Sunteți pe pagina 1din 49

Preparate microscopice

 Examenul bacteriologic urmareste evidentierea si


identificarea bacteriilor in produsele patologice.

 Bacteriile au dimensiuni de micrometrice, deci


nu pot fi vizualizate decat la microscop.
 Sunt de doua feluri:

 Preparat nativ cu germeni vii.

 Preparat colorat-frotiu cu germeni omorati.


 prezentei microorganismelor in preparat
 proprietatilor morfotinctoriale:
- forma (bacili, coci, spirili)
- marimea
- mobilitatea ( in preparatul nativ )
- existenta eventuala a formatiunilor
neobligatorii ( cili, capsula, spori)
 Asezarii bacteriilor in frotiu ( lant, ciorchine, diplo,
tetrade, etc)
 Proprietatile tinctoriale ( colorabilitatea )
 Examenul microscopic direct din produsele
patologice permite in unele infectii stabilirea
diagnosticului :
- -gonococ –frotiu col.Gram din secretia uretrala
(criteriu suficient de diagnostic)
- -bacil tuberculos-frotiu col.ZN din sputa
-stafilococ –frotiu col.Gram din secretii purulente

Constituie o etapa esentiala in identificarea


bacteriana.
 Este un preparat ce contine germeni vii
 Ex. microscopic al preparatului nativ se face prin
examinarea directa intre lama si lamela a unei
suspensii de germeni vii, intr-o picatura de ser
fiziologic, sau mediu de cultura lichid, precum si
a produsului patologic (singe, sediment urina,
lcr).
Examinarea se face cu obiectiv uscat ( 40x).
 Principiu:citoplasma este incolora si are indice de
refractie putin diferit de al mediului de montare
al preparatului.De aceea in preparatele umede
microbii devin vizibili numai in conditii speciale
de iluminare:
 Reducerea diafragmei de apertura la microscopul
cu fond luminos
 Examinarea pe fond intunecat
 Microscopie in contrast de faza.
 O picatura din suspensia bacteriana se pune pe o
lama microscopica cu ajutorul unei pipete Pasteur
si peste picatura se pune o lamela.
 Preparatul se examineaza la microscopul optic, pe
fond intunecat sau prin contrast de faza.
 Se face cu un obiectiv uscat, cu condensatorul
coborat, obtinandu-se un contrast cat mai
mare.
 Privind din lateral apropiem obiectivul de
preparat
 Privind prin ocular ridicam obiectivul pana
apare imagine in campul microscopic
 Miscand viza micrometrica vom obtine detalii.
 Aceasta examinare permite observarea
mobilitatii, formei si a numarului bacteriilor.
 Utilizeaza un condensator special de tip cardioid
care evidentiaza conturul bacteriilor, corpul fiind
luminos.
 Metoda se foloseste la studiul mobilitatii
bacteriene si la evidentierea speciilor greu de
colorat prin metode obisnuite: Treponema,
Leptospira
 Foloseste condensator
si obiective speciale cu
contrast de faza.
 Evidentiaza detalii
morfologice: spori,
capsula
 Proprietatile morfotinctoriale ale bacteriilor pot
fi studiate mai detailat , pe preparate fixate si
colorate, cu germeni omoriti .

 Mai rar se folosesc coloratii vitale, spre ex. in


reactia de umflare a capsulei.
 Principiu:fixarea colorantului pe structurile
protoplastului mareste refringenta
microorganismelor si permite observarea
detaliilor morfologice.
 Structuri speciale asociate peptidoglicanului
bacterian determina anumite afinitati tinctorilae
care apar dupa coloratii diferentiale.
 Timpi pregatitori:

 Etalarea = intinderea frotiului

 Uscarea

 Fixarea
 Colorarea

 Spalarea

 Uscarea
 Intinderea frotiului
 Se face pe lame microscopice perfect curate si
degresate
 Daca produsul patologic este lichid de pune o picatura
pe lama microscopica si se intinde cu ansa.
 Daca se face dintr-o cultura de pe mediu solid, se pune
pe lama o picatura de ser fiziologic in care se
suspensioneaza o colonie cu ajutorul ansei
bacteriologice.
 Un frotiu corect trebuie sa fie bine intins, subtire,
uniform si trebuie sa lase o margine de de 1-2 cm pana
la periferia lamei.
 Se face lent la lasand lama la temperatura
camerei, ferita de praf sau de curenti de aer.
 Se face prin procedee fizice si
chimice

 Procedeul fizic
 Este cel mai utilizat si consta in incalzire prin
trecerea lamei printr-o flacara, de trei ori, pana
lama se incalzeste la o temperatura suportabila pe
dosul mainii.
 Procedee chimice

