SORIN APOSTU ANCUŢA ROTAR

PRACTICUM DE
MICROBIOLOGIE ALIMENTARĂ

VOL. II
SUPORT DE CURS ID

CLUJ-NAPOCA
2009
1
 CUPRINS:

13. Controlul microbiologic al microaeroflorei, utilajelor, personalului şi ambalajelor----------3

14. Controlul microbiologic al apei-------------------------------------------------------------------------10

15. Examen microbiologic general pentru depistarea germenilor patogeni din produsele
alimentare-------------------------------------------------------------------------------------------------------17

16. Analiza microbiologică a cărnii şi produselor din carne------------------------------------------37

17. Analiza microbiologică a cărnii animalelor acvatice ----------------------------------------------42

18. Analiza microbiologică a laptelui şi produselor lactate--------------------------------------------48

19. Microbiologia conservelor şi semiconservelor-------------------------------------------------------53

20. Analiza microbiologică a ouălor şi produselor din ouă--------------------------------------------55

21. Analiza microbiologică a mierii------------------------------------------------------------------------59

22. Analiza microbiologică a berii -------------------------------------------------------------------------60

23. Analiza microbiologică a vinului-----------------------------------------------------------------------62

24. Analiza microbiologică a cerealelor şi derivatelor acestora--------------------------------------71

25. Analiza microbiologică a zahărului--------------------------------------------------------------------76

26. Analiza microbiologică a fructelor şi legumelor ---------------------------------------------------80

27 Analiza microbiologică a condimentelor--------------------------------------------------------------83

Bibliografie -----------------------------------------------------------------------------------------------------86

2
 13. CONTROLUL MICROBIOLOGIC A MICRO-AEROFLOREI, A UTILAJELOR,
PERSONALULUI ŞI AMBALAJELOR

Atmosfera nu dispune de o floră proprie, în sensul existenţei unor microorganisme a căror

mediu specific de viaţă să fie aerul, dar conţine în permanenţă microorganisme provenite din sol,
din aer, din vegetaţie sau organismele umane şi animale. Aceste microorganisme prezintă o
densitate ce variază în funcţie de apropierea de sol, dar pot fi găsite şi la înălţimi mari, sau pe
suprafeţe întinse de apă la mari distanţe de ţărm.
Provenienţa microorganismelor din aer este în cea mai mare parte din natură, urmând apoi
microorganisme provenite de la animale şi/sau oameni. Există deci în atmosferă două grupe de
microorganisme; flora din natură şi flora de origine animală şi/sau umană. Flora din natură joacă un
rol deosebit de important în procesele biologice:- fermentaţii, biodegradarea unor substanţe.
Germenii de origine animală şi sau umană pot fi grupaţi în germeni saprofiţi, condiţionat
patogeni şi patogeni.
Germenii saprofiţi nu joacă nici un rol în patologia infecţioasă, în timp ce germenii
condiţionat patogeni şi îndeosebi cei patogeni pot provoca îmbolnăviri specifice.
Determinarea micro-aeroflorei include următoarele determinări:
- număr total de bacterii aerobe (NTG) /m3 de aer,
- numărul total de drojdii şi mucegaiuri /m3 de aer.
Prin recoltarea probelor de aer pentru determinarea numărului total de germeni se urmăreşte
aprecierea germenilor viabili vehiculaţi pe calea aerului. Aceşti germeni se găsesc rareori sub formă
de corpi microbieni singulari întrucât ei ajung în aer fixaţi pe particule din stratul care-i conţine
(stropi de secreţie, fibre vegetale, praf ); astfel numărul de germeni obţinuţi prin oricare din
metodele de determinare, reprezintă în realitate, numărul de particule ce conţin germeni viabili,
fiecare particulă putând să conţină mai mulţi germeni.
De asemenea se ia în considerare faptul că mediul de cultură folosit şi temperatura de 37oC
(temperatură de incubare ) nu permit întotdeauna dezvoltarea tuturor germenilor din aer, de aceea
rezultatele obţinute sunt în realitate o subestimare a numărului real de germeni pe unitatea de
volum aer.
În alegerea metodelor de recoltare se va ţine cont de:
1. metoda să fie eficientă în recoltarea particulelor între 1-10µm
2. să permită evaluarea numărului de germeni la 1m3 de aer
3. să permită identificarea anumitor germeni sau grupe de germeni.

3
Însămânţarea se poate realiza fie direct pe medii solide turnate în plăci Petri, fie prin intermediul
unei ligament steril în care se concentrează germeni din aer şi se însămânţează tot pe suprafaţa unui
mediu solid.
13.1. Determinarea micro-aeroflorei - Metode de recoltare
Recoltare se poate efectua folosind metode: prin sedimentare, prin aspiraţie.
13.1.1. Metoda de recoltare prin sedimentare
Această metodă se mai numeşte şi metoda Koch şi are ca principiu expunerea cutiilor Petri cu un
mediu specific, un interval de timp bine determinat maxim o oră. Pentru a se putea calcula numărul
de germeni la un anumit volum de aer, se recomandă expunerea timp de 5 minute sau expuneri de
timp multiplu de 5 minute (10, 15, 20 minute, până la o oră). După expunere, cutiile se închid şi se
incubează 24 h la 37oC, apoi se mai lasă încă 24 h la temperatura camerei şi la lumină, pentru a
permite
dezvoltarea pigmentului la anumite specii bacteriene. Se numără apoi coloniile, pornind de la
premisa că fiecare colonie s-a dezvoltat dintr-un microorganism. Prin numărarea tuturor coloniilor
se obţine NTG, dar pentru aprecierea mai exactă a gradului de salubritate se recomandă extragerea
din NTG a numărului de indicatori specifici: streptococi, stafilococi, coliformi, klebsiele.
Metoda prezintă avantajul că este simplă permiţând efectuarea mai multor determinări,
având astfel o caracterizare destul de fidelă a gradului de contaminare a aerului. Dezavantajul
constă în faptul că microorganismele care sedimentează sunt cele aderente pe suspensii de
dimensiuni mai mari. Metoda va pune în evidenţă deci, în special bacteriile din picăturile lui Flügge
şi praful bacterian şi în măsură mai mică cele din nuclei de picături.

