Sunteți pe pagina 1din 22

_STERILIZAREA_

Sterilizarea este procedeul prin care sunt indepartate sau distruse toate microorganismele vii de
pe suprafata si din interiorul unor obiecte.
Dezinfectie → distrugerea unor grupe de microorganisme, mai ales patogene, prin metode
chimice.
Asepsia → ansamblul masurilor luate prin care prevenim contaminarea unor materiale si
organisme, in primul rand omul, cu microorganisme.
I. Sterilizarea prin caldura
Caldura uscata: 1. Incalzirea la incandescenta;
2. Flambarea;
3. Sterilizarea cu aer supraincalzit (cuptorul Pasteur);
Caldura umeda: 1. Fierberea;
2. Pasteurizarea;
3. Tindalizarea;
4. Sterilizarea cu vapori curenti (100°);
5. Sterilizarea prin vapori sub presiune
6. Autoclavare;
Metode de sterilizare prin caldura uscata:
1. Incalzirea la incandescenta este mentinerea obiectului in flacara pana devine rosu, dupa care
se lasa sa se racoreasca la temperatura camerei. Se aplica pentru ansa bacteriologica inainte
si dupa fiecare folosire. Prin aceasta metoda de sterilizare microorganismele sunt
carbonizate.
2. Flambarea este trecerea repetata, rapida a obiectelor sau a unor parti a obiectelor prin
flacara. Astfel se sterilizeaza pipetele, orificiul baloanelor si eprubetelor, inainte si dupa
utilizare. Nu se flambeaza obiectele de metal.
3. Sterilizarea cu aer supraincalzit se face in cuptorul Pasteur (cuptor cu aer cald sau
Poupinel), care este o cutie paralelipipedica cu pereti dubli de metal intre care circula aerul
cald, avand in interior rafturi. Este incalzit electric, in care caz are un termoreglator, fixat
pentru 180°. Printr-un orificiu pe partea superioara se introduce un termometru. Tot in
partea superioara se afla si sistemul de ventilatie.
Sterilizarea se face la 180° timp de o ora.
Aceasta sterilizare se aplica unor obiecte de sticla si portelan.
Metode de sterilizare prin caldura umeda:
1. Fierberea este o sterilizare incompleta deoarece nu are actiune asupra tuturor sporilor.
2. Pasteurizarea este tot o metoda imperfecta de sterilizare, fiind distruse doar formele
vegetative prin coagularea proteinelor la temperaturi sub 100° C.
3. Tindalizarea este o sterilizare fractionata sau discontinua. Consta in incalzirea produselor in
baia de apa consecutiv 3-8 zile, timp de 1-3 ore intre 60-100° C. Intre incalziri materialul
este pastrat la temperatura camerei, iar dupa ultima incalzire, la 4°C. Intre doua incalziri
sporii trec in forme vegetative pe care noua incalzire le distruge prin coagularea proteinelor.
4. Sterilizarea prin vapori curenti se realizeaza in oala lui Koch sau in autoclave cu robinetul
deschis. Este o metoda imperfecta, deoarece distruge numai formele vegetative. Se aplica la
lichidele care peste 100°C sunt alterate.
5. Sterilizarea prin vapori de apa sub presiune se realizeaza in autoclave. Caldura umeda sub
presiune fiind mai penetranta, reprezinta cea mai sigura metoda de sterilizare. Se realizeaza
o temperatura de 120° C care in 30 minute distruge atat formele vegetative cati si sporii.
6. Autoclavul este compus dintr-un cazan de fier cu peretii dubli, grosi si rezistenti, avand un
capac care se inchide ermetic cu ajutorul unor suruburi mari si a unei garnituri de azbest sau
cauciuc. Capacul are trei dispozitive: manometru, robinet de vapori pentru evacuarea aerului
si vaporilor de apa si supapa de siguranta. Lateral, cazanul are un robinet de scurgere. In

1
ineriorul autoclavului este un gratar mobil, pe care se aseaza obiectele mari, cele mici fiind
asezate in cosuri de sarma. Incalzirea cazanului se face cu gaz, electric etc
Se introduce in cazan apa distilata putin sub nivelul gratarului. Obiectele se aseaza pe
gratar in asa fel ca sa fie asigurata circulatia vaporilor de apa si se acopera cu hartie, pentru ca
dopurile de vata sa nu se umezeasca de apa de condensie. Se inchide capacul strangand
suruburile doua cate doua diametral opuse. Robinetul de vapori se deschide si se porneste sursa
de caldura. Un jet continu de vapori de apa indica momentul cand aerul a fost evacuat in
intregime. Acest moment e important pentru ca urmele de aer denatureaza valorile indicate de
manometru si sterilizarea nu e corecta. Se inchide robinetul de vapori. Se lasa sa se ridice
presiunea la o atmosfera si se regleaza sursa de caldura ca sa se mentina aceasta presiune timp
de 30 minute. Se inlatura apoi sursa de caldura, se asteapta ca acul manometrului sa cada la
zero, se deschide capacul si se scot obiectele sterilizate. Deschiderea capacului inainte ca
presiunea sa fi scazut la zero poate produce accidente. De asemenea din cauza diferentei de
presiune pot sari dopurile, compromitand sterilitatea. Daca obiectele se lasa in autoclav mai
mult timp, dopurile se vor uda datorita apei de condensie. In mod obisnuit o sterilizare buna se
realizeaza la 120° C(1 atmosfera vapori de apa) timp de 30 minute.
In autoclav se sterilizeaza medii de cultura, material infectios, obiecte de cauciuc,
aparate de filtrat, casetele cu material chirurgical, etc. Nu se sterilizeaza lichide alterabile peste
100° C.
Controlul sterilizarii se face prin teste chimice, teste biologice si termometre inregistratoare.

_STUDIUL MORFOLOGIEI BACTERIENE_


_PREPARATE MICROSCOPICE_

Examinarile bacteriologice urmaresc evidentierea si identificarea bacteriilor din produsele


patologice.
Bacteriile avand dimensiuni de ordinul micrometrilor nu pot fi vazute cu ochiul liber, de aceea
examinarea lor se efectueaza cu ajutorul microscopului.
Examenul microscopic se executa fie direct din produsele patologice (examen microscopic
direct), fie din culturi pure.
Preparatele microscopice sunt de doua feluri:
- preparat nativ, cu germeni vii;
- frontiu sau preparat colorat, cu germeni omorati;

Examenul microscopic al unui preparat nativ reprezinta examinarea directa intre lama si lamela
a unei suspensii de germeni vii intr-o picatura de solutie salina fiziologica, sau mediu de cultura lichid,
precum si a produsului patologic (sange, sediment urinar,etc).
Pentru executarea preparatului nativ dintr-un produs patologic lichid sau din cultura in mediu
lichid, se ia cu pipeta Pasteur o picatura din produsul respectiv, se depune pe mijlocul lamei si se
acopera cu o lamela. Din cultura obtinuta pe mediul solid, se ia cu ansa sterila o cantitate mica dintr-o
colonie izolata si se suspenda omogen intr-o picatura de solutie salina fiziologica depusa pe mijlocul
lamei. Se acopera cu o lamela.
Examinarea la microscopul optic se face cu ajutorul unor obiective uscate.
Se coboara condensatorul si se diafragmeaza in asa fel incat campul microscopic nu sa fie
luminat prea puternic, obtinandu-se astfel un contrast mare. Punerea la punct a imaginii se realizeaza in
trei timpi:
- ne apropiem cu obiectivul de preparat cu ajutorul vizei macrometrice privind lateral;
- privim prin ocular si ridicam obiectivul cu ajutorul vizei macrometrice, pana cand apare
campul microscopic;

2
- realizam obtinerea detaliilor in campul microscopic cu ajutorul vizei micrometrice;

Examenul microscopic al unui preparat colorat (frontiu).


Proprietatile morfotinctoriale ale bacteriilor pot fi studiate mai detaliat pe preparate fixate si
colorate, cu germeni omorati.
Obtinerea unui preparat colorat se executa in mai multi timpi:
• timpi pregatitori: etalarea, uscarea, fixarea;
• timpi terminali: colorarea, spalarea, uscarea;

Etalarea (intinderea frontiului).


