzuale ca

bulionul si geloza nutritiva, dar se prefera geloza-sange de oaie pe care se insamanteaza prin descarcarea ansei
pentru a obtine colonii izolate. Sangele uman nu este recomandat sa se foloseasca, deoarece contine inhibitori
nespecifici si eventual anticorpi antistafilococici care pot interfera cu izolarea in cultura pura.
Probele se termostateaza la 370C timp de 18-20 ore. Coloniile de stafilococ se dezvolta abundent si
caracteristic pe geloza-sange. Diametrul coloniilor este de 1-3mm, aspectul de colonii S, bombate, lucioase,
opace, cu margini regulate, de consistenta cremoasa, de culoare galben-aurie. Coloniile ce se dezvolta pe mediu
cu sange poat fi inconjurate de o zona circulara de hemoliza completa.

Staphylococcus

Caracter

aureus

Coagulaza
Rezistenta
la novobiocina
D
manitolxx
Pigment

Staphylococcus
epidermidis

Staphylococcus
saprophyticus

+
-

+*

3.

Identificarea si diagnosticul diferential cu specii inrudite

Din cultura pura de 18-20 ore in bulion gluconat se fac urmatoarele subculturi:
a). pe agar sange de oaie
Insamantarea se face in spot, pentru controlul hemolizei.
Marea majoritate a tulpinilor de S. aureus sunt hemolitice.
Exista insa unele tulpini de S. aureus care nu sunt hemolitice, iar unele tulpini de S. epidermidis pot
prezenta o zona discreta de hemoliza.
Hemoliza totala de tip beta este data de alfa hemolizina.
Zona de hemoliza la 370C data de beta hemolizina poate fi discreta si atunci este necesara
mentinerea 20-24 ore la +40C.
b). in tuburi cu bulion cu adaos de manitol si indicator de pH
Fermentarea manitolului este o caracteristica relativ constanta a S. aureus.
S. epidermidis nu fermenteaza manitolul
Citirea rezultatelor se face dupa 48 ore, deoarece exista tulpini de S. aureus ce fermenteaza lent
manitolul.
c). pe mediu selectiv hiperclorurat Chapmann
Insamantarea se face prin descarcarea ansei pentru a obtine colonii izolate.
Citirea rezultatelor se face dupa o termostatare de 24 si 48 ore.
Coloniile de S. aureus se dezvolta bine si produc virajul de culoare al indicatorului de pH ce indica
fermentarea manitolului.
S. epidermidis creste greu sau este inhibat de mediul selectiv.
d). testul evidentierii coagulazei
Se folosesc doua tehnici de evidentiere a coagulazei stafilococice:
-

una pune in evidenta coagulaza legata sau clumping factor printr-o tehnica simpla de aglutinare
pasiva pe lama, in prezenta de hematii sau particule de latex sensibilizate cu fibrinogen

a doua evidentiaza coagulaza libera, difuzibila, printr-o tehnica in tuburi, cu plasma de iepure.
e). testul evidentierii catalazei

Evidentierea activitatii catalazei se realizeaza prin punerea in contact a culturii de

cercetat cu o picatura de perhidrol diluat 20%-30%. Cultivarea tulpinii de cercetat trebuie
facuta pe un mediu solid care sa nu contina sange deoarece hematiile contin catalaza si reactia
este asfel fals pozitiva. Reactia pozitiva consta in aparitia efervescentei si diferentiaza cocii
gram pozitivi din familia Micrococcaceae de cei din familia Streptococcaceae. Stafilococii
sunt coagulazo-pozitivi, streptococii si pneumococii nu produc catalaza.
Se foloseste in paralel, ca martori pozitivi si negativi ai reactiei si o tulpina de enterococ si una de
stafilococ auriu.
e). testul evidentierii fosfatazei
Se foloseste pentru diferentierea speciilor de stafilococ.
S. aureus poseda in echipamentul sau enzimatic fosfataza, enzima ce desface molecula de fosfat de
fenolftaleina punand in libertate fenolftaleina. Prezenta fenolftaleinei libere se evidentiaza in mediu bazic,

Se foloseste agar nutritiv cu adaos de 0,01% fosfat de fenolftaleina.

Placa cu agar se imparte in sectoare. Se insamanteaza doua tulpini de control: una pozitiva (S.
aureus) si una negativa (S. epidermidis) si in restul sectoarelor tulpinile de analizat. Culturile se insamanteza 1820 ore la 370C, apoi se pune pe capacul cutiei Petri un disc de hartie de filtru imbibata in amoniac. Dupa 1-2
minute coloniile ce contin fosfataza se coloreaza in roz-rosu.
Diagnosticul de laborator al infectiilor streptococice

Izolarea in cultura pura

Insamantarea prelevatelor monomicrobiene se face pe medii agarizate, suplimentate cu
5% sange din berbec si/sau in bulion nutritiv suplimentat cu 2 glucoza. Toti streptococii
cultiva optim la 37oC, iar culturile pot fi examinate dupa 24h.
-streptococii de grup B si D tulbura omogen mediul
-cei de grup A, C, G au o crestere granulara, cu sediment rapid, cu supernatant limpede sau usor
tulbure.
Streptococii piogeni de grup A si B formeaza pe geloza-singe colonii alb cenusii beta-hemolitice
Streptococii de grup D (enterococii) -formeaza pe geloza-singe colonii alb cenusii cu de circa 1mm ,
transparente initial, opace in cultura veche, nehemolitice sau hemalitice.

Coloniile de pneumococi sunt gri-opace au circa 1mm diametru, hemolitice

asemanatoare cu ale streptococilor viridans. Dupa incubare in atmosfera cu 5% CO 2 zona de
-hemoliza se largeste. Progresiv uneori in cateva ore coloniile pneumococilor devine
crateriforme datorita autolizei enzimatice. Tulpinile virulente formeaza colonii transparente
mucoide la care autoliza este mai rapida si frecvent completa incat pe suprafata mediului se
observa numai urma coloniilor.
Teste diferentiale
Testul sensibilitatii la vancomicina diferentiaza genurile Staphylococcus, Enterococcus,
Lactococcus care sunt sensibili la vancomicina de genurile Leuconostoc si Pediococcus care sunt rezistente.

Testul la optochin
Diferentiaza prezumtiv streptococii hemolitici in pneumococi sensibili la optochin si streptococi
viridans rezistenti. Cand sensibilitatea la optochin nu este concludenta se impune realizarea testului de biloliza.
Testul bilolizei se bazeaza pe reducerea bilei sau sarurilor biliare de catre penumococi, proces care duce
la accelerarea autolizei. Toate tulpinile capsulate de S. pneumoniae sunt lizate, in timp ce tulpinile necapsulate de
S. viridans sunt rezistente.
Testul bila esculina (BE) este pozitiv pentru enterococi si stafilococii de grup D care cresc pe mediu
cu 40% bila si hidrolizeaza esculina determinand innegrirea mediului.
Testul tolerantei la sare este pozitiv pentru majoritatea speciilor de Enterococcus care se dezvolta in
bulion cu 6.5 NaCl in 24-72h la 35-37oC in timp ce tulpinile de Streptococcus nu se dezvolta in acest mediu.

Cresterea la 10-45oC permite identificarea prezumtiva a enterococilor care se dezvolta la 10-45 oC .

Testul PYR (L- pyrrolidonyl , -naphytilamida) este 100% pozitiv in exclusivitate pentru streptococii de grup A,
spre deosebire de streptococii hemolitici non A.
Testul CAMP
Majoritatea streptococilor de grup B produc o proteina difuzibila (factorul CAMP-Christie Atkins
Muench Peterson) care actioneaza sinergic cu -hemolizina stafilococica si determina liza completa a hematiilor
pe geloza-singe.
Diagnosticul imunologic rapid urmareste in principal evidentierea polizaharidului capsular de Str.
pneumoniae, direct in prelevatele patologice (LCR, sange) prin tehnici imunologice rapide de aglutinare pasiva,
coaglutinare sau contraimunoelectroforeza. Reactia de umflare a capsulei este o metoda mai specifica pentru
detectarea si identificarea microscopica a pneumococilor din diferite produse (LCR , exsudat pleural, peritoneal,
aspirat traheobronsic, sputa). Reactia anticorpilor homologi cu polizaharidul capsular face mai evidenta aceasta
structura mai refrigerenta mai bine conturata. Data fiind diversitatea serotipurilor de S. pneumoniae sunt utilizate
initial seruri polivalente.

Identificarea enterococilor
Enterococii sunt coci Gram pozitivi, ovali sau cocobacili), imobili (cu cateva exceptii)
si nesporulati cresc intre 100C si 450C, optim la 370C; se multiplica la pH 9,6. Pot supravietui
dupa 30 minute de incalzire la 600c.
Se cultiva in bulion cu 6,5% NaCl , hidrolizeaza esculina in prezenta a 40% bila sau
saruri biliare .Contin antigen specific de grup D.
Genul Enterococus a fost recunoscut in 1984 ca avind doua specii: Enterococcus
faecalis si Enterococcus faecium, separate din genul Streptococcus pe baza diferentierierilor
genetice.
In prezent au fost confirmate prin hibridare ADN-ADN si prin caracterele bichimice
19 specii de enterococi.

Diagnosticul etiologic al infectiilor cu E. coli- etape

1.

Prelevarea produsului patologic: sange, urina, materii fecale, bila, puroi, exudate, lichid
cefalorahidian, alimente, varsaturi, organe, etc.

2.

Izolarea in cultura pura

se face pe medii selective, solide

pe mediu McConkey - coloniile de E. coli sunt rosii (mediul de cultura din jurul lor devine rosu si
opalescent)

pe mediu Levine coloniile de E. coli au culoare rosie, cu luciu metalic

mediile de cultura se examineaza dupa incubare 24-48 ore

3.

Identificarea tulpinilor de E.coli - etape

examen microscopic al culturilor in mediu lichid pe preparate proaspete lama-lamela pentru

evidentierea mobilitatii

examenul caracterelor de cultura pe medii selective solide

examen microscopic pentru evidentierea proprietatilor morfo-tinctoriale coloratie Gram

testarea proprietatilor biochimice biotipizare

4.

sisteme conventionale: testul oxidazei

sisteme de identificare biochimica multitest: TSI , MIU, MILF

sisteme microtest: API 20E, Enterotube II, MicroID

identificare sistem automat

Identificare serologica
- clasic reactii de aglutinare pe lama cu seruri aglutinante anti E. coli - enteroinvaziv
- determinarea enterotoxigenitatii tulpiunilor de E.coli.

Diagnosticul etiologic al infectiilor cu Salmonella - etape

1.

Prelevarea produs patologic

2.

Izolarea in cultura pura

se face pe medii selective, solide

a). pe medii moderat selective (cu putere inhibitorie medie, ce permit dezvoltarea speciilor lactozonefermentative): mediu ADCL, mediu cu rosu fenol
-

mediile de cultura se examineaza dupa incubare 24-48 ore

ADCL: coloniile de Salmonella sp. Sunt semitransparente, rotunde, lucioase, la 8 ore devin negre
in centru, evidentiind producerea de hidrogen sulfurat

mediu cu rosu fenol: colonii translucide sau transparente, incolore

b). pe medii inalt selective (cu putere inhibitorie mare)

-

mediu Wilson-Blair: colonii negre, plate, rugoase, inconjurate de un halou negru, cu luciu metalic

mediu cu verde brilliant: colonii rosu-visiniu

mediu Istrati-Meitert
3.

Identificarea tulpinilor de Salmonella sp. - etape

examen microscopic al culturilor in mediu lichid pe preparate proaspete lama-lamela pentru
evidentierea mobilitatii

examenul caracterelor de cultura pe medii selective solide

examen microscopic pentru evidentierea proprietatilor morfo-tinctoriale coloratie Gram

testarea proprietatilor biochimice biotipizare

4.
-

sisteme conventionale: testul oxidazei

sisteme de identificare biochimica multitest: TSI , MIU, MILF

sisteme microtest: API 20E, Enterotube II, MicroID

Identificare serologica
serotipizare

5.

Lizotipizare

6.

Determinarea sensibilitatii la antibiotice

Diagnosticul etiologic al infectiilor cu Pseudomonas aeruginosa

- etape

1.

Prelevarea produs patologic

2.

Izolarea in cultura pura

se face pe medii selective, solide: Cetrimide agar

3.

Identificarea tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa sp. - etape

examen microscopic al culturilor in mediu lichid pe preparate proaspete lama-lamela pentru

evidentierea mobilitatii

examen microscopic pentru evidentierea proprietatilor morfologice: coloratie Gram

testarea proprietatilor biochimice

testul oxidazei

testul catalazei

testul reducerii nitratilor

pigmentogeneza

sisteme microtest: API 20NE

Diagnostic etiologic al dizenteriei bacilare

1.

Prelevarea produsului patologic- recoltarea materiilor fecale, pe cat posibil inainte de administrarea
de substante cu actiune antimicrobiana

Insamantarea pe medii de cultura selective sau diferentiale

2.

a) Medii selective:
-

mediul Leifson

varianta recomandata de Inst. de Epidemiologie

Experimentala din R.D.G. J. Sedlak, H. Rische: Enterobacteriaceae

Infektionen, 1968, VEB, G. Thieme, pag. 126.
-

Varianta ADCL a mediului Leifson, livrabila de catre Insitutul

Cantacuzino.

Mediul cu bila uscata Istrati-Meitert (IM), livrabil de catre Insitutul

Cantacuzino.

Se pot utiliza si alte medii selective, ca mediul S-S, variante cu

desoxycholat-citrat ale mediului Leifson sau ale mediului Istrati-Meitert
(IM), ca de exemplu mediul IM cu 0.5% desoxycholat de sodiu (acesta din
urma cu o selectivitate moderata si o capacitate de inhibare mai redusa
pentru germenii patogeni).
b) Medii diferentiale:

Mediul Agar Albastru de Bromtymol-Lactoza (AABTL) livrabil de

catre Institutul Cantacuzino.

In cazul suspiciunii unei infectii cu Shigella dysenteriae tip 1 (Shiga) este

necesara utilizarea si unor medii mai putin inhibante (ca de ex. Mediul
Mac Conkey), precum si a unui mediu diferential (AABTL).
Este indicat, in special pentru diagnosticarea primelor cazuri dintr-o
epidemie, ca si in formele clinice atipice sau fruste sa se insamanteze cate
2-3 placi cu mediu selectiv si mediu diferential cu cantitati diferite de
inocul (1, 2 si 4 picaturi respectiv anse de inocul pentru cate o placa). De
asemenea, se recomanda atat pentru diagnosticul dizenteriei acute sau
cronice, cat si pentru depistarea purtatorilor, sa se utilizeze pe cat posibil,
insamantarea pe cel putin 2 medii selective, dar in care substanta activa se
afla in concentratie diferita (de ex. mediul ADCL sau mediul IM din care
se prepara loturi cu 2.5 % si respectiv 5% desoxycholat de sodiu).
3. Incubarea placilor insamantate se face la 37 C timp de 18-20
ore.
Este recomandabil sa se efectueze si o incubare suplimentara a
acelorasi placi, de inca 18-24 ore, care uneori evidentiaza colonii de
germeni patogeni care nu se dezvolta decat dupa o incubare prelungita.
Examinarea placilor insamantate si incubate se face in vederea
recunoasterii si repicarii coloniilor lactozo-negative, care dupa aspectul lor
morfologic pot fi suspectate ca apartinand unor specii din genul Shigella.
Vor fi examinate si repicate un numar cat mai mare de colonii lactozonegative nu sunt vizibile (putand fi eventual mascate) se recomanda
urmatoarea metoda: se tine 20-30 secunde un tampon imbibat cu amoniac

sau chiar sticla de amoniac fara dop sau placa deschisa, intoarsa cu
suprafata mediului in jos. In acest fel coloniile lactozo-negative, care au
devenit galbene din pricina unui numar prea mare de colonii de b.coli isi
recapata culoarea verde si pot fi cu usurinta recunoscute.

4. Identificarea coloniilor suspecte:

-

in cazul in care in placa predomina coloniile de Shigella (de ex. in

cazul unui bolnav acut) se pot efectua reactii de aglutinare pe lama cu
seruri neabsorbite si absorbite livrate de Institutul Cntacuzino.
Coloniile investigate prin aglutinare vor fi intotdeauna si repicate;

in cazul in care in placa se gasesc putine colonii suspecte se pot efectua

un nmar redus de reactii de aglutinare pe lama, incepandu-se cu serurile
corespunzatoare speciilor si serotipurilor mai frecvent intalnite la noi in
tara (Sh. flexneri 2a, 1b, 3a, Sh. sonnei).
Identificarea serologica pe lama este efectuata in functie de frecventa
speciilor si serotipurilor de Shigella sp. din tara noastra cu seruri de
diagnostic neabsorbite in ordinea urmatoare:
o

ser aglutinant polivalent Flexner

ser aglutinant Sonne S (faza I)

ser aglutinant Sonne R (faza II)

ser aglutinant Schimtz

ser aglutinant Boyd C1

ser aglutinant Boyd C2

ser aglutinant Boyd C3

ser aglutinant polivalent Large-Sachs

ser aglutinant Shiga

In cazul in care se obtin reactii de aglutinare pozitive pe lama cu serul

aglutinant Flexner se trece la efectuarea de reactii de aglutinare cu seruri
absorbite Flexner de tip si de grup (in urmatoarea ordine: serurile de tip II, I,
III, IV, V, VI si serurile de grup 3, 4; 6 si 7, 8, 9). Stabilirea cu ajutorul
serurilor Flexner absorbite a serotipului Shigella fexneri (conform schemei
din Anexa nr. 2b), constituie totodata si o confirmare a diagnosticului de
specie care va fi insa completata si cu cercetarea caracterelor biochimice.
-

Pentru tulpinile care au aglutinat cu serurile polivalente Boyd C1, C2, C3

reactia rosu-metil si polivalent Large-Sachs, reactiile de aglutinare cu seruri

monospecifice se efectueaza de catre Centrul National pentru tulpini si
Bacteriofagi Shigella din Insitutul Cantacuzino.
Toate tulpinile posedand caractere biochimice de Shigella, dar inaglutinabile
cu serurile anti-Shigella, vor fi cercetate din punct de vedere al
aglutinabilitatii si dupa termoinactivare (1 ora la 100 C) in vederea
inlaturarii unor eventuale antigene de suprafata. Suspensia care se
termoinactiveaza se prepara dintr-o cultura de 24 ore pe geloza inclinata,
suspendata in aproximativ 2 ml solutie cloruro-sodica 0.85%. Nu pot fi
utilizate

decat

suspensii

care

dupa

termoinactivare

nu

prezinta

aglutinabilitate spontana.
Evidentierea caracterelor biochimice
Sunt cercetate utilizand inocul prelevat din sectoarele cu repicari. Schema
minimala de diagnostic biochimic cuprinde cercetarea urmatoarelor reactii
biochimice:
-

producerea de gaz din glucoza

comportarea fata de lactoza, manita, salicina, adonita, inozita

reactia indol

cresterea pe mediu Simmons

producerea de H2S

reactia Voges-Proskauer

comportarea fata de uree si malonat

prezenta lizindecarboxilazei

Caractere de patogenitate
Testul Sereny (keratoconjuctivita cobaiului). Se recomanda pentru
diagnosticul complementar al tulpinilor de Shigella recent isolate, care
prezinta in proportie de 100% un test pozitiv.
Tehnica de lucru: colonia suspecta de pe mediul cu bila se trece pe o
geloza simpla, inclinata. Dupa 6-8 ore sau a 2 a zi, daca situatia clinica sau
epidemiologica nu reclama urgenta, se incarca bine o ansa (de 0.65 1 mm
grosime) cu cultura dezvoltata si se introduce sub pleoapa ochiului unui
cobai (de orice varsta sau greutate). Sub pleoapa se fac cateva miscari
adecvate pentru a goli ansa de incarcatura microbiana, cu grija insa de a nu
leza mucoasa conjuctivala. Se recomanda sa se faca acelasi lucru si la
celalalt ochi.
Dupa 12 ore (sau cel mult 24 de ore) in cazul cand germenii inoculati fac
parte din grupul Shigella, va aparea o congestie conjuctivala, o secretie
mucopurulenta mai mult sau mai putin abundenta si o opacifiere a corneei.
In urmatoarele ore si zile, toate aceste fenomene se accentueaza, ajungand
pana la keratoconjuctivita. Boala la cobai dureaza 14-21 zile in medie si intr-

un anumit procent se cronicizeaza, putand ajunge la ulceratii corneene. In

mod obisnuit insa, restitutia clinica si anatomica este integrala si numai
arareori animalul moare. Dupa cel putin o luna de la vindecare cobaii pot fi
refolositi in acelasi scop.
Atragem atentia ca pe tot timpul bolii, cobaii fiind eliminatori de germeni,
prin secretiile oculare si uneori chiar prin materiile fecale, sunt contagiosi,
atat pentru alti cobai, cat si pentru personalul de laborator.
Acest lucru impune o grija deosebita pentru prevenirea contaminarii, fie a
cobailor, fie a personalului care manipuleaza animalele bolnave. Cobaii vor
fi tinuti in borcane separate. Borcanul va fi acoperit cu tifon pentru a preveni
patrunderea mustelor. Ingiena personalului ingrijitor trebuie sa fie
exemplara, atat pentru protectia lui proprie, cat si pentru a nu permite
transmiterea bolii la alti cobai sau chiar oamenilor.
2. testul de punere in evidenta a exotoxinei Shiga (pe soarecele alb) se
efectueaza la nivelul Centrului National de Referinta Shigella din Insitutul
Cantacuzino, pentru tulpinile suspectate a apartine speciei Shiga (Shigella
dysentariae tip1).
Pastrarea tulpinilor de Shigella in laborator se va face pe geloza 0.2%
dreapta (coloana 5-7 cm), pH = 7.6-7.8 fiind apoi (dupa incubare de 24 ore
la 37C) inchise ermetic (cu dop de cauciuc sau parafinate). Pastrarea
tulpinilor se face la temperatura camerei si la intuneric (30 de zile pe
geluloza moale 0.2% si 6 luni pe mediul Dorset, dupa care este nevoie de o
noua trecere). Se atrage atentia asupra faptului ca tulpinile de Sh.
dysenteriae tip 1 (Shiga) nu pot fi pastrate pe geloza inclinata sau in placi
mai mult de 24-48 ore.

