LP 3 1. ETAPELE DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR GENERALA, 2. DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIC DIRECT SI INDIRECT, 1.

SCHEMA GENERALA MICROBIOLOGIC A DIAGNOSTICULUI DE

SCHEMA

LABORATOR

A. DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIC (DIRECT): ETAPE: I. PRELEVAREA SI TRANSPORTUL PROBELOR DE LABORATOR, II. EXAMEN MICROSCOPIC DIRECT (preparat proaspat, frotiu direct din prelevat), III. INSAMANTARE PE MEDII DE CULTURA (CULTIVARE), IV. IZOLARE (in cultura pura) SI IDENTIFICARE A AGENTULUI PATOGEN (ETIOLOGIC) , pe baza urmatoarelor caractere: 1. - morfologice, 2. - culturale, 3. - biochimice, 4. - antigenice, 5. - de patogenitate in vivo si in vitro, 6. sensibilitate la bacteriofag (lizotipie). V. VI. METODE MOLECULARE (extractie ac. nucleici, amplificare, detectie), ANTIBIOGRAMA

B. DIAGNOSTIC IMUNOLOGIC (INDIRECT): ETAPE: I. EVIDENTIEREA RASPUNSULUI IMUN UMORAL: 1. in vitro- Diagnostic serologic (serodiagnostic), 2. in vivo Diagnostic imunobiologic (IDR Schick) II. EVIDENTIEREA RASPUNSULUI IMUN CELULAR: 1. in vitro TTL, TIM, 2. in vivo Diagnostic imunobiologic (IDR la tuberculina) ETAPE ALE DIAGNOSTICULUI MICROBIOLOGIC DIRECT: 1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE:

- cat mai aproape de debutul bolii, - inainte de administrarea antibioticelor, - in conditii stricte de asepsie (luand toate masurile de antisepsie), - tehnici de recolta corecte, - se preleva un anumit produs / produse, in functie de manifestarea clinica. 2. EXAMINAREA MACROSCOPICA : - utila pentru orientarea diagnosticului: - ex: materii fecale de consistenta redusa, apoase, cu mucus, striuri de sange sau sanghinolernte, cu resturi alimentare insuficient digerate, paraziti vizibili cu ochiul liber, - urina tulbure, cu sediment, cu sange (hematurie), - LCR opalin, purulent , galben- verzui ( in zeama de varza ) sau sanghinolent, - Lichid de punctie pleurala: opalin, purulent, hemoragic, - sputa purulenta, hemoptoica (cu sange), - secretii, colectii purulente de culoare galben- verzuie, albastrui (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa etc), 3. EXAMINARE MICROSCOPICA A PRELEVATULUI PATOLOGIC: - esentiala: orienteaza pasii urmatori de diagnostic, - produs patologic recoltat si transportat corect: frotiu direct din produs (exudat faringian, secretii otice, oculare, plagi colectii purulente, sputa, materii fecale etc.), imersie, 90X -100X, - 2- 3 frotiuri plus 1 de rezerva (date clinice, epidemiologice ale pacientului, o prima orientare): - coloratia Gram: evidentiaza prezenta microorganismelor, morfologia (forma, marime, dispozitie caracteristica), colorabilitatea/ tinctorialitatea (Gram+/ violet sau Gram - / roz ciclam), relatia cu PMN neutrofile (intr- / extra- leucocitari), - colorate albastru metilen (evidentiaza citologia, leucocite PMN neutrofile, limfocite, levuri); - col. Giemsa : permite vizualizarea cu acuratete a morfologiei celulare, aprecierea cantitativa a predominantei PMN/ etiologie bacteriana sau limfocitara/ virala+ Mycob. tuberculosis., prezenta anomaliilor/ atipiilor celulare/ suspiciune de modificare neoplazica, - coloratia Ziehl Neelsen: suspiciune de infectie data de Mycobacterium tuberculosis (direct din sputa, colectie purulenta sau din sediment/ LCR, lichid pleural, preparat proaspat intre lama si lamela (LCR, lichid pleural, alte lichide de punctie, urina, din sediment, dupa centrifugare/ concentrare): - in sediment urinar: prezenta leucocitelor, hematiilor, celulelor epiteliale, cristale, flora bacteriana mobila, levuri etc, - preparat proaspat din materii fecale (suspensie in ser fiziologic steril sau Lugol): bacterii cu mobilitate caracteristica/ spiralata, in tirbuson: Campylobacter, Helicobacter, Vibrio cholarae sau prezenta elementelor parazitare/ oua, chisturi, etc, - sediment LCR: preparate proaspete cu coloratie negativa/ tus China: prezenta