In acest scop se folosesc lame perfect curate si degresate. Daca frotiul se face dintr-un lichid, se
depune cu ansa, sau pipete Pasteur o picatura foarte mica pe mijlocul lamei. Daca frotiul se face dintr-
un produs semisolid, sau dintr-o cultura pe mediu solid, se depune pe lama o picatura de solutie salina
fiziologica in care se suspenda cu ansa sterilizata in prealabil, o cantitate mica de produs, se
omogenizeaza bine, apoi se intinde cu grija. Un frotiu corect etalat trebuie sa indeplineasca urmatoarele
conditii: sa fie intins subtire si uniform pe suprafata lamei, lasand de la marginile lamei un spatiu liber
de 1-2 cm.
Uscarea se face lent, lasand lama la temperatura camerei ferita de praf, curenti de aer etc.
Fixarea se face prin procedee fizice si chimice.
Procedeul fizic cel mai utilizat este fixarea prin incalzire si consta prin trecerea rapida a lamei
cu preparatul uscat, de cel putin trei ori, prin flacara unui bec de gaz, pana cand primeste o temperatura
suportata de partea dorsala a mainii.
Pentru scopuri speciale se folosesc procedee chimice, care constau in tratarea frotiului uscat cu
alcool metilic, etilic, amestec de acloolo-eter.
Scopul fixarii este multiplu. Microorganismele sunt omorate si deci preparatul nu mai este
infectios. Printr-o fixare corecta preparatul adera mai bine pe lama si nu se detaseaza in timpul
operatiilor de colorare si spalare. Prin omorarea microorganismelor se mareste permeabilitatea peretelui
celular si se produc modificari ale citoplasmei, care cresc afinitatea fata de unii coloranti.
Colorarea
Dupa scopul urmarit se pot utiliza mai multe tipuri de coloratii:
- coloratia simpla, care se executa cu un singur colorant;
- coloratia combinata, care se realizeaza prin actiunea succesiva sau simultana a mai multor
coloranti, fiecare colorant actionand independent si fixandu-se pe anumite elemente;
- coloratii speciale, pentru formatiuni morfologice celulare si extracelulare: corpusculi, cili,
spori, capsula.
Spalarea frotiului colorat se realizeaza cu apa de robinet, sau cu apa distilata, pana la
indepartarea completa a procesului de colorant de pe lama.
Uscarea frotiului colorat se face la temperatura camerei.
Examinarea microscopica a frotiului colorat se face cu ajutorul microscopului optic, intotdeauna
cu obiectivul de imersie.

Metode de colorare folosite in microbiologie:

• Coloratia simpla
Frotiul fixat este acoperit complet cu un singur colorant, de obicei albastru de metilen, sau
fuxina diluata, timp de 1-2 minute, apoi se spala cu apa curenta si se usuca. In coloratia cu albastru de
metilen toate elementele se coloreaza in albastru, iar in cea cu fuxina, toate elementele se coloreaza in
rosu.
Coloratia simpla permite stabilirea unor proprietati morfologice ca: forma si marimea
microbilor. Este foarte utila in diagnosticul prin examen microscopic direct din produsul patologic in
gonoree, meningita cerebrospinala epidemica si in alte infectii.
3
• Coloratia combinata
Friotiul fixat este supus actiunii mai multor coloranti.

• Coloratia GRAM
Este larg utilizata in microbiologie, pentru ca deosebeste germenii gram pozitivi de cei gram
negativi.
Timpi coloratiei Gram:
1. Frotiul fixat este acoperit cu violet de gentiana filtrat extemporaneu, timp de 2 minute, apoi
se scurge colorantul.
2. Se acopera cu o solutie lugol pentru mordansare (fixare colorant), timp de 2 minute. Se
scurge mordantul. Prin aceasta operatie toate elementele din frotiu se coloreaza in albastru
violet.
3. Se decoloreaza cu alcool-acetona timp de 20 secunde pana nu se mai dizolva colorant. Se
spala cu apa curenta.
4. Se recoloreaza cu fuxina diluata timp de 2 minute.
5. Se spala cu apa curenta pana la indepartarea completa a colorantului in exces.
6. Se usuca frotiul si se examineaza cu imersia.
Germenii gram pozitivi rezista la decolorare si isi mentin culoarea albastru violet initiala.
Germenii gram negativi se decoloreaza si se recoloreaza in rosu cu fuxina diluata.
Diferenta de comportament in coloratia gram se explica prin structura si compozitia chimica
diferita a peretelui celular la bacteriile gram pozitive si gram negative.
Coloratia gram permite dezvaluirea urmatoarelor grupe importante la bacterii:
- coci gram pozitivi: stafilococ, steptococ;
- coci gram negativi: meningococ;
- bacili gram pozitivi: bacilul coli;
- cocobacili gram negativi: brucele;

• Coloratia ZIEHL-NEELSEN
Pune in evidenta germenii acido-acloolo-rezistenti.
Timpii coloratiei Ziehl-Neelsen:
1. Se acopera frotiul fixat, cu fuxina concentrata si se incalzeste trecand flacara pe sub
preparat, pana cand incep sa iasa vapori, fara sa se ajunga la fierbere si fara sa se usuce
colorantul pe lama, timp de 5-10 minute. Se spala cu apa curenta.
2. Se decoloreaza cu acid sulfuric 20% timp de 30 secunde. Se spala cu apa curenta.
3. Se decoloreaza cu alcool etilic 96%, 30 secunde, pana la indepartarea colorantului. Se spala
cu apa curenta.
4. Se recoloreaza cu albastru de metilen 2-3 minute, se spala cu apa curenta si se usuca. Se
examineaza cu imersia.
Germenii acido-alcoolo-rezistenti apar colorati in rosu, ceilalti germeni si elementele celulare
apar colorate in albastru. Proprietatea acido-alcoolo-rezistenta este caracteristica genului
„Myobacterium” (bacilul tuberculos, bacilul leprei) si se datoreaza structurii particulare a
peretelui celular, cantitatii mari de lipide pe care acesta le contine si in special acidul micolic.

4
MEDIILE DE CULTURA_

Multiplicarea in laborator a microorganismelor izolate din natura, poarta numele de cultivare a


microorganismelor.
Def: Amestecurile de substante care asigura cultivarea se numesc medii de cultura.
Totalitatea microorganismelor dintr-un mediu de cultura constituie cultura microbiana.
Cultivarea microorganismelor poate fi efectuata in diverse scopuri: izolarea in cultura pura (un
singur tip de germen) a unui tip de microorganism dintr-un amestec natural de germeni, identificarea pe
baza proprietatilor de multiplicare, obtinerea de produse biologice pentru diagnosticul, tratamentul sau
prevenirea unor imbolnaviri microbiene.
Orice mediu de cultura trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii:
 sa asigure substantele nutritive necesare: sursa de carbon si de azot, donatorul si
acceptorul de hidrogen, minerale, factori de crestere.
 sa asigure conditiile de desfasurare optima a metabolismului: pH, potential
redox, aerare si cantitate de CO2, putere ionica si presiune osmotica.
 sa fie steril

Compozitia mediilor de cultura:


cultura
1. Substante nutritive
• Peptonele se obtin prin hidroliza acida, alcalina sau enzimatica. Ele contin
aminoacizi, peptide, proteoze si peptone alaturi de zaharuri, vitamine, saruri etc.
• Amestecurile naturale de proteine consta din ser sanghin, sange defibrinat, lichid de
ascita, ou, lapte s.a.m.d.

2. Agenti de solidificare
• Agar-Agar: phytocoloid de natura polizaharidica (poligalactozid), obtinut din algele
marine. Nu are valoare nutritiva. Utilizarea se bazeaza pe doua proprietati
fundamentale: incalzit in apa da o solutie care dupa racire se solidifica sub forma
unui gel si la caldura absoarbe cantitati foarte mari de apa.
• Gelatina: substanta proteica extrasa prin hidroliza partiala a colagenului din oase,
cartilagii.
3. Alte componente
• Indicatorii colorimetrici de pH ca albastrul de bromtimol, purpura de bromcrezol,
rosu fenol, rosu neutru se utilizeaza mai ales pentru demonstrarea producerii de acid
din zaharurile din mediu. Se utilizeaza mai ales in mediile pentru teste biochimice.
• Agentii selectivi. Acestea sunt substante colorante sau nu, uneori chimioterapice,
introduse in mediile selective pentru a inhiba multiplicaea unor grupe de bacterii,
permitand dezvoltarea celorlalte microorganisme.
• Agentii reducatori. Se utilizeaza in mediile pentru cultivarea bacteriilor anaerobe,
care alaturi de lipsa oxigenului molecular au nevoie de un potential de oxido-
reducere scazut.
• Substrate pentru testele biochimice si alte ingrediente. Evidentierea unor
proprietati metabolice se face prin cultivarea bacteriilor in medii in care s-au
introdus unul sau mai multe substraturi ca de exemplu zaharuri, polialcooli,
aminoacizi etc.

Prepararea mediilor de cultura:


cultura
1. Amestecul ingredientelor in proportia si ordinea indicata in reteta de preparare;
2. Ajustarea pH-ului;
3. Repartizarea in recipiente adecvate(eprubete, baloane etc);
5
4. Controlul sterilitatii;

_RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE_

Def: Diagnosticul etiologic al unei boli infectioase depinde in mare masura de recoltarea
corecta a produsului patologic.
Produsele patologice sunt probe in care se banuieste prezenta microorganismelor. Ele pot fi:
- produse normale, care prezinta unele modificari in caz de boala (sange, fecale, urina
l.c.r. etc)
- produse care apar numai in imbolnaviri (puroi, lichid peritoneal, lichid articular, sputa)
Produsele patologice se pot recolta de la bolnavi, convalescent, purtatori sanatosi (personal
spitalicesc, sector alimentar) cadavre.
Reguli generale de recoltare a produselor patologice:
1. Pentru fiecare boala infectioasa trebuie cunoscut:
- de unde se pot obtine produsele patologice cele mai reprezentative;
- cand este momentul cel mai potrivit pentru recoltare, in raport cu perioada de evolutie
a bolii.
- cum trebuie recoltat, deci care este tehnica cea mai corecta de prelevare.
- cat trebuie recoltat, deci cantitatea necesara pentru reusita diagnosticului.
2. Prelevarea trebuie facuta steril;
3. Produsul trebuie etichetat corespunzator;
4. Produsul se va ambala corespunzator;
5. Expedierea la laborator se face cat mai rapid;
6. Insamantarea se face cat mai repede dupa recoltare;

I . Recoltarea produselor patologice din tractul respirator


In interpretarea rezultatelor se tine cont de microogranismele normal intalnite in tractul
respirator superior.
1. Secretia faringiana se recolteaza cu tampon faringian care e format dintr-o tija metalica sau
de lemn, cu un capat invelit in vata, introdus intr-o eprubeta sterila. Recoltarea se face
dimineata inainte de mancare, inainte de spalarea dintilor, fara a fi precedata de gargarisme
cu substante antiseptice. Dupa deschiderea larga a gurii se sterge cu tamponul peretele
posterior al faringelui si amigdalele.
2. Secretia nazala: se recolteaza asemanator, folosind cate un tampon pentru fiecare nara.
3. Secretia conjunctivala in conjunctivitate si secretia etica in otite, se recolteaza de asemenea
cu tampoane sterile.
4. Sputa: se recolteaza in bronsite, bronhopneumonii, tuberculoza, dimineata cand bolnavul isi
face toaleta bronsiilor. Recoltarea se face inainte de mancare, dupa clatirea gurii cu ser
fiziologic steril. Se va avea grija sa se obtina secretie din bronsii, nu saliva.
5. Secretiile traheo-bronsice: recoltate prin cateter (aspirate).