13.1.2. Metode de recoltare prin aspiraţie

Aceste metode exprimă un număr de germeni mai real la un volum dat de aer (m3). În cazul
folosirii acestor metode este necesar un sistem de aspiraţie, un aparat de investigare a volumului de
aer şi un dispozitiv de reţinere a microorganismelor.
Principiu de lucru constă în trecerea aerului aspirat prin sisteme filtrante sterile care ulterior
se vor spăla pentru reţinerea microorganismelor în ser fiziologic steril. Suspensia bacteriană
obţinută se va însămânţa pe medii de cultură specifice.
Determinarea fungilor (mucegaiurilor)- se practică în aerul atmosferic cât şi în atmosfera
încăperilor.
Recoltarea sporilor de fungi se poate face în mod pasiv prin expunerea unor suprafeţe pe
care sporii se depun datorită gravitaţiei (metoda sedimentării) sau a curenţilor de aer; sau prin
metode active prin aspirarea aerului, sporii fiind colectaţi prin diferite filtre (metoda aspiraţiei).
Metoda sedimentării:
4
-se expun lame de sticlă unse cu soluţie glicerinată, iar după o expunere de 24 h lamele se
examinează la microscop.
Determinarea genului Candida- prin metoda Koch, folosind ca mediu de cultură, mediu
Saubouraux sau PCB cu antibiotic. Se incubează la 37oC şi se citeşte la 24-48-72 de ore. Din
coloniile suspecte a fi de Candida (colonii albe cenuşii de diferite dimensiuni cu marginea
neregulată, cu centrul ridicat şi prelungiri radiare), se face un preparat între lamă şi lamelă şi se
examinează la microscop.
Determinarea florei mezofile- reprezintă numărul total de microorganisme care se dezvoltă
pe plăci cu medii nutritive după incubare la temperaturi specifice. Identificarea NTG, si a drojdiilor
şi mucegaiurilor constă în folosirea a câte 2 plăci Petri pentru fiecare probă, cu medii specifice
Diametrul plăciilor Petri trebuie să fie de 10 cm, iar timpul de expunere să fie de minim 10 minute.
Plăcile cu mediu pentru NTG se incubează la 35oC , timp de 48 h, ia plăcile cu mediu pentru
drojdii şi mucegaiuri se incubează la 22oC, timp de 5 zile.
Acesta reprezintă un indicator orientativ de apreciere a gradului de contaminare a aerului din
spaţiile de lucru şi depozitare şi se raportează la 1m3 aer.

Număr de germeni/m3aer = n X 50
în care:
n = număr de colonii dezvoltate pe suprafaţa mediului de cultură
În anumite cazuri aria investigaţiilor se poate extinde, pentru determinarea streptococilor hemolitici,
stafilocociilor, coliformilor.
Limitele legale maxim admise sunt redate în OMS 976/1998.
În cazul streptococilor hemolitici- se foloseşte mediu de cultură geloză- sânge în proporţie
de 5-7% (sânge defibrinat adăugat steril la geloza nutritivă). Identificarea coloniilor de streptococ se
face după aspectul morfologic (colonii uniforme, mici cu diametrul de 0,5-1 mm, rotunde, cu
margini regulate, semitransparente, nepigmentate), notându-se numărul coloniilor de streptococ şi
tipul de hemoliză. Exprimarea se face tot la 1 m3 aer.
În cazul stafilocociilor - se foloseşte mediu geloză- sânge. Se numără coloniile de stafilococ
după aspectul morfologic al coloniei (colonii rotunde, neuniforme în general mari, cu diametrul de
1-6 mm, opace, cu suprafaţă netedă şi lucioasă, margini neregulate, pigmentate.) Exprimarea
rezultatelor atât în cazul numărului total de streptococi cât şi de stafilococi se face cu ajutorul
aceleiaşi formule de calcul folosite în cazul florei mezofile. Confirmarea se face pe mediu
Chapman.
În cazul coliformilor- izolarea se face tot pe medii geloză-sânge iar confirmarea se face pe
mediu Levine (colonii negricioase verzui cu luciu metalic)
5
 13.2. Controlul microbiologic a suprafeţelor de lucru, utilajelor şi a tegumentelor palmare
Contaminarea suprafeţelor de lucru, utilajelor şi a tegumentelor palmare, poate reprezenta o
cale de transmitere a infecţiilor microbiene, virotice sau parazitare. Contaminarea se poate face cu
agenţi patogeni proveniţi de la purtători umani sau materii prime folosite în fluxul tehnologic de
fabricaţie.
13.2.1. Controlul eficienţei igienizării-tampoanele de sanitaţie
Se urmăreşte verificarea igienizării pe o suprafaţă de 100 cm2 (10/10 cm2); se trasează un
careu imaginar sau se foloseşte un şablon din inox (10/10 cm2) , suprafaţă de pe care se va recolta
cu tamponul de sanitaţie steril, după următoarea tehnică:
Suprafaţa delimitată se şterge cu tamponul în trei direcţii diferite (figura 18), în cazul
suprafeţelor uscate, tamponul se va umecta în prealabil cu ser fiziologic steril. După recoltare
tamponul se introduce imediat în eprubeta cu neutralizant (se va cunoaşte agentul dezinfectant şi se
va folosi neutralizant specific acestuia.), după care se expediază laboratorului ce va efectua analiza
microbiologică.

