3.

Sterilizarea

Prin sterilizare se înţelege distrugerea sau îndepărtarea

microorganismelor dintr-un spaţiu sau de pe o suprafaţă dată. Metodele
folosite în acest scop sunt numeroase şi utilizarea lor depinde de natura
mediului pe care îl sterilizăm.

Sterilizarea poate fi realizată prin:

 agenţi fizici (căldura, filtrarea, centrifugarea, radiaţiile ultraviolete,
ultrasunetele, etc);
 agenţi chimici (substanţe cu acţiune dezinfectantă sau antiseptică).

3.1. Sterilizarea prin agenţi fizici

În acest scop se folosesc mai multe metode de sterilizare cum sunt:

căldura, filtrarea, centrifugarea, radiaţiile ultraviolete şi ultrasunetele.

3.1.1. Sterilizarea prin căldură

Este metoda cel mai des utilizată în microbiologie, fie sub formă de
căldură uscată sau de căldură umedă. Acţiunea distrugătoare a căldurii
asupra microbilor se exercită prin coagularea proteinelor care intră în
constituţia acestora, sau prin carbonizare. Pentru sterilizare se poate utiliza
căldură uscată sau căldură umedă.

I. Sterilizarea prin căldură uscată se poate realiza în mai multe moduri:

1. Încălzirea la roşu se foloseşte pentru sterilizarea firului ansei de

însămânţare şi a spatulei înainte şi după întrebuinţare. Metoda constă în a
menţine obiectul de sterilizat în flacăra unui bec de gaz sau a unei lămpi de
alcool până la înroşire (Fig. 11). Înainte de a le pune în contact cu produsul
de însămânţat instrumentele respective se lasă să se răcească pentru a nu
distruge microorganismele prezente.