II. Recoltarea produselor patologice de la nivelul tractului digestiv


1. Lichidul de varsatura;
2. Materii fecale;
Recoltarea si insamantarea fecalelor in scopul cultivarii germenilor, se numeste
coprocultura. De obicei se recolteaza 2-3 g fecale, care se pun in colectoare de sticla sau
material plastic cu dop, de care se ataseaza o spatula.
3. Bila;
Se recolteaza dimineata cu sonda Einhorn, dupa clatirea gurii cu ser fiziologic steril.
Examinarea bacteriologica a bilei se numeste biliocultura.
6
III. Recoltarea produselor patologice de la nivelul tractului uro-genital
1. Urina: se recolteaza prin metoda jetului intrerupt. Insamantarea urinii pe medii de cultura in
vederea izolarii germenilor se numeste urocultura.
In infectiile urinare se efectueaza urocultura cantitativa, adica determinarea numarului de
bacterii pe mililitru de urina. Pentru a diferentia bateriile contaminante de cele cu importanta etiologica,
se accepta ca prezenta a peste 100.000 UFC/ml, (UFC=unitati formatoare de coloni), urina este
semnificativa pentru diagnosticul de infectie urinara.
2. Secretia uretrala
Se recolteaza de la barbati pentru diagnosticul gonoreei si a altor uretrite.
De la femei se recolteaza secretie vaginala, sau secretie de pe colul uterin pentru diagnosticul
infectiilor genitale.

IV. Recoltarea sangelui


Se face in mai multe scopuri:
a) Examen bacteriologic: hemocultura;
b) Examen serologic: testarea anticorpilor;
c) Examen virusologic;
De asemenea se mai recolteaza pentru:
d) Examinari parazitologice, examinari hematologice si examinari biochimice.
e) Hemocultura: consta in cultivarea bacteriilor din sange in caz de septicemii.

Sangele se recolteaza din vena plicii cotului, in perioada de ascensiune termica sau frisoane,
cand microogranismele se afla in numar mare in circulatie. Se folosesc seringi de 10-20 ml, cu acul
adaptat si cu permeabilitatea verificata, totul montat in tuburi de sticla speciale „port seringa”, care se
sterilizeaza la autoclav. Portseringa se deschide la patul bolnavului numai in momentul recoltarii.
Aseptizarea plicii cotului se face cu tinctura de iod, apoi cu alcool 70%. Dupa dezinfectie nu se mai
palpeaza vena cu degetul. Se recolteaza 10-20 ml sange, care se insamanteaza imediat, la patul
bolnavului, sub protectia flacarii, intr-un balon cu mediul lichid (bulion simplu, bulion glucozat, bila,
etc) in proportie de 1:10 (10 ml sange la 100 ml mediu). Paralel se insamanteaza 10 ml sange in
conditii de anaerobioza pentru detectarea germenilor anaerobi. Se recomanda efectuarea a cel putin 3-4
hemoculturi la un bolnav.
Daca bolnavul a fost in prealabil tratat cu antibiotice, se adauga la mediul de cultura substante
neutralizante: PABA pentru sulfamide, penicilinaza pentru penicilina, cisteina pentru streptomicina,
sulfat de magneziu pentru tetraciclina.
Hemoculturile se mentin la 37°C timp de 2-3 saptamani, dezvoltarea germenilor urmarindu-se
prin subculturi pe medii solide, efectuate la intervale de 2-3 zile. In acest scop este util procedeul
Castaneda: sangele se insamanteaza in mediu lichid al unui balon Erlenmayer in care, s-a solidificat in
prealabil in pozitie verticala un mediu solid. Flaconul se incubeaza la 37°C. La intervale de 2-3 zile se
inunda suprafata gelozei cu bulionul din flacon pentru a realiza insamantarea pe suprafata mediului
solid. In felul acesta se exclude pericolul suprainfectarii mediului prin deschiderea repetata a
flaconului;
Uneori, inocularea sangelui la animale da rezultate mai bune decat cultivarea (leptospiroze), sau
constituie singura metoda de izolare a bacteriilor din sange (rickettsioze).

V. Lichidul cefalo-rahidian
Se recolteaza in meningite, prin punctie lombara sau suboccipitala. Se insamanteaza cat mai
repede, daca este posibil chiar la patul bolnavului, mai ales cand se suspecteaza meningita
meningococica.

7
VI. Exudate din seroase
Lichidul pleural, peritoneal, sinovial, se recolteaza in leurezii, respectiv, peritonite, sinovite,
dupa asepsie locala prin punctie in partea declina a regiunii.

VII. Puroi
Din colectii inchise (abscese) se recolteaza prin punctie. Puroiul din leziuni inchide profunde va
fi studiat si in conditii de anaerobioza.
Din colectii deschise se recolteaza cu tampoane sterile dupa curatirea plagii cu ser fiziologic
steril si eliminarea primei cantitati care iese.

_INSAMANTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE_

Izolarea unui agent infectios este hotaratoare pentru diagnostic, mai ales cand rezulta dintr-un
produs patologic normal lipsit de germeni (sange, l.c.r., lichid aticular). Izolarea de germeni din tractul
respirator digestiv, leziuni cutanate, se va considera in raport c microbiocenoza fiecarei regiuni.
In scopul izolarii bacteriilor din produsele patologice se practica insamantarea pe medii de
cultura potrivite, adica depunerea produsului recoltat pe suprafata sau in profunzimea mediului.
Insamantarea se poate face cu ansa bacteriologica sau cu pipeta Pasteur (sterilizate in prealabil).
Insamantarea produsului patologic urmareste obtinerea de colonii izolate, a caror caractere sa
fie usor de analizat. O colonie reprezinta o populatie bacteriana omogena provenita dintr-o singura
celula. Genetic aceasta populatie reprezinta o clona.
Pot fi utilizate diferite tehnici de insamantare:
1. Prin epuizarea inoculului pe suprafata unei placi Petri. Inoculul se depune pe un sector
limitat al placii, cu ansa bacteriologica, sau cu tamponul. Apoi, cu ansa sterilizata si racita
se disperseaza inoculul pe un alt sector al placii, executand cateva striuri paralele de la
inocul spre marginea placii. Se sterilizeaza ansa si apoi, pornind de la striurile anterioare si
perpendicular pe ele se mai traseaza cateva striuri paralele. Operatia se repeta pana la
epuizarea suprafetei de insamantare.
2. Insamantarea prin dilutii succesive in tuburi.
Se poate efectua in doua moduri:
• intr-o serie de 3-4 tuburi cu bulion se fac dilutii succesive din produsul patologic
• produsul patologic se depune (o picatura) in lichidul de condensare al unui tub de
geloza inclinata, intinzandu-se apoi pe suprafata mediului. In continuare se
realizeaza dilutii succesive direct in apa de condensare a 3-4 tuburi cu geloza.
inclinata.
3. Insamantarea in profunzimea mediilor solide: se poate face prin intepare cu o ansa
bacteriologica dreapta.
4. Insamantarea in medii lichide.

_STUDIUL CARACTERELOR CULTURILOR BACTERIENE_

Culturile bacteriene trebuiesc examinate sub aspectul dezvoltarii lor pe mediile lichide si solide.
La o cultura pe mediu de lichid se urmareste:
- turbiditatea;
- sedimentul;
- prezenta peliculei;
- culoarea;
- mirosul;
Pe medii solide se examineaza aspectul coloniilor izolate:
8
- relief;
- contur;
- marime;
- pigmentarea coloniilor;
- transparente sau opace;
- consistenta;
- aderenta la mediu;
- capacitatea de a fi emulsionate in solutie salina fiziologica (exp: maioneza);

In functie de aceste atribute se deosebesc doua tipuri de colonii:


a) colonii de tip S(smooth=neted) cu suprafata bombata, neteda, lucioasa, contur bine
delimitat, consistenta cremoasa. Prin emulsionare cu ser fiziologic rezulta o suspensie
omogena.
b) colonii de tip R (rough=rugos) cu suprafata turtita, neregulata, contur crenelat, festonat,
uscate, aderente la mediu. In ser fiziologic dau suspensii granulate.
Majoritatea speciilor patogene la izolarea din organism se dezvolta sub forma de colonii S. Prin
cultivarea repetata pe medii de cultura, coloniile S pot trece in forma R, cu structura antigenica si
patogenitate modificata. Exceptie de la aceasta regula intalnim la bacilul difteric, bacilul tuberculos si
bacilul carbunos, care se izoleaza de la bolnavi si sunt patogene in forma R.
Variatia S-R reprezinta un exemplu de mutatie genetica la bacterii.