levurilor incapsulate: Cryptococcus neoformans (meningite levurice la bolnavii imunodeprimati/ SIDA), - secretia vaginala suspensionata in ser fiziologic steril, cald, la 37C: se vizualizeaza prezenta, morfologia si mobilitatea caracteristica pentru Trichomonas vaginalis, - ex. micologic direct: raclaj scuame cutanate, raclaj unghial in solutie KOH 20%, Diagnostic bacteriologic pus exclusiv pe examen microscopic, fara etapele de izolare - identificare: * asocierea fuso- spirilara: angina ulcero- necrotica (flora bacteriana naeroba) Plaut- Vincent, * vaginita parazitara, cu Trichomonas vaginalis. * uretrita cu gonococ (necesita izolare, identificare si antibiograma) Avantajele ex microscopic: - rapid: 5- 20 min, ieftin, - ofera suficiente date pentru orientarea diagnosticului, - util in urgente: meningite, infectii tract respirator inferior, tuberculoza, infectii urinare, boala diareica acuta etc. - permite diagnostic exclusiv pe examinarea microscopica, 4. CULTIVAREA: - medii de cultura sintetice (continut: substrat energetic, zaharuri, proteine, factori de crestere, vitamine, minerale etc), - lichide, - solide, - insamantare cu ansa bacteriologica (descarcare, dispersie), pentru obtinerea de colonii izolate, - conditii de incubare: - temperaturi diferite: 37C, 42 C, 56 C, 35 C, 22 C, - atmosfera: aeroba (O2 + 5% CO2), microaerofilie (N2, Co2, H2), anaeroba (absenta O2), - umiditate, - timp de incubare: 20- 24 ore, 48 ore, 5 zile, 7 zile, 60 zile, - colonii izolate, cultura pura: conditii pentru etapele ulterioare: 5. IDENTIFICARE, pe baza caracterelor: - morfologice (frotiu Gram/ AM/ Z-N din colonie), - caractere de cultura: S/ smooth (cremoase), R/ rought (rugoase), M (mucoase, capsulate), hemoliza, pigment, invazie etc - biochimice: diferentiaza pe baza proprietatilor enzimatice (vizualizate pe un substrat colorat, prin modificatre de pH, virare de culoare) specii bactreriene, in cadrul genului, familiei etc - antigenice: se utilizeaza anticorpi cunoscuti, pentru decelarea antigenelor necunoscute complementare. Ex: reactia de aglutinare pe lama, in tuburi, pentru identificare

Enterobacteriaceae (E. coli, Salmonella, Shigella etc), reactia latex aglutinare, co aglutinare etc., - de patogenitate: - identificarea factorilor de patogenitate (Ex: coagulaza libera la Staphylococcus aureus), evidentierea efectelor patogenitatii bacteriene sau virale pe culturi celulare, prin metode in vitro, - infectia experimentala la animalul de laborator, metode in vivo, cum ar fi testul de patogenitate al Shigellei disenteriae pe mucoasa conjunctivala de cobai (Test Sereny). - pe baza sensibilitatii la actiunea fagilor specifici (lizotipie), - caractere genetice (gene cromosomale sau plasmidice specifice, utile in identificare, rezistenta la antibiotice) evidentiate prin metode de biologie moleculara/ tehnici PCR, 6. ANTIBIOGRAMA/ ANTIFUNGIGRAMA: - determinarea sensibilitatii/ rezistentei la antibiotice (metoda metode cantitative/ CMI, CMB, NEI, NEB) - CMI: concentratie minima inhibitorie, - CMB: concentratie minima bactericida, - NEI: nivel de eficienta inhibitorie, - NEB: nivel de eficienta bactericida. difuzimetrica,