1 1

2 2
Fig. 18 Modul de recoltare a tampoanelor de sanitaţie în cazul suprafeţelor 3mici
3

În laborator probele se lucrează astfel :

- tampoanele pentru NTG şi bacterii coliforme se introduc în 10 ml ser fiziologic steril agitându-se
eprubeta prin lovirea acesteia de podul palmei de circa 30-40 de ori.
Din lichidul astfel obţinut se însămânţează câte 1 ml în 2 plăci Petri (pentru NTG) şi 1 ml într-o
eprubetă cu mediu pentru bacteriile coliforme. În cazul în care se bănuieşte că obiectivul controlat
are o încărcătură bacteriană foarte mare se pot executa diluţii decimale succesive.
În fiecare placă însămânţată se toarnă 10-15 ml de agar nutritiv la temperatura de 40-45 oC,
se omogenizează prin rotirea plăcii în ambele sensuri şi se lasă să se solidifice. Incubarea pentru
ambele medii se face la 35o C, 48 h.
Interpretarea rezultatelor:
Pentru bacteriile coliforme este considerată reacţie pozitivă- degajarea de gaze cel puţin a 10-a
parte din înălţimea tubului.
Calcularea NTG se face prin formula:
NTG/cm2 = n/10,
unde:
6
n = media numărului de colonii obţinute în cele două plăci
10 = reducerea suprafeţei de la 10 cm2 (reprezentat de cantitatea de 1 ml, luată în lucru) la 1
cm2(raportarea finală).
Numărul total de germeni (NTG) acceptat este de 2, în cazul în care bacteriile coliforme sunt
prezente şi de 20 atunci când bacteriile coliforme sunt absente. Aceste limite sunt reglementate de
OMS 976/1998.
În cazul germenilor patogeni (Salmonella şi Stafilococ) examenele sunt calitative, interesându-ne
doar prezenţa sau absenţa lor.
În cazul tegumentelor palmare se procedează în felul următor: recoltarea se face de pe întreaga
suprafaţă tegumentară a ambelor mâini şi spaţiile interdigitale, frecându-se cu tamponul de trei loc
în acelaşi loc, examenul fiind unul calitativ, interesându-ne prezenţa sau absenţa germenilor
patogeni; tamponul odată recoltat se introduce în 10 ml ser fiziologic steril care se agită conform
metodologiei descrise mai sus, repartizându-se astfel:
- 5 ml în mediu specific pentru Salmonella,
- 4 ml în mediu specific pentru stafilococ,
- 1 ml în mediu specific pentru bacterii coliforme.
Mediile se incubează la 35oC. Nu se admite prezenţa germenilor controlaţi pe tegumentele palmare.
13.3. Controlul microbiologic al materialelor de ambalaj
În vederea controlului microbiologic al materialelor de ambalaj se fac următoarele determinări:
- NTG/cm2
- Număr de drojdii şi mucegaiuri/cm2
- Bacterii coliforme/18cm2
Materiale:
- plăci Petri cu diametrul de 10 cm, pipete gradate de 1 sau 2 ml, foarfeci, pense sterilizate
- medii de cultură specifice microorganismelor analizate (ex: agar Frazier sau agar nutritiv, BBLV,
agar cu cartof sau agar cu malţ).
Tehnica de lucru: Din proba de material de ambalaj controlată se taie mai multe bucăţi în mod
aseptic sub forma unor pătrate cu latura de 3 cm (deci cu o suprafaţă totală de 9cm2) şi se introduc
într-o placă Petri sterilă. Se pregăteşte o placă Petri cu agar Frazier sau cu agar nutritiv şi una cu
agar cu cartof sau agar cu malţ.
Pentru determinarea NTG-ului/cm2 şi a drojdiilor şi mucegaiurilor/cm2 , se procedează
astfel: se ia cu pensa din placa Petri o bucată de material de ambalaj, (pregătită ca şi mai sus) şi se
aşează cu una din feţe pe suprafaţa agarului turnat în placă. Se ia o altă bucată şi se aşează cu
cealaltă faţă într-o altă zonă de pe suprafaţa agarului NTG din aceaşi placă (astfel pot fi controlate

7
 2
ambele feţe ale materialului de materialului de ambalaj - 9cm x 2). Bucăţile de folie se lasă în
contact 5 minute, după care se îndepărtează.
Pentru determinarea drojdiilor şi mucegaiurilor alte 2 bucăţi de material de ambalaj se
aşează pe suprafaţa agarului cu malţ (cartof), procedându-se ca mai sus.
Plăcile pentru NTG se incubează la 35oC, 48 h, iar cele pentru drojdii şi mucegaiuri la 18-
25oC si la loc întunecos, 4-5 zile.
Interpretarea rezultatelor: se face prin raportarea rezultatului obţinut prin numărarea
coloniilor la 1 cm , ţinând cont că în control au intrat 18 cm2 de material de ambalaj (2 x 9 cm2).
2

Deci pentru aflarea NTG-ului şi a drojdiilor şi mucegaiurilor, numărul de colonii găsite pe placă se
împart la 18.
Pentru determinarea B. coliforme o bucată de material de ambalaj, cu suprafaţa de 18 cm2,
se taie în mod aseptic, mărunt şi se introduce într-o eprubetă cu mediu specific pentru bacterii
coliforme. Se incubează la 35oC, 48 h.
Interpretarea rezultatelor: prin apariţia de gaze (10% din înălţimea tubului) se consideră prezente B.
coliforme/18 cm2 material de ambalaj controlat.
Ordinul Ministerului Sănătăţii (OMS) -.976/1998 (extras)
NTG Enter Stafiloco Stafilo- Mucega- Bacterii Observaţii
o- ci coci iuri Coliform
bacter coagulaz hemolitic e
ia- o-pozitiv i
ceae
Conducte de la 1/ml - - - - abs/ml -
instalaţiile de
pasteuriz.
Suprafeţe de 2/cm2 - - - - abs/10c Se acceptă
lucru de pe m2 NTG=
fluxul 20/cm2,
tehnolog. care dacă
vin în contact bacteriile
direct cu alim. coliforme
sunt
absente/10c
m2
Mese din 4/cm2 abs/10 abs/100 abs/100 - - Se acceptă
blocurile 0 cm2 cm2 cm2 NTG=
alimentare 20/cm2,
dacă
bacteriile
coliforme
sunt
absente/10c
m2
Bazine, tancuri 1/cm2 - - - - abs/10 Se acceptă
aparate cm2 NTG=
8
 20/cm2,
dacă
bacteriile
coliforme
sunt
absente/10c
m2
Echipament de 2/cm2 - - - - abs/10 Se acceptă
protecţie cm2 NTG=
20/cm2,
dacă
bacteriile
coliforme
sunt
absente/10c
m2
Tacâmuri 10 ml abs abs abs abs - Condiţiile
soluţie se referă la
spălare un obiect
Farfuri 1/cm2 abs abs abs abs - Condiţiile
se referă la
un obiect
Căni, ceşti, 10 ml abs abs abs abs - Condiţiile
pahare soluţie se referă la
spălare un obiect
Hârtie şi folie 1 cm2 - - - - 3/cm2 -
de plastic
folosite în
vânzare
Mâini - abs abs abs - - -
Aerul din 600/m3 - - - 300/m3 - -
încăperile de
producţie