Izolare si identificare tulpini V. cholerae 01/0139

(CDC/WHO 2003)

Laborator

Timp

Coprocultura
o picatura din

suspensie
scaun lichid

APalc
18-20h

6-8h / 35-37C
18-34 ore
APalc
6-8h / 35-37 C

TCBS
agar neselectiv

(inalt selectiv, nu necesita an.are)

(30 sec - 1 min)

R.aglutinare

reactia oxidazei
(10 sec)

Ser fiziologic Ser polivalent 01

(-)

(+)

Ser ads
In

Total 36-54 ore

(-)

Ser ads
Ser 0139
Og

24-72 ore
in caz (+)

confirmare

TSI

Izolare si identificare tulpini V. cholerae 01/0139/IC 2004

Laborator

Timp

Coprocultura
Direct/m. ..
APalc (I i.)

16-24 ore

Apalc (II-a I.)

BSA+TCBS
BSA+TCBS

Ser polivalent 01

Ser fiziologic
idem

CNR

Aglutinare (30sec-1min)
Ser ads
In

Aspect colonie

(+)
oxidaze

Ser ads
Og

Schema diagnostic de certitudine Vibrio cholerae

tub Durham

Gl
+
gaz -

Lac
-

Z
+

Mz
+

Mn
+

Ara
-

Ad
-

In
-

Idc
+

Odc ADH M
+
(Gl)

Tulpini V. cholerae non 01

a. producatoare de toxine

enterotoxine tip CT (tulpini cholera-like)

toxina sto (ST)
hemolizine

similare celor
de la V. ch. 01...

b. enteroinvazive
c. enteropatogene
d. inerte din punct de vedere biologic

similare celor de la
V. parahaemolyticus

Etapele reaciei GM1-ELISA pentru detectarea CT

Substana
cromogen

FAlc
Ac
capr
anti CT
CT

2
1
GM1 +
GM1
CT
(receptor pentru CT)
(din supernatant)
fixat pe fundul
godeului

3
GM1+
CT+
Ac anti CT

Ac oaie
anti capr
marcai

4
GM1+
CT+
Ac capra anti CT +
Ac oaie (anti capra),
marcai cu fosfataz
alcalin

FAlc

5
ca la 4
+
substrat
.gen care
interacioneaz
cu enzima
-> devine colorat

Tabel 6

Formula lichidului de rehidratare OMS

(Gelsol)
Rp.
ClNa
Bicarbonat Na
ClK
glucoz
ap distilat

.
.
.
.
.

3,5
2,5
1,5
20
1000 ml

EVIDENTIEREA POTENTIALULUI DE VIRULENTA SI PATOGENITATE PRIN TESTE IN VITRO

Determinarea capacitatii de aderenta si invazie a tulpinilor bacteriene la un substrat celular, prin
metoda Cravioto i colab (1979).
Modelul utilizeaz ca substrat celular sensibil liniile celulare HEp-2 (Human Epithelioma) sau CaCo-2
(linie de celule intestinale, de origine tumoral - Carcinom Colonic). Pentru cultivarea acestei ultime linii este
necesar adugarea la mediul pentru culturi celulare a unui supliment nutritiv numit I.T.S. (Insulin
Transferrine Selenium)- Sigma, care permite obinerea unui monostrat cu confluen 80% pentru realizarea
testului de aderen n 48 de ore, aceste celule avnd n mod normal o cretere foarte lent in vitro. Celulele sunt
cultivate n mediu Eagle MEM (EMEM) (Gibco), cu adaos de 10% ser fetal de viel, glutamin 1%, soluie
penicilin-streptomicin 1%, soluie fungizon 1%, ITS 1%.
Se utilizeaza culturi de 18 ore n bulion nutritiv din care se prepara suspensii bacteriene n TFS, cu
densitate optic D.O. = 2 (msurat spectrofotometric la = 600 nm), care corespunde densitii celulare de 1 x
109 U.F.C./ml.

Determinarea calitativa a capacitatii de aderenta

Se adauga cate 1 ml de suspensie bacterian peste monostratul celular, dup
ndeprtarea mediului de cretere suplimentat cu antibiotice i spalarea (de 3 ori) cu mediu
fr antibiotice.
Dup repartizarea suspensiilor bacteriene peste monostratul celular, plcile se
incubeaza la 37C, timp de 2 ore, timp n care bacteriile ader la suprafaa celulelor
substratului; se spala monostratul celular infectat, cu TFS (3x).
Se fixeaza cu metanol (5 min).
Se coloreaza celulele aderate cu soluie Giemsa- 20 min.
Se spala godeurile cu ap de robinet.
Se usuca i se examineaza la microscopic cu O.I., determinndu-se pattern-ul de
aderen (localizat, difuz sau agregativ) i numrul de celule aderate + invadante.
Determinarea cantitativa a capacitatii de aderenta si invazie
Fiecare tulpina de testat se va inocula in 2 godeuri
Dupa primele 2 ore de incubare se adaug cte 1 ml de mediu cu gentamicin ntr-unul din cele 2
godeuri.

Adugarea gentamicinei are rolul de a omor toate bacteriile aflate n mediul

extracelular, supravieuind doar bacteriile care au invadat celulele substratului. n godeurile
fr gentamicin se apreciaz numrul total de bacterii aderate i invazive.
Plcile se incubeaz la 37C, timp de o or;
ndeprtarea mediului i splarea monostratului celular cu TFS (3x), pentru ndepartarea bacteriilor neaderate.
Se adaug in toate godeurile cte 1 ml Triton X-1% n TFS/ godeu i se incubeaz 5 minute la 37C pentru
eliberarea bacteriilor aderate i a celor invadante intracelulare;

Se fac diluii zecimale din suspensiile din fiecare godeu (pn la diluia 1/10 8) n ap fiziologic steril (AFS),
care se

nsmneaz, cte 10l din diluiile obinute, pe geloz nutritiv n plci, n triplicat , pentru

determinarea U.F.C./ml (se face media nr. de colonii).

n godeurile fara gentamicina se determin numrul de celule aderate i invadante, iar n cele cu gentamicina se
determin numrul de celule invadante (internalizate).
Interpretarea rezultatelor se bazeaz pe compararea ordinelor de mrime ale numrului de celule viabile
(U.F.C./ml) din suspensiile utilizate ca inocul pentru fiecare tulpin bacterian testat i din suspensiile celulare
din compartimentele plcilor multi-well, dup realizarea celor dou modele experimentale pentru aprecierea
capacitii de aderen + invazie i respectiv invazie.
Capacitatea de aderena la substratul inert - testul producerii de slime (pelicul)

Factorul slime (exopolizaharid hidrofil secretat de unele tulpini care promoveaz

aderena celulelor bacteriene la suprafee inerte, abiotice) este un indicator al gradului de
rezisten i al capacitii de supravieuire a tulpinilor bacteriene n mediul extern i poate
constitui un factor de virulen, n cazul infeciei unui organism gazd, prin blocarea
procesului de fagocitoz. Tulpinile bacteriene de S. aureus si Ps. aeruginosa sunt cultivate pe
agar cu snge de oaie, incubate timp de 24h la 37 oC. Pentru fiecare tulpina s-au executat din
cte o colonie doua suspensii bacteriene identice n ap peptonat (repartizat cte 1ml n
tuburi de diametru de 12mm), care sunt incubate 24h la 37 oC. Dup incubare tuburile sunt
golite de cultura bacterian, splate de 3 ori cu ap peptonat (pH=7.2), uscate la temperatura
camerei i colorate cu soluie alcoolic de safranin 1% -30min. Dup colorare tuburile sunt
golite, splate de 2 ori cu apa peptonat i uscate. Prezena inelului rou pe pereii interiori ai
tuburilor s-a inregistrat ca rezultat pozitiv, iar absena inelului rou ca rezultat negativ ((Lazar
si colab., 2004).
Evidentierea hemolizinelor. Hemolizinele sunt enzime extracelulare care acioneaz
n patogeneza diferitelor specii bacteriene ca toxine formatoare de pori. Bacteriile
produc mai multe tipuri de hemolizine, evideniate prin diferite teste: hemoliza
hematiilor de oaie, hemoliza hematiilor de berbec (evidenierea factorul hemolitic
Kanagawa) sau teste de sinergism de tip CAMP pentru evidenierea hemolizinelor
incomplete de tip factori CAMP-like, care produc hemoliza hematiilor doar n
prezena unei sfingomielinaze produse de o tulpin de stafilococ beta-hemolitic.
Dintre aceste hemolizine, hemolizina de tip Kanagawa joac rol de enterotoxin i a
crei aciune toxic a fost demonstrat n teste de patogenez experimental (aceast
enterotoxin determin acumularea de lichid n ansa ligaturat de iepure, ceea ce
demonstreaz inducerea de pori n enterocite i alterarea pattern-ului secretor al

acestor celule). Detectarea producerii de hemolizine s-a evideniat prin nsmnarea

bacteriei de cercetat pe geloz repartizat n plci Petri cu adaos de 5% snge de oaie
sau snge de iepure (evidenierea hemolizinelor Kanagawa). Dup incubare la 37 0C
timp de 24h s-a vizualizat apariia zonelor de hemoliz n jurul coloniilor, sub forma
unui halou transparent, clar, caracteristic pentru tulpinile beta-hemolitice (care
realizeaz o hemoliz complet, n care hemoglobina eliberat din hematii sub
aciunea beta-hemolizinelor este degradat total pn la produi finali de metabolism)
sau verzui caracteristic tulpinilor alfa-hemolitice care realizeaz o hemoliz partial, n
care hemoglobina este degradata doar partial de catre bacterii la methemoglobin).
Zona de hemoliz poate fi accentuat prin pstrarea plcilor la frigider cteva ore
nainte de citirea rezultatelor (Lazar si colab., 2004).
Testul de evideniere a factorului CAMP i a factorilor CAMP-like
Unele bacterii posed hemolizine incomplete, care pot induce formarea de pori n
eritrocitelor doar n prezena unei enzime solubile denumite sfingomielinaza

membrana

C, secretat de tulpini de S.

aureus hemolitice.
Pentru detectarea acestor factori CAMP sau CAMP-like, tulpinile de cercetat s-au

nsmnat sub

form de striuri paralele pe geloz-snge, iar perpendicular pe aceste striuri, la 8 mm distan, se nsmneaz
o tulpin de S. aureus hemolitic. Prezena
sinergice, mrite, de hemoliz

factorului CAMP este indicat de apariia unei zone

complet la extremitatea striurilor din vecintatea tulpinii de S. aureus

hemolitic, cu aspect de sgeat, n timp ce pe restul lungimii striului de cultur se observ hemoliz
incomplet sau chiar absena hemolizei (Lazar si colab., 2004).
Hemolizinele stafilococice au o activitate biologica foarte variata, avand in principal
hemolitica, letala si dermonecrotica. La S. aureus sunt descoperite 4 tipuri de
antigenic: alfa, beta, gamma si delta. Tulpinile de stafilococ
frecvent asociatia de alfa si delta hemolizine (82%).
hemolitica asupra eritrocitelor de oaie si de
agresivitatea asupra tuturor
actiunea citolitica
toxina

actiune

hemolizine,

distincte

patogene pentru om prezinta cel mai

Alfa

toxina

(alfa

hemolizina)

are

actiune

iepure, foarte slab asupra hematiilor umane, isi exercita

tesuturilor organimului, inclusiv asupra macrofagelor si trombocitelor,

nu se exercita asupra monocitelor care au rezistenta fata de alfa hemolizine. Beta

(beta hemolizina) este o sfingomielinaza care actioneaza asupra structurilor

0

din membrana eritrocitara la 37 C si hemolizeaza specific eritrocitele de

de iepure. Aceasta enzima realizeaza o hemoliza caldprocesului de hemoliza la +40C, care incepe
(gamma hemolizina) exercita

rece,

sfingomielinice

oaie, dar nu si hematiile umane si

manifestata

prin

accentuarea

neta

prin incubarea la 370C timp de 18-20 ore. Gamma toxina

actiune litica asupra eritrocitelor de iepure, om, oaie, leucocitelor si

limfoblastelor umane. Delta toxina (delta hemolizina) are actiune hemolitica asupra hematiilor umane,
de oaie, de iepure, dar si aspra altor eritrocite si actiune citolitica asupra neutrofilelor,
trombocitelor si macrofagelor. Unele tulpini de stafilococ coagulazocitolitica denumita epsilon hemolizina. Pseudomonas

limfocitelor,

negative pot produce o enzima

aeruginosa produce hemolizine termostabile si

lecitinaze care actioneaza local la nivelul focarului de infectie.

 Detectarea producerii de alte toxine formatoare de pori

Lecitinazele si lipazele sunt enzime implicate n patogeneza unor tulpini bacteriene
prin capacitatea lor de a induce formarea de pori n membrana celulelor eucariote, prin
alterarea coninutului lipidic al acesteia. Astfel, n cursul infeciei aceste enzime pot
aciona ca toxine formatoare de pori, fiind responsabile de simptome ca diareea apoas
caracteristic infeciei holerice. Pentru evidentierea producerii de lecitinaz, culturile
sunt nsmnate n spot pe mediu solid cu galbenu de ou i incubate la 37 oC pn la 7
zile. Prezena unei zone opace (de precipitare) n jurul ariei de cretere a indicat
producerea de lecitinaz. Pentru evidentierea producerii de lipaz culturile sunt
nsmnate n spot pe mediu solid cu adaos de Tween 80 n concentraie final de 1% i
sunt incubate la 37oC pn la 7 zile. Prezena unei zone opace (de precipitare) in jurul ariei
de cretere a indicat producerea de lipaz. Lipazele stafiloccocice actioneaza asupra
lipidelor plasmatice si a grasimilor de pe suprafata tegumentelor. Astfel se explica
tropismul si colonizarea stafilococilor pentru zonele tegumentare unde glandele sebacee
sunt mai active (Lazar si colab., 2004).
Proteazele sunt enzime extra-celulare cu specificitate sczut, care hidrolizeaz
proteinele la peptide i aminoacizi, implicate in distrugerea integritatii tesuturilor
gazdei si in progresia infectiei. Pentru evidentierea producerii de proteaze, tulpinile
sunt nsmnate n spot pe doua tipuri de medii solide - cu cazein, respectiv cu
gelatin, i incubate 24h la 37oC. Prezena unei zone de precipitare n jurul ariei de
cretere a indicat proteoliza

cazeinei/gelatinei (prezena cazeinazei/gelatinazei)

(Lazar si colab., 2004). Hialuronidaza stafilococica este o enzima care difuzeaza

extracelular si actioneaza prin descompunerea acidului hialuronic in glucosamina, acid
gluconic si acid acetic, favorizand astfel patrunderea si invadarea tesuturilor.
Stafilococii patogeni sunt producatori de hialuronidaza in proportie de 90%. Reactia
inflamatorie de la nivelul tesutului afectat de stafilococ blocheaza actiunea
hialuronidazei (factor de difuziune) la fazele initiale ale infectiei, enzima fiind
considerata factor accesoriu de patogenitate. Ps. aeruginosa produce o serie de
proteaze (colagenaze, elastaze) cu rol in progresia infectiei.
Producerea de DNA-z: tulpinile sunt nsmnate n spot pe geloz cu ADN i incubate 24h la 37 oC.
Dup incubare, peste culturile n spot s-a adaugat cteva picaturi de soluie HCl 1N, clarificarea zonei

n jurul ariei de cretere a fost nregistrata ca reacie pozitiv (Lazar si colab., 2004). Nucleazele
stafilococice

sunt enzime termorezistente, elaborate de tulpinile patogene coagulazo-pozitive in

proportie de 90-95%. Aceasta enzima este absenta la tulpinile coagulazo-negative si la Staphylococcus

epidermidis. Biochimic, este o fosfodiesteraza care poate desface atat molecula de ADN cat si pe cea
de ARN, producand fosfomononucleotizi, ce pot fi utilizati in sintezele proprii.
Mucinaza joac un rol foarte important n virulena unor tulpini bacteriene i reprezint un complex
enzimatic care scindeaz mucina gastric, favoriznd accesul microorganismelor la receptorii specifici de pe
suprafaa celulelor epiteliale. n acelai timp produii de hidroliz ai mucinei ,,tapeteaz celulele bacteriene
i le protejeaz de aciunea nociv a pH-ului acid i a altor molecule implicate n aprarea anti-infecioas la
nivelul mucoaselor (Lazar si colab., 2004). Pentru evidentierea producerii de mucinaz tulpinile sunt
nsmnate n spot pe mediu cu mucina din stomac de porc i incubate la 35 oC pn la 7 zile; activitatea
enzimatic a fost determinat prin prezenta unui halou transparent n jurul ariei de cretere.

MUCINAZA

Hemolizine

Lecitinaza
(Fosfolipaze)

LIPAZA

DN-aza

Amilaza

Cazeinaza

DN-aza

CAMP

DETERMINAREA SPECTRULUI DE SENSIBILITATE LA ANTIBIOTICE A SPECIILOR

MICROBIENE
Datorita specificitii lor de aciune, antibioticele manifest eficien diferit fa de diferite specii
microbiene; totalitatea speciilor microbiene sensibile la un anumit antibiotic definete spectrul de
activitate al antibioticului respectiv. n funcie de numrul i diversitatea speciilor microbiene afectate,
spectrul de activitate al antibioticelor poate fi :
- larg (de exemplu, spectrul de aciune al tetraciclinei este reprezentat de bacterii Gram-negative,
inclusiv chlamidii i rickettsii i specii Gram-pozitive; penicilinele sunt active n special fa de specii
Gram-pozitive, dar i Gram-negative, inclusiv chlamidii; nitrofuranii, rifampicina, sulfamidele sunt
active pe un numr mare de specii bacteriene Gram-pozitive i Gram-negative i pe bacteriile acidoalcoolo-rezistente);
- ngust (novobiocina este activ pe bacteriile Gram-pozitive, mai ales stafilococi, dar i pe coci i
bacili Gram-negativi, cum ar fi hemofilii i pasteurelele; glicopeptidele, bacitracina, pe bacterii Gram
pozitive);
- limitat (nitroimidazolii sunt activi doar pe microorganismele anaerobe).
Chiar n cadrul aceleiai specii microbiene, pot exista diferene mari de sensibilitate a diferitelor
tulpini fa de un anumit antibiotic, astfel c stabilirea tratamentului cu antibiotice n clinic necesit
izolarea tulpinii microbiene care reprezint agentul etiologic al infeciei respective (mai ales dac acesta
aparine unor genuri i specii supuse fenomenului de dobndire a rezistenei clinice) i determinarea
spectrului su de sensibilitate la antibiotice.
Evaluarea in vitro a eficienei unui antibiotic se realizeaz prin msurarea a trei parametri, care
variaz n funcie de concentraia antibioticului i de timpul su de aciune:
-

concentraia minima activ (= C.M.A.) - este concentraia la care antibioticul poate induce
anumite perturbri n activitatea metabolic a microorganismelor, fr a afecta capacitatea de
multiplicare i viabilitatea microorganismelor;

concentraie minima inhibitorie (= C.M.I.) -

este concentraia

la care un antibiotic inhib

multiplicarea microorganismelor (efect bacteriostatic);

-

concentraie minima bactericida (= C.M.B.) - este concentraia la care un antibiotic are aciune
letal asupra microorganismelor (efect bactericid).
Cunoaterea acestor parametri prezint o importan clinic deosebit, deoarece, pentru unele

antibiotice, concentraia bactericida este foarte greu de atins in vivo. Din acest motiv, unele antibiotice ca
tetraciclina, cloramfenicolul, rifampicina sunt considerate antibiotice bacteriostatice.

Pe lng valoarea C.M.I. determinat in vitro, n alegerea tratamentului cu un anumit antibiotic, trebuie
s se in cont i de calitile farmacologice ale antibioticului respectiv (de exemplu, posibilitatea
realizarii concentraiei active la nivelul focarului de infecie), de eventualele efecte secundare i de
starea fiziologic a bolnavului.
Tehnica de evideniere a sensibilitaii la antibiotice a unei tulpini microbiene se numete
antibiograma. Antibiograma trebuie practicat n mod obligatoriu n cazul microorganismelor patogene,
supuse fenomenului de dobndire a rezistenei, naintea nceperii oricrui tratament cu antibiotice.
Dup determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice prin tehnici calitative (n care tulpina
microbian de testat este pus n contact cu diferite antibiotice aflate ntr-o anumit concentraie), se pot
practica teste cantitative pentru determinarea valorii C.M.I. (n care tulpina microbian este pus n
contact cu concentraii cresctoare ale aceluiai antibiotic).