DIAGNOSTICUL MOLECULAR AL INFECTIILOR BACTERIENEGENERALITATI Reactia de polimerizare in lant (The polymerase chain reaction/ PCR) este cea mai buna metoda de amplificare rapida a acidului deoxyribonucleic/ DNA. Tehnica PCR a fost descoperita de Dr. K.B.Mullis, merit pentru care, a primit Premiul Nobel in 1993. Tehnica PCR utilizeaza enzima DNA- polimeraza (DNA- polymerase) pentru a multiplica selectiv o singura molecula de DNA de cateva milioane de ori, in cateva ore. Aceasta tehnica si-a gasit aplicatie nu numai in cercetare fundamentala, in cadrul biologiei moleculare, ci si in medicina, in special in diagnosticul clinic. Componentele reaciei: ADN matri: constituit din molecule de ADN care conin fragmentul ce urmeaz a fi amplificat. Cnd se urmrete identificarea prin PCR a unei regiuni genomice de interes n patologia infecioas, liza celular termic, prin nclzirea suspensiei bacteriene la 100C timp de 10 min, este suficient pentru a pune la dispoziia reaciei ADN- ul de cercetat. Cantitatea folosit n reacie este de aproximativ 100 ng, cantiti mai mici nefiind suficiente pentru a se obine un produs de amplificare vizibil pe un gel de agaroz, cantiti mai mari putnd s inhibe reacia. Primerii (amorsele) sunt fragmente scurte de ADN monocatenar (oligonucleotide sintetice), complementare celor dou capete ale fragmentului care urmeaz a fi amplificat, sintetizate n laborator. Acetia sunt elemente cruciale n desfaurarea reaciei de amplificare. Secvena primerilor trebuie s fie complementar unei regiuni nalt conservat din structura regiunii genomice de interes astfel nct eventuale evenimente genetice care ar

