1.

Ipoteza clinica
2. Prelevarea de probe patologice
3. Redactarea cererii de analiza
4. Transportul probelor la laborator
5. Examinarea probelor
6. Concluziile microbiologului
7. Redactarea buletinului de analiza
(comunicarea rezultatelor)
8. Insusirea rezultatelor de catre medic
9. Efectul acestor rezultate asupra deciziei
clinice
1. Metode directe
Examen microscopic direct
Izolarea in cultura pura si realizarea
antibiogramei
Depistarea antigenelor (Ag) microbiene
Depistarea acidului nucleic prin tehnici
moleculare
2. Metode indirecte
Diagnostic serologic (depistarea Ac)
intradermoreactiile
 1. Produse patologice: recoltate precoce,
transportate rapid, la rece, s conin celule
infectate
o Secreii respiratorii (exudat faringian, sput, secreii bronice
pentru virusuri respiratorii)
o Secreii genitale (papiloma virusuri)
o Suc medular (parvovirus B19)
o Urina (CMV)
o raclaj vezicular (HSV, VVZ)
o scaun (virusuri enterice)
2. Preparate tisulare
o biopsie hepatic (VHB)
o amprent de esut cerebral (virusul rabic)
1. Evidenierea modificrilor morfologice - MO
n produsul patologic, biopsie sau cultur (efect citopatic): apariia celulelor gigante,
multinucleate, incluzii citoplasmatice sau nucleare, liza celular, formarea sinciii
sugestive pentru o familie de virusuri (Herpesviridae, v. rujeolic, v. rabic, VHB,
adenovirusuri, v. papiloma, v. molluscum contagiosum, parvovirus B19, VSR)
coloraii:
pentru preparate citologice: Papanicolau (detalii nucleare), Romanovski (detalii de citoplasm preparatul
Tzank: diagnostic rapid al leziunilor induse de HSV, VVZ), Giemsa (hematologic), Lugol
pentru preparate tisulare: coloraia hematoxilin/eozin modificri citopatice, tipul celulelor inflamatorii

2. Evidenierea Ag virale
necesit un produs patologic celular culturi celulare
pot fi identificate: v. gripale, paragripale, v. rujeolic, adenovirusuri, v. papiloma,
arbovirisuri, VSR, CMV, VHB
coloraii specifice
imunoenzimatice (peroxidaz) MO
imunoflourescente (fluorocromi) microscop fluoresc.

3. Evidenierea virusurilor
ME sau microscopie imunoelectronic (cu Ac marcai)
Pot fi evideniate: HSV, VVZ, v. molluscum contagiosum, CMV, v. urlian,
enterovirusuri, rotavirusuri, coronavirusuri
Indicatii:
Identificarea microbiologic a culturii
Examinarea produselor patologice normal sterile (L.C.R.)
Examinarea produselor n care se pot vizualiza germeni ce cresc
pe medii pretenioase (Campylobacter, fuzospirili, M.
tuberculosis)
Examinarea produselor patologice n infecii cu anaerobi
Metode optice speciale: examinare n cmp ntunecat, n contrast
de faz
Verificarea contaminrii unui produs patologic
Orientarea etiologic n cazul culturilor polimicrobiene
Avantaje: rapiditate, cost redus
Dezavantaje:
Nu identific specia
Se pot colora i bacteriile neviabile
Bacteriile modificate morfologic pot prezenta aspecte atipice
I. uzuale
albastru de metil: vizualizarea celulelor inflamatorii i a
bacteriilor (diagn. difteriei granulaii metacromatice)
Gram
celule inflamatorii roii
G+: violet, G-: roii
Limite: nu coloreaz bacteriile ce nu au perete (Mycoplasma), nici
spirochetele, Legionella pneumophilla; unii BG+ neviabili apar G-,
unele clostridii apar G-, germ. intracelulari se observ greu
II. speciale
Ziehl-Nielsen i Kynioun (diferenierea Nocardia de Actinomyces)
difereniaz BAAR (Mycobacterium spp., Nocardia spp.) care se
coloreaz n rou pe fond albastru
Coloraii argentice (Dieterle, Steiner) Legionella spp
Giemsa detalii hematologice, Borellia spp. n frotiu periferic,
Helicobacter pylori n biopsia gastric
Fluorescente (direct pe lam ex. fluorescent direct sau cu Ac
specifici ex. imunofluorescent): Mycobacterium spp., Francisella
tularensis, Bordetella pertussis, T. palidum, Legionella pneumophilla
Avantaje:
Evidenierea n produsul patologic a fungilor sub
form de levuri, hife, capsula, modificri citologice
Pneumocistis trofozoii i chisturi
Preparate bioptice: reacia granulomatoas -
micoze invazive
Dezavantaje: nu identific specia i necesit
corelarea cu datele clinice i celelalte metode de
diagnostic
Frotiu necolorat, lam-lamel: prezena i structura
fragmentelor miceliene sau a sporilor
 Gram spori i levuri G+, hife G-, Cryptococcus
neoformans G-, Gram-Weigert perete chist P.