1. Metode calitative de determinare a spectrului de sensibilitate la antibiotice

Metoda difuzimetric (Kirby-Bauer)
Este o metod foarte simpl i rapid, care permite determinarea concomitent a spectrului de
sensibilitate a microorganismului i a valorii C.M.I. n vederea calculrii dozelor terapeutice de
antibiotice. Metoda are mai multe variante, n practic folosindu-se curent tehnica discurilor impregnate
cu antibiotice, standardizat, recomandat de NCCLS / CLSI (National Committee for Clinical
Laboratory Standardisation / Clinical Laboratorz Standards Institute).
O serie de factori, ca de exemplu, tulpina microbian studiat (densitatea inoculului, specia,
vrsta culturii), mediul de cultur (compoziia mediului, pH-ul, densitatea i grosimea stratului de
mediu), tehnica folosit i criteriile de interpretare a rezultatelor obinute, pot influena rezultatele unei
antibiograme. Din acest motiv, tehnica trebuie efectuat n condiii standardizate, reproductibile,
conform indicaiilor forurilor internaionale n domeniu.
Pe suprafaa unui mediu agarizat nsmnat n pnz cu un inocul standardizat, obinut din tulpina
de testat, se plaseaz la distane egale discuri impregnate cu soluii de antibiotice de o anumit
concentraie care vor difuza n mediu, realiznd un gradient de concentraie invers proporional cu
diametrul zonei de difuzie, deci cu distana fa de disc. Dac tulpina este sensibil la un anumit
antibiotic, creterea microbian va fi inhibat pe o anumit suprafa n jurul discului impregnat cu
antibioticul respectiv, suprafa denumit zon de inhibiie a creterii.
Citirea rezultatelor se realizeaz prin masurarea diametrelor zonelor de inhibiie a creterii
determinate de diferite antibiotice, cu ajutorul unei rigle gradate. n cazuri de urgen clinic se poate

realiza o prim citire la 6-8 h de la incubare. Interpretarea rezultatelor se face n funcie de dimensiunea
zonelor de inhibiie a creterii, exprimnd rezultatul cu termenii de tulpin sensibil (S), rezistent (R)
sau intermediar sensibil (I), conform tabelelor cu puncte critice standardizate i corespunztoare
metodei de lucru: tabelele NCCLS pentru metoda difuzimetric recomandat de NCCLS (National
Committee for Clinical Laboratory Standards, USA), in prezent CLSI (Clinical laboratory and
Standards Institute).
Termenii S, I, R definesc de fapt i categoriile de antibiotice, n funcie de efectul lor clinic, dup
cum urmeaz:
- categoria S, nseamn c exist o mare probabilitate ca antibioticul, administrat n doze obinuite, s
elimine infecia determinat de tulpina testat (C.M.I. are valori net inferioare celor ale concentraiilor
umorale obinute n urma administrrii unei doze obinuite);
- categoria I, semnifica probabilitatea ca antibioticul s fie eficient in vivo prin administrare local sau
prin realizarea n mod fiziologic a concentraiilor mari in organe sau esuturi (rinichi, ficat, cai biliare),
la nivelul crora este localizat procesul infecios;
- categoria R nseamn c, cel mai probabil, administrarea antibioticului nu va determina eliminarea
din organism a agentului infecios, a crui sensibilitate a fost testat sau rezultatul tratamentului este
imprevizibil.
La citirea i interpretarea rezultatelor se iau n considerare diametrele zonelor de inhibiie, lipsite
complet de colonii vizibile cu ochiul liber.
Apariia coloniilor la marginea sau n interiorul zonei de inhibiie se poate datora urmatorilor
factori: cultura este mixt sau suprainfectat; cultura este pur, dar prezint celule heterorezistente;
apariia mutantelor rezistente; dezvoltarea tardiv a unor celule, de fapt sensibile, i apariia coloniilor
dup ce antibioticul s-a diluat prin difuzie n mediu.
2. Metode cantitative de determinare a valorii C.M.I.
Metoda diluiilor n mediul lichid sau n agar
Principiul metodei: un inocul standardizat al tulpinii testate este nsmnat ntr-un gradient
discontinuu de concentraii ale antibioticului, fie n plci cu mediu agarizat, fie n tuburi cu bulion
nutritiv. Dup incubarea adecvat, se citeste valoarea C.M.I. prin observarea macroscopic a tuburilor:
n primele tuburi, cu concentraii mari de antibiotic, creterea culturii nu este vizibil, microorganismele
fiind omorte sau inhibate n prezena antibioticului. Concentraia de antibiotic corespunztoare tubului

cu cea mai mic concentraie, care inhib creterea vizibil a culturii microbiene, reprezint valorea
C.M.I. (mcg/ml) pentru antibioticul respectiv. n tuburile urmtoare, inclusiv tubul martor de cretere,
mediul se tulbur ca urmare a creterii microbiene. n tubul martor de sterilitate, obligatoriu mediul
trebuie s rmn steril (limpede), iar pe placile cu mediu agarizat, coloniile lipsesc. Determinarea
C.M.I. se utilizez pentru stabilirea dozei terapeutice i a cii de administrare n cazul infeciilor severe,
supravegherea evoluiei rezistenei bacteriilor la antibiotice, cuantificarea activitaii bactericide a
substantelor antimicrobiene. Aceast metod permite i aflarea valorii C.M.B. (concentraia minim
bactericid) pentru antibioticul testat. Pentru aceasta, se preleveaz 0.01 ml sau 0.1 ml din tuburile
utilizate pentru tehnica diluiilor n mediu lichid (din tubul la care s-a stabilit valoarea C.M.I. i din
tuburile anterioare care prezint concentraii superioare de antibiotic) i se nsmneaz pe suprafaa
unor plci cu mediu solid nesuplimentat cu antibioticul testat. Dup incubare, se va observa dezvoltarea
microorganismelor la diluia corespunztoare C.M.I. Valoarea C.M.B. este dat de cea mai mic
concentraie de antibiotic care reduce numrul coloniilor pan la 99.9%.
Metoda E-test
La ora actual, exist variante ale metodei difuzimetrice pentru determinarea valorii C.M.I.. O
astfel de varianta este E-testul (Epsilometer test), ce utilizeaz benzi impregnate cu diferite antibiotice
ale cror concentraii variaz exponenial i sunt nscrise pe banda respectiv. Zona de inhibiie a
creterii microorganismului testat are aspect de elips, al crei diametru variaz direct proporional cu
gradientul de concentraie a antibioticului difuzat n mediu, diminundu-se odat cu scderea
concentraiei astfel c, la o anumit valoare, zona de inhibiie a creterii va intersecta banda, concentraia
nscris pe band la acest nivel indicnd valorea C.M.I.

Aspectul benzilor E-test i gradientul de Zona de inhibiie n elips i determinarea

concentraie al antibioticului utilizat.
valorii C.M.I. cu ajutorul E-test.
Zona de inhibiie a creterii microorganismului testat are aspect de elips, al crei diametru
variaz direct proporional cu gradientul de concentraie al antibioticului difuzat n mediu, diminunduse odat cu scderea concentraiei astfel c, la o anumit valoare, zona de inhibiie a creterii va
intersecta banda, concentraia nscris pe band la acest nivel reprezentand valorea C.M.I..
Materiale necesare:
Inocul standardizat (pregatit ca n tehnica anterioara);
Plci Petri cu mediu Mueller-Hinton;
Pipete gradate sau tampon de vata sterile.
Mod de lucru:
Inoculul standardizat se repartizeaz pe suprafaa mediului Mueller-Hinton, prin tehnica nsmnrii
n panz cu tamponul de vat steril sau prin inundare cu pipeta gradat.

Dup uscarea suprafetei mediului, se aplic benzile E-test cu concentraia maxim orientat spre
periferia plcii Petri. Pentru obinerea de rezultate optime, pe o plac Petri pot fi dispuse maximum 5
benzi E-test.

Plcile sunt incubate n condiii corespunztoare microorganismului testat, timp de 15-18h. Dup
incubare, valorile CMI se citesc prin examinarea direct a benzilor.

Etapele determinrii valorii C.M.I. cu ajutorul E-testului.

Controlul de calitate n testarea sesibiltii la antibiotice
Controlul de calitate are drept scop s asigure precizia i fiabilitatea tehnicii de testare a
sensibilitii, performana reactivilor utilizai i performana personalului care efectueaz testele (Codi,
2005). Pentru a rspunde acestor deziderate, laboratoarele care realizeaz antibiograma trebuie s
dispun de tulpini de referin pentru realizarea antibiogramei, i anume: Escherichia coli ATCC 25922,
Escherichia coli ATCC 35219,

Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC

43300, Staphylococcus aureus

ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Haemophilus

influenzae ATCC 49247, Haemophilus influenzae ATCC 49766, Neisseria gonorrhoae ATTC 49226,
Neisseria gonorrhoae ATTC 49226, Streptococcus pneumoniae ATCC 49619.
Controlul de calitate trebuie s fie realizat pentru fiecare lot nou de mediu Mueller Hinton i /
sau antibiotic, utiliznd tulpinile de referin care vor fi testate n aceleai conditii ca i cele bacteriene a
caror rezistenta se evalueaz. Antibiogramele vor fi efectuate zilnic pentru fiecare dintre tulpinile de
referin.
Daca rezultatele nu sunt satisfctoare, vor fi controlai urmtorii parametri:
1. citirea i interpretarea diametrelor zonelor de inhibitie
- citirea antibiogramei trebuie realizat cu ajutorul unei rigle precise i s se evite la maximum erorile,
meninndu-se instrumentul de msur perpendicular pe axa optic;
- trebuie verificat daca interpretrile (S, I, R) corespund diametrelor masurate;
- trebuie evitate erorile prin confuzia diferitelor tabele de citire.
2. mediul de cultur

pH-ul trebuie s fie 7,2 - 7,4, deoarece variaiile de pH influenteaz activitatea aminozidelor,
macrolidelor i fenicolilor.
Umiditatea:
- plcile cu mediu trebuie s fie uscate inainte de inoculare
Concentraia n timidin sau timin:
- o concentraie prea crescut de timidin determin o reducere a diametrelor zonelor de inhibiie in jurul
discurilor de sulfamide i trimetoprim
- pentru aceasta trebuie testat mediul MH cu o tulpin de referin Enterococcus faecalis ATCC 29212;
diametrul de inhibiie n jurul discului de cotrimoxazol trebuie s fie >/= 20 mm.
Concentraia n cationi divaleni:
- o concentraie prea crescut n ioni bivaleni (n principal de Ca 2+ i Mg2+) determin o reducere a
diametrelor zonelor de inhibiie n jurul discurilor de aminozide (testate pentru P. aeruginosa), n timp ce
concentraii mai mici favorizeaz apariia unor zone de inhibiie prea mari
- ionii de Zn influeneaz activitatea carbapenemelor
- concentraiile optime trebuie s fie : Ca2+ = 50 100 mg i Mg2+ = 20 - 35 m
3. inoculul
- etalonul 0,5 Mc Farland - se poate obtine astfel:
0,5ml Mg Cl2 sol 1% (10 g/l) +
95,5 ml H2SO4 1% (10 ml/ l);
etalonul astfel preparat trebuie s prezinte o densitate optic (D.O.) de 0,08 - 0,1 la 625 nm.
- se repartizeaz aceast soluie n volume de 10 ml, n tuburi identice cu acelea care vor servi la
prepararea inoculului
- tuburile se inchid ermetic pentru a evita evaporarea (parafilm, adeziv etc.)
- se marcheaz nivelul lichidului cu un marker i se controleaz periodic msurndu-i densitatea optic
- se conserv tuburile la temperatur ambiant, ferit de lumin (hrtie de aluminiu)
- tubul etalon se agita nainte de utilizar, iar inoculul i etalonul trebuie s aib aceeai turbiditate
4. discurile de antibiotice
- nainte de utilizare, cartuul de antibiotic trebuie verificat pentru data valabilitii, mai ales pentru lactamine, i pentru ncarctura discului;
- stocul de cartue de antibiotice trebuie s fie pastrat la -20 oC; aplicatorul ncrcat cu antibiotice trebuie
pstrat la + 4 oC;
- discurile umede sau n contact direct cu gheaa, sau care au fost conservate la temperatura ambiant nu
trebuie utilizate;

- cartuele trebuie scoase din frigider sau congelator cu 1-2 h nainte de utilizare.
5. tulpinile de referin
- de la primirea lor, tulpinile de referin vor fi izolate pe un mediu adecvat; plecnd de la aceast cultur
se fac 12 subculturi care se repartizeaz n 12 tuburi si se conserv prin congelare la - 70 oC. n fiecare
lun se va scoate un tub congelat cu tulpina / tulpinile care vor fi testate; se refac 12 tuburi cu culturi
pentru congelare, pentru anul viitor, pornind de la al 12-lea tub consevat
Aplicaii practice ale citirii interpretative
Evidenierea fenotipic a beta-lactamazelor (beta-lactamaze)
Prima penicilinaz a fost descoperita de Abraham n 1940. La ora actual exist peste 300 de
beta-lactamaze, cu evoluie accelerat sub aciunea presiunii selective exercitate de antibiotice betalactamice (utilizate la scar larg), care favorizeaz producerea mutaiilor spontane n genele ce codific
enzimele deja cunoscute, cu apariia de noi fenotipuri de beta-lactamaze.
O tulpin bacterian productoare de beta-lactamaze este mai virulent, pe de o parte datorita
prezenei enzimei, adesea codificat plasmidial, i pe de alt parte datorit prezenei altor factori genetici
de virulen localizai pe aceeai plasmid (factori de adeziune la mucoasa intestinal).
Tulpinile producatoare de beta-lactamaze pot produce epidemii i situaii clinice complicate
datorit transmiterii clonale, transferului orizontal al genelor codificatoare la alte specii, diseminrii
plasmidiale cu evoluia convergent a aceleiai enzime pe diferite plasmide, evoluiei genelor
codificatoare de betalactamaze, persistenei tulpinilor productoare de beta-lactamaze n mediul
spitalicesc, seleciei de tulpini rezistente sub aciunea presiunii selective a antibioticelor, introducerii de
noi tulpini rezistente n mediul spitalicesc.
Clasificarea beta-lactamazelor
n funcie de specificitatea de substrat (penicilin, oxacilin, carbpenicilin i cefalosporine cu spectru
larg), susceptibilitatea la inhibarea cu acid clavulanic, beta-lactamazele se clasific n 4 clase: clasele A,
C i D conin serin-beta-lactamaze, iar clasa B conine metalo-beta-lactamaze (Bush i colab., 1995).
Clasa A

conine penicilinaze inhibate de acidul clavulanic; hidrolizeaz peniciline,

cefalosproine cu spectru larg sau ngust, monobactami, AMX, TIC, PIP, CF ; sensibile la acid clavulanic,
cu excepia beta-lactamazelor TEM rezistente la inhibitori (IRT inhibitor- resistant TEM betalactamases) ; nu hidrolizeaz cefalosporinele din generaiile II i III, carbapenemele; sunt reprezentate
de :

 penicilinazele de la bacteriile Gram-negative;

beta-lactamazele cu spectru extins (ESBL - extended spectrum beta-lactamases) ce
hidrolizeaz att penicilinele, ct i cefalosporinele geneneraiei III ; inhibate de acidul clavulanic ; nu
hidrolizeaz carbapenemele; reprezentative sunt TEM- i SHV-ESBL;
Clasa B - conine carbapenemaze, metaloproteaze Zn-dependente ce hidrolizeaz toi betalactamii cu excepia AZT; sunt susceptibile la EDTA i rezistente la inhibitori (imipenem);
Clasa C - cuprinde cefalosporinaze rezistente la inhibitori, hidrolizeaz cefalosporinele de gen. I,
II, ceftazidimul, nu hidrolizez carbapenemele; reprezentative sunt beta-lactamazele AmpC cu
exprimare inductibil de la bacteriile Gram-negative (ex. Enterobacter cloacae i E.coli);
Clasa D conine oxacilinaze (enzimele Oxa) rezistente la inhibitorii clasici, susceptibile la
aciunea NaCl, nu hidrolizeaz carbapenemele;
Metoda difuzimetric permite detectarea fenotipulurilor ESBL tip TEM i SHV prin determinarea
sensibilitii la anumite antibiotice beta-lactamice.
Diferenierea tipurilor TEM i SHV de ESBL prin metoda difuzimetric.
Amoxicilin/Ampicilin
Amoxocilin+ Acid Clavulanic
Piperacilin
Cefoxitin
Cefuroxima
Cefotaxima
Ceftazidima
Aztreonam
Cefepima
Imipenem

ESBL tip TEM

R
S
R
S
S
S
S
S
S
S

ESBL tip SHV

R
S
R
S
R
S/I/R
R
R
S/I/R
S

Evidenierea fenotipic a beta-lactamazelor se realizeaz prin teste de sinergism i antagonism

bazate pe asocierea a cel puin dou antibiotice diferite.
Testele de sinergism permit evidenierea efectului antimicrobian a dou antibiotice asociate,
efectul sinergic fiind semnificativ mai mare dect suma efectelor antibioticelor asociate (zonele de
inhibiie a creterii conflueaz sau inhibiia apare numai n zona de interdifuzie).

Evidenierea efectului sinergic prin metoda difuzimetric (A i B discuri cu cele dou

antibiotice utilizate n asociaie).

Testarea efectului sinergic la tulpini de E. coli cu discuri coninnd 30g CAZ, 30g CTX i
AMC (centru).
Efectul sinergic serveste la detectarea ESBL prin testul de dubl difuzie/ difuzie
bidimensional (Jarlier i colab., 1988) bazat pe faptul c inhibitorii de beta-latamaze (acidul clavulanic
sau asociaia amoxicilin/acid clavulanic) rmn activi fa de ESBL, potennd astfel aciunea
cefalosporinelor folosite ca substrat de aciune a ESBL.
Se depune pe plac, la distande 20 mm, un disc de amoxicilin/acid clavulanic (AMC)
nconjurat de discuri de ampicilin (AM), ceftazidim (CAZ), cefotaxim (CTX) i cefepim (PM).
Apariia efectului sinergic ntre AMC i cel puin una din cefalosporine denot prezena ESBL.
Se recomand utilizarea discurilor de cloxacilin pentru detectarea penicilinazelor (acest
antibiotic inhib cefalosporinazele);
N.B. inoculul dens poate masca hiperproducia de beta-lactamaze;
N.B.- cnd sinergismul nu este vizibil din cauza fuzionrii zonelor de inhibiie, se ndeprteaz
discurile (30 mm) sau se taie discurile de antibiotic n patru.
N.B.- existena unor discrepane mari ntre diametrul zonelor de inhibiie la CAZ i CTX se
datoreaz prezenei unei alte enzime pe lng ESBL (ex. beta-lactamaze AmpC la Enterobacter
cloacae).

Producere de ESBL la tulpini de Enterobacteriaceae.

Testele de antagonism - efectul antagonist este semnificativ inferior fa de al celui mai eficient
antibiotic din asociaie (diametrele zonelor de inhibiie se ngusteaz n zona de interdifuzie a
antibioticelor).
Efectul antagonist st la baza testului de difuzie inductibil ce evideniaz producerea de metalobeta-lactamaze i beta-lactamaze inductibile.
Se poziioneaz central pe plac un disc
cu EDTA/ un antibiotic beta-lactamic puternic
inductor (ex. imipenem-IMP) i lateral cel
puin un antibiotic beta-lactamic indicator
(CTX

sau/i

CAZ).

Apariia

efectului

antagonist la nivelul zonei de interdifuzie

dintre EDTA/ IMP i CTX denot producerea
de metaloproteaze/ beta-lactamaze inductibile Evidenierea efectului antagonist prin
de ctre tulpina testat.
metoda difuzimetric (A i B discuri
cu antibiotice).
N.B. Uneori discurile de EDTA produc inhibarea creterii bacteriene n absena
metaloproteazelor, n special la speciile de Acinetobacter.

Producere de beta-lactamaze AmpC inductibile la tulpini de Enterobacter cloacae : discuri cu

30g CAZ i 30g CTX poziionate lateral la o distanta de 20mm fa de discul cu IMP.
Antibiograma difuzimetric cantitativ prin metoda E-test.
Principiu: Aceast metod se bazazeaz pe proprietatea ESBL de a fi sensibile la inhibitori de lactamaze (acidul clavulanic). Exist i excepii de la aceast regul enzimele de tip IRT (Inhibitor
Rezistant TEM lactamase).
Benzile E-test conin un gradient de Cefotaxim la un capt i un gradient de Cefotaxim i acid
clavulanic la cellat capt. Concentraia de Cefotaxim este mai mic n cazul n care acesta este asociat
cu acidul clavulanic:

Cefotaxim (mg/L)
0,50
0,75
1
1,5
2
3
4
6
8
12
16
24
32

Concentraiile de antibiotic pe striurile E-test

Cefotaxim (mg/L) + ac. Clavulanic
0,125
0,19
0,25
0,38
0,5
0,75
1
1,5
2
3
4
6
8

Benzile similare coninnd gradiente de ceftazidim / ceftazidim + clavulanat (TZ / TZL) sunt
deasemenea disponibile i sunt mai potrivite pentru detectarea tipului enzimatic CTX-M.
Dac raportul dintre concentraia minim inhibitorie (CMI) de Cefotaxim i CMI de Cefotaxim +
clavulanat este mai mare de 8 rezult c tulpina respectiv este productoare de ESBL-uri.
Alternativ, se pot nregistra urmtoarele aspecte ale plcii n urma incubrii:

 Cretere bacterian de-a lungul ntregii benzi (lipsa elipsei de inhibiie) indic faptul c
valoarea respectiv de CMI este mai mare dect cea mai mare valoare din scal

O elips de inhibiie dedesubtul gradientului arat o valoare

Valori CMI mai mari dect

concentraiile scalate; Rezultatul
este nedeterminat (Strachounski
si colab, 2003).

a CMI mai mic dect cea mai mic valoare din scal.
Apariia unei zone fantom plasat sub gradientul CT, dei o zon de inhibiie clar n
jurul captului CT nu s-a evideniat, indic producerea de ESBL.

O zon de inhibiie fantom,

circular, n jurul CT semnific
prezena ESBL-urilor
(Strachounski si colab, 2003).

Apariia unei elipse de inhibiie deformate nspre captul tiprit indic producerea de
ESBL, datorit sinergismului dintre cefotaxim (CT) si acidul clavulanic difuzat dinspre regiunea
CTL.

Deformarea elipsei de
inhibiie TZ indic prezena
ESBL-urilor
(Strachounski si colab, 2003).