putea avea loc la nivelul acesteia (inversii, deleii, inserii etc.) s nu influeneze rezultatul reaciei. Taq AND polimeraza Sinteza unui nou lan ADN pe baza complementaritii cu ADN matri din reacie este catalizat de Taq polimeraza izolat din Thermophilus aquaticus. Cationi bivaleni, cu rol n catalizarea reaciei enzimatice. Toate ADN polimerazele termostabile funcioneaz n prezena ionilor bivaleni, n mod obinuit ioni de Mg+, uneori de Mn+. Deoxinucleozide trifosfat (dNTP) necesare pentru alungirea lanului de ADN nou sintetizat. Reaciile PCR standard conin cantiti echimolare de dATP, dTTP, dCTP i dGTP pentru a evita ncorporrile eronate n lanul de ADN. O cantitate excesiv de dNTP poate conduce la ncorporri greite de nucleotide. Cationi monovaleni (K+) sunt importani pentru randamentul reaciei. (Un PCR standard conine 50 mM KCl, suficient pentru a amplifica un fragment de ADN lung de 500 baze azotate). Tamponul de reacie este necesar pentru meninerea unui pH de 8,3 8,8, la temperatura ambiant. Cantiti mai mari inhib pn la 50% activitatea Taq ADN polimerazei. Etapele reaciei: 1. Denaturarea moleculei de ADN de cercetat const n ruperea legturilor de H dintre cele dou lanuri ale dublului helix (double strands- DNA). Denaturarea standard se realizeaz la 95C timp de 30 secunde sau la 97C timp de 15 secunde, dupa care se obtin doua lanturi monocatenare de DNA (single strand- DNA). Aceste lanturi monocatenare (ss DNA) servesc ca matrite pentru atasarea primerilor (in etapa de hibridizare/ aliniere a primerilor). 2. Hibridizare: alinierea primerilor la molecula de ADN matri se realizeaz pe baz de complementaritate i este dependent de temperatura de aliniere (Ta), calculat cu 3-5C sub Tm (melting temperature: temperatura de topire: separare a dublului helix DNA in lanturi monocatenare). Optimizarea temperaturii de aliniere este o operaiune important a fiecrui protocol de lucru i se realizeaz prin efectuarea unor reacii a cror temperatur variaz ntre 2 i 10C sub Tm calculat a celor doi primeri pereche. 3. Amplificare: extensia primerilor const n sinteza unui nou lan de ADN pe baza complementaritii cu ADN matri. Aceasta se realizeaz la temperatura de 72-78C, de activitate optim a Taq ADN polimerazei. Numrul de cicluri de amplificare depinde de numrul de copii de ADN prezente n mediul de reacie, eficiena de extensie a primerilor, lungimea fragmentului care urmeaz a fi amplificat. n protocoalele standard sunt necesare cel puin 25 cicluri, 30 de cicluri sunt cel mai frecvent realizate, iar peste 30 de cicluri se amplific numai dup optimizarea reaciei. 4. Detectie: vizualizarea produilor de amplificare se realizeaz prin electroforez n gel de agaroz, fiind metoda cea mai utilizat de separare, identificare i purificare a acizilor nucleici. Principiul metodei const n migrarea moleculelor de acizi nucleici, ncrcate electric negative, ntr-un cmp electric. Vizualizarea se realizeaz dup colorare cu bromur de etidiu (BET) i iluminare n ultraviolet. Bromura de etidiu are capacitatea de a se intercala ntre bazele azotate ale moleculei de acid nucleic i de a da lumin fluorescent la iluminare cu UV (260-360 nm). 5. Documentarea gelului se face prin fotografiere cu o camer Polaroid fie prin preluarea imaginii pe un computer pentru a fi analizat i imprimat.

Aplicatii ale tehnicilor PCR: 1. Biologie evolutionista: tehnici de amplificare genica pe matrite DNA provenite din material biologic arheologic, au permis studierea speciilor disparute, luarea de masuri pentru prevenirea pierderii variantelor genetice. 2. Genetica umana: detectia mutatiilor genetice. Prima aplicatie diagnostica a tehnicii PCR a constituit diagnosticul prenatal al anemiei cu hematii in secera (Drepanocitoza sau siclemia). Acest diagnostic a servit ca model pentru dezvoltarea altor metode de diagnostic in afectiuni ce implica mutatii genetice, cum ar fi: - talasemia, fenilcetonuria, fibroza chistica etc. Alte aplicatii diagnostice au fost legate de detectia predispozitiei pentru boli autoimune, identificarea unor oncogene etc. 3. Detectia unor microorganisme patogene implicate in bolile infectioase si in Microbiologia sanitara: virusuri care declanseaza diverse forme de cancer, leucemie, limfoame (limfom Burkitt); virusuri ce determina infectii virale latente (v. hepatitic B, C, virusul imunodeficientei umane/HIV). Bacterii patogene detectate prin PCR: specii de Mycobacterium, Vibrio, Treponema, Chlamydia- direct din prelevate clinice; Shigella, Salmonella, enterotoxine stafilococice, Listeria in alimente; Enterobacteriaceae si protozoare/ Giardia intestinalis in apa. Exista tehnici rapide PCR care permit monitorizarea calitatii microbiologice a apei, alimentelor, mediului, aerului (E. coli, ca indicator specific pentru contaminare fecala umana). 4. Diagnostic de laborator de rutina: Tehnica PCR constituie un diagnostic rapid, de mare sensibilitate si specificitate, in diagnosticul de urgenta al bolilor infectioase; este aplicata cu succes in transplantul de tesuturi si organe; foarte utila in strategiile legate de utilizarea armelor biologice si atac bioterorist. B. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR INDIRECT, IMUNOLOGIC (serologic, imunobiologic) B.1. Evidentierea raspunsului imun umoral (producerea de Ac/ Ig de catre LB/ plasmocite), dupa intalnirea cu un antigen specific (infectii bacteriene), - in vivo: IDR Schick, - in vitro: Diagnostic serologic: ELISA, B. 2. Evidentierea raspunsului imun celular (proliferare a liniei limfocitare LT), dupa un contact al organismului cu un antigen viral sau M. tuberculosis. -in vivo: IDR la tuberculina, - in vitro: TIM, TTL, Tehnici imunologice pentru diagnosticul bolilor infectioase