_TESTAREA SENSIBILITATII BACTERIILOR PATOGENE LA ANTIBIOTICE_

_ANTIBIOGRAMA_

Def: Prin antibiograma se intelege testarea sensibilitatii unei tulpini bacteriene izolate intr-un
produs patologic fata de diverse antibiotice (AB).
Conditii de efectuare:
1. Antibiograma se face dupa stabilirea diagnosticului etiologic, prin izolarea in cultura pura si
prin identificarea agentului patogen.
2. Antibiograma se realizeaza in functie de rezultatele date de antibiograma, alegand
antibioticul cel mai eficace, adica fata de care bacteria izolata are cea mai mare sensibilitate.
3. Antibiograma trebuie repetata daca tratamentul cu antibiotice este de durata mai lunga;
aceasta deoarece prin mecanismele cunoscute, agentul patogen poate sa castige rezistenta
fata de antibioticul utilizat. Apoi in cursul tratamentului datorita dezechilibrului din
populatiile microbiocenozelor, poate sa se produca o infectie supraadaugata cu o bacterie
din aceste microbiocenoze.
Principiul antibiogramei consta in capacitatea antibioticelor de a impiedica multiplicarea
bacteriana, fenomen cunoscut ca efect bacteriostatic. Unele antibiotice au in anumite concentratii si
proprietatea de a omori bacteriile: efect bactericid.
Exista mai multe metode pentru efectuarea antibiogramei, dintre care mai importante sunt
urmatoarele:
1. Metoda difuzimetrica
Aceasta se efectueaza pe medii solide, in placi Petri, pe care s-a insamantat in panza cultura
bacteriana; apoi pe suprafata mediului se dispun rondele cu antibiotice astfel ca in jurul acestora se va
realiza un gradient de concentratie prin difuziunea locala a AB-ului (in imediata vecinatate a rondelei
realizandu-se o concentratie mai mare de AB care descreste pe masura indepartarii de aceasta).
Metoda difuzimetrica, cu toate ca nu stabileste cu precizie concentratia minima inhibitorie
(CMI), da informatii pretioase asupra sensibilitati speciei testate fata de antibioticele utilizate si este
folosita mai frecvent in laboratoarele clinice.
9
Citirea rezultatelor se face masurand cu rigla zona de inhibitie din jurul rondelelor, diametrul
zonei de inhibitie exprimandu-se in mm.
Tehnica de lucru
Mediul de cultura indicat este geloza Muller-Hinton deoarece are o valoare nutritiva care
permite dezvoltarea optima a unei varietati de bacterii si nu contine inhibitori ai actiunii unor
antibiotice. Pentru bacterii cu necesitati de cultura speciale, se utilizeaza medii adecvate (de exp pentru
Streptococcus pygenes se foloseste geloza sange).
Coloniile izolate obtinute din produsul patologic, se insamanteaza in bulion, care se incubeaza
18-24 ore la 37° C, iar pentru bacteriile cu dezvoltare rapida este suficient a se incuba numai 4-6 ore la
37 ° C. Apoi cultura se dilueaza 1/100-1/1000 si se insamanteaza in panza 0,5-1 ml cu cultura diluata,
adica se raspandeste uniform lichidul pe suprafata gelozei iar excesul este aspirat cu o pipeta Pasteur si
aruncat intr-un vas cu amestec sulfo-cromic. Placa se usuca cu capacul intredeschis timp de ½-1 ora un
vecinatatea unei flacari, apoi pe suprafata uscata a mediului se dispun rondele (discuri) de hartie de
filtru sau comprimate standard, impregnate cu diverse antibiotice.
Concentratia de antibiotice utilizata corespunde concentratiei serice, sau tisulare, realizate in
tratamentul clinic.

2. Metoda dilutiilor in medii lichide


Aceasta urmareste determinarea limitei de sensibilitate a germenului fata de substanta data,
indicand concentratia de chimioterapice sau antibiotice necesara pentru inhibarea dezvoltarii sale. In
acest fel se determina ceea ce se cunoaste sub denumirea de concentratie minima inhibanta (CMI –
inhibitorie).

_REACTIA DE AGLUTINARE_

Def: Aglutinarea bacteriana este o reactie antigen-anticorp de agregare, in care antigenul este
reprezentat de celule bacteriene sau fragmente de celule bacteriene in suspensie (antigen particulat).
Sub actiunea anticorpilor specifici, complexele imune antigen-anticorp, formeaza retelele
tridimensionale in prezenta unor electroliti din mediu si in anumite conditii de temperatura si pH,
constituind agregate vizibile. Reactia de aglutinare se foloseste in identificarea unor bacterii pe baza
proprietatilor antigenice, cat si pentru evidentierea anticorpilor aglutinati din serul de bolnav.
In aglutinarea bacteriana, dupa natura si localizarea antigenului care participa la reactie, exista
doua tipuri principale de aglutinare: somatica sau aglutinare O sau ciliara sau aglutinare H.
Aglutinarea O sau somatica este data de antigenul O, somatic, care intra in constitutia peretelui
celular fiind in general identic cu endotoxina. Antigenul O este de natura glucido-lipido-polipeptidica,
termostabil, alcoolorezistent si distrus de formol.
Aglutinarea O apare sub forma unor grunji fini, care nu disociaza la o aglutinare brutala; apare
mai lent, necesitand o incubare de 2 ore la 52°C, urmata de 20 ore la temperatura camerei. In
aglutinarea O bacteriile se unesc intre ele pein alinierea cap la cap (aglutinare polara).
Aglutinarea H, flagelara este data de antigenul H, prezent la bacteriile mobile, antigen de natura
proteica, termostabil, distrus de alcool, rezistent la formol. Aglutinarea H apare sub forma unor
flacoane care formeaza un sediment abundent care dispare la agitare brusca; aglutinarea H apare mai
rapid. In aglutinarea H bacteriile se unesc prin flageli.

_REACTIA DE PRECIPITARE_

Def: Este o reactie antigen-anticorp de agregare, in care antigenul este reprezentat de


macromolecule in solutie coloidala. Punerea in contact a antigenului cu anticorpul corespunzator duce
la formarea unor complexe antigen-anticorp care precipita atunci cand elementele ce participa in reactie
se gasesc in proportie optima. Are mai multe variante in functie de mediul in care se desfasoara reactia.
Tinand cont de faptul ca in reactia de precipitare, antigenul, ca solutie coloidala, poate fi bine

10
caracterizat chimic aceasta confera reactiei un mare grad de specificitate si sensibilitate, pretandu-se
foarte bine si la analize imunochimice de finete.

TESTE CARE UTILIZEAZA VIZUALIZAREA COMPLEXELOR ANTIGEN-ANTICORP PRIN ARTIFICII


TEHNICE

Sensibilitatea reactiilor antigen-anticorp poate fi marita legand de anticorp (mai rar de antigen)
un marker usor de identificat, care sa nu interfereze cu proprietatile imunologice ale reactantilor. Acest
marker poate fi:
a. O substanta fluorescenta (izotiocianat de fluoresceina, rodamina), in tehnica
imunofluorescentei;
b. Izotopi radioactivi (de obicei 125), in metoda radio-imunotestarii;
c. O enzima (peroxidaza, beta-galactozidaza, fosfataza alcalina etc), in testele
imunoenzimatice.

_SCHEMA DIAGNOSTICULUI ETIOLOGIC IN BOLILE INFECTIOASE_

Metode folosite in diagnosticul etiologic sunt :


A. Metode in diagnostic direct sau bacteorologice
B. Metode de diagnosticare indirect
a) diagnostic serologic
b) diagnostic biologic prin intradermo-reactie
A. Diagnosticul bacteoriologic urmareste evidentierea agentului patogen din produsul
patologic, de obicei prin izolarea si identificarea lui.
Etape principale:
I. Recoltarea produselor patologice in functie de localizare si manifestare clinica;
II. Examenul microscopic direct din produsul patologic prin efectuarea preparatului nativ si a
frotiului colorat;
III. Insamantarea si izolarea agentului patogen din produsele patologice in cultura pura;
IV. Identificarea agentului patogen izolat prin:
1. Cercetarea proprietatilor morfotinctoriale in urma examinarii microscopice a
preparatului nativ(mobilitate) si a frotiurilor colorate luate din cultura, forma dimensiuni
asezare prezenta cililor capsulei sporilor.
2.Caracterizarea proprietatiilor de cultura permite sa se stabileasca in primul rand daca
sunt necesare pentru dezvoltare medii simple sau medii speciale, se observa de
asemenea forma, dimensiunile, consistenta coloniilor, colonii de tip S sau tip R (pe
medii solide); tulburarea mediului, formarea peliculei, sediment ( medii lichide).
3. Cercetarea proprietatilor biochimice, degradarea fermentativa a zaharurilor si acizilor
organici.
4. Stabilirea structurii antigenice prin reactii de aglutinare, precipitare cu seruri imune
standard.
5. Cercetarea proprietatilor de patogenitate in vivo sau in vitro.
V. Determinarea sensibilitatii la antibiotice.