Aspectul E-Test la o tulpin de E.coli J53 (SHV-2) productoare de ESBL

(dup Stratchounski i colab., 2003)
CMIAMC 12 mg/L
CMIPTZ 1,5 mg/L
CMICPS1 mg/L

Aspectul E-Test la o tulpina de K.pneumoniae productoare de ESBL (dup Stratchounski i colab.,

2003)
(SHV-2 + SHV-1 + TEM-1)
CMIAMC 48 mg/L
CMIPTZ 64 mg/L
CMICPS 4 mg/L
Au fost concepute numeroase teste directe de detectare a activitaii -lactamazice, dar numai o
parte dintre ele se pot folosi ca analize de rutin. Majoritatea folosesc cefalosporine cromogene, sau
coreleaz hidroliza penicilinei cu o schimbare a culorii mediului de reacie, mediat de iod sau detectat
cu un indicator de pH.
Cefalosporinele cromogene sunt foarte specifice, n timp ce acidifierea mediului i reducerea
iodului se poate datora i altor cauze dect aciunii -lactamazelor, genernd rezultate fals pozitive.
Datorit slabei specificiti a testului iodometric ar trebui realizate n paralel controlale pozitive si
negative pentru toate testele.

Testul la nitrocefin
Nitrocefinul este o cefalosporin care poate funciona ca substrat cromogen pentru -lactmaze i
ii schimb culoarea de la galben la rou atunci cnd este hidrolizat. Acesta reprezint testul cel mai
sensibil pentru majoritatea lactamazelor, exceptnd penicilinazele stafilococice. Avantajul folosirii
acestui antibiotic n testele de evideniere const n faptul c el este hidrolizat de toate lactamazele
cunoscute, indiferent de specificitatea acestora.
Nitrocefinul este disponibil sub form de pudr purificat de la Becton Dickinson (Oxford, UK)
sau discuri mbibate cu antibiotic (OXOID).
Coloniile bacteriene sunt raclate de pe mediul nutritiv solid i resuspendate n tampon fosfat
obinndu-se o suspensie dens, peste care se adaug soluie nitrocefin. Activitatea -lactamazic este
evideniat prin apariia culorii roii n 1 - 2 minute. n cazul enzimelor cu activitate mai mic rspunsul
poate ntrzia, ns rezultatele pozitive aprute la mai mult de 10 minute trebuie tratate cu scepticism
ntruct ele pot fi cauzate de o activitate lactamazic secundar a proteinelor care leag penicilina
(penicillin binding protein - PBP) care formeaz complexe acil instabile (OCallaghan i colab., 1972).
Avantajul acestei metode const n rapiditatea cu care se pot obine rezultate despre prezena lactamazelor.

Testul iodometric
Hidroliza penicilinei determin formarea acidului peniciloic, care reduce iodul, decolornd
complexul iodamidon. Aceast proprietate poate fi exploatat pentru a detecta activitatea lactamazic
n tuburi sau pe hrtie. Aceste teste sunt sensibile pentru penicilinazele stafilococice, dar sunt mai puin
sensibile dect nitrocefinul pentru majoritatea lactamazelor provenite de la bacterii Gram negative.

Metoda n tub: Se poate efectua n cantiti mici att n tuburi, ct i n plci cu godeuri.

Se distribuie benzilpenicilin (penicilin G) n tampon fosfat, n godeurile unei plci. n aceast

soluie se suspend cultur bacterian, solid (de pe agar) i se pstraz la temperatura camerei
pentru aproximativ 30 60 minute. Se adaug amidon solubil n ap distilat i ulterior iod n
soluie de iodur de potasiu. Activitatea lactamazic este demonstrat prin decolorarea
iodului n maxim 5 minute (Catlinsi colab., 1975)

Sunt necesare teste de control pozitive i negative deoarece alte proteine pot de asemenea reduce
iodul, iar un inocul concentrat poate da rezultate fals pozitive.

Metoda pe benzi de hrtie: Se folosete hrtie de filtru Whatman nr.3, mbibat n

soluie de amidon dizolvat n ap distilat la fierbere, la care s-a adugat benzil penicilin la
rcire. Cnd benzile de hrtie iodometric s-au uscat (aproximativ 2 ore), acestea sunt nmuiate
n soluie de iod n iodur de potasiu. Pe acestea se aplic colonii dintr-o cultur de 24 de ore.
Decolorarea apare n 5 minute i indic activitate lactamazic (Jorgensen i colab., 1977).
Testul acidimetric
Hidroliza nucleului -lactamic genereaz o grupare carboxil care acidific un mediu netamponat.
Acidifierea rezultat poate fi detectat n tuburi sau pe hrtie de filtru.

Metoda n tub: Se folosete soluie de rou fenol la care s-a adugat benzilpenicilin, cu pH 8,5.

Soluia de culoare violet este distribuit n godeuri i inoculat cu bacterii din cultur solid pentru a
forma o suspensie dens. Activitatea -lactamazic este indicat de virajul culorii de la rou la galben n
maxim 5 minute (Duma & Kinz, 1968).

Metoda pe benzi de hrtie: benzi mici, de hrtie de filtru Whatman sunt mbibate ntr-o soluie

proaspt preparat de benzilpenicilin, bromo-crezol i NaOH. Benzile se usuc i se pstreaz pentru

mai multe luni. nainte de folosire ele trebuiesc rehidratate n ap distilat i apoi se aplic cultur
bacterian de pe agar solid. Apariia culorii galbene n maxim 5 minute indic activitate -lactamazic
(Livermore, 1995).
A.3. Metode de identificare a diferitelor tipuri de -lactamaze: cinetic enzimatic
Obinerea extractului proteic:
Tulpinile bacteriene care expim constitutiv -lactamaze se cultiv n bulion Mueller-Hinton
peste noapte la 37oC, din care se recolteaz celulele prin centrifugare. Suspensia celular obinut din
fiecare preparat se supune sonicrii urmat de ultracentrifugare. Supernatantul este dializat i concentrat
dac este nevoie.
Purificarea -lactamazelor:
ntr-o prim etap, -lactamazele se purific prin focusare isoelectric orizontal (IEFO), ntr-un
gradient de pH cuprins ntre 6.5 i 10.5 obinut prin metoda amfoliilor.
Dup migrare, gelul este mprit n 30 de segmente egale n care se testeaz activitatea
lactamazic cu nitrocefin sau benzilpenicilin (OCallaghan i colab., 1972). Fraciile din gel care
prezint activitate lactamaizic se ncarc pe o coloan cromatografic de carboxi metil Sephadex

i se elueaz cu tampon fosfat conform protocolului descris de Iaconis i colab., 1989. Fraciile care au
prezentat activitate lactamazic se concentreaz prin ultrafiltrare i au fost trecute n continuare pe o
coloan schimbtoare de ioni.
Hidroliza antibioticelor -lactamice este examinat prin spectrofotometrie UV (Beckman DU-7).
Se folosesc cuve de cuartz, de 1cm, la lungimea de und maxim de absorbie a inelului -lactam, pentru
fiecare antibiotic n parte, iar densitatea optic se msoara la intervale de 10 secunde, timp de 5 minute.
Maximul de absorbie pentru pricipalele antibiotice folosite sunt:
cefalotin (265 nm)
cefuroxim (274 nm)
cefotaxim (254 nm)
ceftazidim (254 nm)
imipenem (299 nm)
cloxacilin (260 nm)
aztreonam (292 nm)
nitrocefin (489 nm)
Rata de hidroliz a benzilpenicilinei este msurat la 233 nm. Soluiile de antibiotic sunt
preparate n tampon 0,1M, pH 7.0. Pentru stabilirea profilelor substratelor, toate antibioticele se
examineaz la o concentraie de 100 uM, mai puin benzilpenicilina care este testat pentru 500 uM.
O unitate de activitate -lactamazic, este definit ca fiind cantitatea de enzim care hidrolizeaz
un nmol de substrat / min n etapa liniar a reaciei la 37oC n tampon fosfat 0,1M, ph 7.0.
Constanta Michaelis (Km) i rata maxim de hidroliz (vm) se determin cu ajutorul transformrii
Lineweaver-Burk a vitezei iniiale (v) pentru ase concentraii diferite ale substratului. Susceptibilitatea
-lactamazelor de a fi inhibate de clavulanatul de potasiu i cloxacilina este msurat cantitativ prin
preincubarea enzimei cu concentraii diferite de inhibitor pentru 10 minute. Pentru msurarea activitii
enzimatice reziduale se adaug ulterior ca substrat benzilpenicilin (500 uM) sau imipenem (100 uM).
Concentraia de inhibitor necesar pentru a inhiba 50% din activitatea enzimatic se determin
prin teste statisitice de certitudine.
Criterii de decizie pentru realizarea unei antibiograme n funcie de natura prelevatului
Prelevat
Hemocultura

Necesitatea antibiogramei
Fara antibiograma
Pentru toate speciile izolate Daca sunt contaminani
cu exceptia contaminrii normali (Bacillus,
evidente.
corineformi), iar o

Observaii

singura hemocultur este

pozitiv.
Toate speciile considerate Daca sunt contaminani
ca
responsabile
de normali(Bacillus,corinef
meningite comunitare sau ormi )
nosocomiale.
SCN
Daca
examenul
citochimic este normal.

LCR

Cateter

Dac numrul de colonii

este 1000 ufc/ml(Brun
Buisson) sau
15 colonii (Maki)
Leucocituria
10000
UFC/ml i bacteriuria
100000 UFC/ml.

Urocultura

Secreii
faringiene

naso-

Puroi din otite i S.

pneumoniae,

Dac numrul de colonii

este < 1000 UFC/ml
( Brun Buisson) sau
15 colonii ( Maki)
Dac
leucocituria
=
10000
UFC/ml
i
bacteriuria

1000
UFC/ml

S. pneumoniae/N.
meningitidis:
investigarea
sistematic
a
rezistenei
la
penicilina G
H.
influenzae:
investigare

lactamaze
Efectuare de CMI la
antibioticele utilizate
pentru tratament.

Se realizeaz la:
-pacienii
imunodeprimai,
dializai,
diabetici,
batrni, gravide, sau
pacieni
cu
antecedente
endoscopice
sau
chirurgicale pe cile
urinare i leucociturie
< 10000 i bacteriurie
100000 UFC/ml

-la
pacienii
Daca sunt ,ai mult de 3 simptomatici i izolare
specii bacteriene diferite. de specii uropatogene
sau
pacienii
cu
antecedente
de
intervenii
endoscopice
si
chirurgicale pe cile
urinare sau nefropatii
subiacente
i
leucociturie

10000/ml
i
bacteriurie 1000 i <
100000 UFC/ml.
Investigare de SAMR,
Streptococ A la pacient
alergic la penicilin.
Prelevate
din
otite S.pneumoniae

sinuzite

Haemophilus influenzae, S.
aureus,
Enterobacterii,
Pseudomonas
Expectoraii
10000000 UFC/ml
nr. leucocite >25/cmp
numar celule bucale <
10/cmp
(10x).
Secreii bronice
specii patogene 1000
UFC /ml
Lichid
bronho- specii patogene 10000
alveolar
UFC /ml
Aspirate
traheo- specii patogene 10000
bronice
UFC /ml
Coprocultura
Speciile responsabile de
gastroenterite.
Coprocultura
cantitativ
la
pacieni
neutropenici
Prelevate cutanate
(panariii,
arsuri,
ulcere
varicoase,
escare)
Prelevate
osteoarticulare

Toate
speciile
1000 UFC /ml.

externe, puroi recoltat investigarea rezistenei

prin paracentez
la penicilin
SCN
Specii comensale sau
patogene
<10000000 Idem
UFC/ml
<1000 UFC /ml
<10000 UFC /ml

H. influenzae
( lactamaz)
Idem

<10000 UFC /ml

Idem

Speciile comensale

Interes epidemiologic
n special

izolate

Biopsie cutanat, ari,

dermatomiozite.

Sistematic dac prelevarea

este realizata chirurgical
sau din situsuri profunde.
Lichide de punctie
In functie de examenul
(ascite, pleural)
microscopic si de numarul
UFC
Colecii inchise
Cu prioritate pe speciile
(abcese craniene i predominante.
pulmonare)
Prelevate genitale
N. gonorrhoeae sistematic
-in functie de examenul
microscopic numarul UFC
pentru alte specii.
Sperme
UFC >1000 /ml
Prelevate oculare
Ulcere
corneene,
conjunctivite, endoftalmii.

Escare
profunde,
prelevare chirurgical
Fara antibiograma
orificii i fistule.

la Conservarea tulpinilor
timp de 1an

Speciile
comensale Se determin CMI
(SCN, corinebacterii).
Pentru antibioticele R

Gardnerella

Speciile comensale

Ageni antimicrobieni de prima alegere pentru tratamentul infeciilor cu bacterii

patogene
antibiorezistente
Bacterii patogene

Antibioticul indicat pentru organismul

susceptibil

Antibiotice alternative dac

organismul este rezistent la
medicamentul indicat
Staphylococcus aureus Cloxacilina sau meticilina
Vancomicina
Streptococcus
Penicilina
Cefotaxima, ceftriaxon sau vancomicina
pneumoniae
*
Haemophilus
Ampicilina
Cefalosporine de generatia III,
influenzae
eritromicina, TMP/SMX, Cefaclor,
Amoxicilina/clavulanat, Claritromicina
Enterococcus fecalis
Ampicilina si gentamicina
Vancomicina
Moraxella catarrhalis Ampicilina
La fel ca si pentru H. influenzae
Mycobacterium
Izoniazida (n combinatie cu rifamfin i alte
O combinatie de 3-6 medicamente la care
tuberculosis
medicamente)
organismul este susceptibil
Specii de Shigella
Ampicilina sau TMP/SMX
Cefixim,
ceftriaxon,
cefotaxim,
ciprofloxacin
Specii de Salmonella Ampicilina
TMP/SMX, cloramfenicol, ceftriaxon
Pseudomonas
Ticarcilin si tobramicina
Ceftazidim, cefoperazon, quinolone,
aeruginosa
imipenem
*
Alegerea este determinata de localizarea infectiei si de rezultatele antibiogramei;

terapie orale;

Trimetoprim/sulfametoxazol (TMP/SMX);

Sau alt cefalosporin oral de a doua sau a treia generaie; A nu se folosi in cazul copiilor

152

Antibiotice de testat pentru cocii Gram-pozitivi

153

Staphylococcus
aureus
Lista standard
penicilin*
eritromicin
lincomicin
pristinamicin
kanamicin
tobramicin
gentamicin
cloramfenicol
tetraciclin
cotrimoxazol
acid fusidic
rifampicin

- se testeaz pe
geloz Mueller
Hinton cu 4% NaCl
i 6 g/ml oxacilin
Rezisten
dobndit:
rezisten
la
penicilin G; fenotip
MLSb inductibil la
eritromicin; fenotip
KT.

Streptococcus spp
(altii decat S.
pneumoniae)
Lista standard
penicilina G
ampicilina sau
amoxicilina
oxacilina
tetraciclina
eritromicina
lincomicina sau
clindamicina
pristinamicna
clindamicina

Streptococcus pneumoniae Enterococcus spp

Lista standard
penicilina G
ampicilina sau amoxicilina
oxacilina
cefotaxim sau ceftriaxon
tetraciclina
eritromicina
lincomicina sau
clindamicina
pristinamicina
Antibiotice opionale
imipenem)
streptomicina
kanamicina
gentamicina
cloramfenicol
telitromicina
linezolid
cotrimoxazol*
fluorochinolone
fosfomicina
vancomicina
teicoplamina

Antibiotice opionale
rifampicina
cefotaxim
cefepim
streptomicina
kanamicina
gentamicina
cloramfenicol
spiramicina
telitromicina
linezolid
cotrimoxazol*
ofloxacin
vancomicina
teicoplamina
* - se testeaza pe geloza * - se testeaza pe geloza
Mueller Hinton cu 5% Mueller Hinton cu 5%
sange de cal hemolizat sange de cal hemolizat
Rezisten natural:
- nivel scazut la
aminozide; polimixine,
acid
fusidic,
acid
nalidixic; sensibilitate
moderat
la
fluoroquinolone;
sensibilitate sczut la
acid fusidic.
NB: Activitatea SXT
inhibitat de prezena
timidinei n mediu
(geloz Mueller Hinton
cu adaos de 5% sange
de cal).

Lista standard
- ampicilina
- gentamicina
- nitrofurani
Antibiotice opionale
- oxacilina*
- streptomicina
- kaanamicina
- cloramfenicol
- tetraciclina
- eritromicina
- lincomicina* sau
clindamicina*
- pristinamicina (E.
faecium)
- linezolid
- cotrimoxazol
- rifampicina
- fluorochinolone
- vancomicina
(Hteicoplamina

* - ajuta la identificarea
E. faecalis (rezistenta
naturala)

Rezisten natural:
-de
nivel
scazut
la
aminozide, acid fusidic,
polimixin, acid nalidixic,
- puin sensibil la
pefloxacin i norfloxacin
(sensibil la sparfloxacin),
bacitracin

154

Antibiotice de testat pentru Enterobacteriaceae i bacili Gram negativi

nonfermentativi
Escherichia Klebsiella
P. aeruginosa
Vibrio
Haemophilus
coli,
Acinetobacter
influenzae**
Salmonella
spp.
ampicilin/
amoxicilina/ amoxicilina/
amoxicilin
ampicilina
ampicilina
ticarcilina
ampicilina
cefalotin
gentamicina geentamicina/ piperacilina
cotrimoxazo gentamicin
/
tobramicina
ceftazidim
l
cloramfenicol
tobramicina ceftazidim/
imipenem
acid
pristinamicin
ftazidim/
cefotaxim/
amikacina
nalidixic
eritromicin
cefotaxim/
ceftriaxon
gentamicina
tetraciclina
tetraciclin
ceftriaxon
ofloxacin/
tobramicina
pefloxacin
ofloxacin/
ciprofloxacin ofoxacin
sulfametoxazo
ciprofloxaci cotrimoxaszol
l rifampicin.
n
cotrimoxazo
l
Acid
nalidixic
*
Inocul McFarland 0,5 n bulion Mueller Hinton sau n soluie salin ( 0,9% Na Cl) pornind
de la o cultur de 18 - 24 h pe mediu solid neselectiv
**
Rezisten constitutiv: la aminopeniciline, carboxipeniciline, ureidopeniciline- -lactamaz
sensibil la inhibitori, frecvent asociat cu multirezisten; la aminopeniciline, cefalosporine
generaia I nonenzimatic, sensibilitatea nu este restabilit n prezena inhibitorilor de betalactamaze.

METODE GENETICE DE EVIDENTIERE A MECANISMELOR DE REZISTENTA

LA ANTIBIOTICE
Isoelectrofocuarea beta-lactamazelor
Isoelectrofocusarea (IEF Isoelectric focusing) este o metoda de separare a proteinelor in
care acestea se aliniaza sub forma de benzi corespunzator masei moleculare si punctului lor
izoelectric (pI) intr-un gradient de pH generat o data cu migrarea lor electroforetica. In
eletrofoereza conventionala, amestecul de proteine de separate este incarcat in/pe suprafata
gelului de electroforeza (ex.: gel de agaroza sau poliacrilamida) la nivelul zonei de start
situata in extremitatea catodica si fortat sa migreze catre anod, trecand printr-o zona inerta si
oprindu-se in zona de gel cu valoare pH corespunzatoare pI. In IEF, gradientul de pH creste
progresiv de la anod catre catod si este generat printr-un process de sortare eletroforetica
intr-un mediu fluid anticonvectiv corespunzator a amfolitilor cu rol de carrier introdusi in
prealabil in gel.
Atunci cand o molecula amfoterica, precum o proteina, este incarcata in gel, aceasta
va migra in campul electric corespunzator sarcinii electrice de suprafata. In cursul separarii
prin IEF, proteina se deplaseaza de-a lungul gradientului de pH, rata sa de deplasare se
modifica constant, iar sarcina sa neta de suprafata scade progresiv, ca rezultat al deprotonarii
functiilor carboxi- si amino- pana la o valoare minima (sarcina zero = pI ). Ca urmare, la
155

valoare pH specifica proteinei, se atinge pI astfel ca migrarea inceteaza, iar moleculele se

concentreaza in aceasta zona sub forma unei benzi inguste.
Indiferent de metoda aplicata, orice protocol de IEF presupune obligatoriu urmatoarele etape:
obtinerea extractului crud de b-lactamaze, incarcarea acestuia in gelul de IEF, IEF propriuzisa, colorarea specifica si vizualizarea benzilor de beta-lactamaze, compararea pattern-urilor
eletroforetice obtinute pentru b-lactamaze prodse de diferite izolate.
In calitate de standard electroforetic se foloseste o varietate de b-lactamaze cu pI
cunoscut sau standarde de IEF disponibile in diferite domeniii de pI si concentratii (e.x IEF
standards, BioRad, number de catalog 161-0310, domeniu de pI: 4.45-9.6, 250 l).
PROTOCOL DE LUCRU
1.Obtinerea extractului crud de beta-lactamaze
1.a. Obtinerea culturii de celule:
1. se pregateste o cultura in faza logaritmica de crestere prin cultivare in bulion simplu sau
LB (Luria Bertani: 10gr bacto-triptona, 5 gr bacto-yeast exract, 10gr. NaCl, 1.0 l A.D.)
continand Amp 50g/ml sau CAZ (CTX) 1-2g/ml, in fucntie de pattern-ul de
susceptibilitate, incubare cu agitare orbitala la 37oC peste noapte.
2. Se inoculaeaza 25-40ml bulion LB cu aceasta cultura (1/10 volum) si se continua
incubarea cu agitare la 37oC pentru 4h.
3. Cultura se contrifugheaza la 4oC, 10.000rpm pentru 15min.
4. Se indeparteaza supernatantul, sedimentul resuspendandu-se in 5.0 ml PBS 50mM
(pH07.0) (la 100ml: 57.7ml Na2HPO4 1M si 42.3ml NaH2PO4).
5. Se repeta etapele 3 si 4. Suspensia obtinuta se transfera in tuburi Eppi 1.5ml si se
stocheaza la 20oC (daca este nevoie).
1.b. Sonicarea celulelor:
6. tuburile Eppi se vortexeaza, dupa care se mentin pe baie de gheata pe toata durata
sonicarii.
7. Sonicare timp de 30-60 sec., puls de 2 sec. si ciclu 50-60% on/off. Raceste pe baie de
gheata pentru 1.0min inainte de repetarea sonicarii (4-10 cicluri pana la obtinerea
unui extract clar).
8. Centrifugare 10 min. la 4.0C. supernatantul obtinur reprezinta extractul crud de blactamaze. Acesta va fi transferat intr-un tub curat.
1.c. Determinarea calitativa a activitatii beta-lactamazelor etapa recomandata pentru
confirmarea prezentei activitatii b-lactamice.
9. se adauga 10l de erxtract crud de b-lactamaze la 10l de nitrocefin 100M. Hidroliza
substratului cromogenic se observa prin virajul culorii acestuia de la orange la rosu.
1.d. Conservarea extractelor de beta-lactamaze se poate face prin stocare la -20/-70oC
pana in momentul utilizarii.
O metoda alternative si mult mai rapida de obtinere a extractelor de b-lactamaze se bazeaza pe
utilizarea protocolului PeriPreps Periplasting kit (Epicentre UK) ce inlocuieste sonicarea cu
digestia enzimatica a peretelui celular bacterian (pentru proteine periplasmatice precum blactamaze) si socul osmotic (pentru proteine intracitoplasmatice). Acest protocol presupune:
1. dubla centrifugare a 1.5ml cucltura celulara in faza logaritmica de crestere la
13000rpm pentru 5-7min.
2. la sedimentul cellular se adauga 100ml periplasting buffer (Tris-HCl 200mM, ph+7.5,
sucroza20%, EDTA 1mM si lizozim 2%), cu suspendare prin pipetare repetata.
3. Suspensia se incubeaza 5min la 370C (pe baie de apa).