Definitie: metodele imunologice sunt considerate metode analitice care utilizeaza antigenii (Ag) sau anticorpii (Ac) ca reactivi, pentru a determina prezenta Ag sau Ac corespunzatori, specifici, prezenti in diferite prelevate clinice: sange, lichide de punctie, tesutiri si prelevate din mediul inconjurator. Tehnicile imunologice au evoluat devenind cele mai larg raspandite metode de diagnostic in laboratoarele clinice si de cercetare. Acestea nu sunt utilizate doar pentru diagnosticul bolilor infectioase, ci si pentru diagnosticul imunologic in cancer, boli autoimune, boli imunodeficitare; pentru identificarea si cuantificarea unei largi varietati de proteine umane si animale (Ag sau Ac). Tehnicile imune utilizeaza Ag sau Ac specifici in procedurile lor si sunt configurate in asa fel incat permit investigarea Ac specifici ce sunt produsi in organismul uman, ca raspuns la interventia unei proteine nonself (Ag) sau pentru a detecta unii constituenti ai unor microorganisme cu proprietati Ag- ice. Termenii de serologie sau serodiagnostic se refera la studiul sau detectia Ag sau Ac in ser, saliva, urina (serologic assay sinonim cu immunoassay). Tehnicile imunologice (immunoassays) care se bazeaza pe principiul actiune enzima/ substrat enzimatic, ca sistem indicator, sunt denumite teste imunologice enzimatice (enzyme immunoassays/ EIAs). Exista foarte multe tipuri de sisteme EIA, dar cel mai frecvent utilizat sistem este enzyme liked immunosorbent assay (ELISA), in care reactivii Ag sau Ac sunt adsorbiti pe un suport solid (faza solida/ placi plastic cu godeuri). Daca sistemul indicator utilizeaza fluorocromi (substante fluorescente) sau izotopi radioactivi, tehnicile sunt clasificate ca: tehnici imunologice fluorescente (IFA) sau tehnici imunologice radioactive (RIA). Rezultatele se exprima in moduri diferite: uzual, rezultatele se exprima ca pozitiv sau negativ (reactiv/ non- reactiv), indicand prezenta sau absenta Ag sau Ac detectabil fata de valoarea cutt- of stabilita in protocolul reactiei. Se raporteaza un titru care indica cantitatea sau concentratia de Ac specific sau cantitatea de Ag detectat (pg/ ml). Titrul reactiei este definit ca inversul celei mai mari dilutii / ser, lichid de punctie, care a mai produs un rezultat pozitiv. Evolutia Tehnicilor imunologice:: Observatia privind legarea specifica a Ac de Ag a reprezentat baza dezvoltarii initiale a diagnosticului imunologic. Fenomenele de precipitare si aglutinare au devenit bazele dezvoltarii metyodelor de cercetare, care au fost adoptate pentru teste de diagnostic clinic. * Principiul hemaglutinarii (HA) a fost exploatat pentru dezvoltarea tehnicii de hemaglutino- inhibare (HAI), utilizata larg pentru detectia Ac specifici impotriva unor virusuri (v. gripal). * Sistemul Complement (C`) odata studiat si inteles, a fost utilizat in tehnicile imunologice, ca Reactie de fixare a C` (RFC`). * Tehnicile imunologice de precipitare au devenit larg utilizate , reactii imunologice specifice, ce exprima si rezultate semicantitative. Avantajele tehnicilor imunologice: - simplicitate, - timp redus pentru obtinerea rezultatelor, - raport bun cost- eficienta,