 Frotiul uscat se trateaza cu :


 alcool etilic, metilic
 amestec alcool-acetona
 saruri de metale grele.
 Prin fixare microorganismele sunt omorate,
preparatul ne mai fiind infectios.
 Adera mai bine la lama.
 Creste permeabilitatea peretelui celular crescand
afinitatea fata de coloranti.
 Se folosesc coloranti organici: acizi, baze sau
coloranti neutrii sub forma de solutii apoase la
care se adauga cantitati mici de alcool.
 Ex .de coloranti: fuxina bazica, violet de gentiana,
albastru de metilen, verde malachit, verde metil .
 Este un proces fizico-chimic complex in care
colorantul se combina cu componentii celulari
facandu-i vizibili la microscop prin formarea
unor combinatii stabile.
 Se acopera suprafata frotiului fixat cu
colorant, se lasa sa actioneze o periada de
timp la cald sau la rece.
 In urma colorarii obtinem detalii vizibile la
microscop referitor la structura celulara,
dimensiuni, asezare, etc.
 Coloratia simpla foloseste un singur colorant
 Coloratia combinata: colorantii actioneaza succesiv
sau simultan pe anumite elemente
 Coloratii speciale: pun in evidenta elemente
structurale: corpusculi, cili, spori, capsula.
 Se face cu apa de robinet sau cu apa
distilata pana la indepartarea excesului
de colorant de pe lama.
 Se face la temperatura camerei, punand
lama in pozitie verticala intr-un stativ.
 Se face cu obiectivul cu imersie
 Lichidul de imersie( uleiul de cedru are un indice de
refractie apropiat de cel al sticlei.)
 Se ridica condensatorul la maxim
 Se deschide complet diafragam
 Se fixeaza lama pa platina microscopului
 Se pune o picatura de ulei de cedru
 Se coboara obiectivul pana patrunde in uleiul de
imersie cu ajutorul vizei macrometrice, privind din
lateral
 Se ridica din viza macrometrica pana apare imaginea,
privind prin ocular
 Din viza micrometrica se clarifica imaginea
 COLORATIA CU ALBASTRU DE METILEN
 a) Componente
 - solutie albastru de metilen
 b) Prepararea solutiei colorante apoase
 1. Albastru de metilen
 - albastru de metilen pulbere …………………...1g
 - alcool etilic 96 grade ………………………10 ml
 - apa distilata ……………………………….100 ml
 c) Tehnica coloratiei
 Frotiul uscat si fixat prin caldura se trateaza astfel:
 - se acopera cu solutie albastru de metilen 2-3 min.
 - se spala cu apa de robinet
 - se usuca si se examineaza la microscop, cu imersie
 d) Rezultate
 - Bacteriile apar la examinarea cu imersie de culoare albastra
 Coloratia cu fuxina tote elementele apar colorate
in rosu
 Este o coloratie compusa folosita in
microbiologie pentru examenul microscopic al
bacteriilor,care a permis clasificareaq acestora in
functie de afinitatea tinctoriala a peretelui
bacterian.

 Metoda a fost inventata de bacteriologul danez


Hans Christian Gram in anul 1884!
 Tehnica coloratiei
 Frotiul uscat si fixat prin caldura se trateaza astfel:
 se acopera cu sol.Violet de gentiana 1 – 2 min
 se inlatura colorantul si se spala cu apa
 se acopera cu sol. Lugol 2 min
 se inlatura sol. Lugol
 se decoloreaza cu alcool-acetona
 se acopera cu sol.Fucsina diluata 1/10, 30sec-1min
 se spala frotiul cu apa
 se usuca si se examineaza la microscop, cu imersie
 d) Rezultate
 - Bacteriile Gram negative apar la examinarea cu imersie
colorate in rosu
 - Bacteriile Gram pozitive apar la examinarea cu imersie
colorate in violet
 Mordansarea este tratarea frotiului cu anumite
substante chimice, numite mordanţi (de
exemplu, solutia Lugol), in scopul de a intensifica
activitatea coloranţilor. Mordantii, prin afinitatea
puternica pe care o au atat fata de colorant, cat si fata
de substratul supus colorarii, faciliteaza si
intaresc legatura dintre acestia, contribuind astfel la
obtinerea unei coloratii mai intense si de o
calitate mai buna.
 Bacteriile Gram-pozitive rezista la decolorare,
ramanand colorate in violet, dar cele
Gramnegative sunt decolorate de alcool-acetona
si recolorate in rosu.

 Comportarea diferita a bacteriilor in coloratia


Gram tine de diferenta in structura peretelui
celular
 reteaua de peptidoglican tridimensionala cu
ochiuri stranse micsorata si mai mult sub
actiunea deshidratanta a agentilor de diferentiere
poate explica retinerea complexului colorant
violet-iod de catre bacteriile grampozitive
 reteaua de peptidoglican bidimensionala cu
ochiuri laxe si dizolvarea unor lipide asociate
peretelui sub actiunea agentilor de diferentiere
poate explica decolorarea bacteriilor
gramnegative.
 Tehnica coloratiei
 Frotiul uscat si fixat prin caldura se trateaza astfel :
 se acopera lama cu fucsina fenicata
 se incalzeste la flacara pina emite vapori, de trei ori
 se mentine 10 min.
 se spala cu apa de robinet
 se decoloreaza cu amestec alcool- acid
 se spala cu apa de robinet
 se acopera cu sol. Albastru de metilen 1-2 min.
 se spala cu apa de robinet
 se usuca si se examineaza la microscop, cu imersie
 d) Rezultate
 - Bacilii acid – alcool rezistenti apar la examinarea cu
imersie colorati in rosu
 Frotiu col.ZN -sputa
 Obtinem detalii de structura bacteriana
 Col. Moller pentru spori sporul se coloreaza in
rosu;
 Capsula bacteriana se coloreaza in roz iar corpul
bacteriei in violet