9
 14. ANALIZA MICROBIOLOGICĂ A APEI
Indicatori bacteriologici.
Majoritatea bolilor transmise prin apă au ca agenţi etiologici, microorganisme eliminate
prin tubul digestiv. De aici rezultă că prima şi cea mai importantă condiţie bacteriologică de
potabilitate a apei este absenţa microorganismelor patogene.
Analiza bacteriologică constă în:
- metode de analiză curente;
- metode de analiză complementare.
1. Metodele de analiză curentă sunt obligatorii şi constau în:
- determinarea numărului de bacterii aerobe ce se dezvoltă la 37oC;
- determinarea numărului de bacterii coliformi totali;
- determinarea numărului probabil de bacterii coliformi fecali.
- determinarea numărului probabil de streptococi fecali;
2. Metodele de analiză complementară se aplică în situaţii speciale, în cazul alegerii unei noi
surse de apă, epidemii hidrice, poluări accidentale etc., şi constau în:
- determinarea numărului total de bacterii aerobe ce se dezvoltă la 22oC;
- determinarea numărului probabil de clostridii sulfito-reducătoare şi de bacterii Clostridium
perfringens,
- numărul probabil de bacterii Pseudomonas aeruginosa
- determinarea numărului probabil de bacteriofagi tifici Vi şi coli
- prezenţa bacteriilor din genul Salmonella etc.
Pentru înţelegerea mai clară a principalelor determinări impuse la apă, conform STAS 3001-
91, se impun următoarele precizări:
1. bacteriile mezofile sunt microorganisme care se dezvoltă la 22oC şi la 37oC, capabile să
formeze colonii vizibile pe medii nutritive, în anumite condiţii de cultură.
2. Bacteriile coliforme –coliformii totali- sunt bacterii bacilare Gram negative, nesporulate
care fermentează lactoza cu producere de gaz şi acid,
3. Bacteriile coliforme termotolerante –coliformii fecali- fermentează lactoza în medii lichide
lactozate cu producere de acid şi gaze la 44±0,5oC
4. streptococii fecali sunt coci sferici sau ovalari. Gram pozitivi, aşezaţi izolaţi în perechi sau
lanţuri scurte ce se dezvoltă la 44±0,5oC, în prezenţa a 40% săruri biliare şi a azidei de sodiu.
5. clostridiile sunt bacili sporulaţi anaerobi, Gram pozitivi, reducători ai sulfitului în sulfură şi care
în prezenţa Fe divalent produc sulfură feroasă de culoare neagră. Cl. perfringens se dezvoltă la 44-
46oC.

10
6. Pseudomonas aeruginosa este o bacterie bacilară, nesporulată, Gram negativă care elaborează
doi pigmenţi caracteristici: piocianina şi fluoresceina.

14.1. Norme de recoltare a apei pentru analiza bacteriologică:

Probele de apă din conducte (reţele de distribuţie) se vor lua cu ajutorul buteliilor de sticlă
de 100- 500 ml, cu dop rodat sau cu dop de cauciuc, sterilizat în prealabil.
Probele de apă din râuri, lacuri, bazine, ape de adâncime se vor lua de asemenea cu ajutorul
buteliilor de sticlă sterilizate în prealabil şi prevăzute cu un dispozitiv de închidere, sterilizat şi
montat astfel încât să asigure deschiderea dispozitivului când butelia a ajuns la stratul de apă dorit.
Recoltarea propriu-zisă a probelor
1.Din reţea de distribuţie se alege un robinet care furnizează apa de la branşamentul reţelei,
evitându-se reţelele branşate secundar la o cisternă sau rezervor. Robinetul se va curăţa şi deschide
complet, lăsând să curgă 5- 10 minute, până când apa care a stagnat în conductă va fi îndepărtată
total, după care se va reduce debitul robinetului, până la formarea unei coloane de apă continuă,
permiţând umplerea buteliei fără a stropi în exterior.
2. Din cursurile de apă, rezervoare, lacuri, izvoare sau fântâni, probele se vor lua la punctul
folosit pentru captare. La cursurile de apă se vor evita zonele de stagnare.
Se va lua minim 100 ml şi max. 500 ml apă. În timpul umplerii se va evita contaminarea din
afară a gâtului şi a dopului dispozitivului de luare a probelor.
Butelia va fi ţinută de partea bazală şi va fi închisă cu dopul imediat după umplere.
În cazul apelor dezinfectate cu clor se va introduce în prealabil sterilizării în butelii 1 ml
soluţie de tiosulfat 0,5% pentru 100 ml apă.
• Recoltarea apei din instalaţiile centrale:-
- proba de apă de suprafaţă sau subterană, tratată sau dezinfectată se recoltează de la robinetele
montate în puncte reprezentative fiecărei trepte de tratare. Pentru recoltare se deschide robinetul şi
se lasă să curgă apa 5-10 min. Se închide robinetul şi se flambează. Se deschide din nou robinetul şi
se reglează debitul apei în aşa fel încât să se formeze o coloană de apă continuă de maxim 1 cm
diametru. Se scoate dopul flaconului, se umple până la aproximativ 2 cm. sub dop. Se astupă cu
dopul apoi se notează. Când nu există posibilitatea recoltării apei de la robinet, flaconul sterilizat
ţinut de o sfoară se introduce în bazin sau rezervor, se umple până la 2 cm sub dop, se astupă cu
dopul apoi se notează.
• Recoltarea apei din surse locale (fântâni, izvoare)
- se recoltează direct din apa fântânii cu flaconul sau prin turnare cu găleata fântânii direct în flacon,
cu un nivel al apei până la 2 cm sub dop. Se acoperă cu dop şi se notează.
Pentru analiza bacteriologică probele se trimit la laborator în minim:
11
 6 ore pentru ape impurificate,
10 ore pentru ape neimpurificate sau clorinate.
Probele se vor transporta în condiţii de temperatură - maxim 4oC.