156

4. se adauga 50 l A.D.S. (4oC) si amesteca prin inversia tubului cu incubare ulterioara

la -200C pentru 5 min.
5. suspensia se centrifugheaza la 13000rpm, 2 min, la temperatura camerei.
6. supernatantul ce reprezinta extractul proteic periplasmic se transfera intr-un nou tub.
Se continua cu etapa 1.c.
7. pentru purificarea extractelor si indepartarea urmelor de precipitat se pot folosi
coloane de cromatografie (ex. Micro Bio-Spin Chromatography colums, BioRad, nr.
catalog 161-0400); 75 l extract se descarca in centrul coloanei, se centrifugheaza la
2000 rpm timp de 4 min si se colecteaza intr-un tub Eppi curat.
2. Protocol de IEF beta-lactamaze. Sistem IEF Mini Cell BioRad (nr. catalog 170-2975).
Spre deosebire de sistemul PHAST (Pharmacia), acest sistem introduce un format de gel
simplu si inovativ prin faptul ca gelul vine in contact direct cu eletrozii de grafit, eliminand
asftel nevoia utilizarii unui tampon de migrare eletroforetica, nu este nevoie de sistem de
racire a gelului in cursul focusarii, iar amplasarea gelului cu fata incarcata cu probe pe
eletrozi evita problema condensului pe durata migrarii.
Etapele de lucru sunt:
2.a.Pregatirea gelului de PA*:
1. se prepara in prealabil solutiile stoc pentru gelul de PA:
a. concentrat de monomer ce contine 24.25% (g/v) acrilamida si 0.75% bis (N,Nmetilen-bis-acrilamida); depozitare la 40C, la intuneric, timp de 1 luna;
b. FMN (riboflavin 5 fosfat) 0.1%; depozitare la 40C, la intuneric, timp de 1 luna;
c. persulfat de amoniu 10% - pregatit proaspata;
d. glicerol 25% (g/v);
e. TEMED distilat (N, N-tetrametilen-etilendiamina). depozitare la temperatura
camerei, la intuneric;
2. se prepara solutia de monomer-amfolit: 2.2ml A.D., 0.8ml concentrat de monomer,
0.8ml glicerol 25%, 0.2ml amfolit (ex. Bio-Lyte 3/10 ampholyte, 40%, nr. catalog 1631112). Aceasta se stocheaza la intuneri pana in momentul utrnarii gelului. Volumul total
este suficient pentru 1 gel de PA.
*Se vor purta manusi pe toata durata pregatii si manipularii gelului de PA (PA este
neurotoxica).
3. se prepara un volum corespunzator de solutie de cataliti: 28.0 l persulfat de amoniu
10%, 20.0l FMN 0.1% si 1.2l TEMED.
2.b. Turnarea gelului de PA:
4. se degreseaza cu Et-OH si se usuca atat placa de sticla cat si tavita de incarcare a
gelului;
5. se plaseaza placa de stica pe tavita, la una din extremitatile acesteia; in statiul creat in
acestea se va turna gelul de PA;
6. se amesteca cu o pipeta solutiile de monomer-amfolit si cataliti si, cu aceeasi pipeta,
amestecul se descarca cu atentie in spatiul destinat gelului, evitand formarea de bule de
aer in masa acestuia.
7. polimerizarea gelului de PA se realizeaza utilizand orice lampa fluorescenta de birou
prin iradiere timp de 45 min;
8. detasarea cu ajutorul unei spatule plate a placii de sticla de tavita si expunerea la
suprafata a gelului de PA ce va fi iradiat suplimentar pentru inca 15min.
2.c. Incarcarea probelor: se va face cat mai rapid dupa obtinerea gelului de PA pentru a evita
deshidratarea excesiva a acestuia:

157

10. se plaseaza matrita in partea superioara a gelului de PA, pastrand o distanta de 1cm fata
de capatul superior deoarece la acest nivel gelul va veni in contact cu eletrodul de la
anod.
11. pe o banda de parafilm se amesteca cu o pipeta 1.8 l proba cu 0.2 l buffer IEF;
12. se pipeteaza amestecul in godeurile preformate ale matritei, lasand gelul 5 min in repaus
pentru a permite difuzia preobei in gel; la final se incarca markeul de IEF, preferabil intrun din godeurile periferice;
2.d. IEF propriu-zisa:
13. eletrozii de grafit se umezesc cu A.D.;
14. se intoarce gelulul si se pozitioneaza cu fata pe care s-au aplicat problele pe electrozi,
avand grija ca extremitatea incarcata cu probe sa corespunda anodului;
15. se ataseaza capacul care se conexteaza la sursa de curent;
16. focusarea propriu-zisa presupune migrarea probelor in conditii de voltaj constant realizat
in maniera etapizata:
- se incepe cu 100V, 5-6mA timp de 15min;
- se creste voltajul la 200V, 5-6mA timp de 15 min;
- la final, se ajunge la 450V, 4 mA timp de 1h;
Pentru reusita acestei etape se recomanda utilizarea sursei de curent Bio-Rad PowerPac 3000
ce prezinta avantajul introducerii si stocarii conditiile de focusare.
2.e. Detectarea benzilor de b-lactamaze:
17. dupa terminarea focusarii, se inchide sursa, se indeparteaza capul si gelul de pe
electrozi;
18. se inunda gelul cu 200-400l solutie nitrocefin 50l /ml si se mentine la intuneric pana
in momentul vizualizarii benzilor de nitrocefin, de culoare rosie, pozitionate
corespunzator b-lactamazelor existente in probele focusate;
19. pattern-ul de benzi se compara cu marker-ul de IEF pentru a afla pI al b-lactamazelor
evidentiate.

METODE DE TIPIZARE INFRASPECIFICA UTILE IN

EPIDEMIOLOGIA BOLILOR INFECTIOASE
Studiul relatiilor de inrudire clonala dintre izolatele microbiene are un rol
important ca urmare a cresterii numarului si spectrului patogenilor infectiosi, in
special nozocomiali. Prin urmare, aceste studii sunt critice pentru identificarea
unui focar de infectii, determinarea modului de transmitere a patogenilor si, in
concecinta, definirea masurilor terapeutice si de prevenire eficiente.
Desi metodele de tipizare bazate pe polimorfismul ADN au aparut relativ
recent, epidemiologia moleculara are un impact major in domenii precum
epidemiologia. Scopul studiilor de tipizare moleculara este de a oferi date de
laborator care sa confirme ca izolate inrudite epidemiologic, colectate in cursul
unei epidemii, sunt inrudite si din punct de vedere genetic si, prin urmare,
reprezinta aceeasi tulpina. Aceasta informatie permite intelegerea si controlul
raspandirii bolilor in spitale sau comunitati, identificarea surselor de infectie si
implementarea strategiilor de control al epidemiilor. Alta aplicatie a tipizarii
moleculare este evaluarea infectiilor cauzate de tulpini endogene sau exogene.
Terminologie
158

Sistem de tipizare (typing system) : este sistemul bazat pe marker-i fenotipici si

genotipici si utilizat la (1) discriminari intre izolate neinrudite epidemiologic si
care apartin unei singure specii bacteriene ; (2) recunoasterea inrudirii stranse
dintre derivatele recente ale unei singure celule - ancestor.
Izolat: o populatie de celule existente in monocultura obtinuta dintr-un
material clinic primar si identificata pana la nivel de specie.
Tulpina: un izolat sau grup de izolate ce exprima trasaturi distincte de cele ale
altor izolate apartinand aceleasi specii.
Tipul: set de indici de marcare caracteristic pentru o anumita tulpina si obtinut
prin aplicarea unui sistem de tipizare particular.
Izolate inrudite epidemiologic: izolate cultivate din specimene colectate de la
pacienti sau din mediu in cursul unei perioade de timp sau dintr-o anumita zona
ca parte a unei investigatii epidemiologice ce sugereaza ca izolatele ar putea
deriva dintr-o sursa comuna.
Clona (izolate inrudite genetic): un grup de izolate rezultate dintr-un ancestor
comun ca parte a unui lant direct de replicare si transmiterea de la gazda-lagazda sau din mediu-la-gazda.
Epidemie: incidenta crescuta a unei boli infectioase intr-o zona specifica in
cursul unei perioade date .
Tulpina endemica: izolate recoltate frecvent de la pacienti proveniti dintr-un
mediu particular si care nu pot fi diferentiate sau sunt strans inrudite intre ele.

Criterii de evaluare a sistemelor de tipizare

Terminologia utilizata curent la descrierea caracteristicilor de operare a testelor
de laborator (sensibilitate si specificitate) nu sunt strict aplicabile pentru
rezultatele unui sistem de tipizare. Criterii utile in evaluarea sistyemelor de
tipizare sunt tipabilitatea, reproductibilitatea si puterea discriminatorie.
Aceste criterii trebuie evaluate de fiecare data atunci cand metoda este aplicata
pentru un nou microorganism sau cand se modifica un paracmetru din protocol.
Tipabilitatea se refera la abiliatea de a obtine rezultate pozitive certe pentru
fiecare izolat analizat ; izolatele netipabile sunt cele ce dau rezultate nule sau
neinterpretabile. Reproductibilitatea se refera la abilitatea unei tehnici de a
oferi acelasi rezultat atunci cand aceeasi tulpina este testata repeta. Puterea
discriminatorie evalueaza abilitatea metodei de a diferentia izolate neinrudite.
Alte caracteristici importante ale metodelor sunt viteza, costul si necesarul
tehnic.
Clasificarea metodelor de tipizare infraspecifica
A. Metode fenotipice (tipizare fenotipica)
159

Caracteristicile fenotipice sunt larg utilizate in studiile epidemiologice.

Totusi, aceste trasaturi sunt limitate de capacitatea tuturor microorganismelor de
a altera expresia unei caracteristici date. Prin urmare, izolatele ce reprezinta
aceeasi tulpina si care sunt identice genetic pot varia prin detectare fenotipica.
Cele mai utilizate tehnici fenotipice sunt:
Biotipizarea utilizata in principal in laboratorul clinic pentru identificarea
organismelor la nivel de gen si specie. Are putere de discriminarea scazuta.
Pattern-urile de sensibilitate la antibiotice (antibiotipia) testatea
susceptibilitatii la antibiotice este simpla, rapida si aplicata curent pentru
tulpinile patogene. Ofera primele informatii intr-o investigatie epidemiologica.
Totusi, are putere de discriminare scazuta intre tulpini multi-rezistente sau
susceptibile total. De asemenea, presiunea selectiva exercitata in spitale de catre
antibiotice poate afecta reproductibilitatea tehnicii.
Serotipizarea una din tehnicile clasice pentru studiile epidemiologice,
detecteaza determinantii antigenici exprimati pe suprafata microorganismelor. In
prezent se utilizeaza reactivi serologici standardizati pentru tipizarea unei
anumite specii (ex. Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila,
Salomnella sp., Shigella sp, Haemophilus influaenza etc.). are putere de
discriminare limitata pentru izolatele apartinand unei anumit serogrup.
Lizotipizarea (tipizarea fagica) depinde de susceptibilitatea la
bacteriofagi a organismului testat. Multe din tulpini nu pot fi tipizate cu ajutorul
setului standard de fagi la care se adauga variabilitatea biologica si
experimentala a procedurii.
MultiLocus Enzyme Electrophoresis (MLEE) - tehnica bazata pe
diferentele in secventele de aminoacizi din diverse proteine ce determina
diferente in sarcina electrostatica a moleculelor si, ca atare, diferente de
mobilitate in camp electric. Variantele moleculare de mobilitate
electroforetica au fost denumite electromorfe (sinonim cu electrotipuri, ET)
sau alozime si sunt echivalente cu alelele de la eucariotele superioare (in
contrast cu izozimele ce reprezinta un acelasi tip de enzima codificat insa
de loci diferiti).
B. Metode genotipice (Genotipizare)
Metodele genotipice examineaza direct continutul genetic (ADN
cromozomal si extra-cromozomal) al microorganismelor. Cele mai
frecvent folosite metode genotipizare sunt: (1) analiza profilului
plasmidial, (2) analiza ADN genomic prin macrorestrictie in situ si (3)
tehnici bazate pe PCR.

160

(1) Analiza profilului plasmidial reprezinta una din primele

metode utilizata in epidemiologia moleculara. Desi utila in multe studii,
acesta metoda are limitari semnificative legate de natura extracromosomala a plasmidelor: unele tulpini sunt lipsite de plasmide sau
nu pot fi tipizate, iar reproductibilitatea poate fi afectatea deaoarece
plasmidele pot fi pierdute sau castigate in timp in vivo. De asemenea,
extractia ADN plasmidial este variabila deoarece o singura plasmida
poate exista in forme moleculare diferite ce migreaza diferentiat in cursul
electroforezei. Profilul plasmidial nu e obligatoriu constant in timp si
datorita pierderii spontane de plasmide sau selectiei tulpinilor ce au
dobadit noi plasmide. Prin urmare, tulpini-gazda diferite genetic pot
dobandi randomic sau selectiv aceeasi plasmida sub actiunea factorilor
de selectie (ex. antibiotice).
O metoda de analiza plasmidiala mult mai avansata presupune
restrictia enzimatica a ADN plasmidial cu separarea electroforetica a
fragmentelor de restrictie, generand pattern-uri mult mai complexe si
oferind o reproductibilitate si o putere discriminatorie considerabil
crescute.
(2) Analiza profilelor de restrictie enzimatica in analiza de
restrictie conventionala se folosesc enzime de restrictie cu situsuri de
restrictie frecvente (ex. EcoRI, HindIII si BamHI) si, in consecinta, este
generat unu numar de fragmente de restrictie relativ mici separate
corespunzator masei moleculare prin electroforeza in in gel de agaroza.
Diferite tulpini ale aceleasi specii pot avea profile de restrictie
distincte datorita variatiilor in secventelor ADN ce altereaza numarul si
distributia situsurilor de restrictie, inclusiv numar si masa moleculara a
fragmentelor de restrictie.
Principalul dezavantaj al metodei consta in faptul ca profilele de
tipizare pot contine benzi suprapuse, dificil de analizat, caracterizarea si
clasificarea izolatelor fiind dificila. Exista doua posibilitati de simplificare
a acestor pattern-uri : (1) hibridizarea Southern-blot ce presupune
utilizarea de probe ADN marcate radioactiv/chimic si care hibridizeaza
doar cu anumite fragmente de restrictie si (2) restrictia enzimatica a ADN
cu ajutorul unor enzime de restrictii ce recunosc situsuri de restrictie rare

161

si care genereaza un numar limitat de fragmente relativ mari, separate

prin tehnici speciale (ex. tehnica PFGE).
(3) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) si
hibridizare prin Southern blotting
Fragmentele de restrictie (0,5 - 50pb) separate electroforetic pot fi
transferate din gelul de agaroza intr-o membrana de nitroceluloza si
hibridizate prin tehnica Southorn blot. Probele ADN marcate chimic pot
fi detectate cu ajutorul substraturilor enzimatice colorimetrice sau
enzimatice chemiluminiscente.
Variatiile in numarul de marimea fragmentelor sunt definite ca
polimorfisme de lungime ale fragmentelor de restrictie (RFLP) si reflecta
variatiile de secvente nucleotidice in interiorul sau vecinatatea
locusurilor genetice de interes. Toate tulpinile purtatoare ale secventei de
interes pot fi tipizate prin aceasta tehnica, profilele detectate fiind inalt
reproductibile si permitand comparatii de finete. Puterea discriminatorie
a tehnicii depinde de marker-ul genetic selectat.
Tehnica are dezavatajul ca adesea sunt generate pattern-uri foarte
complexe de fragmente de ADN dificil de comparat.
Numarul si dimensiunea plasmidelor bacteriene, adesea purtatoare
de gene de antibiorezistenta si de transpozoni, precum si pattern-ul de
restrictie al acestora au o relevanta speciala in urmarirea raspandirii
microorganismelor antibiorezistenta in mediu. Totusi, natura instabila a
plasmidelor care se pot raspandi la specii bacteriene multiple si pot fi
pierdute spontan, face din amprentarea plasmidiala o metoda slab
reproductibila. De asemenea, tulpinile nu contin intotdeauna plasmide,
iar cele mai multe apartin adesea catorva tipuri.
Diferentele de lungime ale fragmentelor omologe, din ADN
provenit de la specii sau tulpini diferite, apar ca urmare a modificarilor
ce au loc in secventa primara de ADN. Aceste diferente de lungime pot fi
rezultatul:
- unei mutatii punctiforme ce poate duce la pierderea sau castigarea unui
situs de restrictie enzimatica
- unei insertii sau deletii de ADN intre doua situsuri de restrictie
- deletiei unui situs de restrictie

162

-unei rearanjari genetice in care unul din capetele fragmentului care a

suferit rearanjarea se gaseste intre doua situsuri de restrictie.
c) Macrorestrictia in situ a ADN genomic si analiza PFGE (Pulsed Field
Gel Electrophoresis)
Enzimele de restrictie cu situsuri de recunoastere rare (6-8 baze;
<20situsuri intr-un cromozom) genereaza fragmente ADN mult prea
mari (>50kpb) pentru a fi separate si evidentiate prin electroforeza
conventionala ce permite migrarea moleculelor de ADN cu dimensiuni
de < 40-50kpb.
Eletroforeza in camp pulsator (FGE) este multidirectionala si
asigura modificarea continua a localizarii incarcaturii pozitive.
Moleculele de ADN raspund prin reorientarea continua a directiei de
migrare in gelul de agaroza. In plus, pulsurile electrice de durata diferita
favorizeaza reorientarea moleculelor ADN cu dimensiuni diferite. Prin
varierea ambilor parametri (directia si durata campului electric), PFGE
permite rezolutia moleculelor ADN >500kb.
Campul pulsator permite separarea clara a fragmentelor de ADN
de dimensiuni foarte mari, care variaza intre 10 si 80 kb. Pattern-urile
electroforetice sunt vizualizate in urma colorarii gelului cu un colorant
fluorescent cum este bromura de etidiu. Aceasta tehnica este cunoscuta
ca analiza fragmentelor de restrictie cu frecventa mica sau
macrorestrictia in situ.
Pentru tehnica PFGE, izolatele bacteriene cultivate fie in bulion fie
pe medii solide, sunt amestecate cu agaroza topita si turnate in matrite
speciale, rezultand blocuri mici da agaroza ce contin celule bacterine
intregi. Celulele inglobate in blocurile de agaroza sunt apoi supuse lizei
in situ prin tratare cu detergenti enzimatici, si digestiei cu o enzima de
restrictie cu situsuri rare de clivare. Blocurile de agaroza cu fragment de
restrictie rezultate sunt introduse intr-un gel de agaroza si supuse
electroforezei in cmap pulsator obtinut prin schimbarea polaritatii
curentului eletric la intervale de timp predeterminate.
In prezent, aceasta este considerata a fi cea mai discriminatorie
metoda de tipizare moleculara. Analiza PFGE s-a dovedit a fi superioara
celor mai multe metode biochimice si moleculare de tipizare.