B. Diagnosticul indirect evidentiaza instalarea imunitatii in urma trecerii prin infectie.


Se efectueaza prin:
I. Metode de diagnostic serologic, care se bazeaza pe aparitia anticorpilor in serul bolnavului.
II. Metode de diagnosit biologic. Prin inocularea intradermica a antigenului.

11
_DIAGNOSTICUL INFECTIILOR STREPTOCOCICE (SCARLATINEI)_
_GENUL STREPTOCOCCUS_

Genul streptococus reuneste un numar mare de specii, cu o distributie larga in natura,


caracterizat in general prin asezarea lor in lanturi si prin absenta catalazei.
Clasificare: 1. Tipuri de hemoliza
2. Structura antigenului

1. Dupa tipul de hemoliza


1. Streptococii alfa-hemolitici: produc pe geloza cu sange o hemoliza incompleta, cu aparitia in
jurul coloniei a unei zone de culoare verzuie. Se incadreaza aici un grup constituit din mai multe specii,
cel putin 10 fiind in mod obisuit comensale ale cavitatii buco-faringiene. Din acestea S-mutans si S.
sanguis se considera ca au alaturi de alte bacterii ce formeaza placa dentara, un rol principal in
producerea cariei dentare.
2. Streptococii beta-hemolitici, cu hemoliza completa vizualizata pe geloza cu sange cu o zona
clara in jurul coloniei. Fac parte din acest grup, principalii streptococi patogeni: S. pyogenos de grup A,
care determina cea mai mare parte din infectiile omului, fiind de aceea considerat principalul streptococ
patogen uman, STR. de grup B, care se intalneste mai ales la infectiile materno-infantile.
3. Streptococii gama-hemolitici care nu produc hemoliza pe geloza cu sange, in care sunt inclusi
mai ales streptococii comensali si saprofiti.

Diagnostic direct sau bacteriologic

I. Recoltarea produselor patologice: secretia faringiana recoltata dimineata, pe nemancate, cu


precautii pentru a se evita imbibarea tamponului cu saliva si urmarindu-se insistenta a faringelui si a
amigdalelor.
II. Examen microscopic direct: deoarece in faringe exista intotdeauna streptococi comensali,
este lipsit de semnificatie.
III. Izolarea: se face prin insamantarea pe geloza cu sange.
IV. Identificarea
1.Proprietati morfo-tinctoriale, coci gram pozitivi, ovalari, asezati caracteristic in lanturi,
rar izolati sau diplo.
2. Proprietati de cultura. Streptococii sunt aerob-anaerob facultativ. Streptococii patogeni
necesita pentru dezvoltare medii de cultura cu adaos de proteine native; sange, ser, lichid
de ascita. Pe medii lichide, nu tulbura medii, formand sediment redus ca volum, care prin
agitare se dispreseaza sub forma de grunji (dezvoltare granulara).Pe geloza sange apar
colonii mici cu o zona completa de hemolizi in jur (hemoliza beta). Alti streptococi
produc hemoliza alfa sau sunt nehemoliti.
3. Proprietati biochimice: sunt importante in identificarea streptococilor alfa-hemolitici.

II. Dupa structura antigenului


In peretele celular este prezent un carbohidrat – substanta C, care a permis pe baza studiilor
efectuate de Rebecca Lancefield sa se constituie mai multe grupe antigenice notate cu litere mari de la
A-O. Streptococii beta-hemolitici umani fac parte din grupul A. Grupul B,C,F si G pot sa produca
infectii sau sunt comensali.
• Testul la bacitracina permite o identificare rapida a streptococului din grupul A,
singurii sensibili la acest antibiotic. Dezvoltarea culturii de streptococ de grup A este
inhibat in jurul rondelei care contine bacitracina asemanator ca la antibiograma.
12
• Testul Camp, realizeaza o incradare provizorie a unei tulpini in grupul B.
• Proprieteti de patogenitate; streptococul elaboreaza peste 20 de produsi
extracelulari toxici si netoxici. Au rol in conturarea polimorfismului clinic.
• ANTIBIOGRAMA. Streptococi din grupul A sunt sensibili la penicilina si de aceea
nu necesita in mod obisnuit efectuarea antibiogramei. Pentru ceilalti streptococi, se
poate intalni o rezistenta variabila la chimioterapice, inclusiv de naura plasmidica,
ceea ce face necesara utilizarea antibiogramei.

Diagnostic indirect

1.Diagnosticul serologic – Reactia ASLO ( antistrepto-lisina O)- evidentiaza anticorpii


anti-streptoliza O din serul bolnavilor.
2. Diagnosticul biologic – se utilizeaza in diagnosticul scarlatinei si se bazeaza pe
proprietatea exotoxinei de a produce eruptia cutanata si pe capacitatea antitoxinei (anticorpul
corespunzator) de a neutraliza toxina si in consecinta efectul eritrogen al acesteia.
-Reactia Schultz-Charlton
- Reactia Dick

_DIAGNOSTICUL INFECTIILOR STAFILOCOCICE_


_GENUL STAPHYLOCOCCUS_

Stafilococul face parte din familia Micrococaaceae, care cuprinde coci gram pozitiv si catalazo-
pozitivi, ce pot fi incadrati in doua genuri: Staphylococus au fost si Micrococcus.
In genul Staphylococcus au fost individualizate mai multe specii din care retin in mod special:
- Staphylococcus aureus specie care poate fi patogena pentru om si animale
- Staphylococcus epidermidis, specie lipsita in mod obisnuit de patogenitate.

Infectiile stafilococice.
Stafilococii fac parte din germenii piogeni si produc infectii diverse cu localizare, manifestari
clinice si evolutie.
Din gama larga de infectii, furuncul, panaritiul, hidrosadentita si osteomielita, se pot considera
ca infectii tipic stafilococice, dat fiind faptul ca in majoritatea cazurilor se izoleaza stafilococul. De
asemenea toxiinfectiile stafilococice constituie o entitate clinica etiologica cu caracteristici proprii.
Diagnosticul se face numai prin metode directe (diagnostic bacteorologic).
1. Produsul patologic se recolteaza in functie de localizare si aspect clinic.
2. Examenul microscopic direct. In cazul unui puroi stafilococic se vad coci gram pozitivi
(colorati violet), asezati in ciorchine, mai rar in diplo si izolat.
3. Izolarea agentului patogen se bazeaza pe capacitatea germenului de a creste pe medii
simple si pe medii hiperclorurate, ca geloza sange si medii Chapman.
4. Identificarea care se bazeaza pe:
a) Proprieteti morfo-tinctoriale: stafilococii sunt coci sferici, gram pozitivi, care se aseaza in
gramezi (ciorchine), dar pot fi observati in diplo, lanturi scurte sau izolat.
b) Proprietati de cultura. Stafilococul creste pe medii simple fiind aerob-anaerob facultativ. Pe
mediile lichide- apa peptonata, bulion, tulbura uniform mediul. Pe mediile solide creste sub formade
colonii „S” destul de mari, rotunde, cu margini regulate, bombate. culturile de stafilococ au proprietatea
ca in aerobioza sa se pigmenteze (pigmenti care nu difuza in mediu). In raport cu pigmentul se pot
intalni:
- stafilococi cu pigment auriu
- stafilococi cu pigment alb
- stafilococi cu pigment citrin
13
Stafilococul produce mai multe tipuri de hemoliza dintre care mai importante sunt:
- alfa-hemoliza care apare dupa o incubare la 37° C (hemoliza de tip cald) ca un halou
clar de liza completa, cu marginile nebuloase in jurul coloniei.
- beta-hemoliza care apare dupa o incubare la 37° C ca o hemoliza incompleta, care se
intensifica la 4° C (hemoliza de tip cald-rece).
c) Proprietati biochimice: prezenta catalazei(efervescentei) este caracteristica pentru familia
Micrococcacee.
d) Caractersitici de patogenitate.
Teste de patogenitate in vitro
• Coagulaza este considerata din unct de vedere al diagnosticului de laborator, prin
constanta sa, proprietatea cea mai utila de apreciat a patogenitatii unei tulpini de
stafilococ.
Teste de patogenitate in vivo tin de proprietatea stafilococului patogen de a produce exotoxine.
• Activitatea dermonecrotina
• Exotoxina exfoliativa
• Enterotoxina este o enterotoxina termorezistenta produsa de tulpinile de stafilococ
patogen, fiind responsabila de producerea toxiinfectiilor alimentare stafilococice. Prezenta
ei se evidentiaza prin testul Dolman, inoculand filtratul culturii, fiert 20 min,
intraperitoneal la pisoi tineri. dupa 10-60 minute, animalul devine agitat, prezinta sialoree,
caontractari ale musculaturii abdominale, varsaturi in jet, incoerabile si diaree. Dupa
aproximativ o ora animalul revine la starea normala.
Deoarece stafilococul este un germen cu raspandire ubiquitara, pentru a putea fi incriminat ca
agent etiologic intr-o infectie, tulpinei izolate i se determina proprietatile de patogenitate: pigmentarea,
hemoliza, coagulaza.
Identificarea tulpinei izolate se completeaza cu: determinarea sensibilitatii la antibiotice.