sensibilitate, specificitate, siguranta, posibilitate de standardizare a metodei, utilizarea de platforme automatizate, obtinerea de rezultate in cazul bolilor infectioase determinate de microorganisme necultivabile, diagnostic serologic obtinut in cazul bolilor infectioase determinate de agenti inalt patogeni, periculosi a fi manipulati vii, in culturi, tehnicile imunologice sunt foarte utile in monitorizarea evolutiei bolii (diferentierea fazei acute/ IgM de faza cronica/IgG), evaluarea necesitatii si a momentului imunizarii (vaccinarii) de protectie pentru persoanele care lucreaza in conditii specifice (grupe de risc expuse la imbolnaviri) sau care circula in zone geografice endemice, monitorizarea personalului medical expus accidental la contactul cu produse biologice infectate (sange sau secretii provenite de la bolnavi de hepatita virala B, C, sau HIV pozitivi), monitorizarea mamelor bolnave de SIDA (nivel Ac, incarcatura virala, etc) in vederea administrarii tratamentului antiretroviral de protectie a nou- nascutului.

Tehnici imunologice. Principiul reactiei: 2 stadii: a) interactiunea intre Ag si Ac in solutie, in gel sau pe suport solid. Aceasta reactie este dependenta de legarea specifica intre epitop (componenta Ag-ica a microorganismului patogen) si situsul specific de legare a Ag (antigen binding site) de pe suprafata Ac. b) detectia interactiunii directe sau vizualizata prin incorporarea unui sistem indicator, cum ar fi: colorant fluorescent (legat de Ag sau Ac), particule care vizualizeaza aglutinarea (prot A / Staphylococcus aureus), fie o enzima ce catalizeaza un substrat specific, determinand o reactie de culoare. Specificitate: abilitatea unui Ac particular de a se combina cu un singur epitop/ Ag. Aviditatea: interactiunea intre Ac multivalenti si Ag multivalente: daca sunt implicate mai multe situsuri de combinare, legaturile formate sunt foarte puternice. Sensibilitatea unui diagnostic: abilitatea unui test de a detecta cantitati mici de Ac (urmarire epidemiologica, screening la contactii de boala infectioasa, Ac in ferestre imunologice, in perioada de seroconversie etc). Tipuri de tehnici imunologice (principiu, generalitati):