9
 2. Flambarea constă în
trecerea rapidă a obiectului de
sterilizat de câteva ori printr-o
flacără; în acest mod substanţele
organice şi microorganismele
aflate eventual pe respectivul
obiect sunt carbonizate.
Flambarea serveşte la sterilizarea
pipetelor în momentul
întrebuinţării, a gâtului
flacoanelor şi al eprubetelor.
Instrumentele de metal (ex:
bisturie, foarfece, pense) nu se Fig. 11 - Sterilizarea prin încălzire la roşu.
flambează deoarece se
deteriorează.
3. Sterilizarea prin aer cald se bazează pe carbonizarea materiei vii cu
ajutorul temperaturii înalte. În etuvă (Fig. 12), aerul încălzit la 180˚C şi
menţinut timp de 60 minute distruge atât formele vegetative cât şi sporii.
Această metodă se foloseşte pentru sterilizarea obiectelor de sticlă
(baloane, eprubete, tuburi de sticlă, plăci Petri, pâlnii, fiole etc.), din
porţelan (capsule, mojare) şi a instrumentelor chirurgicale (foarfece,
bisturie, pense).
Pentru a fi menţinută în
stare sterilă şi curată, sticlăria ce
urmează a fi supusă sterilizării se
pregăteşte în prealabil, după ce a
fost spălată, curăţată şi uscată.
Astfel, baloanele,
eprubetele şi pipetele, vor fi
acoperite cu dopuri de vată, iar
plăcile Petri, pipetele gradate,
mojarele, capsulele etc. vor fi
ambalate în hârtie pergament.
Obiectele de sterilizat se introduc
Fig. 12- Etuvă termoreglabilă.
în etuvă care se reglează pentru
10
temperatura de 180˚C şi se aşează în interiorul etuvei pe rafturi; eventual
eprubetele se pot introduce în coşuri de sârmă special confecţionate.
Menţinerea temperaturii la 180˚C trebuie să dureze o oră, după care se
închide sursa de căldură şi se aşteaptă ca temperatura din interiorul
aparatului să scadă sub 100˚C înainte de a-l deschide. Astfel se evită ca
obiectele care vin în contact cu aerul rece din încăpere să se spargă. Dacă
temperatura în etuvă depăşeşte 180˚C dopurile de vată şi hârtia de ambalaj
devin brune, sfărâmicioase şi nu mai asigură o protecţie suficientă împotriva
unei eventuale reinfectări.
Pentru a ne asigura că s-a realizat temperatura de 180˚C se introduce
în etuvă odată cu sticlăria de sterilizat puţină zaharoză care se caramelizează
la 170˚C.
II. Sterilizarea prin căldură umedă este mai des folosită în
microbiologie, deoarece se realizează distrugerea eficace a germenilor la o
temperatură mult mai joasă, căldura umedă având putere de pătrundere mai
mare.
Sterilizarea prin căldură umedă se poate realiza în mai multe feluri:
prin fierbere, prin vapori produşi continuu, prin vapori sub presiune şi la
temperaturi sub 100˚C (pasteurizarea şi tindalizarea).
1. Fierberea este folosită curent la sterilizarea unor instrumente
metalice, a seringilor cu armătură metalică (acestea trebuiesc montate
înainte de introducerea în fierbător) etc. Obiectele se introduc în
sterilizatoare electrice timp de 30 minute. Se foloseşte apa distilată pentru a
se evita depunerea sărurilor pe obiectele de sterilizat, iar pentru a se ridica
punctul de fierbere în apa distilată de adaugă borax.
Prin această metodă nu sunt distruse unele forme sporulate care rezistă
până la 120˚C. Din această cauză obiectele sterilizate prin fierbere se
folosesc în următoarele două ore şi nu se menţin un timp mai îndelungat.
2. Pasteurizarea se realizează prin încălzirea pe baia de apă a
substanţelor repartizate în diverse flacoane la temperatura de 55-95˚C,
urmată de răcirea bruscă şi menţinerea la +4˚C. Încălzirea are ca scop
distrugerea formelor vegetative, iar răcirea bruscă şi menţinerea la
temperatură scăzută împiedică germinarea formelor de rezistenţă.
Această metodă se aplică lichidelor supuse unei alterări rapide, în
scopul de a menţine valoarea factorilor activi.
11
 3. Tindalizarea este o metodă de
sterilizare fracţionată sau discontinuă,
prin care se realizează o sterilizare
completă, distrugându-se atât formele
vegetative cât şi sporii. Metoda
serveşte la sterilizarea substanţelor
care se degradează cu uşurinţă la
temperaturi mai ridicate, cum sunt
mediile ce conţin glucide, serul
sanguin etc.
Metoda constă în încălzirea
substanţelor ce urmează a fi
Fig. 13- Baie de apă. sterilizate, câte o oră pe zi, la
temperaturi între 56-65˚C într-o baie de apă (Fig. 13), timp de trei zile
succesiv. Explicaţia eficienţei metodei este aceea că treptat rezistenţa
sporilor sub influenţa căldurii cedează sau că formele vegetative sunt
distruse după ce sporii au germinat în intervalul celor trei zile.
4. Sterilizarea prin vapori produşi continuu la 100˚C se realizează în
autoclav (Fig. 14), lăsând robinetul de
evacuare a vaporilor deschis. Prin
această metodă se distrug numai
formele vegetative şi se foloseşte pentru
sterilizarea substanţelor ce se
degradează uşor, sub acţiunea căldurii.
5. Sterilizarea prin vapori de apă
sub presiune (autoclavarea) este metoda
cea mai utilizată şi mai eficace,
deoarece realizează o sterilizare
completă. Principiul metodei constă în
faptul că temperatura vaporilor de apă
într-un spaţiu închis creşte proporţional
cu presiunea la care aceştia sunt supuşi:
astfel la 1/2 atmosfere temperatura este
de 115˚C, la o atmosferă temperatura
Fig. 14- Autoclav.
creşte la 120˚C şi la 2 atmosfere se
12
realizează o temperatură de 134˚C.
Aparatul folosit pentru sterilizarea prin vapori sub presiune se
numeşte autoclav. El se compune dintr-un cazan cu pereţi groşi, rezistenţi la
presiunea de 3-4 atmosfere. La partea superioară este acoperit cu un capac
care se închide ermetic cu ajutorul unor şuruburi speciale (buloane) şi al
unei garnituri de cauciuc.
În capac sunt practicate orificii în care sunt montate următoarele
dispozitive: un manometru pentru indicarea presiunii de vapori în autoclav;
un robinet pentru evacuarea aerului şi a vaporilor; o supapă de siguranţă
care permite ieşirea vaporilor în cazul depăşirii presiunii prea mari, pentru a
evita pericolul de explozie al aparatului. Cazanul prezintă la partea
inferioară un orificiu prin care se face legătura cu un tub de nivel prin care
se controlează nivelul apei în autoclav şi un robinet de scurgere a apei.
În interiorul cazanului se află un grătar mobil care serveşte ca suport
pentru materialele de sterilizat.
Cazanul este susţinut de o îmbrăcăminte din tablă groasă care la partea
inferioară are o nişă unde se află sursa de căldură reprezentată printr-o
rezistenţă electrică sau un bec de gaz.