_DIAGNOSTICUL INFECTIILOR PNEUMOCOCICE. PNEUMONIA FRANCA


LOBARA_
_STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE_

Pneumococii sunt o specie a genului Streptococcus: S. pneumoniae. Sunt coci gram pozitivi, cu
forma alungita ca o flacara de lumanare sau varf de lance, asezati in diplo, capsulati. Se gasesc frecvent
ca si comensali in microbiocenoza buco-faringiana. In conditii de scadere a rezistentei organismului pot
provoca mai multe tipuri de infectie. Entitatea clinica caracteristica o constituie pneumonia franca
lobara.

Diagnosticul etiologic al pneumoniei se bazeaza pe:


A. Metodele de diagnostic direct bacteriologic:
1. Recoltarea materialului patologic. Pentru diagnosticul pneumoniei si bronhopneumoniei se
recolteaza sputa. In celelalte infectii produsul patologic se recolteaza in raport cu forma clinica.
2. Examenul microscopic direct. Frotiul efectuat din sputa si colorat gram, ecidentiaza
diplococi capsulati cu morfologia caracteristica.
3. Izolarea se face prin insamantarea pe medii cu proteine native (geloza-sange, geloza-ser,
geloza-ascita) si mai ales pe geloza sange socolatie, cu incubare in atmosfera 10% de CO2 . Pe aceste
medii pneumococul se dezvolta formand colonii mici, cu aspect inconjurat pe geloza sange de o zona
verzuie (alfa hemoliza) iar pe geloza socolatie de o zona galben verzuie.
Cele mai bune rezultate se obtin insa prin inocularea produsului patologic subcutanat sau
intraperitoneal la soarecele alb. Daca este prezent un pneumococ virulent, in 24-48 ore soarecele moare
prin septicemie.

14
4. Identificarea pneumococului:
a) Proprietati morfotinctoriale
Sunt coci gram pozitivi, alungiti, in forma de flacara de lumanare sau varf de lance,
asezati in diplo, cu capsula.
b) Propritati de cultura
Pneumococul nu creste pe medii simple. In bulion-ser, bulion- glucosat, pneumococul se
dezvolta tulburand discret mediul, cu formareauniui depozit fin. Pe geloza-sange formeaza colonii
mici, plate, caracteristice, inconjurate de o zona verzuie (alfa hemoliza)
c) Proprietati biochimice
Sunt importante pentru diferentierea pneumococului de alti streptococi alfa hemolitici.
- un test valoros de identificare a pneumococilor, il constituie sensibilitatea lui la
optochin: cultura este inhibata in dezvoltare, in jurul rondelelor care sunt impregnate cu optochin.
d) Proprietati antigenice
Toti pneumococii au in structura lor antigenica un carbohidrat C comun. Pentru
identificare este important antigenul polizaharidic din capsula care este caracteristic de tip, permitand
impartirea pneumococilor in aproximativ 80 tipuri. Apartenenta tulpinilor cercetate la unul din aceste
tipuri se stabileste prin testul de umflare a capsulei al lui Neufeld.

_DIAGNOSTICUL INFECTIILOR PRODUSE DE BACTERIILE ANAEROBE.


GENUL_ _CLOSTRIDIUM. ANAEROBI NESPORULATI_

Se disting de ceilalti germeni prin incapacitatea lor de a se dezvolta in prezenta oxigenului


atmosferic. De asemenea necesita un potential de oxido-reducere scazut, necesitand medii speciale si
tehnici adecvate de cultivare.
Se impart in 2 grupe mari:
 Anaerobi sporulati (genul Clostridium);
 Anaerobi nesporulati (o multitudine de germeni) prezenti pe mucoasa si in intestinul
omului, mai rar intalniti in patologia umana cu patogeni oportunisti.

Recoltarea produselor patologice:


- lichidele se recolteaza in seringa, serul este expulzat si acul intepat intr-un dop de cauciuc
sterilsi transportat ca atare.
- sange → cel mai bine recoltat in vase cu mediu sub vacuum
- tampoane → trebuie sa fie ume…… inaintea recoltarii, daca e posibil mentinute in
containere fara oxigen, transportate rapid fara sa se miste, fara sa fie racite.

Cultivarea anaerobilor:
1. Metode fizice:
- fierberea mediilor lichide 10-15 min, urmata de racire, inaintea insamantarii lor;
2. Metode chimice:
- utilizarea unor amestecuri care absorb oxigenul (pirogalol, hidroxid de K). Tehnica Ott: intre
placa cu mediu si capacul sau se plaseaza un inel dublu impregnat cu amestec absorbant. Dupa
insamantarea mediului se inchide placa ermetic;
- folosirea unor substante care reduc potentialul oxido-reducator: glucoza, acid ascorbic,
glutation, tiogicolat de Na, cisteina etc.
- introducerea in mediu a catalazei care descompune peroxizii;
3. Metode biologice:
- cultivarea in prezenta unui germen aerob (B. subtilis, Serratia)

15
Mentinerea anaerobiozei se realizeaza prin:
- pastrarea mediilor de cultura in containere cu anaerobioza;
- acoperirea mediilor lichide cu ulei de parafina sau parafina topita;
- reducerea suprafetei de contact cu aerul la minimum prin utilizarea tuburilor inalte umplute
cu mediu;

Medii de cultura
In mod obisnuit se utilizeaza:
- Bulion cu acid thioglicolic;
- Geloza sange in placi Petri, tehnica Ott;
- Mediile Nagler si Willis-Hobbe;
- GENUL CLOSTRIDIUM -

Genul clostridium a primit denumirea dupa forma determinata de spor care avand diametrul mai
mare decat diametrul transversal al celulei, o deformeaza. Larg raspanditi in special in sol, (germeni
telurici) se pot gasi in intestinul omului si al animalelor, in fecale, balegar, praf, apa, vegetale, lapte etc
Caractere generale:
- sunt bacili mari;
- cu spori centrali, terminali sau subterminali, mai largi decat formele vegetative;
- sunt ciliati peritrichi (mobili);
- nu au capsula, cu exceptia B. perfringens care este aciliat si capsulat;
- sunt gram pozitivi;
Speciile cu importanta medicala:
 Cl. Tetani
 Cl. Botulinum
 Germenii gangrenei gazoase

Toxiinfectia tetanica

Tetanosul este o toxiinfectie, caracterizata prin simptome nervoase cu contractii tonico-clonice


si paralizii, data de toxina bacilului tetanic care difuzeaza in organism si actioneaza asupra sistemului
nervos. Infectia apare in urma unor plagi (adanci si zdrobite sau numai in urma unei intepaturi)
murdarite de impuritati.
Diagnosticul direct
In tetanos se folosesc numai metodele de diagnostic direct. Deoarece acesta este dificil de
realizat, diagnosticul in tetanos se bazeaza in mare masura pe observatia clinica cu simptomatologia
specifica. Administrarea terapeutica a serului antitetanic se face de aceea pe baza suspiciunii clinice,
fara a astepta rezultatul examenului de laborator. Trebuie sa retina atentia profilaxia plagilor tetanigene.
Recoltarea produselor patologice
Se recolteaza urmatoarele produse patologice: puroi si tesuturi din plaga, catgut, pansamente,
medicamente etc.
Examenul microscopic direct
Adesea nu da rezultate pentru ca b. tetanici pot fi putini la numar, sau se pot confunda usor cu
alti germeni asemanatori (tetanomorfi).
Izolarea se face pe mediile speciale pentru anaerob.
Identificarea
• Caractere morfo-tinctoriale: pe frotiul colorat Gram, se vad bacili lungi si subtiri, drepti, cu
capatul taiat drept, unii avand un spor terminal, mare, rotund, care-i dau un aspect de bat de tobosar sau
ac cu gamalie.

16
• Caractere de cultura: B. tetanic se dezvolta pe medii simple in anaerobioza stricta. Bulionul
este tulburat slab, omogen, cu limpezire ulterioara datorita sedimentarii sporilor. Degaja un miros de
corn ars. Dezvoltarea pe suprafata: pe geloza apar colonii rotunde, cenusii-galbui, marginile rau
delimitate. Dezvoltarea in profunzime (mediul Veillon): formele ciliate dau colonii pufoase, difuze (D),
cele neciliate colonii lenticulare (L). Produc gaze abundente, coloana mediului este rupta si dislocata in
2-3 locuri.
• Caractere biochimice: nu fermenteaza nici un zahar, slab proteolitic.
• Caractere antigenice: deoarece toate tipurile produc aceeasi toxina, determinarea tipului
antigenic nu este folosita in practica.
• Caractere de patogenitate: se inoculeaza o suspensie din produsul patologic sau cultura in
bulion, subcutanat (la baza cozii) la soarecele alb sau cobai.

