I.

TEHNICI MICROBIOLOGICE GENERALE

1. Laboratorul de microbiologie

Laboratoarele de microbiologie sunt amenajate în funcţie de scopul pe

care îl urmăresc şi de lucrările ce urmează să se execute aici. De exemplu,
dotarea va fi diferenţiată dacă laboratorul este destinat analizelor
microbiologice medicale, umane sau de medicină veterinară, pentru
microbiologia solului sau pentru microbiologia industrială.
Laboratorul de care ne ocupăm este destinat în principal scopului
didactic şi de cercetare în domeniul microbiologiei solului şi microbiologiei
fermentaţiilor, într-un cuvânt microbiologiei agricole.

1.1. Organizarea laboratorului

Spaţiul destinat laboratorului trebuie orientat către nord sau nord-est şi

protejat de lumina solară prin jaluzele, storuri sau rulouri. Pereţii pe cât
posibil vor fi îmbrăcaţi în faianţă sau vopsiţi cu produse lavabile pentru a fi
uşor dezinfectaţi. Pardoseala va fi acoperită cu vopsea epoxidică, cu gresie
sau cu parchet acoperit de un linoleum pentru a se putea spăla şi dezinfecta
uşor.
Încăperile vor fi prevăzute cu reţea electrică, de gaz, apă şi canal, iar
sterilizarea aerului din interiorul acestora se va utiliza razele ultraviolete.
Acestea trebuie să fie ferite de curenţi de aer care ar putea să vehiculeze
microorganismele şi să fie situate în locuri lipsite de praf.
Mobilierul va fi alcătuit din dulapuri simple din metal sau lemn, iar
mesele de lucru vor fi acoperite cu faianţă, sticlă sau material plastic pentru
a se curăţa şi dezinfecta uşor.
Laboratorul va fi dotat cu taburete rotative, reglabile pe înălţime, care
să asigure o poziţie cât mai comodă mai ales pentru examinarea la
microscop.

9 

 
executarea defectuoasă a unor operaţii de pregătire şi manipulare a
materialelor.
În principiu se au în vedere următoarele reguli:
• lucrările de laborator se efectuează numai de personal instruit, echipat cu
îmbrăcăminte de protecţie corespunzătoare ce se poate spăla şi dezinfecta
(halat, şorţ, bonetă şi pentru anumite lucrări: mască, ochelari, mănuşi de
cauciuc);
• după executarea însămânţarilor este obligatorie sterilizarea pipetelor sau a
anselor; ansele se sterilizează prin încălzire la roşu, iar pipetele se introduc
în recipiente cu soluţie dezinfectantă (amestec sulfocromic, bicromat de
potasiu 5%);
• tuburile şi plăcile Petri cu culturi microbiene se adună in vase speciale
prevăzute cu capac, se sterilizează prin autoclavare şi apoi se spală;
• în laborator trebuie să se găsească în permanenţă prosoape curate şi săpun,
precum şi soluţii antiseptice (apă oxigenată, alcool 70%);
• este interzis să se mănânce în încăperile unde se lucrează cu material
infectat. Persoanele trebuie să se spele pe mâini după executarea lucrărilor şi
apoi să se dezinfecteze cu alcool.
În cazul în care se produc contaminări accidentale în laborator, se
recomandă păstrarea calmului şi se iau măsuri de prim ajutor:
• dacă materialul infectat ajunge în gură, se elimină imediat, se clăteşte gura
cu apă şi apoi se face o gargară cu permanganat de potasiu 0,1%, apă
distilată 1% sau soluţie de tinctură de iod (5 picături la un pahar de apă).
Apoi se clăteşte cu apă , repetându-se de mai multe ori dezinfecţia;
• în cazul când materialul ajunge în ochi, se evită frecarea, se spălă sacul
conjuctival de mai multe ori cu apă, apoi se fac instilaţii cu colire antiseptice
sau unguente cu antibiotice;
• în cazul rănilor produse în urma manipulării neîndemânatice a unor
instrumente, se lasă rana să sângereze bine, se badijonează cu tinctură de iod
şi se aplică pulberi sau unele soluţii de sulfamide sau antibiotice.
În laborator se evită deplasările inutile, mişcările bruşte care produc
curenţi de aer ce duc la infectarea culturilor de microorganisme, iar pe de
altă parte, creează posibilităţi de infecţie prin răsturnarea sau spargerea unor
recipiente cu microorganisme.