Flacoanele cu probe de apă se prevăd cu etichete pe care se înscriu date necesare identificării
probei: - numărul probei sau lotului
- denumirea punctul de recoltare;
- data şi ora recoltării şi eventualele caracteristici ale locului de recoltare.
14.2.Determinarea numărului de bacterii aerobe care se dezvoltă la 37oC (NTG)
Principiul metodei: Se determină numărul total de bacterii aerobe ce se dezvoltă la 37oC,
stabilind gradul de impurificare bacteriană a apei.
Mod de lucru: 1. Însămânţarea
Din proba de apă de analizat, bine omogenizată prin mişcări de rotaţie în plan orizontal al
flaconului, se ia cu o pipetă 1 cm3 şi se introduce într-o placă Petri.
În cazul probelor de apă de fântână sau al apelor cu un conţinut mai mare de bacterii, este
necesar să se însămânţeze şi proba diluată 1/10, 1/100, etc.
În fiecare placă Petri cu proba nediluată sau diluată se introduc 10- 15 cm3 mediu geloză
nutritivă topită şi răcită la 45oC. Se omogenizează conţinutul cutiilor Petri prin mişcări de rotaţie, în
plan orizontal, în ambele sensuri, după care se lasă să se solidifice geloza. Probele se execută pe
minim 2 plăci.
Pe capacele cutilor Petri se notează numărul probei, diluţia, data însămânţării etc.
2.Efectuarea diluţiilor
Într-o eprubetă care conţine 9 cm3 soluţie de lucru de apă tamponată sterilă se introduce 1 cm3
de probă de apă (diluţia 1/10) cu pipeta de 1 cm3 şi se omogenizează conţinutul. Cu o altă pipetă de
1 cm3 se trece 1 cm3 din diluţie 1/10 într-o altă eprubetă care conţine 9 cm3 soluţie de lucru de apă
tamponată sterilă (diluţia 1/100). Se procedează la fel pentru obţinerea diluţiei dorite.
3.Incubarea
Cutiile Petri însămânţate şi acoperite se introduc cu capacul în jos, în termostat la 37oC +/-
0,5oC, timp de 48 h.
4. Stabilirea numărului total de germeni
Se numără coloniile care sau dezvoltat atât la suprafaţa cât şi în interiorul gelozei cu ochiul
liber sau cu lupa.
5. Calcul numărul total de bacterii aerobe ce se dezvoltă la 37oC pe cm3, se calculează cu formula:
Σ(nxd)
Bacterii = (bacterii totale/cm3)
N
12
în care
n – numărul total de colonii ce s-au dezvoltat pe o placă Petri
d – inversul diluţiei probei însămânţate
N – numărul de plăci Petri luate în calcul
14.3. Determinarea numărului probabil de bacili coliformi totali
Determinarea numărului probabil de bacili coliformi totali se pune în evidenţă prin testul de
prezumţie (examenul preliminar) şi se confirmă prin testul de comfirmare (examenul definitiv).
A. Testul de prezumţie (examenul preliminar)
• Pentru apa recoltată din alte instalaţii centrale ( rezervor şi reţea de distribuţie) se analizează
o probă de 100 cm3, din care se însămânţează 50 cm3 probă într-un flacon care conţine 50 cm3
mediu bulion bilă lactoză, dublu concentrat şi câte 10cm3 probă în câte 5 eprubete care conţin
fiecare 10cm3 mediu bulion bilă lactoză, dublu concentrat.
• Pentru apa recoltată din surse locale (fântâni, izvoare) se însămânţează: câte 10cm3 probă de
apă în câte 5 eprubete care conţin fiecare 10cm3 mediu bulion bilă lactoză, dublu concentrat.
câte 1cm3 probă de apă în câte 5 eprubete care conţin fiecare 10cm3 mediu bulion bilă
lactoză, dublu concentrat.
câte 1cm3 probă de apă diluată1/10 în câte 5 eprubete care conţin fiecare 10cm3 mediu
bulion bilă lactoză, dublu concentrat.
Flacoanele şi eprubetele însămânţate se introduc în termostat şi se incubează la 37oC +/-
0,5oC, timp de 48h. După 24 h se face o primă citire şi trecere pe mediu geloză- lactoză- eozină-
albastru de metilen, pentru testul de confirmare, pentru flacoanele şi eprubetele unde se constată
tulburare şi degajare de gaze, minim 10% din înălţimea tubului. Se consideră pozitive tuburile în
care se constată fermentarea lactozei cu producere de gaz în tuburile de fermentare (minim 10% din
înălţimea tubului). În continuare eprubetele se ţin în termostat până la 48 h.
B. Testul de confirmare (examenul definitiv)- determinarea coliformilor fecali
Pentru a preciza dacă fermentarea a fost produsă de bacili coliformi, din fiecare flacon sau
eprubetă, considerată pozitivă la testul prezumtiv se fac însămânţări cu ansa, în prealabil flambată
pe mediul geloză- lactoză- eozină- albastru de metilen (mediu Levin). Se fac dispersii în striuri pe
sectoare, pentru obţinerea de colonii izolate pe o placă Petri, cel mult 5- 6 sectoare. Se incubează
plăcile la termostat la 37oC +/- 0,5oC,timp de 24h.
Prezenţa bacililor coliformi se confirmă dacă s-au dezvoltat colonii caracteristice (colonii
plate de culoare albastru- violet închis, cu luciu metalic sau bombate) etc.
Stabilirea numărului probabil de bacili coliformi totali se face cu ajutorul tabelelor 8 şi 9, conform
STAS 3001-91