Toxiinfectia botulinica

Botulismul este o toxiinfectie alimentara foarte grava, produsa de botulinum, cu mortalitate


ridicata, caracterizata prin fenomene gastro-intestinale si nervoase. Botulismul apare in urma ingerarii
unor alimente conservate necorespunzator, de origine animala (carne, sunca, mezeluri, peste) sau
vegetala (diverse conserve) in care s-a dezvoltat bacilul botulinic si a eliberat toxina sa.
Diagnosticul de botulism este direct si necesita maxima urgenta.
Recoltarea produselor patologice. Se recolteaza urmatoarele produse patologice: alimentul
incriminat (obligator), varsaturi (mai rar), fecale, urina, organe de necropsie, sange (prezenta toxinei).
Examenul microscopic direct: lipsit de importanta practica.
Izolarea se face pe medii pentru anaerobi.
Identificarea:
- Caractere morfologice: bacili sporulati, cu numerosi spori liberi, au 4-8 cili peritrichi, nu au
capsula, sunt gram pozitivi.
- Caractere de cultura: dezvoltare optima la 25 ° C. In bulion dezvoltarea este abundenta, cu
un depozit granular format din spori, cultura are miros ranced. Dezvoltarea in suprafata:
colonii mari, neregulate, cu centru opac, proeminent, mergini filamentoase, cu tendinta de a
se intinde. Dezvoltarea in profunzime: in geloza Veillon dau colonii sferice sau biconvexe,
cu centrul mai opac, degajarea de gaze produce rupturi multiple in coloana mediului.
- Caractere biochimice: fermenteaza o serie de zaharuri, produce H2S, unele tulpini au
caractere proteolitice.
- Caractere antigenice: sunt 6 tipuri antigenice, dar numai tipurile A,B,E si F sunt patogene
pentru om, C si D numai pentru animale. Nu dau imunitate incrucisata, fiecare tip
producand o toxina proprie. De aceea pentru administrarea serului antibotulinic
corespunzator, trebuie identificat tipul.
Determinarea tipului se face prin reactia de neutralizare in vivo.
- Caractere de patogenitate: toxina botulinica omoara animalul sensibil cu simptome
caracteristice. La soarece produce paralizia trenului posterior, la cobai paralizia muschilor
abdominali, la pisica (animalul cel mai sensibil) paralizia muschilor acomodarii si diaree.

Germenii gangrenei gazoase

Gangrena gazoasa este o toxiinfectie grava, care apare ca o complicatie a plagilor (de razboi sau
accidentale) prin murdarirea lor cu pamant si corpi straini, ca si prin zdrobirea tesuturilor in care se
creeaza conditii se anaerobioza prin devitalizare si formare de cheaguri de sange. Este cauzata de
actiunea combinata a unei asociatii de germeni anaerobi. Gangrena gazoasa este o infectie obligatoriu
polimicrobiana.
Speciile anaerobe care participa mai frecvent sunt: C1.perfrigena, C1.novy(oedematiens),
C1.septicum.
17
C1. perfrigens nu lipseste niciodata, celelalte specii participa inegal. In multe cazuri in plaga se
dezvolta si germeni aerobi, stafiloccoci, streptococi, E.coli.
Infectia se caracterizeaza printr-o culoare livida a tesuturilor, edem care creste rapid, infiltrare
cu gaze sau impastrare dura, miros putred, necroza.
Diagnosticul este direct si de urgenta. Tehnica anaeroba fiind prea laborioasa si de durata, nu se
asteapta confirmarea diagnosticului, ci se trece la tratamentul cu antibiotice si ser antigangrenos
polivalent pe baza suspiciunii clinice.
Recoltarea produselor patologice.
Se recolteaza urmatoarele produse patologice: serozitatea din profunzimea plagii, fragmente de
tesuturi, sange, urina, fecale, fragmente de organe.
De regula se recolteaza produs din plaga cu 2 tampoane: unul pentru frotiu, al doilea pentru
culturi.
Examenul microscopic direct
Este obligatoriu si de mare valoare diagnostica. Frotiul colorat Gram arata un polimorfism
accentuat al formelor bacteriene prezente: bacili mari si grosi, cu capete rotunjite sau net taiate, de
lungimi si forme diferite, asezate izolat, in diplo, in lanturi sau gramajoare, cu spori centrali (barcuta,
fus) subterminali (racheta de tenis) sau fara spori.
Identificarea
Foarte dificila si se bazeaza atat pe caracterele morfologice si de cultura cat mai ales pe cele
biochimice si de patogenitate
- Caractere morfologice: se studiaza prin coloratia Gram si Moeller.
- Caractere de cultura: tulburarea initiala e urmata de limpezirea mediilor lichide, prin
sedimentarea sporilor. Dezvoltarea in suprafata: apare sub forma de colonii cu aspecte
diverse. Dezvoltarea in profunzime: germenii mobili dau colonii pufoase, arborescente, cu
tendinta de confluere, germenii imobili dau colonii mici, lanticulare, biconvexe.
- Caractere biochimice: servesc ca si criterii de diferentiere.
- Caractere antigenice: au antigene H si O. Germenii participanti la infectie pot fi rapid
identificati direct din produsul patologic, prin aglutinare pe lama, punand in contact cate o
picatura din serozitate cu serurile monovalente. Picaturile unde apare aglutinarea indica
prezenta speciilor respective.
- Caractere de patogenitate: sunt patogene pentru soarece cobai si iepure.
- Antibiograma: se executa in conditii speciale de anaerobioza.

_DIAGNOSTICUL INFECTIILOR DETERMINATE DE BACTERII DIN FAMILIA_


_ENTEROBACTERIACEAE_

Def: Enterobacteriile formeaza o familie larga de bacterii cu sediul in intestinul animalelor si


omului, patogene sau comensale, unele frecvent contaminate in elemente de mediu. Sunt bacili Gram
negativi, mobili sau imobili, care se cultiva cu usurinta pe mediile de cultura si care au un metabolism
foarte activ.
Morfo-tinctorial enterobacteriile au caractere comune: bacili de 2-4/0.3-0.6 um, mobili datorita
cililor peritrichi, sau imobili, Gram negativi.
Proprietati de cultura: se dezvolta pe mediile uzuale simple, de cultura. Sunt anaerobe si
anaerob facultative: pe mediile lichide se dezvolta tulburand uniform mediul sub forma de valuri
matasoase. Pe mediile solide cresc sub forma de colonii rotunde translucide cu diametrul de 2-3 mm, cu
marginile regulate, suprafata neteda-clonii de forma S. Prin cultivare repetata apar variante de faza R.
Pe mediile solide pentru intestinale - ADCL
- Leiffson
- Istrate Meitert

18
Pentru etichetarea unei tulpini ca enterobacterie se folosesc urmatoarele teste biochimice:
- degradarea oxidativa si fermentativa a glucozei;
- citocromoxidaza;
- testul indol evidentiaza prezenta triptofanazei;
- intrebuintarea citratului: dezvoltarea pe mediul Simmons.
In general Enteriobacteriile au in structura lor un: antigen somatic (antigenul O); antigen de
invelis (antigenul K); antigen flagelar (antigenul H). Se evidentiaza prin rr. Ap/Ae → rr. de aglutinare.

_DIAGNOSTICUL INFECTIILOR DATE DE SALMONELLE_


_SALMONELOZE_

Salmonella, gen care face parte din tribul Salmonellae, cuprinde bacterii prezente la om,
animale si intalnite in mediul inconjurator. Cele peste 1200 specii ale genului Salmonella sunt foarte
larg raspandite in lumea animala. Exista reprezentanti adaptati strict la om (S. typhi, S. paretyphi A),
altii intalniti la animale cu un spectru restrans de gazda (S. pullorum, S. gallinarum) si in sfarsit
Salmonelle cu un spectru larg de gazda fiind prezente la multe specii animale(S. typhimurium, S.
enteritidis). Multe din acestea pot da infectii si la om.
Salmonellele pot produce la om cateva tipuri de infectii, etichetate global cu termenul de
salmoneloze:
• Febrele tifoide si paratifoide.Febra tifoida este determinata de S.typhi si S.paratyphi B
• Toxiinfectia alimentara. Salmonelle se situeaza pe primul loc ca agenti etiologici ai acestor
imbolnaviri, mai frecvent izolandu-se S. typhimurium, S. enteritidis, S. paratyphi B, S. panama. In
prezent la noi in tara au fost izolate din aceste imbolnaviri peste 100 specii.
• Enterite, mai ales la copii, in care intervin aceleasi tipuri ca si in toxiinfectiile alimentare.
• Stari septico-piemice, cauzate cel mai frecvent de salmonelle din gripa C (S. paratyphi C, S.
cholarae suis, etc).
Diagnosticul de laborator al febrelor tifo-paratifoide poate fi ales ca model general, pe acesta
adaptandu-se si diagnosticul celorlalte imbolnaviri date de Salmonelle.
Diagnosticul bacteriologic direct
Recoltarea produselor patologice: in dependenta de etapele de evolutie a febrelor tifo-
paratifoide, agentul etiologic poate fi izolat prin:
→ Hemocultura: in prima saptamana de boala germenul se izoleaza mai frecvent din sange
(90% din hemoculturi dau rezultate pozitive) in saptamana a doua si a treia frecventa rezultatelor
pozitive scade mult.
→ Urocultura: in faza septicemica germenii se elimina prin urina de aceea in prima saptamana
de boala se recolteaza si urina.
→ Coprocultura: deoarece incepand din a doua saptamana b. tific si b. paratific se elimina prin
fecale, din acest moment coprocultura da cel mai frecvent rezultate pozitive. Materiile fecale se
recolteaza din scaun de emisie spontana si se introduc pentru transport in mediul Cary-Blair.
→ Bilicultura: pentru depistarea purtatorilor.
Pentru diagnosticul toxiinfectiilor alimentare se recolteaza fecale (coprocultura), varsaturi,
spalaturi gastrice si obligatoriu probe din alimentul sau alimentele care se banuieste ca au declansat
infectia.
In diagnosticul enteritei cu salmonella se recolteaza fecale, iar in cazuri septico-piemice se
procedeaza ca in febrele para-tifoide.
Examenul direct microscopic din produsul patologic nu da informatii utile diagnosticului
(sunt bacili gram negativi toti).
Izolarea se realizeaza astfel (insamantare pe medii pt intestinal):
- Hemocultura;
- Coprocultura;