jirovecii
Mayer: mucopolizaharide din peretele C.
neoformans
KOH dizolv cheratina i mater. cel., nu afecteaz
fungii
Tu de India: C. neoformans n LCR
Giemsa: Histoplasma capsulatum, P. jirovecii
Gomori methenamine silver-GMS: fungii n negru
Fluorescente: identificare direct P. jirovecii n
secreii respiratorii, autoflourescen: Candida
spp., Aspergillus spp.
Preparate tisulare: hematoxilin/ eozin, GMS, PAS,
Papanicolau, IF pneumocistoz, histoplasmoz
Diagnosticul microscopic al infeciilor cu protozoare
protozoare intestinale examen coproparazitologic: E.
histolytica, B. coli, Giardia, Isospora belli
protozoare cu invazie sistemic examenul sngelui
(Plasmodium spp.), preparate tisulare obinute prin biopsie
visceral, ganglionar (Toxoplasma), musculara (Trypanosoma)
Diagnosticul microscopic al infeciilor cu helmini
Helmini intestinali: examen coproparazitologic (ou, larv, adult)
Helmini cu invazie sistemic: biopsie musculara (Trichinella)
Examenul coproparazitologic
o Preparat nativ: MO cu obiectiv mic, cu contrast de faz, necolorat
lam-lamel sau cu eozin, lugol, verde malachit
o Fixat i colorat: tricrom, Gram, fluorescent, IF
Examenul de snge pentru Plasmodium spp.: frotiu subire, pictur
groas
Preparatele tisulare: coloraii HE, Giemsa, Gram, PAS, argentice,
fluorocromi
Produse patologice: aspirat nazofaringian, lavaj
bronho-alveolar, sput (pentru virusuri
respiratorii ), scaun, LCR (enterovirusuri)
Recoltarea: n cantitate suficient, s conin celule
infectate
Transport: medii cu antibiotice, suplim. proteine,
rapid, la rece
Izolarea
Ou embrionat
Animale de laborator
Culturi celulare: culturi primare (rinichi de maimu),
culturi diploide (celule fetale umane), culturi
heteroploide (cel. HeLa, animale Vero)
Detectia creterii virusului
Efect citopatic caracteristic unei familii
de virusuri
Hemadsorbie
Hemaglutinare
Interferena efectului citopatic
Identificarea virusurilor
Examen morfologic prin ME
Tehnici imunologice
Tehnici moleculare
Recoltare
naintea nceperii antibioterapiei
n condiii aseptice
n cantitate suficient
Din produs patologic adecvat localizrii infeciei
Infecii cu anaerobi: n sering cu dop nfipt n ac sau se
nsmneaz direct n flacon nchis ermetic
Transport
Rapid, la nevoie pe medii de transport
Evitarea uscrii produsului
Meninerea temperaturii adecvate: 37oC: H.
influenzae, B. pertusis, N. meningitidis; 4oC:
scaun, urin - polimicrobiene
 Medii uzuale (agar-snge, agar-ocolat)
Medii de mbogtire (agar-ocolat cu factor X i
V -Haemophillus spp., tioglicolat cu hemin i vit
K - anaerobi)
Medii selective inhib creterea anumitor
bacterii (Thayer-Martin inhib germenii din
tractul urinar cu excepia N. gonorhoeae; BYCA
Legionella spp.)