13
 Calculul bacteriilor coliforme totale/100cm3 apă din alte instalaţiile centrale
Tabel 8
Numărul flacoanelor sau eprubetelor pozitive din Numărul probabil de germeni
O eprubetă conţinând câte cinci eprubetă conţinând câte 10 coliformi/100cm3 probă de apă
50 cm3 probă de apă cm3 probă de apă
0 0 0
0 1 1
0 2 2
0 3 4
0 4 5
0 5 7
1 0 2
1 1 3
1 2 6
1 3 9
1 4 16
1 5 Peste 16
Exemplu: S-au confirmat numai 2 eprubete cu câte 10 cm3 probă de apă, ca fiind pozitive şi nici una
de 50 cm3. Rezultat conform tabelului :0-2 = 2 bacili coliformi / 100 cm3 apă
Calculul bacteriilor coliforme totale/100 cm3 apă pentru apa recoltată din surse locale
Tabel 9
Numărul eprubetelor pozitive din Numărul Numărul eprubetelor pozitive din Numărul
Cinci cinci Cinci probabil Cinci Cinci Cinci probabil de
eprubetă eprubete eprubete de eprubetă eprubetă eprubete germeni
conţinând conţinând conţinând germeni conţinând conţinând conţinând coliformi/100c
câte 10 câte 1 cm3 câte 10 coliformi/ câte 10 câte 1 cm3 câte 10 cm3 m3 probă de
cm probă probă de cm3 probă
3
100cm3 3
cm probă probă de probă de apă
de apă apă de apă probă de de apă apă apă diluată
diluată apă 1/10
1/10
0 0 0 Sub 2 4 2 1 26
0 0 0 2 4 3 0 27
0 1 0 2 4 3 1 33
0 2 0 4 4 4 0 34
1 0 0 2 5 0 0 23
1 0 1 4 5 0 1 31
1 1 0 4 5 0 2 43
1 1 1 6 5 1 0 33
1 2 0 6 5 1 1 46
2 0 0 5 5 1 2 63
2 0 1 7 5 2 0 49
2 1 0 7 5 2 1 70
2 1 1 9 5 2 2 91
2 2 0 9 5 3 0 79
2 3 0 12 5 3 1 109
3 0 0 8 5 3 2 141
3 0 1 11 5 3 3 175
3 1 0 11 5 4 0 130
3 1 1 14 5 4 1 172
3 2 0 14 5 4 2 221
3 2 1 17 5 4 3 278
3 3 0 17 5 4 4 345
4 0 0 13 5 5 0 240
4 0 1 17 5 5 1 348
4 1 0 17 5 5 2 542
4 1 1 21 5 5 3 918
4 1 2 26 5 5 4 1600
4 2 0 22 5 5 5 peste 1600
14
Exemplu: S-au confirmat 5 eprubete cu câte 10 cm3 probă de apă, 3 eprubete cu câte 1 cm3 probă de
apă şi o eprubetă cu 1 cm3 din diluţia 1/10. Rezultatul: un număr probabil de 109 bacili coliformi
totali/100cm3 probă de apă. Normele maxim admise sunt reglementate de STAS 1342/91
1.4.4. Determinarea streptococilor fecali
Principiul metodei:
Punerea în evidenţă a streptococilor fecali prin testul de prezumţie prin însămânţarea probei(şi/sau a
diluţiilor decimale)într-un număr de flacoane şi eprubete cu mediu de îmbogăţire lichid la
37±0,5oC. Reacţia pozitivă este evidenţiată prin testul de confirmare într-un mediu lichid selectiv la
temperatura de 44±0,5oC, timp de 24 h, sau pe un mediu selectiv solid la temperatura de 44±0,5oC
timp de 48 h.
Mod de lucru:
Testul de prezumţie:
• Pentru apa recoltate din instalaţii centrale – se însămânţează un volum de 100 ml probă din
care se însămânţează:
- 50 ml probă într-un flacon care conţine 50 ml mediu bulion azidă de sodiu dublu concentrat şi
câte
- 10 ml probă în câte 5 eprubete care conţin fiecare 10 ml în mediu bulion azidă de sodiu dublu
concentrat
• Pentru apa recoltată din surse locale şi alte categorii de apă decât cele potabile: -
însămânţează astfel:
- câte 10 ml probă de apă în câte 5 eprubete care conţin fiecare 10 ml mediu bulion azidă de
sodiu dublu concentrat
- câte 1ml probă de apă în câte 5 eprubete care conţin fiecare 10 ml mediu bulion azidă de
sodiu dublu concentrat
- câte 1ml probă de apă diluată 10-1în câte 5 eprubete care conţin fiecare 10 ml mediu bulion
azidă de sodiu dublu concentrat
Incubarea se face la 37±0,5oC timp de 48 h, se face apoi citirea urmată de treceri din toate
flacoanele şi eprubetele (unde se constată apariţia turbidităţii cu sau fără sediment) pentru testul de
confirmare
Testul de confirmare:
- se face în mediu lichid, se trec cu o pipetă Pasteur una sau două picături din fiecare flacon sau
eprubetă considerată pozitivă la testul de prezumţie, în câte o eprubetă cu mediu bulion azidă de
sodiu şi brom cresol purpur.
Incubarea se face la 44±0,5oC timp de 24 h.
15
Virarea culorii mediului în galben cu sediment pe fundul eprubetei, atestă prezenţa streptococilor
fecali în apă. Când confirmarea streptococilor fecali se face pe mediu solid, din fiecare flacon sau
eprubetă considerată pozitivă la testul de prezumţie, se fac însămânţări cu ansa pe mediu agar
glucoză azidă de sodiu trifenil tetrazol clorură.
După incubarea la 44±0,5oC timp de 48 h. Coloniile de streptococi fecali ce se dezvoltă sunt de
culoare roz, roşu-aprins, rotunde, cu marginea regulată, cu aspect mucos.
Calculul: la fel ca în cazul coliformilor fecali.

14.5. Controlul apei potabile din unităţile de industrie alimentară autorizate pentru export în
Uniunea Europeană
Controlul de laborator al apei potabile din unităţile de industrie alimentară autorizate pentru
activitatea de export în Uniunea Europeană, se face conform Directivei Consiliului Uniunii
Europene 98/83/EC din 03/11/1998, care prevede următorii parametrii de analizat:
Nr. Parametrul Valoarea maximă admisă Metoda de
crt a parametrului analiză
1 Clostridium perfringens (spori)1 0/100 ml Dir. CUE 98/83
2. Bacterii coliforme 0/100 ml STAS 3001/91
3. Escherichia coli 0/100 ml STAS 3001/91
4. NTG LA 22 oC 100/ml STAS 3001/91
5. NTG LA 37 oC 20/ml STAS 3001/91
6. Amoniu 0,50/l STAS 6328/61
7. Cloruri 250 mg/l STAS 3049/52
8. Clor rezidual (Cl2) 0,10-0,25 mg/l STAS 6364/78
9. Azotiţi (NO2) 0 mg/l STAS 3048-2/77
10. Oxidabilitate (substanţe organice 10 mg/l STAS 3002/61
oxidabile ml/l permanganat de potasiu)
11. Fier 0,200 mg/l STAS 3086/68
12. pH 6,5-9,5 STAS 6325/75
13. Culoare Fără modificări STAS 3001/91
14. Miros Fără miros STAS 3001/91
15. Gust Fără gust STAS 3001/91
16. Turbiditate Nesesizabilă STAS 3001/91
1
= acest parametru se cercetează numai la apa potabilă provenită din surse de suprafaţă sau care
poate fi influenţată de apa de suprafaţă.