1. Aglutinarea si Flocularea: * Aglutinarea: este cuplarea unor particule (Ag +Ac), rezultand conglomerate vizibile microscopic sau macroscopic. Rezulta din atasarea a 2 molecule de Ag pe Ac bivalenti. O limita importanta a reactiei este aparitia de rezultate fals (-) la concentratii mari de Ac: fenomenul de prozona: determinata de inhibarea aglutinarii in prezenta excesului de Ac. * Flocularea: similara aglutinarii, doar ca flocoanele rezultate plutesc in ser, plasma, pe cardul de detectie, pe lama de microscop, fiind vizualizate prin diferite sisteme. Ex: diagnosticul sifilisului (RPR Carbon, TPHA). 2. Precipitare:cea mai simpla metoda serologica in care se obtine un complex insolubil intre Ag si Ac pacientului, reactii ce au loc in solutie (in tuburi), sau in procedurile clasice, in gel. Cand Ag este solubil, in prezenta unor cantitati echivalente de Ac formeaza precipitate. Necesita cantitati mari de reactanti (Ag, Ac), pentru a forma agregate mari, vizibile. Cand cantitatea/ concentratia de Ag e prea mica in raport cu excesul de Ac sau invers, precipitarea nu are loc (determinata de fenomenul de prozona). Aplicatii: - Dubla difuzie in gel (metoda Ouchterloni) - Imunodifuzia radiala Mancini, - Imunodifuzia in camp electric(electroimunodifuzia in gel). 3. Reactia de fixare a Complementului (RFC): tehnica clasica, dezvoltata in anii 1900. Inca este utilizata de unele laboratoare. Este o procedura riguroasa si standardizata, dar consuma timp indelungat si personal bine instruit, cu experienta. Tehnica: Se pune in contact Ag cunoscut, titrat, standardizat cu Ac (ser bolnav inactivat termic) suplimentat cu C`. Daca in ser sunt prezenti Ac specifici Ag ului cunoscut, se formeaza complexe imune (Ag- Ac) activate de C`. Se adauga sistemul hemolitic ca sistem indicator (hematii de berbec sensibilizate cu Ac- antiiepure ) pentru vizualizarea reactiei. C` fixat pe complexele imune Ag/ Ac nu mai este liber si disponibil a se lega de sistemul hemolitic indicator, hemoliza nu are loc si hematiile cad in buton la fundul godeului sau sedimenteaza la fundul tubului. Asadar, reactie pozitiva (Ac specifici prezenti): buton hematic = absenta hemolizei. Daca nu sunt Ac specifici in serul de bolnav, C` se fixeaza pe sistemul hemolitic indicator, are loc hemoliza si lichidul in mediul de reactie este omogen opalin si rozat. Rezultat negativ: prezenta hemolizei. 4. Reactia de hemaglutino- inhibare (HAI): metoda imunologica clasica, ce se bazeaza pe capacitatea virusurilor de a aglutina hematiile (RBCs). Ex: virusul influenza aglutineaza hematiile umane grup O. Principiu: o anumita cantitate cunoscuta de Ag viral este pusa in contact cu dilutii seriale de ser de bolnav in prezenta unui sistem indicator, in placi de microtitrare. Toate componentele sistemului trebuie atent standardizate, datorita riscului aparitiei de reactii fals pozitive sau fals negative. De asemenea sunt obligatorii martorii sigur pozitiv si sigur negativ. (M+, M-)

5. Tehnici de neutralizare: utilizate pentru confirmarea reactivitatii specifice prin tehnica ELISA, pentru verificarea prezentei Ag HBs, si HIV p24 Ag. 6. Tehnica RIA (Radioimmunoassay): consta in cresterea sensibilitatii si specificitatii tehnicilor imunologice cu ajutorul unor peptide marcate radioactiv, pentru o mai buna identificare si cuantificare a diferitelor tipuri de Ag (hormoni, medicamente, enzime, steroli, proteine serice etc). Necesita precautii majore referitoare la manipularea izotopilor radioactivi de catre personalul calificat. 7. Tehnica ELISA: usoara, permite diagnosticarea unui numar mare de probe, automatizata/ semiautomatizata, nu necesita substante radioactive, sensibilitate si specificitate bune. - Este o tehnica biochimica utilizata in imunologie, pentru a detecta prezenta de Ac sau Ag in prelevate biologice. In ELISA, o cantitate necunoscuta de Ag este fixata pe suprafata solida (in godeurile placii de microtitrare) si apoi, Ac specific este adaugat in godeuri, astfel incat sa se combine cu Ag. Ac este legat de o enzima, iar in etapa finala, este adaugata o substanta astfel incat enzima sa actioneze asupra acestui substrat, determinand un semnal detectabil. - Citirea se face la spectrofotometru, cu lungime de unda corespunzatoare: orice complex Ag/ Ac cuplat cu substanta fluorescenta va emite semnal, iar cantiitatea de Ag din proba depinde de magnitudinea fluorescentei. - concentratiile de Ag cunoscute in probele testate, constituie o curba standard, utilizata pentru calculul concentratiei de Ag din probele prelucrate. Tipuri de tehnici ELISA: - ELISA indirecta, - ELISA sandwich, - ELISA competitiva, - Revers - ELISA .

10