Medii difereniale evidenierea unor
proprieti biochimice specifice unor bacterii
(Mac-Conkey agar, cu lactoz)
Medii pentru anaerobi (agar-snge anaerob, cu
antibiotice selectiv, Wilkins Chalgren)
I. Metode conventionale
teste biochimice
caractere fizice (morfol., pigmentaie, miros, hemoliz)
examen microscopic coloraie Gram
reacii de agutinare pe lam
profilul sensibilitii
II. Metode biochimice
metode enzimatice: enzime preformate hidrolizeaz un
substrat cromogen/ fluorogen culoare/ fluorescen
metode cromatografice: identificarea unor metabolii
microbieni bazat pe fragmentarea, absorbia i solubilitatea
diferit a acestora n 2 faze: mobil, imobil
Medii simple: agar
Medii difazice
Mediu cu liz-centrifugare
Mediu Bactec
Medii mbogite i
suplimentate cu antibiotice -
Histoplasma
Indicaii ale diagnosticului imunologic direct (prin
determinarea Ag):
Infecii tratate
Infecii n care agentul etiologic este dificil de
cultivat
Infecii la imunodeprimai
Infecii simptomatice, n care cantitatea de Ag
este important
Indicaii ale diagnosticului imunologic indirect
(serologic prin determinarea Ac):
Infecii cu germeni greu sau periculos de izolat
n laborator (Coxiella)
Infecii paucibacilare
 urmrirea titrului Ac n dinamic 2 seruri:
n primele zile de boal i n dup 2-3
sptmni; rezultat pozitiv creterea de cel
puin 4x
determinarea separat a IgG de IgM
rezultate fals negative: imunodeprimai
rezultate fals pozitive: Ac postvaccinali,
reacii ncruciate datorate nrudirii Ag,
teste id anterioare ce stimuleaz formarea
Ac
 1. reacii de aglutinare
direct: Paul-Bunnel, Widal, Weil-Felix
indirect
latex aglutinare: Ag n LCR, exudat faringian, urin, ser
coaglutinare: Ag Criptocococcus neoformans n LCR
hemaglutinare: Ac antitoxina C. diphteriae sau Cl. tetani, rubeol
2. reacii de precipitare n faz fluid sau n gel de agaroz
pasiv: dubl imunodifuzie Ouchterlony (toxina C. diphteriae), imunodifuzia radial
n cmp electric (imunoelectrodifuzie, contraimunoelectroforez Ag n LCR, ser)
3. reacii de fixare a complementului: infecii virale (oreion, rujeol, grip), Mycoplasma
pneumoniae, Chlamidia, toxoplasma, fungi
4. reacia de neutralizare: oreion, rujeol, toxoplasmoz (Sabin-Feldman), ASLO
5. imunotehnici cu reactivi marcai
tehnici de imunoflourescen: directa, indirecta, micro-IF, FIAX
tehnici imunoenzimatice (EIA): ELISA (directa - Ag din produsul cercetat, indirecta - Ac din
produsul cercetat), Imunoblot: identificarea Ac corespunztori fraciunilor Ag specifice
subspeciei
Principiu: hibridarea acizilor nucleici proces de legare a 2 lanuri
de acizi nucleici prin puni de H, pe baza omologiei dintre bazele
complementare n condiii speciale asigurate de substane
chimice i temperatur.
Indicaii:
Infecii cu germeni lateni sau cu cretere lent (M. tuberculosis, B.
burgdorferi, Ehrlichia)
Infecii cu microorganisme dificil sau imposibil de cultivat (VHB,
M. leprae, Mycoplasma pneumoniae, N. gonorrhoeae)
Infecii cu microorganisme periculos de cultivat (Coxiella
burnetti)
Importana:
Prezena microorganismului n cantiti foarte mici, nu i
viabilitatea sau relaia cauzal cu boala
Gradul de infeciozitate i eficiena terapeutica (ADN VHB, HIV)
Determin mutaiile virale (VHB)
Determin rezistena la tratament (gena de rezisten la rifa a BK)
Determinarea genotipului
A. Dot-blot hibridizare: acidul nucleic-int fixat cu ajutorul
unui aparat special pe o membran de nitroceluloz, care
este hibridizat cu o sond specific marcat, produsul
hibrid fiind detectat prin autoradiografie; se utilizeaz n
special pentru produse bogate n ADN
B. Southern-blot: metod de vizualizare a ADN ce se
realizeaz dup separarea acestuia n fragmente, urmat
de Electroforeza n gel de poliacrilamid, transfer pe
membran de nitroceluloz, hibridizare cu sond marcat,
detectare prin autoradiografie
C. Northern-blot: vizualizarea ARN cu Southern-blot
D. PCR
metod ciclic de amplificare a secvenelor de ADN
specifice
se utilizeaz un set de primeri (secvene scurte de
oligonucleotide ce delimiteaz lanul de ADN ce va fi
amplificat) i o ADN-polimeraz termorezistent
RT-PCR (revers-transcriptaza PCR): amplificare a ARN dup
conversie n ADN complementar cu ajutorul RT
 Virusuri: hepatitice A-F, herpetice, enterovirusuri,
HIV, rinovirusuri, parvovirusuri, adenovirusuri,
rubeolic, papilomavirusuri
Bacterii: Mycobacterium spp., S. aureus, streptococi
grup A,B, Enterococcus, H. influenzae, N.
gonorrhoaea, L. monocytogenes, Sh. Disenteriae,
Helicobacter pylori, V. cholerae, B. burgdorferi, L.
pneumophila, T. pallidum, Chlamydia spp.,
Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetti, B.
pertussis, E. coli enterotoxigen
Fungi: candida spp., Pneumocystis jirovecii,
Blastomyces dermatidis, Coccidioides immitis,
Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum
Protozoare: Gardnerella vaginalis, Trichomonas
vaginalis, Toxoplasma gondii, Plasmodium spp.