Limite acceptate în controlul microbiologic al apei:

• apa din surse centrale:
- Bacteriile coliforme – abs/100 ml sau max. 3 (dacă nitriţii sunt absenţi)
- NTG max. 20/ml
- Coliformii fecali 0/100 ml
• apa din surse locale:
- Bacteriile coliforme – 10/100 ml
- NTG max. 300/ml
- Coliformii fecali 0/100 ml
16
 15. EXAMEN MICROBIOLOGIC GENERAL PENTRU DEPISTAREA GERMENILOR
PATOGENI DIN PRODUSELE ALIMENTARE
Izolarea şi identificarea microorganismelor patogene care se pot întâlni în alimente,
reprezintă o problemă de siguranţă a sănătăţii publice, fiind considerată o analiză dificilă datorită
faptului că de cele mai multe ori alimentele sunt contaminate concomitent cu numeroase specii din
cele mai diverse grupe.
Principalele bacterii considerate patogene pentru om şi contaminante frecvente a alimentelor
sunt: Salmonella, Staphilococus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocitogenes, Escherichia coli,
Clostridium perfringens.
15.1. Salmonella. Salmonelele sunt enterobacterii Gram negative patogene pentru om şi
animale, care fermentează glucoza cu producere de gaz, produc de obicei hidrogen sulfurat, folosesc
citratul ca unică sursă de carbon, nu fermentează lactoza, nu produc indol şi nici urează şi prezintă
structură antigenică specifică pusă în evidenţă prin reacţii serologice. Se identifică pe 25g produs
prin trei etape:
1. O primă etapă ar fi etapa de preîmbogăţire ce constă în inocularea probelor într-un mediu lichid
neselectiv (apă peptonată tamponată) şi incubarea la 35oC sau la 37oC, timp de 16 h până la 20 h.
Preâmbogăţirea se foloseşte pentru produsele congelate sau deshidratate pe mediul apă peptonată
tamponată.
Mod de lucru: se însămânţează 25 g produs (carne tocată, semipreparate din carne tocată sau 50 g
preparate din carne sărată şi sau afumate, mezeluri, salamuri crude uscate) în 100 respectiv 200 ml,
mediul de preâmbogăţire. Mediile însămânţate se incubează la 35oC sau la 37oC, timp de 16 h până
la 20 h.
2. Se face trecere pe un mediu de îmbogăţire (selectiv). Îmbogăţirea, constă în inocularea a două
medii lichide selective cu cultură din mediul de preîmbogăţire sau din produsul omogenizat urmând
incubarea în paralel la temperatură diferită în funcţie de mediul utilizat: astfel atunci când folosim
ca mediu de îmbogăţire selectivă:
mediul RV = bulion cu verde malahit şi clorură de magneziu, incubarea se face la 42oC, timp de
24h; iar în cazul mediului bulion selenit-cistină, incubarea se face timp de 24 h şi 24h suplimentare
la 35oC sau la 37oC.
3. Urmează etapa de izolare ce constă în însămânţarea a două medii solide selective din culturile
obţinute din etapa de îmbogăţire. Se folosesc următoarele medii: agar cu roşu fenol şi verde briliant
– Edel şi Kampelmacher, atunci când standardul internaţional nu necesită înlocuirea cu alt mediu
obligatoriu şi un alt mediu solid, ce se lasă la latitudinea laboratorului de analize* mediu Istrati-

17
Maitert, Mac Conkey, Rajhans, etc). Incubarea se face la 35 sau 37oC, timp de 20 h până la 24 h (şi
din nou de la 18 h până la 24 h, dacă este necesar), conform SR ISO 6579/1997 . Se va lua în
considerare doar coloniile roz cu virarea mediului în roşu pe mediul Edel şi Kampelmacher, colonia
de culoare albastră cu sau fără punct negru la mijloc, pe mediul Istrati-Maitert; coloniile roz-cenuşii
pe mediul Mac Conkey şi coloniile
violet –închis de pe mediul Rajhans
4. Urmează etapa de confirmare ce constă în repicarea coloniilor prezumtive de Salmonella şi
determinarea caracterelor biochimice sau serologice. Se aleg cinci colonii ce vor fi trecute pe medii
biochimice care se incubează la 35-37oC timp de 18 până la 24 de ore.
Pentru obţinerea unui rezultat mai rapid, coloniile suspecte de pe mediile selective, se vor
inocula pe un mediu politrop TSI ( triple sugar iron) mediul MIU (mobilitate, indol, uree) mediul
MILF ( mobilitate, indol, lizindecarboxilază, fenilalanindezaminază).
Interpretarea testelor biochimice este indicată în tabelul 10
Tabelul 10.
Test Reacţie pozitivă Procentajul însămânţărilor de
sau negativă Salmonella, care prezintă reacţia
Glucoză, TSI(formare acid) + 100
Glucoză, TSI(formare gaz) + 91,9
Lactoză, TSI - 99,2
Zaharoză, TSI - 99,5
Hidrogen sulfurat,TSI + 91,6
Descompunerea ureei - 99,0
Decarboxilarea lozinei + 94,6
Evidenţierea B-galactozidazei - 98,5
Reacţia Voges-Proskaner - 100
Evidenţierea indolului - 98,9

Cercetarea prezenţei antigenelor “O”, “Vi” sau “H” de Salmonella se efectuează prin aglutinare pe
lamă cu sărurile adecvate, din colonii pure şi după eliminarea tulpinilor autoaglutinante.