Modul de funcţionare a autoclavului

Mai întâi se introduce în cazan apa distilată necesară formării de

vapori, care se controlează cu ajutorul coloanei de nivel. Nivelul apei
trebuie să fie cu câţiva centimetri sub cel al suportului. Se aşează apoi
materialele de sterilizat fie direct pe suport sau introduse în prealabil în
coşuleţe de sârmă; se ia precauţia ca materialele să fie acoperite cu hârtie
pentru a nu se umecta dopurile de vată din cauza vaporilor.
Se închide după aceea capacul autoclavului cu ajutorul buloanelor,
care se strâng în sens diametral opus, două câte două. Robinetul de vapori
rămâne deschis până ce se evacuează aerul. Când aburul iese în jet continuu
înseamnă că aerul este complet evacuat, robinetul de vapori se închide
automat şi presiunea în cazan începe să crească treptat.
După ce s-a atins presiunea dorită care se poate citi pe manometru, se
menţine timp de 15-30 minute funcţie de programul de sterilizare ales.
Corelaţia între presiune şi temperatura vaporilor este dată în tabelul 1.
13
Capacul autoclavului nu se poate deschide decât după ce acul manometrului
a ajuns la 0.
În autoclav se sterilizează culturile care nu mai sunt necesare, pentru
ca vasele respective să nu rămână infectate.
De asemenea se sterilizează:
 sticlăria de laborator;
 obiectele de cauciuc;
 aparatele de filtrat din sticlă, porţelan sau metal;
 mediile de cultură, apa distilată şi unele soluţii.

Corelaţia între presiunea aburului şi temperatura ce se realizează în autoclav

Tabel 1
Presiunea Temperatura Presiunea Temperatura
(atm.) vaporilor (°C) (atm.) vaporilor (°C)
0,0 100,0 1,0 121,0
0,1 102,5 1,1 122,9
0,2 105,0 1,3 125,0
0,3 107,5 1,4 126,0
0,4 110,0 1,5 127,0
0,5 112,5 1,6 128,0
0,6 114,5 1,7 129,0
0,7 116,5 1,8 130,0
0,8 117,0 1,9 131,0
0,9 119,0 2,0 132,0

Pentru controlul bunei funcţionări a autoclavului se întrebuinţează

unele metode de testare.
 testele chimice utilizează substanţe cu punct de topire constant care se
introduc în tuburi de sticlă închise la extremităţi. Se utilizează substanţe cu
punct de topire cunoscut: floarea de sulf la 115˚C, benzonaftolul la 110˚C şi
acidul benzoic la 121˚C.
 unele teste biologice utilizează bacterii sporulate (Bacillus anthracis,
Clostridium botulinum) care după sterilizare se însămânţează pe medii de
cultură. Dacă sterilizarea a fost corect executată, germenii sunt distruşi şi nu
mai cresc pe mediile însămânţate.
14
 testele fizice utilizează termometre înregistratoare foarte exacte.

3.1.2. Sterilizarea prin filtrare

Filtrarea nu este un fenomen pur mecanic în care filtrul se comportă

ca o sită, ci la baza sa stă adsorbţia particulelor din lichidul de filtrat de către
pereţii capilarelor care reprezintă porii filtrelor. Adsorbţia este influenţată de
vâscozitatea, temperatura şi pH-ul soluţiilor, dar şi de încărcarea electrică a
particulelor şi a filtrului.
Acest procedeu se aplică pentru sterilizarea anumitor lichide care se
degradează uşor sub acţiunea temperaturilor ridicate (Fig. 15).
Filtrele folosite în microbiologie sunt de mai multe feluri, după natura
substanţei poroase din care sunt fabricate.
Filtrele Chamberland sunt din porţelan şi au forma unor lumânări
(bujii), închise la capătul inferior. La extremitatea liberă au o porţiune
impermeabilă din porţelan smălţuit sau sunt prevăzute cu o tetină, de
asemenea smălţuită.
Porii filtrelor au mărimi diferite şi se notează cu litera L, urmată de
cifre de la 1 la 7, filtrul L1 fiind cel mai grosier.
Filtrele Berkefeld sunt fabricate din pământ de infuzorii sau kiselgur.
După dimensiunea porilor sunt notate în felul următor: W = filtre cu pori
mici; V = filtre cu pori mari; N = filtre cu mărimea porilor intermediară
(normal).
Filtrele Seitz sunt constituite din plăci de azbest care formează
substanţa poroasă prin care se efectuează filtrarea; ele sunt de dimensiuni
diferite, notate după cum urmează: EK = cu dimensiuni care reţin bacteriile,
dar lasă să treacă virusurile; EK1 = intermediare şi EK2 = care reţin şi
virusurile mari.
Membrana de azbest este montată la fundul unei cupe de metal, în care
se introduce lichidul ce trebuie filtrat.
Membranele filtrante se folosesc în principal în virusologie şi pot fi
confecţionate din celuloză, gelatină, colodiu sau mase plastice speciale.

15
 Cilindru de sticlă

Clemă Membrană filtrantă

Pâlnie cu dop

Spre pompa de vid

Gâtul balonului

Fig. 15 - Sterilizarea prin filtrare.