15 

 
 Laboratorul trebuie menţinut permanent în stare perfectă de curăţenie,
fiind dotat cu ştergătoare pentru dezinfectarea încălţămintei, precum şi cu
lămpi bactericide cu raze ultraviolete.
Deoarece îm laborator se găsesc aparate electrice (termostate, etuve,
microscoape) aflate sub tensiune, se impune manipularea cu mare atenţie a
acestei aparaturi pentru a evita producerea de accidente prin electrocutare.
În laborator se găsesc şi autoclave care dezvoltă presiune de vapori şi
care prezintă pericol de explozie sau arsuri; este necesar ca studenţii să
manipuleze aceste aparate numai după ce cunosc bine tehnicile de lucru
respective.
Toţi reactivii utilizaţi şi coloranţii sunt în recipiente etichetate vizibil,
iar produsele toxice trebuie să aibă şi indicativul de pericole de de otrăvire
cu semnul de „cap de mort”.

2. Examenul microscopic al microorganismelor

2.1. Microscopul

Microscopul (grec. mikrós: mic; skopein: a observa) este un

instrument optic cu ajutorul căruia pot fi observate şi studiate corpuri foarte
mici, situate mult sub limita vizibilităţii cu ochiul liber. Olandezul Antonie
van Leeuwenhoek (1632 - 1723) este considerat inventatorul microscopului,
deoarece a descris pentru prima dată organisme unicelulare (diferite tipuri
morfologice de bacterii) observate prin intermediul instrumentului optic
realizat de el.
În decursul timpului microscoapele au suferit multiple perfecţionări
care au permis să se mărească imaginea obiectivului de cercetat de mai
multe mii de ori. Perfecţionări ulterioare, mai ales la microscopul electronic,
au permis a fi văzute particule cu dimensiuni de 100 de ori mai mici ca cele
observate cu microscoapele optice cele mai puternice.
Din punct de vedere practic mai utilizate sunt două categorii de
microscopie:
1. Microscopia optică utilizează fotonii radiaţiilor luminoase drept
sursă de lumină pentru formarea imaginii. Laboratoarele de microbiologie

16 

 
pot fi dotate cu diferite tipuri de microscoape optice, iar dintre acestea
amintim:
• microscopul optic (cu fond clar) permite observarea microorganismelor
invizibile cu ochiul liber. Are o putere de rezoluţie de 0,2 µm ce permite
studierea microorganismelor ca formă, dimensiuni, grupare şi prezenţa unor
particularităţi morfologice.
• microscopul cu contrast de fază permite vizualizarea structurilor biologice
transparente fără fixare şi colorare. Imaginea se formează pe baza diferenţei
de fază induse de proprietăţile optice diferite ale mediilor strabătute. Este un
microscop optic obişnuit prevăzut cu două dispozitive speciale: diafragma
inelară şi placa (inelul) de fază.
• microscopul cu câmp întunecat (ultramicroscopul) permite luminarea
laterală a preparatului de examinat obţinându-se astfel o imagine de difuzie.
Din punct de vedere constructiv se utilizează un microscop optic prevăzut
cu un condensator special alcătuit dintr-o oglindă concavă şi una convexă,
astfel încât doar razele de lumină împrăştiate pe neomogenităţile
preparatului să ajungă în obiectiv.
• microscopul cu raze ultraviolete este un microscop optic care foloseşte
lentile din cuarţ şi raze ultraviolete invizibile, care trec prin preparat şi sunt
înregistrate deo placă fotografică. Are o putere de rezoluţie de până la 100
nm (1nm = 10-9 m), această cifră reprezentând limita maximă de rezoluţie a
microscopiei optice.
2. Microscopia electronică utilizează pentru formarea imaginii
fascicule de electroni care luminează preparatul microscopic şi care ulterior
sunt dirijate printr-un sistem de lentile electromagnetice. Puterea de
rezoluţie a microscoapelor electronice este diferită în funcţie de tipul
constructiv şi are o valoare cuprinsă între 0,1 şi 1 nm. Există mai multe
tipuri constructive de microscoape electronice, iar dintre acestea enumerăm:
• microscopul electronic de transmisie (Transmission Electron Microscope,
TEM);
• microscopul electronic de baleiaj (Scanning Electron Microscope, SEM );
• microscopul electronic de transmisie şi baleiaj (Scanning Transmission
Electron Microscope, STEM );
• microscopul electronic analitic de transmisie (Transmission Electron
Analytical Microscope, TEAM);
17 