163

(4) Tehnici bazate pe amplificare PCR randomizata

1. Metoda RAPD/ AP-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA/
Arbitrarily Primed-PCR)
Principiu: diferente in talia si numarul unor ampliconi obtinuti dupa
amplificare randomizata cu primeri universali de aproximativ 10 baze ce
hibridizeza cu o afinitate suficienta de mare cu secventele de ADN cromosomal
la temperaturi mici de legare.Daca doi primeri RAPD se leaga la distanta de
cateva kb unul de celalalt, in orientare corecta, va rezulta un produs PCR cu o
lungime corespunzatoare distantei dintre cei doi primeri. Numarul si localizarea
acestor situsuri de legare a primer-ilor variaza la tulpini diferite ale unei specii
bacteriene. In urma separarii electroforetice in gel de agaroza a produsilor de
amplificare, rezulta un pattern de benzi care este caracteristic fiecarei tulpini in
parte. In cele mai multe cazuri, secventele primer-ilor randomici, care genereaza
cel mai bun pattern ADN pentru diferentierea intre tulpini, sunt determinate
empiric.
S-a constatat ca tehnica RAPD are o capacitate de discriminare mai mare
decat analiza RFLP a genelor ARNr 16S sau a regiunii spatiatoare 16-23S, dar
mai mica decat rep-PCR.
2. Rep-PCR (Repetitive-element PCR)
Tehnica rep-PCR reprezinta o abordare alternativa la amprentarea
bazata pe PCR si foloseste ca primeri oligonucleotide omologe cu unele
secvente bine definite prezente in copii multiple in genomul bacterian.
Pentru aceasta tehnica sunt folosite doua seturi principale de
elemente repetitive : (1) elementele repetitive palindromice extragenice
(REP=Repetitive Extragenic Palindromes) au o sceventa de 38 pb ce
consta din sase pozitii degenerate si o bucla variabila de 5 pb, situate
intre elementele laterale ale unui stem palindromic conservat ; (2)
secventele consensus repetitive intergenice enterobacteriene
(ERIC=Enterobacterial Repetitive Intragenic Consensus Sequences) sunt
elemente de 126 pb care contin o repetitie inversa centrala inalt
conservata si sunt localizate in regiunile extragenice ale genomului
bacterian. Aceste secvente repetitive au fost definite in special pe baza
datelor de secventa obtinute de la speciile Escherichia coli si Salmonella
typhimurium.
Rep-PCR poate fi realizat cu ADN extras din coloniile bacteriene
sau cu celule bacteriene intregi, neprelucrate. Amplificarile secventelor
REP sau ERIC pot fi realizate cu un singur primer, un singur set de
164

primeri sau mai multe seturi de primeri. Pattern-urile ERIC sunt in general
mai putin complexe decat cele REP, dar ambele au o capacitate
discriminatorie mare la nivel de tulpina.
Tehnica este usor de realizat si poate fi aplicata unui numar variabil
de izolate.
Metoda rep-PCR prezinta o aplicabilitate mai larga la nivel de
specie si o putere discriminatorie mai buna decat analiza profilului
plasmidial sau amprentarea genomica. S-a observat ca rezultatele
obtinute prin tehnica rep-PCR se coreleaza bine cu rezultatele PFGE, dar
puterea discriminatorie a tehnicii rep-PCR este putin mai mica.
C.Metode filogenetice - Ribotiparea
Se refera la analiza de hibridizare in care proba ADN este omologa
operonilor ce codifica ARNr 23S, 16S si/sau 5S. Are putere de
discriminare limitate, iar izolate epidemiologice neinrudite pot prezenta
acelasi profil.
Interpretarea rezultatelor
Investigatiile epidemiologice, daca sunt aplicate infectiilor
nosocomiale, trebuie precedate de supravegherea controlului infectiilor
si evaluarea de laborator a izolatelor (identificarea la nivel de specie si
antibiotipie). Cand sunt necesare studii de tipizare molefulara pentru
coroborarea unei posibile epidemii, trebuie consiferati o serie de factori
in alegerea metodei adecvate : specia bacteriana, numarul izolatelor
implicate, extensia studiului , disponibilitatea rezultatelor in termeni de
cost si viteza. In unele situatii este ma potrivita testatea izolatelor cu mai
multe tehnici, rezultatele obtinute cu diferite sisteme de tipizare putand
sa nu coincida complet, deoarece diferitele sistemele evalueaza diferite
caracteristici.

165

PROTOCOALE DE LUCRU
1. LIZOTIPIA (TIPIZAREA
BACTERIOFAGILOR)

BACTERIAN

CU

AJUTORUL

Reprezint determinarea spectrului de sensibilitate al unei tulpini bacteriene (S.

typhimurium, S. aureus, V. cholerae, C. diphteriae etc.) fa de un set de preparate fagice i se
bazeaz pe faptul ca celulele bacteriene aparinnd aceleiai tulpini sunt sensibile la aceleai
preparate fagice.

Tehnica se foloseste n anchetele epidemiologice pentru depistarea

surselor de infecie i a filiaiei cazurilor, a modului propagare a infeciilor de la
o persoan la alta n cadrul unui focar epidemic. Astfel, daca n momentul
izbucnirii unei epidemii cu S. typhimurium s-au izolat tulpini de S.typhimurium
de la 8 bolnavi i din dou presupuse surse de infecie (ap de fntn care s-a
consumat i personalul de la cantin), lizotipia poate stabili filiaia cazurilor i
originea corect a focarului epidemic.
Materiale necesare:
culturi proaspete (n varsta de 2-3 ore) din tulpinile izolate, preparate in
bulion;
tuburi cu 2.0 ml bulion steril;
pipete gradate sterile;
anse calibrate;
setul de preparate fagice;
plci Petri cu = 10 cm cu geloz 1.5 % ( cte o placpentru fiecare
tulpin), caroiate n prealabil corespunztor numrului preparatelor fagice de
testat, uscate n prealabil lng flacra becului de gaz sau prin meninere la
termostat timp de 30 de minute i notate;
Tehnica de lucru (Fig.1-2.):
Fig.1. Etapele lizotipiei.

placile cu geloz se nsamanteaz n panz cu tulpin bacterian de testat,

folosind tamponul de vat steril i meninndu-le cu capacul ntredeschis
lng flacr pentru uscarea suprafeei;

166

 placile se inoculeaz cu suspensii de preparate fagice la diluia de lucru, prin

depunerea unei picturi n fiecare carou;
suprafaa plcilor inoculate se usuc din nou cu capacul ntredeschis lng
flacr i se incubeaz la 37C timp de 18h;
dup incubare se citesc rezultatele, care se noteaz
astfel:
LSC = liz semiconfluent
+++ = liz prezent (100 plaje de liz)
++ = liz prezent (50 plaje de liz)
+ = liz prezent (20-30 plaje de liz)
I = liz prezent (6-10 plaje de liz)

Fig. 2. Lizotipie cu evidenierea tipurilor de

liz.

Interpretarea rezultatelor:
Tulpinile bacteriene care vor prezenta sensibilitate la aceleai preparate fagice
din setul standard de fagi, provin din aceeai surs de infecie, avnd origine
comun. Daca din cele 8 tulpini se izoleaz 2 lizotipuri nseamn c n cadrul
epidemiei au existat dou surse de infecie cu Salmonella typhimurium: ap de
fntn i purttorul de la cantin.
2. METODA RAPD
Modul de lucru :
1. Prepararea ADN genomic metoda socului termic:
Se utilizeaza culturi bacteriene in varsta de 18-24h, obtinute pe geloza
simpla.
intr-un tub Eppendorf de 1.5ml, se suspensioneaza cate o colonie din
fiecare izolat bacterian in 25l A.D.S.
0
Suspensia celulalara se mentine 10 min. pe baie de apa la 96 C (se produce
liza celulara prin soc termic).
centrifugare scurta (10.000 rpm, 30 sec). Supernatantul reprezinta lizatul
celular ce contine ADN genomic utilizat in reactia de amplificare PCR.
2. Pregatirea amestecului de amplificare:
pentru aceasta reactie s-a folosit urmatorii primeri:
AP4 : 5-TCACGATGCA-3
R108 : 5-GTATTGCCCT-3
Pregatirea amestecului de amplificare s-a realizat conform cu Tabel
nr.1.
167

Tabel nr. 1. Componentele celor trei reactii de amplificare RAPD (kit FlexiTaq Promega).
Reactivi
buffer green 5x
MgCl2 25mM
mix dNTP 10mM each
primer AP4 24M
primer R108 24M
TaqPol 5U/l
A.D.D.S.
Volum total de reactie

Reactia 1
Volum/proba
4.8l
2.4l
0.9 l
0.5 l
0.5 l
14.9 l

Reactia 2
Volum/proba
4.8l
2.4l
0.9 l
0.5l
0.5 l
14.9 l

24.0l

24.0l

Reactia 3
Volum/proba
4.8l
2.4l
0.9 l
0.5 l
0.5l
0.5 l
14.4l
24.0l

Concentratie
finala
1x
2.5mM
0.4mM
5.0mM
5.0mM
2.5U
-

3. Intr-un tup Eppi de 0.5ml se adauga 24.0l amestec de amplificare si 1.0l

lizat celular (volum final de reactie 25.0 l).
4. Amplificare prin reactie PCR :
- 1 ciclu la 940C timp de 3 min (denaturarea initiala)
- 45 cicluri: - 940C timp de 15 sec. (denaturarea propriu-zisa)
- 360C timp de 15 sec. (alinierea primerilor)
- 720C timp de 1.10 min. (polimerizarea)
- 1 ciclu la 720C timp de 5 min (extinctia finala).
5. Electroforeza in gel de agaroza : ampliconii PCR (20l) sunt analizati prin
electroforeza in gel de agaroza 1.4 % (g/v) in TBE1x. In calitate de marker de
masa moleculara s-au utilizat 100pb DNA ladder (Promega) continand 11
fragmente ADNd.c cu dimensiuni de 100, 200, 300,400, 500, 600, 700, 800,
900, 1.000 si 1.500pb.
3. METODA REP-PCR
Modul de lucru :
1. Prepararea ADN genomic metoda socului termic:
Se utilizeaza culturi bacteriene in varsta de 18-24h, obtinute pe geloza
simpla.
intr-un tub Eppendorf de 1.5ml, se suspensioneaza cate o colonie din
fiecare izolat bacterian in 25l a.d.s.
0
Suspensia celulalara se mentine 10 min. pe baie de apa la 96 C (se
produce liza celulara prin soc termic).
centrifugare scurta (10.000 rpm, timp de 30 sec). Supernatantul
reprezinta lizatul celular ce contine ADN genomic utilizat in reactia de
amplificare.
2. Pregatirea amestecului de amplificare:
pentru aceasta reactie s-a folosit urmatoarea pereche de primeri REP:
REP1 : 5IIIGCGCCGICATCAGGC3
168

REP2 : 5ACGTCTTATCAGGCCTAC3
Pregatirea amestecului de amplificare s-a realizat conform cu Tabel
nr.2.
Tabel nr. 2. Componentele reactiei de amplificare REP-PCR (kit flexiTaq Promega) .

Reactivi
buffer green 5x
MgCl2 25mM
mix dNTP 10mM each
primer REP1 25M
primer REP2 25M
TaqPol 5U/l
A.D.D.
Volum total de reactie

Volum/proba
5.0l
3.0l
1.0l
0.1 l
0.1 l
0.5l
15.3l
25.0l

Concentratie finala
1x
3.0mM
0.4mM
1.0mM
1.0mM
2.5U
-

3. Intr-un tup Eppendorf de 0.5ml se adauga 25.0l amestec de amplificare si

25.0l lizat celular (volum final de reactie 50.0 l).
4. Amplificare prin reactia Rep-PCR:
- 1 ciclu la 940C timp de 5 min (denaturare initiala)
- 30 cicluri: 940C timp de 1 min (denaturarea propriu-zisa).
410C timp de 1 min (alinierea primer-ilor)
650C timp de 8 min (polimerizarea)
- 1 ciclu la 650C timp de 16 min (extinctia finala).
5. Electroforeza in gel de agaroza: ampliconii PCR (20l) au fost analizati
prin electroforeza in gel de agaroza 2% (g/v) in tampon de electroforeza TBE1x.
In calitate de marker de masa moleculara s-au utilizat 100pb DNA ladder
(Promega, UK) continand 11 fragmente ADNd.c cu dimensiuni de 100, 200,
300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 si 1.500pb.
4. Macrorestrictia in situ a ADN genomic si analiza PFGE (Pulsed Field
Gel Electrophoresis)
Modul de lucru :
1. Prepararea ADN genomic bacterian:
inocularea unei colonii in 5.0ml bulion nutritiv si incubare peste noapte la
37C, cu agitare;
centrifugarea 1.5ml cultura si spalarea sedimentului celular cu tampon
PIV;

169

resuspendarea sedimentului obtinut dupa o noua centrifugare in 200l

tampon PIV;
ajustarea densitatii celulare prin citirea absorbantei la A620 si calcularea
volumului de tampon PIV necesar;
dilutia 1:1 a suspensiei celulare finale cu 1.5% agaroza LGP (low gelling
point Sigma), in prealabil echilibrata termic la 42C;
repartizarea suspensiei in galeriile de plastic, cu solidificare ulterioara (5
min. la 200C si 10 min. la temperature camerei);
transferul blocurilor de agaroza intr-un tub de centrifuga ce contine 1.0ml
tampon de liza EC si incubare 5h la 37C;
indepartarea tamponului de liza si adaugarea 1.0 ml solutie ESP ce
contine proteinazaK, cu incubare peste noapte la 50C;
decantarea solutiei ESP, adaugarea a 13.0ml tampon TE (pH=8.) si
spalarea blanda cu agitarea orizontala timp de 30 min.; repetarea operatiei
de 5x.

2. Restrictia enzimatica a ADN genomic:

pregatirea mixului de restrictie intr-un tub Eppendorf 1.5ml, utilizand 40
l volum de reactie (Tabel nr.1.) ;
Tabel nr.1. Componentele reactiei de macrorestrictie enzimatica in situ.

Reactivi
Buffer Multicore 10X
BSA 10mg/ml
XbaI 10U/l
AD.S.
Volum final de reactie

Volum per reactie

4.0l
0.4l
4.0l
31.6l
40l

Concentratie finala
1x
0.1g/l
1U/l
-

pentru fiecare cate tulpina bacteriana se transfera cate un bloc de

agaroza in cate un tub Eppendorf continad mixul de restrictie ;

incubarea tuburilor Eppendorf la 37 C peste noapte.

3. Electroforeza in gel in camp pulsator (PFGE):
electroforeaza s-a realizat cu sistemul CHEF DRIII (Bio-Rad, Germania);
prepararea gelului de agaroza PFGE 1% (Sigma) in TBE 0.5x;
migrarea gelului utilizand urmatoarele conditii: timp initial = 1 sec.,
timpul final = 30 sec., timp de migrare = 18h, temperatura = 14C, voltaj =
200V (sau 6V/cm);
evidentierea pattern-urilor de macrorestrictie prin imersarea gelului in
solutie de EtBr 1g/ml si fotografiere cu system Polaroid. In calitate de
marker de masa moleculara s-au utilizat PF DNA marker (Sigma, U.K.)
170

continand 11 fragmente ADN cu dimensiuni de 100, 200, 300,400, 500,

600, 700, 800, 900, 1.000 si 1.500pb.

Tampoane si solutii de reactie:

Tampon TE: 10mM Tris-HCL (pH=8.0), 1.0mM EDTA (pH=8.0)
Tampon PIV: 0.01M Tris-HCl (pH=8.0), 1.0M NaCl
Solutie EC: 6mM Tris-HCl (pH=8.0), 1.0M NaCl, 0.1M EDTA (pH=8.0), 0.2
% deoxicolat de Na, 05.% sarcozil; 50g/ml RN-aza A, 100g/ml lizozim.
Solutie ESP : 0.5M EDTA (pH=9.0), 1%5 sarcozil, proteinaza K 1mg/ml.
TBE 0.5X: 50mM Tris, 50mM acid boric, 0.2mM EDTA (pH=8.0).
Lizozim preparat ca solutie stoc 10mg.ml.
RNAza (Sigma): preparata ca solutie stoc 10mg/ml in 10mM Tris-HCl
(pH=7.5), 15mM NaCl.

METODE DE TIPIZARE INFRASPECIFICA UTILE IN

EPIDEMIOLOGIA BOLILOR INFECTIOASE
Studiul relatiilor de inrudire clonala dintre izolatele microbiene are un rol
important ca urmare a cresterii numarului si spectrului patogenilor infectiosi, in
special nozocomiali. Prin urmare, aceste studii sunt critice pentru identificarea
unui focar de infectii, determinarea modului de transmitere a patogenilor si, in
concecinta, definirea masurilor terapeutice si de prevenire eficiente.
Desi metodele de tipizare bazate pe polimorfismul ADN au aparut relativ
recent, epidemiologia moleculara are un impact major in domenii precum
epidemiologia. Scopul studiilor de tipizare moleculara este de a oferi date de
laborator care sa confirme ca izolate inrudite epidemiologic, colectate in cursul
unei epidemii, sunt inrudite si din punct de vedere genetic si, prin urmare,
reprezinta aceeasi tulpina. Aceasta informatie permite intelegerea si controlul
raspandirii bolilor in spitale sau comunitati, identificarea surselor de infectie si
implementarea strategiilor de control al epidemiilor. Alta aplicatie a tipizarii
moleculare este evaluarea infectiilor cauzate de tulpini endogene sau exogene.
Terminologie
Sistem de tipizare (typing system) : este sistemul bazat pe marker-i fenotipici si
genotipici si utilizat la (1) discriminari intre izolate neinrudite epidemiologic si
171

care apartin unei singure specii bacteriene ; (2) recunoasterea inrudirii stranse
dintre derivatele recente ale unei singure celule - ancestor.
Izolat: o populatie de celule existente in monocultura obtinuta dintr-un
material clinic primar si identificata pana la nivel de specie.
Tulpina: un izolat sau grup de izolate ce exprima trasaturi distincte de cele ale
altor izolate apartinand aceleasi specii.
Tipul: set de indici de marcare caracteristic pentru o anumita tulpina si obtinut
prin aplicarea unui sistem de tipizare particular.
Izolate inrudite epidemiologic: izolate cultivate din specimene colectate de la
pacienti sau din mediu in cursul unei perioade de timp sau dintr-o anumita zona
ca parte a unei investigatii epidemiologice ce sugereaza ca izolatele ar putea
deriva dintr-o sursa comuna.
Clona (izolate inrudite genetic): un grup de izolate rezultate dintr-un ancestor
comun ca parte a unui lant direct de replicare si transmiterea de la gazda-lagazda sau din mediu-la-gazda.
Epidemie: incidenta crescuta a unei boli infectioase intr-o zona specifica in
cursul unei perioade date .
Tulpina endemica: izolate recoltate frecvent de la pacienti proveniti dintr-un
mediu particular si care nu pot fi diferentiate sau sunt strans inrudite intre ele.

Criterii de evaluare a sistemelor de tipizare

Terminologia utilizata curent la descrierea caracteristicilor de operare a testelor
de laborator (sensibilitate si specificitate) nu sunt strict aplicabile pentru
rezultatele unui sistem de tipizare. Criterii utile in evaluarea sistyemelor de
tipizare sunt tipabilitatea, reproductibilitatea si puterea discriminatorie.
Aceste criterii trebuie evaluate de fiecare data atunci cand metoda este aplicata
pentru un nou microorganism sau cand se modifica un paracmetru din protocol.
Tipabilitatea se refera la abiliatea de a obtine rezultate pozitive certe pentru
fiecare izolat analizat ; izolatele netipabile sunt cele ce dau rezultate nule sau
neinterpretabile. Reproductibilitatea se refera la abilitatea unei tehnici de a
oferi acelasi rezultat atunci cand aceeasi tulpina este testata repeta. Puterea
discriminatorie evalueaza abilitatea metodei de a diferentia izolate neinrudite.
Alte caracteristici importante ale metodelor sunt viteza, costul si necesarul
tehnic.
Clasificarea metodelor de tipizare infraspecifica
B. Metode fenotipice (tipizare fenotipica)
Caracteristicile fenotipice sunt larg utilizate in studiile epidemiologice.
Totusi, aceste trasaturi sunt limitate de capacitatea tuturor microorganismelor de
172

a altera expresia unei caracteristici date. Prin urmare, izolatele ce reprezinta

aceeasi tulpina si care sunt identice genetic pot varia prin detectare fenotipica.
Cele mai utilizate tehnici fenotipice sunt:
Biotipizarea utilizata in principal in laboratorul clinic pentru identificarea
organismelor la nivel de gen si specie. Are putere de discriminarea scazuta.
Pattern-urile de sensibilitate la antibiotice (antibiotipia) testatea
susceptibilitatii la antibiotice este simpla, rapida si aplicata curent pentru
tulpinile patogene. Ofera primele informatii intr-o investigatie epidemiologica.
Totusi, are putere de discriminare scazuta intre tulpini multi-rezistente sau
susceptibile total. De asemenea, presiunea selectiva exercitata in spitale de catre
antibiotice poate afecta reproductibilitatea tehnicii.
Serotipizarea una din tehnicile clasice pentru studiile epidemiologice,
detecteaza determinantii antigenici exprimati pe suprafata microorganismelor. In
prezent se utilizeaza reactivi serologici standardizati pentru tipizarea unei
anumite specii (ex. Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila,
Salomnella sp., Shigella sp, Haemophilus influaenza etc.). are putere de
discriminare limitata pentru izolatele apartinand unei anumit serogrup.
Lizotipizarea (tipizarea fagica) depinde de susceptibilitatea la
bacteriofagi a organismului testat. Multe din tulpini nu pot fi tipizate cu ajutorul
setului standard de fagi la care se adauga variabilitatea biologica si
experimentala a procedurii.
MultiLocus Enzyme Electrophoresis (MLEE) - tehnica bazata pe
diferentele in secventele de aminoacizi din diverse proteine ce determina
diferente in sarcina electrostatica a moleculelor si, ca atare, diferente de
mobilitate in camp electric. Variantele moleculare de mobilitate
electroforetica au fost denumite electromorfe (sinonim cu electrotipuri, ET)
sau alozime si sunt echivalente cu alelele de la eucariotele superioare (in
contrast cu izozimele ce reprezinta un acelasi tip de enzima codificat insa
de loci diferiti).
B. Metode genotipice (Genotipizare)
Metodele genotipice examineaza direct continutul genetic (ADN
cromozomal si extra-cromozomal) al microorganismelor. Cele mai
frecvent folosite metode genotipizare sunt: (1) analiza profilului
plasmidial, (2) analiza ADN genomic prin macrorestrictie in situ si (3)
tehnici bazate pe PCR.
(1) Analiza profilului plasmidial reprezinta una din primele
metode utilizata in epidemiologia moleculara. Desi utila in multe studii,

173

acesta metoda are limitari semnificative legate de natura extracromosomala a plasmidelor: unele tulpini sunt lipsite de plasmide sau
nu pot fi tipizate, iar reproductibilitatea poate fi afectatea deaoarece
plasmidele pot fi pierdute sau castigate in timp in vivo. De asemenea,
extractia ADN plasmidial este variabila deoarece o singura plasmida
poate exista in forme moleculare diferite ce migreaza diferentiat in cursul
electroforezei. Profilul plasmidial nu e obligatoriu constant in timp si
datorita pierderii spontane de plasmide sau selectiei tulpinilor ce au
dobadit noi plasmide. Prin urmare, tulpini-gazda diferite genetic pot
dobandi randomic sau selectiv aceeasi plasmida sub actiunea factorilor
de selectie (ex. antibiotice).
O metoda de analiza plasmidiala mult mai avansata presupune
restrictia enzimatica a ADN plasmidial cu separarea electroforetica a
fragmentelor de restrictie, generand pattern-uri mult mai complexe si
oferind o reproductibilitate si o putere discriminatorie considerabil
crescute.
(2) Analiza profilelor de restrictie enzimatica in analiza de
restrictie conventionala se folosesc enzime de restrictie cu situsuri de
restrictie frecvente (ex. EcoRI, HindIII si BamHI) si, in consecinta, este
generat unu numar de fragmente de restrictie relativ mici separate
corespunzator masei moleculare prin electroforeza in in gel de agaroza.
Diferite tulpini ale aceleasi specii pot avea profile de restrictie
distincte datorita variatiilor in secventelor ADN ce altereaza numarul si
distributia situsurilor de restrictie, inclusiv numar si masa moleculara a
fragmentelor de restrictie.
Principalul dezavantaj al metodei consta in faptul ca profilele de
tipizare pot contine benzi suprapuse, dificil de analizat, caracterizarea si
clasificarea izolatelor fiind dificila. Exista doua posibilitati de simplificare
a acestor pattern-uri : (1) hibridizarea Southern-blot ce presupune
utilizarea de probe ADN marcate radioactiv/chimic si care hibridizeaza
doar cu anumite fragmente de restrictie si (2) restrictia enzimatica a ADN
cu ajutorul unor enzime de restrictii ce recunosc situsuri de restrictie rare
si care genereaza un numar limitat de fragmente relativ mari, separate
prin tehnici speciale (ex. tehnica PFGE).