Diferitele tipuri de filtre se montează în aparate speciale iar filtrarea se

face prin presiune pozitivă sau prin aspiraţia aerului cu o pompă de
bicicletă, în primul caz şi o pompă de vid în cel de al doilea. Operaţia de
filtrare se face după anumite reguli:
 înainte de filtrare se sterilizează filtrele în autoclav;
 filtrarea se face la o aspiraţie moderată şi la o durată medie de 15 minute;
 pentru a evita colmatarea filtrelor, lichidele vor fi diluate în soluţie cloro-
sodică izotomică şi filtrate pe hârtie de filtru;
 după întrebuinţare filtrele se sterilizează în autoclav şi apoi se spală
energic cu peria. Filtrele de azbest nu se regenerează.
 regenerarea se face prin ardere în cuptoare la 280˚C, sau prin menţinerea
câteva ore în soluţie de permanganat de potasiu 1% şi apoi în soluţie de
hiposulfit de sodiu 5%.

3.1.3. Sterilizarea prin centrifugare

Centrifugarea, se foloseşte pentru

sterilizarea unor lichide care nu suportă
acţiunea căldurii. În acest scop se folosesc
centrifugi (Fig. 16) cu viteza de 5000-6000
rotaţii/minut, iar forţa centrifugă ce se
creează împinge particulele (inclusiv
Fig. 16- Centrifugă.
microorganisme) către baza tubului, astfel
16
încât lichidul supernatant din tub este liber de germeni. Cu cât particulele
sunt mai fine cu atât durata şi viteza de centrifugare trebuiesc sporite.
Ultracentrifuga atinge până la 100.000 rotaţii/minut.

3.1.4. Sterilizarea prin raze ultraviolete

Radiaţiile ultraviolete distrug formele vegetative ale majorităţii

speciilor de microorganisme, însă acţionează slab asupra sporilor. Moartea
bacteriilor s-ar datora unui efect fotoelectric în urma absorbţiei specifice a
razelor de către anumite grupe moleculare, care sunt astfel profund alterate.
Razele ultraviolete se folosesc pentru sterilizarea unor substanţe care
se degradează uşor prin alte metode. Foarte frecvent sunt utilizate pentru
sterilizarea încăperilor şi a hotelor cu flux laminar. Se pot steriliza pe
această cale numai corpurile transparente care permit trecerea acestor raze.
Se mai utilizează în sterilizarea apei potabile şi a unor medii de cultură. Cele
mai active sunt radiaţiile ultraviolete cu lungimea de 2540-2800 Ǻ.

3.1.5. Sterilizarea prin ultrasunete

Ultrasunetele sunt unde acustice a căror frecvenţă trece cu mult de

limita perceptibilităţii auditive. Ele se obţin prin trecerea unui curent electric
alternativ de înaltă frecvenţă printr-un cristal de cuarţ. Cristalul suferă
deformări mecanice de unde rezultă vibraţii de 20 Khz şi care se produc
numai în acelaşi sens. Unii autori atribuie rolul principal al sterilizării prin
ultrasunete, ionizării gazelor din lichidul expus acestora, urmat de degajarea
de perhidrol, oxid şi bioxid de azot.
Alţi autori susţin că în faza iniţială ar avea loc o intensă traumatizare a
corpului microbilor, provocată de fluxul de electroni.

3.2. Sterilizarea prin agenţi chimici

Unele substanţe chimice se folosesc în laboratorul de microbiologie

fie pentru a împiedica dezvoltarea bacteriilor într-un mediu de cultură, fie
pentru distrugerea lor completă.

17
 În primul caz, substanţa chimică are acţiune bacteriostatică sau
dezinfectantă, iar în al doilea este bactericidă sau antiseptică.
Între acţiunea bacteriostatică şi cea bactericidă, la unele substanţe
deosebirea este dată de concentraţia produsului (doza).
Cei mai cunoscuţi agenţi chimici folosiţi în sterilizare sunt:
 acizii: acidul boric 3-4%, acidul sulfuric 5%;
 săruri: azotatul de argint 1%,
 substanţele oxidante: cloramina (25% clor activ suspensie de 10-20%;
iodul (soluţie alcoolică) 1-5%; apa oxigenată soluţie 5%; permanganatul de
potasiu soluţie 0,1% ca dezinfectant şi 0,01% ca antiseptic; aldehida formică
sub formă de vapori şi ca soluţie în apă 5%; fenolul soluţie 3-5%; cresolii
sub formă de emulsie 5%; creolina sub formă de emulsie 5-10% în apă;
hidroxidul de sodiu 3%).

Materiale necesare

 stative metalice cu eprubete închise cu dopuri metalice sau din vată;

 vase Erlenmeyer cu dopuri din vată;
 anse;
 ace spatulate;
 filtre Seitz;
 plăci Petri împăturite;
 pipete sticlă;
 etuvă;
 lămpi cu ultraviolete;
 centrifugă;
 autoclav.

18