 
• microscopul cu efect de tunel (Scanning Tunelling Microscope, STM);
• microscopul de forţă atomică (Atomic Force Microscope, ATM);
• microsonda electronică (Electron Probe Instrument, EPI).

Microscopul optic (Fig. 4) şi este format din două părţi:

I. partea mecanică;
II. partea optică.

I. Partea mecanică a microscopului este la rândul ei constituită din:

1. Piciorul microscopului;
2. Corpul microscopului;
3. Tubul microscopului.

1. Piciorul (talpa) microscopului asigură stabilitatea aparatului, are

formă paralelipipedică, iar în interior este inclusă şi sursa de lumină. La alte
tipuri constructive piciorul poate avea şi formă de potcoavă.
2. Corpul (coloana) microscopului reprezintă partea verticală a
microscopului şi este fixat de picior prin intermediul unei articulaţii. Pe corp
sunt montate platina (măsuţa microscopului), dispozitivul de punere la punct
a imaginii şi tubul microscopului. La unele modele, corpul poate fi curbat şi
legat de picior cu ajutorul unei articulaţii mobile care permite microscopului
înclinaţii până la 90o.
Platina (masa microscopului) este suportul pe care se fixează
preparatul de examinat şi este poziţionată între dispozitivul de iluminat şi
tubul microscopic. Platina poate fi pătrată, dreptunghiulară sau rotundă şi
prezintă în centru o deschidere circulară pentru trecerea razelor luminoase
de la sursă la preparat. Platina este deplasabilă în plan orizontal cu ajutorul a
două şuruburi laterale, pentru reglarea poziţiei preparatului faţă de obiectiv.
Acesta se fixează pe platină cu ajutorul a doi cavaleri (lame metalice
flexibile) sau cu ajutorul unui "cărucior mobil" alcătuit dintr-o bară
orizontală şi două bare laterale. Căruciorul este prevăzut cu o riglă gradată şi
cu un "vernier" pentru determinarea poziţiei în cele două direcţii de
deplasare a unor detalii de pe preparatul microscopic. Platina poate fi
deplasată şi în plan vertical cu ajutorul dispozitivului de punere la punct a
imaginii.
18 

 
 Pe corpul microscopului se găseşte dispozitivul de punere la punct a
imaginii format din două perechi de şuruburi dispuse la acelaşi nivel. Prima
pereche serveşte la mişcări rapide prin intermediul cremalierei şi se numeşte
viză macrometrică. Punerea la punct a imaginii se face cu ajutorul vizei
micrometrice care este fixată peste viza macrometrică.
3. Tubul microscopului prezintă la partea inferioară revolverul, care
este constituit din două calote concentrice dispuse una peste alta şi unite la
mijloc printr-un şurub. În revolver se înşurubează obiectivele într-o anumită
ordine, astfel încât prin rotirea acestuia în sensul acelor de ceasornic să
aducă în axul optic al microscopului obiective din ce în ce mai puternice. La
partea superioară a tubului se află ocularele.

Oculare

Tubul microscopului

Revolver Şurub fixare

Corpul microscopului
Obiectiv

Platină

Viza macrometrică
Condensator
Viza micrometrică

Sursa de lumină Şurub pentru

deplasarea platinei
Piciorul
microscopului

Comutator

Fig. 4 - Părţile componente ale microscopului optic (Model Krüss MBL2000). 