19
- Urocultura;
- Bilicultura;
Identificarea se realizeaza prin cercetarea:
• Proprietatilor morfo-tinctoriale: bacili gram negativi mobili, cu cili paritrichi.
• Proprietatilor de cultura: se dezvolta pe mediile uzuale simple, de cultura. Sunt anaerobe si
anaerob facultative: pe mediile lichide se dezvolta tulburand uniform mediul sub forma de valuri
matasoase. Pe mediile solide cresc sub forma de colonii rotunde translucide cu diametrul de 2-3 mm, cu
marginile regulate, suprafata neteda-clonii de forma S. Prin cultivare repetata apar variante de faza R.
Pe mediile solide pentru intestinale - ADCL
- Leiffson
- Istrate Meitert
• Proprietatilor biochimice: indiferent de metoda de diagnostic folosita incadrarea culturii
izolate in genul Salmonella se face pe baza proprietatilor biochimice
• Proprietatilor antigenice: apartenenta unei tulpini izolate si incadrate in genul Salmonella la
una dintre cele 1200 specii de Salmonella se realizeaza prin studiul structurii antigenice.
Genul Salmonella cuprinzand germeni mobili, ciliati, poseda cele trei categorii de antigene:
cunoscute la Enteriobacterii (O,H,K)(vi), care stau la baza schemei antigenice de identificare
Kauffmann-White.
Identificarea serologica a unei Salmonelle izolate consta in determinarea formulei sale
antigenice prin reactii de aglutinare cu seruri imune standard (contin anticorpi cunoscuti).
Diagnosticul indirect serologic
Reactia Widal calitativa urmareste stabilirea cresterii titrului de anticorpi.
Reactia Widal evidentiaza prezenta anticorpilor fata de S. typhi, S. paratyphi A si S. paratyphi
B, separat pentru antigenul H si O.

_DIAGNOSTICUL DIZENTERIEI BACILARE_


_(Genul Shigella)_

Genul Shigella reuneste bacili cu proprietati comune care produc dizenteria bacilara,
manifestata prin febra, colici abdominale, scaune frecvente diareice, sanghinolente, mucoase, muco-
apoase, cu tenesme. Infectia are tendinta de a se croniciza.
In genul Shigella pe baza structurii antigenice si a unor proprietati biochimice au fost conturate
urmatoarele specii:
 Shigella dysenteriae
 Shigella flexneri
 Shigella boydi
 Shigella sonne
Diagnosticul bacteriologic direct (coprocultura)
Recoltarea produselor patologice: se recolteaza materii fecale, fie din scaune de emisie spontana
mai ales in caz de scaune muco-sanghinolente (se aleg portiuni muco-sanghinolente sau mucoase) fie
se recolteaza cu sonda Nelaton sau tampon rectal (mai ales pentru depistarea purtatorilor de b.
dizenteric). Fecalele trebuie insamantate pe medii de cultura in cel mult 2 ore de la recoltare. Daca
aceasta nu se poate realiza, produsul patologic trebuie recoltat in mediul Cary-Blair (mediu conservant)
Examenul microscopic direct: da informatii mai mult orientative, in preparatele si frotiurile
examinate evidentiindu-se germeni mobili, gram negativi si eventual hematii( in primele zile de boala)
sau leucocite (mai tardiv).
Izolarea se face prin insamantarea fecalelor pe medii selective: mediul Leifsen, Shigella,
Salmonella, Istrate-Maitert, pe care dau colonii lactozo-negative. Din colonii lactozo-negative se
izoleaza in cultura pura.

20
Identificarea
• Proprietati morfo-tinctoriale: bacili gram negativi, imobili, fara capsula.
• Proprietati de cultura: se dezvolta pe mediile uzuale simple, de cultura. Sunt anaerobe si
anaerob facultative: pe mediile lichide se dezvolta tulburand uniform mediul sub forma de valuri
matasoase. Pe mediile solide cresc sub forma de colonii rotunde translucide cu diametrul de 2-3 mm, cu
marginile regulate, suprafata neteda-clonii de forma S. Prin cultivare repetata apar variante de faza R.
Pe mediile solide pentru intestinale - ADCL
- Leiffson
- Istrate Meitert
• Proprietati biochimice: sunt folosite pentru incadrarea in genul Shigella.
• Structura antigenica: pe baza proprietatilor antigenice se realizeaza identificarea unei tulpini
ca apartinand genului Shigella. Incadrarea in grup si apartenenta la unul din tipurile grupului se face
prin cercetarea structurii antigenice, pe baza antigenului O somatic prin rr. de aglutinare pe lama.

_DIAGNOSTICUL INFECTIILOR PRODUSE DE ENTEROBACTERII_


_COMENSALE_

Diagnosticul enteritei produsa de E.coli si alte bacterii comensale.


Cu toate ca E. coli este un constituent nelipsit al microbiocenozei de tip colon, populatii din
aceasta specie, echipate cu factori de patogenitate particulari, au rol etiologic important in etiologia
enteritei (boli diareice) mai ales la copilul mic.
Se pot contura trei tipuri distincte de populatii:
1. Tulpini de E.coli si alte enterobacterii comensale cu propietati invazive.
2. Tulpini de E.coli si alte tulpini comensale producatoare de enterotoxina.
3. Tulpini de E.coli reprezentand diferite tipuri antigenice denumite si tipuri enteropatogene.
Recoltarea produsului patologic: scaun de emisie spontana sau suc jejunal prin sonda speciala.
Examenul microscopic direct din produsul patologic este in general lipsit de semnificatie(bacili
gram negativi).
Izolarea se face pe medii pentru intestinal (ADCL, Istrate-Meitert).
Incadrarea in trib si gen prin utilizarea testelor biochimice cunoscute.
Structura antigenica: E.coli poseda antigene O, K si H.
Determinarea tipului antigenic se face prin reactii de aglutinare cu se polivalent de E.coli, iar
in caz d reactie pozitiva se continua identificarea prin reactii de aglutinare cu seruri monovalente.

_DIAGNOSTICUL INFECTIILOR PRODUSE DE BACTERII DIN GENUL_


_HAEMOPHILUS_

Genul Haemophilus cuprinde bacterii care au ca proprietate comuna dezvoltarea numai pe


medii cu sange. In realitate aceste bacterii necesita pentru dezvoltarea lor doi (unele specii numai unul)
din factorii de crestere X (hemina) si V (NAD sau NADP). Sunt aerob-anaerob facultativi. Sunt
cocobacili gram negativi, cu polimorfism accentuat.
Multe din speciile din acest gen se intalnesc ca si comensale ale cavitatii buco-faringiene. Unele
din acestea sunt nepatogene si fac in mod obisnuit parte din microbiocenoza placii dentare. Speciile
importante pentru interventia lor in patologia umana sunt H. influenzae, H. parainfluenzae (care se
gaseste destul de frecvent si ca bacterii comensale a microbiocenozei faringiene), H. ducreyi este
agentul etiologic al unei boli venerice – sancrul moale.
H. influenzae determina frecvent pneumonii si bronhopneumonii post-gripale. In lumina
cunostintelor actuale H. influenzae tip antigenic h este agent important al meningitei bacteriene, in

21
special la copii, al laringo-traheitei obstructive si al complicatiilor ce survin dupa infectiile virale ale
cailor respiratorii.
Recoltarea produselor patologice: l.c.r., sputa, sange.
Examenul microscopic direct aduce informatii foarte pretioase pentru diagnosticul de
meningita cu H. influenzae, deoarece in frotiurile efectuate din sedimentul l.c.r.-ului si colorate Gram
se evidentiaza cocobacilii gram negativi, incapsulati.
Izolarea se face pe geloza sange, geloza şocolatie sau pe mediul Levinthal cu lizat de hematii.
Chiar si pe aceste medii H. influenzae se dezvolta dificil, iar cea mai buna metoda este ca dupa
insamantarea produsului patologic sa se faca o insamantare in spoturi de stafilococ. Datorita faptului ca
stafilococul elibereaza factorul V si astfel dezvoltarea coloniilor de H. influenzae va fi favorizata in
jurul spoturilor de stafilococ (fenomenul de satelitism).
Identificarea
• Proprietati morfo-tinctoriale: cocobacili gram negativi cu polimorfism accentuat.
• Proprietati de cultura: pe medii solide → colonii mici asemanate cu picaturile de roua. Foarte
important pentru identificare este fenomenul de satelitism.
• Proprietati biochimice: la diferentierea speciilor de Haemophilus si a biotipurilor (I-VI) din
specia H. influenzae.
• Proprietati antigenice: studiul propr antigenice este folosit mai ales pentru H. influenzae, care
poseda un antigen capsular polizaharidic. Acest antigen a permis identificarea a 6 tipuri antigenice
notate cu litere mici ale alfabetului, de la a la f. Determinarea tipului antigenic se face prin aglutinare
pe lama sau fenomenul de umflare a capsulei cu seruri specifice de tip.

22