174

(3) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) si

hibridizare prin Southern blotting
Fragmentele de restrictie (0,5 - 50pb) separate electroforetic pot fi
transferate din gelul de agaroza intr-o membrana de nitroceluloza si
hibridizate prin tehnica Southorn blot. Probele ADN marcate chimic pot
fi detectate cu ajutorul substraturilor enzimatice colorimetrice sau
enzimatice chemiluminiscente.
Variatiile in numarul de marimea fragmentelor sunt definite ca
polimorfisme de lungime ale fragmentelor de restrictie (RFLP) si reflecta
variatiile de secvente nucleotidice in interiorul sau vecinatatea
locusurilor genetice de interes. Toate tulpinile purtatoare ale secventei de
interes pot fi tipizate prin aceasta tehnica, profilele detectate fiind inalt
reproductibile si permitand comparatii de finete. Puterea discriminatorie
a tehnicii depinde de marker-ul genetic selectat.
Tehnica are dezavatajul ca adesea sunt generate pattern-uri foarte
complexe de fragmente de ADN dificil de comparat.
Numarul si dimensiunea plasmidelor bacteriene, adesea purtatoare
de gene de antibiorezistenta si de transpozoni, precum si pattern-ul de
restrictie al acestora au o relevanta speciala in urmarirea raspandirii
microorganismelor antibiorezistenta in mediu. Totusi, natura instabila a
plasmidelor care se pot raspandi la specii bacteriene multiple si pot fi
pierdute spontan, face din amprentarea plasmidiala o metoda slab
reproductibila. De asemenea, tulpinile nu contin intotdeauna plasmide,
iar cele mai multe apartin adesea catorva tipuri.
Diferentele de lungime ale fragmentelor omologe, din ADN
provenit de la specii sau tulpini diferite, apar ca urmare a modificarilor
ce au loc in secventa primara de ADN. Aceste diferente de lungime pot fi
rezultatul:
- unei mutatii punctiforme ce poate duce la pierderea sau castigarea unui
situs de restrictie enzimatica
- unei insertii sau deletii de ADN intre doua situsuri de restrictie
- deletiei unui situs de restrictie
-unei rearanjari genetice in care unul din capetele fragmentului care a
suferit rearanjarea se gaseste intre doua situsuri de restrictie.

175

c) Macrorestrictia in situ a ADN genomic si analiza PFGE (Pulsed Field

Gel Electrophoresis)
Enzimele de restrictie cu situsuri de recunoastere rare (6-8 baze;
<20situsuri intr-un cromozom) genereaza fragmente ADN mult prea
mari (>50kpb) pentru a fi separate si evidentiate prin electroforeza
conventionala ce permite migrarea moleculelor de ADN cu dimensiuni
de < 40-50kpb.
Eletroforeza in camp pulsator (FGE) este multidirectionala si
asigura modificarea continua a localizarii incarcaturii pozitive.
Moleculele de ADN raspund prin reorientarea continua a directiei de
migrare in gelul de agaroza. In plus, pulsurile electrice de durata diferita
favorizeaza reorientarea moleculelor ADN cu dimensiuni diferite. Prin
varierea ambilor parametri (directia si durata campului electric), PFGE
permite rezolutia moleculelor ADN >500kb.
Campul pulsator permite separarea clara a fragmentelor de ADN
de dimensiuni foarte mari, care variaza intre 10 si 80 kb. Pattern-urile
electroforetice sunt vizualizate in urma colorarii gelului cu un colorant
fluorescent cum este bromura de etidiu. Aceasta tehnica este cunoscuta
ca analiza fragmentelor de restrictie cu frecventa mica sau
macrorestrictia in situ.
Pentru tehnica PFGE, izolatele bacteriene cultivate fie in bulion fie
pe medii solide, sunt amestecate cu agaroza topita si turnate in matrite
speciale, rezultand blocuri mici da agaroza ce contin celule bacterine
intregi. Celulele inglobate in blocurile de agaroza sunt apoi supuse lizei
in situ prin tratare cu detergenti enzimatici, si digestiei cu o enzima de
restrictie cu situsuri rare de clivare. Blocurile de agaroza cu fragment de
restrictie rezultate sunt introduse intr-un gel de agaroza si supuse
electroforezei in cmap pulsator obtinut prin schimbarea polaritatii
curentului eletric la intervale de timp predeterminate.
In prezent, aceasta este considerata a fi cea mai discriminatorie
metoda de tipizare moleculara. Analiza PFGE s-a dovedit a fi superioara
celor mai multe metode biochimice si moleculare de tipizare.
(4) Tehnici bazate pe amplificare PCR randomizata

176

1. Metoda RAPD/ AP-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA/

Arbitrarily Primed-PCR)
Principiu: diferente in talia si numarul unor ampliconi obtinuti dupa
amplificare randomizata cu primeri universali de aproximativ 10 baze ce
hibridizeza cu o afinitate suficienta de mare cu secventele de ADN cromosomal
la temperaturi mici de legare.Daca doi primeri RAPD se leaga la distanta de
cateva kb unul de celalalt, in orientare corecta, va rezulta un produs PCR cu o
lungime corespunzatoare distantei dintre cei doi primeri. Numarul si localizarea
acestor situsuri de legare a primer-ilor variaza la tulpini diferite ale unei specii
bacteriene. In urma separarii electroforetice in gel de agaroza a produsilor de
amplificare, rezulta un pattern de benzi care este caracteristic fiecarei tulpini in
parte. In cele mai multe cazuri, secventele primer-ilor randomici, care genereaza
cel mai bun pattern ADN pentru diferentierea intre tulpini, sunt determinate
empiric.
S-a constatat ca tehnica RAPD are o capacitate de discriminare mai mare
decat analiza RFLP a genelor ARNr 16S sau a regiunii spatiatoare 16-23S, dar
mai mica decat rep-PCR.
2. Rep-PCR (Repetitive-element PCR)
Tehnica rep-PCR reprezinta o abordare alternativa la amprentarea
bazata pe PCR si foloseste ca primeri oligonucleotide omologe cu unele
secvente bine definite prezente in copii multiple in genomul bacterian.
Pentru aceasta tehnica sunt folosite doua seturi principale de
elemente repetitive : (1) elementele repetitive palindromice extragenice
(REP=Repetitive Extragenic Palindromes) au o sceventa de 38 pb ce
consta din sase pozitii degenerate si o bucla variabila de 5 pb, situate
intre elementele laterale ale unui stem palindromic conservat ; (2)
secventele consensus repetitive intergenice enterobacteriene
(ERIC=Enterobacterial Repetitive Intragenic Consensus Sequences) sunt
elemente de 126 pb care contin o repetitie inversa centrala inalt
conservata si sunt localizate in regiunile extragenice ale genomului
bacterian. Aceste secvente repetitive au fost definite in special pe baza
datelor de secventa obtinute de la speciile Escherichia coli si Salmonella
typhimurium.
Rep-PCR poate fi realizat cu ADN extras din coloniile bacteriene
sau cu celule bacteriene intregi, neprelucrate. Amplificarile secventelor
REP sau ERIC pot fi realizate cu un singur primer, un singur set de
primeri sau mai multe seturi de primeri. Pattern-urile ERIC sunt in general

177

mai putin complexe decat cele REP, dar ambele au o capacitate

discriminatorie mare la nivel de tulpina.
Tehnica este usor de realizat si poate fi aplicata unui numar variabil
de izolate.
Metoda rep-PCR prezinta o aplicabilitate mai larga la nivel de
specie si o putere discriminatorie mai buna decat analiza profilului
plasmidial sau amprentarea genomica. S-a observat ca rezultatele
obtinute prin tehnica rep-PCR se coreleaza bine cu rezultatele PFGE, dar
puterea discriminatorie a tehnicii rep-PCR este putin mai mica.
C.Metode filogenetice - Ribotiparea
Se refera la analiza de hibridizare in care proba ADN este omologa
operonilor ce codifica ARNr 23S, 16S si/sau 5S. Are putere de
discriminare limitate, iar izolate epidemiologice neinrudite pot prezenta
acelasi profil.
Interpretarea rezultatelor
Investigatiile epidemiologice, daca sunt aplicate infectiilor
nosocomiale, trebuie precedate de supravegherea controlului infectiilor
si evaluarea de laborator a izolatelor (identificarea la nivel de specie si
antibiotipie). Cand sunt necesare studii de tipizare molefulara pentru
coroborarea unei posibile epidemii, trebuie consiferati o serie de factori
in alegerea metodei adecvate : specia bacteriana, numarul izolatelor
implicate, extensia studiului , disponibilitatea rezultatelor in termeni de
cost si viteza. In unele situatii este ma potrivita testatea izolatelor cu mai
multe tehnici, rezultatele obtinute cu diferite sisteme de tipizare putand
sa nu coincida complet, deoarece diferitele sistemele evalueaza diferite
caracteristici.

178

PROTOCOALE DE LUCRU
1. LIZOTIPIA (TIPIZAREA
BACTERIOFAGILOR)

BACTERIAN

CU

AJUTORUL

Reprezint determinarea spectrului de sensibilitate al unei tulpini bacteriene (S.

typhimurium, S. aureus, V. cholerae, C. diphteriae etc.) fa de un set de preparate fagice i se
bazeaz pe faptul ca celulele bacteriene aparinnd aceleiai tulpini sunt sensibile la aceleai
preparate fagice.

Tehnica se foloseste n anchetele epidemiologice pentru depistarea

surselor de infecie i a filiaiei cazurilor, a modului propagare a infeciilor de la
o persoan la alta n cadrul unui focar epidemic. Astfel, daca n momentul
izbucnirii unei epidemii cu S. typhimurium s-au izolat tulpini de S.typhimurium
de la 8 bolnavi i din dou presupuse surse de infecie (ap de fntn care s-a
consumat i personalul de la cantin), lizotipia poate stabili filiaia cazurilor i
originea corect a focarului epidemic.
Materiale necesare:
culturi proaspete (n varsta de 2-3 ore) din tulpinile izolate, preparate in
bulion;
tuburi cu 2.0 ml bulion steril;
pipete gradate sterile;
anse calibrate;
setul de preparate fagice;
plci Petri cu = 10 cm cu geloz 1.5 % ( cte o placpentru fiecare
tulpin), caroiate n prealabil corespunztor numrului preparatelor fagice de
testat, uscate n prealabil lng flacra becului de gaz sau prin meninere la
termostat timp de 30 de minute i notate;
Tehnica de lucru (Fig.1-2.):
Fig.1. Etapele lizotipiei.

placile cu geloz se nsamanteaz n panz cu tulpin bacterian de testat,

folosind tamponul de vat steril i meninndu-le cu capacul ntredeschis
lng flacr pentru uscarea suprafeei;
placile se inoculeaz cu suspensii de preparate fagice la diluia de lucru, prin
depunerea unei picturi n fiecare carou;
suprafaa plcilor inoculate se usuc din nou cu capacul ntredeschis lng
flacr i se incubeaz la 37C timp de 18h;

179

 dup incubare se citesc rezultatele, care se noteaz

astfel:
LSC = liz semiconfluent
+++ = liz prezent (100 plaje de liz)
++ = liz prezent (50 plaje de liz)
+ = liz prezent (20-30 plaje de liz)
I = liz prezent (6-10 plaje de liz)

Fig. 2. Lizotipie cu evidenierea tipurilor de

liz.

Interpretarea rezultatelor:
Tulpinile bacteriene care vor prezenta sensibilitate la aceleai preparate fagice
din setul standard de fagi, provin din aceeai surs de infecie, avnd origine
comun. Daca din cele 8 tulpini se izoleaz 2 lizotipuri nseamn c n cadrul
epidemiei au existat dou surse de infecie cu Salmonella typhimurium: ap de
fntn i purttorul de la cantin.
2. ANALIZA PROFILULUI PLASMIDIAL
Exista mai multe protocoale de ziolare ADN plasmidial. Pentru
majoritatea scopurilor este suficienta izolarea unor cantitati mici de ADN
plasmidial utilizand tehnici denumite generic miniprep. Dintre miniprep-uri,
metoda lizei alcaline, tehnica Birnboim, Doly& Ish- Horowitz (Ausubel et al.,
1995)este curent utilizata. Aceasta consta in liza celulelor bacteriene cu un
ameste de SDS ce denatureaza proteinele bacteriene si dizolva lipidele de
membrana, si NaOH ce denatureaza ADN cromozomal si plasmidial. Adaugarea
RN-azei are scopul de a denatura ARN ce ar putea interfera cu separarea ADN
plasmidial in cursul eletroforezei. ADN plasmidial circular covalent inchis
(C.C.C.

Circular Covalently Closed) renatureaza in cursul; etapei de

neutralizare cu acetat de K. ADN cromozomal, proteinele bacterine si

complezele SDS-acetat de K sedimenteaza prin centrifugare, spre deosebire de
ADN plasmidial ce ramane in supernatant. Tratarea supernatantului cu Et-OH

180

precipitat ADN plasmidial care poate fi utilizat pentru diverse scopuri (ex. :
eletroforeza in gel de agaroza, restrictie enzimatica).
Majoritatea minpreps au fost optimizate pentru tulpini E.coli de laborator
purtatoare de plasmide cu numar mic si mare de copii (small/ high copy-number
plasmids). Pentru izolarea de plasmide de dimensiuni mari si/ sau numar mic de
copii, metode lizei-alcaline este cea mai adecvata.
2.1. Izolarea si purificarea ADN plasmidial
In aceasta sectiune vor fi prezentate 2 versiuni ale metodei de izolare prin
liza alcalina a ADN plasmidial din bacterii Gram-negative: metoda
clasica,manuala, si metoda adaptata pentru kit-uri de laborator.
2.1.a. Metoda lizei alcaline varianta manuala:
Modul de lucru:

cultivarea tulpinilor de E.coli in 25 ml bulion simplu (B.S.), cu agitare

orbitala timp 18h la 370C ;
se preiau 2 x 1,5 ml cultura bacteriana intr-un tub Eppendorf, care se
centrifugeaza la 10000 rpm, timp de 7 min., la 40C ;
sedimentul celular se spala cu 565 l TEG (pH= 8.0), cu repetarea
centrifugarii;
se indeparteaza supernatantul, iar peste sediment se adauga 200 l solutie
I, cu incubare 15 min. la 37 0C (pe baie de apa);
se adauga 400 l solutie II, urmata de agitare si incubare 10-20 min. la
370C (baie de apa);
se adauga a 300 l solutie III (40C), cu incubare pe gheata 10 min., urmata
de centrifugare la 15.000 rp m, 15-20 min, la 40C ;
deproteinizare enzimatica prin adaugare de proteinaza K (concentratie
finala de 100 l\ ml) cu incubare 1h la 370C ;
2x tratament cu amestec cloroform : alcool izoamilic (24 :1, vol: vol) si
agitare viguroasa 10 min.;
centrifugare la 7000 prm, 7 min la 40C; faza superioara se transfera intr-un
nou tub Eppendorf ;
precipitarea ADN plasmidial prin adaugare de Et-OH 100% rece (-200C)
si incubare 15-30 min la 40C;
centrifugare la 15000 rpm, 10-15 min. la 40C ;
uscarea sedimentului de ADN 20 30 min. la 370C (pe baie de apa) ;
181

resuspendarea sedimentului ADN plasmidial in 20l A.D.S.; incubare

10h la 40C si stocare la 200 C ;

Solutii:
- solutie I : TEG (Tris 25 mM, EDTA 10 mM, glucoza 50mM, pH = 8,2
8,7) ; Lizozimul se adauga numai inainte de folosire, pana la concentratia finala
de 2 5 mg\ml ;
- solutie II :

NaOH 0,2 N, SDS 1% (pH = 12,5) ; se prepara

extemporaneu din solutia stoc NaOH 0,4 N si SDS 10% ;

- solutia III : 60 ml acetat de potasiu 5 N, 11,5 ml acid acetic glacial, 28
ml apa distilata ;
2.1.b. Metoda lizei alcaline - varianta pentru kit-uri (Wizard,
Promega)
Modul de lucru:

cultivarea tulpinilor de E.coli in 25 ml bulion simplu (B.S.), cu agitare

orbitala timp 18h la 370C ;
1,5 ml cultura bacteriana se transfera cu pipeta intr-un tub Eppi si se
centrifugheaza la 10000 rpm, timp de 7 min., temperatura camerei;
se indeparteaza supernatantul; sedimentul celular se suspensioneaza in
250 l solutie de resuspndare celulara, cu pipetare sau vortexare
ulterioara;
se adauga 250 l solutie de liza celulara, tuburile Eppi investandu-se de 4
ori inainte de incubare 5min. la temperatura camerei;
se dadauha 10l proteaza lacalina, reptand inversarea tuburilor de 4 ori
si incubare pentru alte 5 min.;
se dauga 350l solutie de neturalizare Wizard Plus SV si imdeiat tuburile
se inveseaza de 4 ori;
lizatul bacterian obtinut se centrifugheaza la 15000rpm timp de 10min,
temperatura camerei;
se prepara unitatile de purificare ADN plasmidial prin inserarea
coloanelor in cate un tub de colectare de 2.00/1.5ml;

182

se tranfera supernatantul obtinut dupa centrifugarea (~ 850l ) in cate o

coloana evitand orice transfer de precipitat; centrifugarea la 15000rpm,
timp de 1 min.; indepartarea lichidului acumulat in tubul de colectare;
se adauga in coloana 750l solutie de spalare a coloanei anterior diluata
cu Et-OH 95%;
centrifugarea la 15000rpm, timp de 1 min.; indepartarea lichidului
acumulat in tubul de colectare;
se repeta etapa de spalare utilizand 250 l solutie de spalare, cu
centrifugare la 15000rpm, timp de 2 min.;
dupa golirea tubului de colectare, tuburile se recentrigugheaza ca atare la
15000rpm, timp de 2 min.;
se tranfera coloana intr-un tub Eppi steril;
ADN plasmidial se elueaza prin adaugarea de 50 l apa libera de nucleaza
(Nuclease Free Water) in interiourl coloanei, mentinere in repaus 2 min.
la tempratura camrei si centrifugare la 15000rpm timp de 2 min.;
ADN plasmidial este stabil in apa, fara a fi necesara adaugarea de buffer,
daca este depozitat la -20oC. In cazul depozitarii la 40C, se adauga 5.5l
tampon TE la 50l ADN plasmidial eluat.

Tampoane si solutii de reactie:

- solutie de resuspendare: 50mM Tris-HCl (pH=7.5), EDTA 10mM, RNazaA
100g/ml;
- solutie de liza celulara: 0.2M NaOH si 1% SDS;
- solutie de neutralizare: 4.09M guanidine hidroclorid, 0.759 acetat de K, 2.12.
acid acetic glacial;
- - solutie de splare coloane: 162.3mM acetat de K, 22.6mM Tris-HCl
(pH=7.5), 0.1mM EDTA (pH=8.0).
- tampon TE: 10mM Tris-HCL (pH=8.0), 1.0mM EDTA (pH=8.0)

2.2. Evidentierea puritatii si integritatii ADN plasmidial

prin

electroforeza in gel de agaroza

Probele ADN se separa prin electroforeza in sistem orizontal la 30mV
timp de 4 ore, in tampon TBE1X si gel de agaroza 0.75% colorat cu bromura de
etidiu (1g/ml), folosind ca marker de migrare albastru de brom-fenol,
vizualizat pe transiluminator UVP Biometra-UK (=260nm corespunzator
spectrului de absorbtie al ADN) si fotografiat cu film Sigma (Polaroid 665). In
calitate de marker de masa moleculara se poate utiliza ADN restrictat cu

183

HindIII (Promega) avand urmatoarele fragmente ADN: 2.02pb, 2.322pb,

4.361pb, 6.557pb, 9.416pb si 23.130pb.
Tampon de reactie:- tampon TBE (pH=8.0): Tris 0,089M, Acid boric 0,089M,
EDTA 0,002M.
2.3. Evidentierea puritatii si integritatii ADN prin analiza
spectrofotometrica
Analiza spectrofotometrica a probelor ADN permite calcularea
concentratiei de acid nucleic prezent in proba si estimarea gradului de
impurificare cu proteine si contaminanti prin citirea absorbantelor la diferite
lungimi de unda:
masurarea absorbantei la 230nm (A230) estimeaza gradul de impurificare
a probelor ADN cu contaminanti ce prezinta in structura lor legaturi
peptidice sau cu resturi aromatice (proteine si fenol);
acizii nucleici au un maxim de absorbitie la lungimea de unda =260 nm
(A260). Masuratorile A260 sunt cantitative pentru preparatele relativ pure
de acizi nucleici.
proteinele inregistreaza un maxim de absorbitie la 280nm (A280);
Raportul A260/ A280 constituie un indicator al puritatii acizilor nucleici,

prezenta in cantitate ridicata a proteinelor (A280) scazand valoarea acestui raport.