19 

 
 II. Partea optică a microscopului este formată din:
1. Sistemul de iluminat;
2. Obiective;
3. Oculare.

1. Sistemul de iluminat este fixat sub platină şi are ca scop să permită

observarea preparatului microscopic prin lumina transmisă. El se compune
din: sursa de lumină, dispozitivul de transmisie şi condensator.
Sursa de lumină este reprezentată de lumina artificială generată de o
lampă cu halogen de 6V alimentată de un transformator şi montată în
piciorul microscopului. În cazul unor tipuri constructive mai vechi, pentru
observaţiile microscopice se utiliza lumina naturală.
Dispozitivul de transmisie este reprezentat de o oglindă, care are rolul
de a dirija razele luminoase furnizate de către sursa naturală sau artificială
de lumină în axul optic al microscopului. Mai există o serie de piese de
reglare şi focalizare, ca lentilă, diafragma iris, filtre de lumină. Diafragma
iris se găseşte situată deasupra inelelor portfiltre şi serveşte la limitarea
fasciculelor de raze provenite de pe oglindă, ce intră în condensator.
Diafragma poate fi închisă sau deschisă, în raport cu obiectivul folosit.
Filtrele de lumină se utilizează pentru o mai bună apreciere a nuanţelor în
raport cu obiectivul folosit.
Condensatorul este format dintr-un sistem de lentile convergente care
focalizeză lumina pe preparatul de observat. Este o componentă plasată într-
o montură mobilă pe verticală situată sub platină.
2. Obiectivele sunt sisteme de lentile care dau o primă imagine reală,
mărită şi răsturnată a preparatului de examinat. Imaginea furnizată de
obiectiv este prinsă de către ocularul situat la partea superioară a tubului,
fiind mărită şi transformată în imagine virtuală.
Obiectivele se pot clasifica în două categorii şi anume:
• obiective acromatice (corecţie cromatică pentru două lungimi de undă);
• obiective apocromatice (corecţie cromatică pentru trei lungimi de undă);
Aceste obiective se deosebesc prin corecţia mai mult sau mai puţin
perfectă a aberaţiilor cromatice şi de sfericitate. Aberaţia cromatică
determină formarea unei imagini neclare datorită refracţiei inegale a luminii
de diferite lungimi de undă. Aberaţia de sfericitate este dată de faptul că
20 

 
lentilele convergente nu refractă toate razele într-un focar, razele periferice
fiind mai puternic refractate comparativ cu razele din zona centrală.
În cadrul celor două categorii se disting: obiective uscate şi obiective
cu imersie (umede). Acestea diferă după natura mediului ce se interpune
între lentila frontală şi preparatul de examinat. La obiectivele uscate acest
mediu este aerul a cărui indice de refracţie (n=1) este foarte diferit de
indicele mediu al sticlei (n=1,5). La obiectivele cu imersie mediul ce separă
lentila frontală de lama portobiect este un lichid cu un indice de refracţie
apropiat de cel al sticlei. Cel mai utilizat lichid de imersie este uleiul de
cedru al cărui indice este 1,515, iar în lipsa acestuia se poate utiliza apa
distilată (n=1,33), ulei de parafină (n=1,47) sau de ricin (n=1,48).
În cazul obiectivelor uscate, toate razele luminoase a căror înclinare,
în raport cu axa, depăşeşte o anumită valoare, suferă reflexia totală în
momentul trecerii din lama de sticlă în aer. Prin interpunerea uleiului de
cedru între lentila frontală a obiectivului şi lama portobiect se suprimă
reflexia totală şi refracţia, obţinându-se o luminozitate mai mare a imaginii
(Fig 5).

 
Fig. 5 - Secţiune verticală prin lentila frontală a obiectivului uscat comparativ cu a
obiectivului cu imersie pentru observarea drumului parcurs de razele luminoase prin
aer şi uleiul de cedru.

3. Ocularele sunt situate la partea superioară a tubului. Fiecare ocular

este alcătuit din două lentile plan-convexe montate într-un cilindru metalic
şi separate între ele printr-o diafragmă. Ele transformă imaginea dată de

21 

 
obiectiv într-o imagine virtuală, mărită şi dreaptă. Pe montura superioară se
găseşte notată puterea de mărire a ocularelor (Ex: 10x).

Puterea de mărire a microscopului este produsul dintre puterea

de mărire a obiectivului şi cea a ocularului. Dispozitivul optic al
microscopului optic obişnuit permite o mărire medie între 900 şi 2000 ori.

Mod de lucru

Punerea la punct a imaginii microscopice se face diferenţiat în funcţie

de tipul de obiectiv utilizat:
1. Pentru obiectivele uscate:
• se conectează microscopul la reţeaua de curent electric (220V) şi se
activează sursa de lumină artificială prin intermediul comutatorului
poziţionat pe picior;
• se aduce în axul optic al ca microscopului obiectivul cu cea mai mică
putere de mărire (cel mai scurt) prin rotirea revolverului;
• se fixează distanţa interpupilară prin apropierea sau îndepărtarea celor
două tuburi oculare, astfel încât privind cu ambii ochi să vedem o singură
imagine;
• se deplasează condensatorul în plan vertical până în momentul în care,
privind prin oculare, întreg câmpul microscopic apare uniform luminat;
• se aşează pe platină preparatul microscopic de analizat şi se fixează prin
intermediul căruciorului mobil;
• se aduce preparatul microscopic în axa optică deplasând platina în plan
orizontal prin intermediul şuruburilor laterale;
• se va ridica platina cu ajutorul vizei macrometrice până la o distanţă mai
mare decât distanţa frontală a obiectivului cu cea mai mică putere de mărire
( ≈ 2 cm);
• privind prin oculare se coboară încet sistemul optic cu ajutorul vizei
macrometrice până la apariţia imaginii din câmpul microscopului. Este
singurul obiectiv la care imaginea se obţine folosind viza macrometrică.
Dacă imaginea nu apare, înseamnă că obiectivul nu se află în axul optic sau
că preparatul nu se află în câmpul microscopului, iar operaţia trebuie

22 

 
reluată. Prin mişcarea vizei micrometrice în unul din cele două sensuri se va
obţine o imagine mai clară şi mai luminoasă;
• pentru a examina preparatul microscopic cu obiective de putere mai mare
se roteşte revolverul în sensul acelor de ceasornic, aducând obiectivul dorit
în axul optic al microscopului. Viza macrometrică nu se mai mişcă, iar
pentru claritatea imaginii se utilizează viza micrometrică;
• la sfârşitul examinării se roteşte revolverul în sens invers acelor de
ceasornic până la obiectivul cu cea mai mică putere de mărire, se coboară
platina cu ajutorul vizei macrometrice şi se îndepărtează preparatul
microscopic;
• după utilizare microscopul se deconectează de la reţea şi se acoperă cu
husa de protecţie.
2. Pentru obiectivele cu imersie se ridică condensatorul la maximum,
diafragma iris se deschide complet, iar preparatul microscopic se aşează pe
platină şi se fixează cu ajutorul căruciorului mobil. Se pune apoi o picătură
de ulei de cedru pe preparat şi se ridică platina cu viza macrometrică până
ce, privind lateral, observăm că lentila frontală a obiectivului cu imersie
ajunge în contact cu picătura de ulei de cedru. Din acest moment vom privi
prin oculare şi vom continua coborârea tubului cu ajutorul vizei
micrometrice până ce imaginea este clară.
După terminarea examinării, înainte de a scoate preparatul de pe
căruciorul mobil, se coboară platina microscopului 2-3 cm cu viza
macrometrică pentru a nu se zgâria lentila frontală a obiectivului. Uleiul de
cedru de pe obiectivul cu imersie se şterge cu o cârpă îmbibată în xilol sau
benzen.

Întreţinerea microscopului

Microscopul trebuie depozitat în încăperi închise, lipsite de medii

corozive, praf, cu umiditate maximă de 65% şi în limitele de temperatură 0-
35°C. După încetarea lucrului se aşează în cutie sau se protejează cu o husă
din folie de polietilenă. Se întreţine periodic ştergând ocularele şi
obiectivele cu piele de căprioară sau cu o cârpă moale, care nu lasă scame.
Obiectivul cu imersie se şterge din timp în timp cu vată cu xilol sau benzen.

23