Pentru probe ADN pure, acest raport are valori cuprinse intre 1.8-2.0 (Ausubel
et al., 1995).
3. METODA RAPD
Modul de lucru :
1. Prepararea ADN genomic metoda socului termic:
Se utilizeaza culturi bacteriene in varsta de 18-24h, obtinute pe geloza
simpla.
intr-un tub Eppendorf de 1.5ml, se suspensioneaza cate o colonie din
fiecare izolat bacterian in 25l A.D.S.
0
Suspensia celulalara se mentine 10 min. pe baie de apa la 96 C (se produce
liza celulara prin soc termic).
centrifugare scurta (10.000 rpm, 30 sec). Supernatantul reprezinta lizatul
celular ce contine ADN genomic utilizat in reactia de amplificare PCR.
2. Pregatirea amestecului de amplificare:
pentru aceasta reactie s-a folosit urmatorii primeri:
AP4 : 5-TCACGATGCA-3
R108 : 5-GTATTGCCCT-3
184

 Pregatirea amestecului de amplificare s-a realizat conform cu Tabel

nr.1.
Tabel nr. 1. Componentele celor trei reactii de amplificare RAPD (kit FlexiTaq Promega).
Reactivi
buffer green 5x
MgCl2 25mM
mix dNTP 10mM each
primer AP4 24M
primer R108 24M
TaqPol 5U/l
A.D.D.S.
Volum total de reactie

Reactia 1
Volum/proba
4.8l
2.4l
0.9 l
0.5 l
0.5 l
14.9 l

Reactia 2
Volum/proba
4.8l
2.4l
0.9 l
0.5l
0.5 l
14.9 l

24.0l

24.0l

Reactia 3
Volum/proba
4.8l
2.4l
0.9 l
0.5 l
0.5l
0.5 l
14.4l
24.0l

Concentratie
finala
1x
2.5mM
0.4mM
5.0mM
5.0mM
2.5U
-

3. Intr-un tup Eppi de 0.5ml se adauga 24.0l amestec de amplificare si 1.0l

lizat celular (volum final de reactie 25.0 l).
4. Amplificare prin reactie PCR :
- 1 ciclu la 940C timp de 3 min (denaturarea initiala)
- 45 cicluri: - 940C timp de 15 sec. (denaturarea propriu-zisa)
- 360C timp de 15 sec. (alinierea primerilor)
- 720C timp de 1.10 min. (polimerizarea)
- 1 ciclu la 720C timp de 5 min (extinctia finala).
5. Electroforeza in gel de agaroza : ampliconii PCR (20l) sunt analizati prin
electroforeza in gel de agaroza 1.4 % (g/v) in TBE1x. In calitate de marker de
masa moleculara s-au utilizat 100pb DNA ladder (Promega) continand 11
fragmente ADNd.c cu dimensiuni de 100, 200, 300,400, 500, 600, 700, 800,
900, 1.000 si 1.500pb.
4. METODA REP-PCR
Modul de lucru :
1. Prepararea ADN genomic metoda socului termic:
Se utilizeaza culturi bacteriene in varsta de 18-24h, obtinute pe geloza
simpla.
intr-un tub Eppendorf de 1.5ml, se suspensioneaza cate o colonie din
fiecare izolat bacterian in 25l a.d.s.
0
Suspensia celulalara se mentine 10 min. pe baie de apa la 96 C (se
produce liza celulara prin soc termic).
centrifugare scurta (10.000 rpm, timp de 30 sec). Supernatantul
reprezinta lizatul celular ce contine ADN genomic utilizat in reactia de
amplificare.
2. Pregatirea amestecului de amplificare:
185

 pentru aceasta reactie s-a folosit urmatoarea pereche de primeri REP:

REP1 : 5IIIGCGCCGICATCAGGC3
REP2 : 5ACGTCTTATCAGGCCTAC3
Pregatirea amestecului de amplificare s-a realizat conform cu Tabel
nr.2.
Tabel nr. 2. Componentele reactiei de amplificare REP-PCR (kit flexiTaq Promega) .

Reactivi
buffer green 5x
MgCl2 25mM
mix dNTP 10mM each
primer REP1 25M
primer REP2 25M
TaqPol 5U/l
A.D.D.
Volum total de reactie

Volum/proba
5.0l
3.0l
1.0l
0.1 l
0.1 l
0.5l
15.3l
25.0l

Concentratie finala
1x
3.0mM
0.4mM
1.0mM
1.0mM
2.5U
-

3. Intr-un tup Eppendorf de 0.5ml se adauga 25.0l amestec de amplificare si

25.0l lizat celular (volum final de reactie 50.0 l).
4. Amplificare prin reactia Rep-PCR:
- 1 ciclu la 940C timp de 5 min (denaturare initiala)
- 30 cicluri: 940C timp de 1 min (denaturarea propriu-zisa).
410C timp de 1 min (alinierea primer-ilor)
650C timp de 8 min (polimerizarea)
- 1 ciclu la 650C timp de 16 min (extinctia finala).
5. Electroforeza in gel de agaroza: ampliconii PCR (20l) au fost analizati
prin electroforeza in gel de agaroza 2% (g/v) in tampon de electroforeza TBE1x.
In calitate de marker de masa moleculara s-au utilizat 100pb DNA ladder
(Promega, UK) continand 11 fragmente ADNd.c cu dimensiuni de 100, 200,
300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 si 1.500pb.

5. Macrorestrictia in situ a ADN genomic si analiza PFGE (Pulsed Field

Gel Electrophoresis)
Modul de lucru :
1. Prepararea ADN genomic bacterian:
inocularea unei colonii in 5.0ml bulion nutritiv si incubare peste noapte la
37C, cu agitare;
186

 centrifugarea 1.5ml cultura si spalarea sedimentului celular cu tampon

PIV;
resuspendarea sedimentului obtinut dupa o noua centrifugare in 200l
tampon PIV;
ajustarea densitatii celulare prin citirea absorbantei la A620 si calcularea
volumului de tampon PIV necesar;
dilutia 1:1 a suspensiei celulare finale cu 1.5% agaroza LGP (low gelling
point Sigma), in prealabil echilibrata termic la 42C;
repartizarea suspensiei in galeriile de plastic, cu solidificare ulterioara (5
min. la 200C si 10 min. la temperature camerei);
transferul blocurilor de agaroza intr-un tub de centrifuga ce contine 1.0ml
tampon de liza EC si incubare 5h la 37C;
indepartarea tamponului de liza si adaugarea 1.0 ml solutie ESP ce
contine proteinazaK, cu incubare peste noapte la 50C;
decantarea solutiei ESP, adaugarea a 13.0ml tampon TE (pH=8.) si
spalarea blanda cu agitarea orizontala timp de 30 min.; repetarea operatiei
de 5x.
2. Restrictia enzimatica a ADN genomic:
pregatirea mixului de restrictie intr-un tub Eppendorf 1.5ml, utilizand 40
l volum de reactie (Tabel nr.1.) ;
Tabel nr.1. Componentele reactiei de macrorestrictie enzimatica in situ.

Reactivi
Buffer Multicore 10X
BSA 10mg/ml
XbaI 10U/l
AD.S.
Volum final de reactie

Volum per reactie

4.0l
0.4l
4.0l
31.6l
40l

Concentratie finala
1x
0.1g/l
1U/l
-

pentru fiecare cate tulpina bacteriana se transfera cate un bloc de

agaroza in cate un tub Eppendorf continad mixul de restrictie ;

incubarea tuburilor Eppendorf la 37 C peste noapte.

3. Electroforeza in gel in camp pulsator (PFGE):
electroforeaza s-a realizat cu sistemul CHEF DRIII (Bio-Rad, Germania);
prepararea gelului de agaroza PFGE 1% (Sigma) in TBE 0.5x;
migrarea gelului utilizand urmatoarele conditii: timp initial = 1 sec.,
timpul final = 30 sec., timp de migrare = 18h, temperatura = 14C, voltaj =
200V (sau 6V/cm);

187

evidentierea pattern-urilor de macrorestrictie prin imersarea gelului in

solutie de EtBr 1g/ml si fotografiere cu system Polaroid. In calitate de
marker de masa moleculara s-au utilizat PF DNA marker (Sigma, U.K.)
continand 11 fragmente ADN cu dimensiuni de 100, 200, 300,400, 500,
600, 700, 800, 900, 1.000 si 1.500pb.

Tampoane si solutii de reactie:

Tampon TE: 10mM Tris-HCL (pH=8.0), 1.0mM EDTA (pH=8.0)
Tampon PIV: 0.01M Tris-HCl (pH=8.0), 1.0M NaCl
Solutie EC: 6mM Tris-HCl (pH=8.0), 1.0M NaCl, 0.1M EDTA (pH=8.0), 0.2
% deoxicolat de Na, 05.% sarcozil; 50g/ml RN-aza A, 100g/ml lizozim.
Solutie ESP : 0.5M EDTA (pH=9.0), 1%5 sarcozil, proteinaza K 1mg/ml.
TBE 0.5X: 50mM Tris, 50mM acid boric, 0.2mM EDTA (pH=8.0).
Lizozim preparat ca solutie stoc 10mg.ml.
RNAza (Sigma): preparata ca solutie stoc 10mg/ml in 10mM Tris-HCl
(pH=7.5), 15mM NaCl.
EVIDENTIEREA MECANISMELOR MOLECULARE DE
REZISTENTA LA BETA-LACTAMI

Beta-lactamazele de spectru extins (BLSE) iau nastere prin mutatii

punctiforme ce confera rezistenta la b-lactami cu spectru extins, inclusiv
cefalosporine de generatia a 3-a si a 4-a si aztreonam. Contrar, izolatele ce exprima
activitate BLSE raman susceptibile la metoxi-b-lactami (ex.: FOX) si carbapenemi
(ex.:IMP). Mai mult, in absenta unui permeabilitati alterate, aceste izolate sunt
susceptibile la combinatii de b-lactami cu inhibitori de beta-lactamaze.
BLSE au fost caracterizate la Enterobacteriaceae, in special la E.coli si
K.pneumoniae. Recent, ele au fost recunoscute ca fiind prezente si la Ps.
aeruginosa. Pana in prezent, mai mult de 200 beta-lactamaze TEM, SHV si OXA au
fost caracterizate (http://www.lahey.org/studies/webt.htm). La acestea se adauga
grupul nou de beta-lactamaze denumite cefotaximaze si notate CTX-M. Acestea
confera rezistenta de nivel ridicat la CT day prezinat activitate scazuta fata de
CAZ. Prevalenta CTX-M a crescut semnificativ in ultimii ani, fiind probabil cele
mai frecvente BLSE. Beta-lactamzele CTX-M formeaza un grup heterogen de
BLSE inrudite cu clasa A de beta-lactamaze codificate cromozomal, in special cu
cele de la Kluyvera sp., la care cel putin 4 subgrupe au fost diferentiate.
Existe cateva metode descrise pentru caracterizarea BLSE: metode fenotipice,
biochimice si moleculare. Tehnologia PCR este utilizata la detectarea acstor
enzime si, de asemenea, la identificare mutatiilor punctiforme dupa secventierea
ampliconilor PCR.

188

In continuare vor fi prezentate protocoalele de simplex PCR si multiplex PCR

aplicate pentru evidentierea genelor ce codifica unele BLSE (gene blaTEM-like,
blaSHV-like, blaOXA-like si blaCTX-M-like).
1. Simplex PCR pentru evidentierea genelor blaTEM-like
Modul de lucru :
1. Prepararea ADN genomic metoda socului termic:
Se utilizeaza culturi bacteriene in varsta de 18-24h, obtinute pe geloza
simpla.
intr-un tub Eppendorf de 1.5ml, se suspensioneaza cate o colonie din
fiecare izolat bacterian in 50-100l a.d.s.
0
Suspensia celulalara se mentine 10 min. pe baie de apa la 96 C (se
produce liza celulara prin soc termic).
centrifugare scurta (10.000 rpm, timp de 30 sec). Supernatantul
reprezinta lizatul celular ce contine ADN genomic utilizat in reactia de
amplificare.
2. Pregatirea amestecului de amplificare:
pentru aceasta reactie s-a folosit urmatoarea pereche de primeri blaTEM1
(White et all., AAC, 2001, 45:2658-2661):
Forward: 5ATTCTTGAAGACGAAAGGGC3
Reverse: 5ACGCTCAGTGGAACGAAAAC3
Pregatirea amestecului de amplificare s-a realizat conform cu Tabel 1.
Tabel 1. Componentele reactiei de amplificare blaTEM1.
Reactivi
Volum/proba
Concentratie finala
buffer green 5x
1x
10.0l
MgCl2 25mM
2.5mM
5.0l
mix dNTP 40mM
3.2mM
4.0l
primer blaTEM1 forward 20M
0.04M
0.1 l
primer blaTEM1 reverse 20M
0.04M
0.1 l
0.5U
TaqPol 5U/l
0.5l
A.D.D.
25.3l
Lizat celular
5.0 l
Volum total de reactie
50.0l
4. Conditii de amplificare simplex-PCR:
- 1 ciclu la 96C timp de 5 min
- 35 cicluri: 96C timp de 30 sec.
60C timp de 30 sec.
72C timp de 30 sec.
- 1 ciclu la 72C timp de 10 min.

189

5. Electroforeza in gel de agaroza: ampliconii PCR (10l) au fost analizati

prin electroforeza in gel de agaroza 0.8% (g/v) in tampon de electroforeza TBE1x.
In calitate de marker de masa moleculara s-au utilizat 100pb DNA ladder (Promega,
UK) continand 11 fragmente ADNd.c cu dimensiuni de 100, 200, 300, 400, 500,
600, 700, 800, 900, 1.000 si 1.500pb.
2. Simplex PCR pentru evidentierea genelor blaSHV1-like
Modul de lucru :
1. Prepararea ADN genomic metoda socului termic:
Se utilizeaza culturi bacteriene in varsta de 18-24h, obtinute pe geloza
simpla.
intr-un tub Eppendorf de 1.5ml, se suspensioneaza cate o colonie din
fiecare izolat bacterian in 50-100l a.d.s.
0
Suspensia celulalara se mentine 10 min. pe baie de apa la 96 C (se
produce liza celulara prin soc termic).
centrifugare scurta (10.000 rpm, timp de 30 sec). Supernatantul
reprezinta lizatul celular ce contine ADN genomic utilizat in reactia de
amplificare.
2. Pregatirea amestecului de amplificare:
pentru aceasta reactie s-a folosit urmatoarea pereche de primeri
blaSHV1 (White et all., AAC, 2001, 45:2658-2661):
Forward: 5CACTCAAGGATGTATTGTG3
Reverse: 5TTAGCGTTGCCAGTGCTCG3
Pregatirea amestecului de amplificare s-a realizat conform cu Tabel nr.2.

Tabel nr. 2. Componentele reactiei de amplificare blaSHV1-like

Reactivi
buffer green 5x
MgCl2 25mM
mix dNTP 40mM
primer blaSHV1 forward 20M
primer blaSHV1 reverse 20M
TaqPol 5U/l
A.D.D.S.
Lizat celular

Volum/proba
10.0l
5.0l
4.0l
0.1 l
0.1 l
0.5l
25.3l
5.0 l
Volum total de reactie
50.0l
4. Conditii de amplificare simplex-PCR:
- 1 ciclu la 95C timp de 5 min

Concentratie finala
1x
2.5mM
3.2mM
0.04M
0.04M
0.5U
-

190

- 30 cicluri: 95C timp de 30 sec.

52C timp de 30 sec.
72C timp de 1.0min
- 1 ciclu la 72C timp de 10 min.
5. Electroforeza in gel de agaroza: ampliconii PCR (10l) au fost analizati
prin electroforeza in gel de agaroza 0.8% (g/v) in tampon de electroforeza
TBE1x. In calitate de marker de masa moleculara s-au utilizat 100pb DNA
ladder (Promega, UK) continand 11 fragmente ADNd.c cu dimensiuni de 100,
200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 si 1.500pb.
3. Simplex PCR pentru evidentierea genelor blaOXA-like
Modul de lucru :
1. Prepararea ADN genomic metoda socului termic:
Se utilizeaza culturi bacteriene in varsta de 18-24h, obtinute pe geloza
simpla.
intr-un tub Eppendorf de 1.5ml, se suspensioneaza cate o colonie din
fiecare izolat bacterian in 50-100l a.d.s.

Suspensia celulalara se mentine 10 min. pe baie de apa la 96 C (se

produce liza celulara prin soc termic).
centrifugare scurta (10.000 rpm, timp de 30 sec). Supernatantul
reprezinta lizatul celular ce contine ADN genomic utilizat in reactia de
amplificare.
2. Pregatirea amestecului de amplificare:
pentru aceasta reactie s-a folosit urmatoarea pereche de primeri blaOXA
(White et all., AAC, 2001, 45:2658-2661):
Forward: 5ACACAATACATATCAACTTCGC3
Reverse: 5AGTGTGTTTAGAATGGTGATC3
Pregatirea amestecului de amplificare s-a realizat conform cu Tabel nr.3.
Tabel nr. 3. Componentele reactiei de amplificare blaOXA-like.

Reactivi
buffer green 5x
MgCl2 25mM
mix dNTP 40mM
primer blaOXA forward 20M
primer blaOXA reverse 20M
TaqPol 5U/l
A.D.D.
Lizat celular
Volum total de reactie

Volum/proba
10.0l
5.0l
4.0l
0.1 l
0.1 l
0.5l
20.3l
10.0 l
50.0l

Concentratie finala
1x
2.5mM
3.2mM
0.04M
0.04M
0.5U
-

191

4. Conditii de amplificare long - PCR:

- 1 ciclu la 96C timp de 5 min
- 30 cicluri: 96C timp de 1.0 min.
61C timp de 1.0 min.
72C timp de 2.0min
- 1 ciclu la 72C timp de 10 min.
5. Electroforeza in gel de agaroza: ampliconii PCR (10l) au fost analizati
prin electroforeza in gel de agaroza 0.8% (g/v) in tampon de electroforeza
TBE1x. In calitate de marker de masa moleculara s-au utilizat 100pb DNA
ladder (Promega, UK) continand 11 fragmente ADNd.c cu dimensiuni de 100,
200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 si 1.500pb.
4. Multiplex-PCR pentru evidentierea genelor blaCTX-M
Modul de lucru :
1. Prepararea ADN genomic metoda socului termic:
Se utilizeaza culturi bacteriene in varsta de 18-24h, obtinute pe geloza
simpla.
intr-un tub Eppendorf de 1.5ml, se suspensioneaza cate o colonie din
fiecare izolat bacterian in 50-100l a.d.s.

Suspensia celulalara se mentine 10 min. pe baie de apa la 96 C (se

produce liza celulara prin soc termic).
centrifugare scurta (10.000 rpm, timp de 30 sec). Supernatantul
reprezinta lizatul celular ce contine ADN genomic utilizat in reactia de
amplificare.
2. Pregatirea amestecului de amplificare:
pentru aceasta reactie s-au folosit urmatoarele perechi de primeri
blaCTX-M (Woodford si colab., 2005):
Gena
CTX-M grup 1
CTX-M grup 2
CTX-M grup 9
CTX-M grup 8
CTX-M grup 25
CTX-M grup 8/25

Secventa primeri
Forward: 5AAAAATCACTGCGCCAGTTC3
Reverse: 5AGCTTATTCATCGCCACGTT3
Forward: 5CGACGCTACCCCTGCTATT3
Reverse: 5CCAGCGTCAGATTTTTCAGG3
Forward: 5CAAAGAGAGTGCAACGGATG3
Reverse: 5 ATTGGAAAGCGTTCATCACC3
Forward: 5 TCGCGTTAAGCGGATGATGC
Forward: 5GCACGATGACATTCGGG3
Reverse: 5AACCCACGATGTGGGTAGC3

Dimensiune ampliconi
415pb
552pb
205pb
666pb
327pb

Pregatirea amestecului de amplificare s-a realizat conform cu Tabel nr. 4.

Tabel 4. Componentele reactiei de amplificare blaCTX-M-like.

Reactivi

Volum/proba

Concentratie finala

192

buffer green 5x
MgCl2 25mM
mix dNTP 40mM
6 primeri blaCTX-M forward 20M
6 primeri blaCTX-M reverse 20M
TaqPol 5U/l
A.D.D.
Lizat celular

10.0l
5.0l
4.0l
0.1 l
0.1 l
0.5l
10.3l
10.0 l
50.0l

1x
2.5mM
3.2mM
0.04M
0.04M
0.5U
-

Volum total de reactie

4. Conditii de amplificare long - PCR:
- 1 ciclu la 96C timp de 5 min
- 30 cicluri: 96C timp de 1.0 min.
61C timp de 1.0 min.
72C timp de 2.0min
- 1 ciclu la 72C timp de 10 min.
5. Electroforeza in gel de agaroza: ampliconii PCR (10l) au fost analizati
prin electroforeza in gel de agaroza 0.8% (g/v) in tampon de electroforeza
TBE1x. In calitate de marker de masa moleculara s-au utilizat 100pb DNA
ladder (Promega, UK).

193