A. Eliminarea tulpinilor autoaglutinabile

Se depune pe o lamă de sticlă curată o picătură de soluţie salină. Se dispersează, în această picătură
o fracţiune din colonia de testat, în aşa fel, încât să se obţină o suspensie omogenă şi tulbure .Se
mişcă lama timp de 30 s. până la 60 s. Se observă rezultatul pe fond negru, de preferinţă cu ajutorul
unei lupe.
Dacă bacteriile se adună în grămezi mai mult sau mai puţin distincte, tulpina este
considerată autoaglutinabilă şi nu mai trebuie supusă examinărilor ulterioare, punerea în evidenţă a
antigenelor nemaifiind posibilă.

18
B Evidenţierea antigenelor “O”
Dintr-o colonie pură cunoscută ca neaglutinabilă se procedează ca la punctul A, dar în locul
soluţiei saline, se foloseşte o picătură de antiser “O”. Dacă se produce aglutinare, reacţia este
considerată pozitivă.
Se utilizează serurile poli şi monovalente, unul după altul.
Evidenţierea antigenelor “Vi”
Se procedează ca la punctul A, utilizând o picătură de antiser “Vi”, în locul soluţiei saline.
Dacă se produce aglutinare, reacţia este considerată pozitivă.
Evidenţierea antigenelor “H”
Se însămânţează un agar nutritiv semisolid, cu o colonie pură neaglutinabilă.
Se incubează la 35oC sau la 37oC(conform acordului), timp de 18 h până la 24 h. Se utilizează
această cultură pentru examenul antigenelor “H”, procedând ca la pct.A, dar folosind o picătură de
antiser “H”, în locul soluţiei saline. Dacă se produce aglutinare, reacţia este considerată pozitivă.
Interpretarea reacţiilor biochimice şi serologice se observă în tabelul de mai jos

Tabelul 11
Reacţii biochimice Autoaglutinare R.serologice Interpretare
Tipice NU Antigene “O”, “Vi” Tulpini considerate
Sau “H” pozitive ca fiind Salmonella
Tipice NU Toate reacţiile Ar putea fi
negative Salmonella
Tipice DA Neefectuate “
Lipsa reacţiilor tipice NU Antigene “O”,”Vi” sau “
“H” pozitive
Lipsa reacţiilor tipice NU Toate reacţiile Nu sunt considerate
negative ca fiind Salmonella

19
 I PREÎMBOGĂŢIRE 25 g (ml) produs
200-225 ml apă peptonată tamponată

După incubare ,din mediul de

preîmbogăţire se face trecerea
pe două medii de îmbogăţire,

Incubare: la 35 –37oC, timp de 16-24 h

0,1 ml 10 ml

II ÎMBOGĂŢIRE
Bulion cu verde malahid şi Bulion selenit cistină
clorură de magneziu (mediu RV)
Incubare: 42oC timp de 24 h Incubare:la 35o sau 37oC, 24 h şi 24 h
III IZOLARE PE MEDII SELECTIVE
prin pasare cu ansa din mediul de îmbogăţire şi incubare la 35-37oC, 20-24 h

Mediu obligatoriu: Edel şi Kampelmacher

Mediu opţional: Istrati-Meitert Mediu opţional: Mac Conkey

Mediu opţional: Rajhans

IV CONFIRMARE

Cinci colonii caracteristice se însămânţează pe agar nutritiv

Incubare la 35-37oC, 18-24 h

Confirmări biochimice confirmări serologice - tipizarea

Interpretarea rezultatelor

20
Schema modului de lucru pentru identificarea germenilor din genul Salmonella- conform SR
EN –12824/2001

Proba de analizat, 25g

+
Mediul de preimbogatire (neselectiv- apă peptonată tamponată), 225 ml
Incubare la 35°C sau la 37°C timp de 16 h pana la 20 h

0,1 ml cultura Imbogatire selectiva 10 ml cultura

Bulion cu verde malahit si Bulion selenit-cistina

clorura de magneziu (mediul RV)

Incubare la 42°C timp de 24 h Incubare la 35°C sau 37°C, timp

de 24 h si 24 h suplimentare

Izolare pe medii selective,

in cutii Petri

Mediul de izolare selectiv solid I Mediul de izolare selectiv solid II

(agar cu roşu fenol şi verde briliant- Edel şi Kampelmacher) (La latitudinea laboratorului de
analiză)

Incubare la 35°C sau la 37°C, timp de 20 h pana la

24 h (si din nou de la 18 h pana la 24 h, daca este necesar)

Cinci colonii caracteristice, daca este necesar

Insamantare pe agar nutritiv

Incubare de la 35°C pana la 37°C, timp de 18 h pana la 24 h

Confirmari biochimice Confirmari serologice

Interpretarea rezultatelor

21
15.2. Stafilococul. Stafilococii sunt bacterii Gram pozitive,de formă cococidă, care pe frotiu
prezintă o dispoziţie caracteristică sub formă de ciorchine .
Staphylococus aureus se raportează la 1g produs. Din produsele solide se determină astfel:
se mojarează 5g de produs cu 45 ml ser fiziologic sau 10 g produs cu 90 ml ser fizilogic steril
(diluţia 1). Se ia 1ml din mojarat şi se introduce pe mediul lichid selectiv (mediul hiperclorurat cu
manită- de culoare roşie sau mediul Gilotti Cantoni), care se incubează la 37oC timp de 24 de ore.
Din eprubetele care au prezentat reacţii pozitive (ex: mediul hiperclorurat cu manită-culoarea
mediului virează din roşu în galben).cu ansa, prin striere se etalează la suprafaţa mediului Chapman
solid sau mediului Baird-Parker gata turnat în plăci Petri, apoi se incubează la 35-37oC, 24-48 de
ore.
Confirmare: Coloniile de culoare galben-portocalii, punctiforme, bombate (mediul Chapman) sau
coloniile negre, strălucitoare şi convexe, înconjurate de o zonă clară care poate fi parţial opacă
(mediul Baird-Parker), se prelevează cu ajutorul ansei bacteriologice sterile şi se însămânţează într-
o eprubetă cu bulion de inimă -creier care se incubează la 35-37 oC, timp de 20-24 h. Se adaugă în
mod steril câte 0,1 ml din fiecare cultură, la câte 0,3 ml plasmă citratată, în eprubete cu diametrul
de max 10 mm şi se incubează la 35-37 oC. Se examinează coagularea plasmei după 4-6 h. Se
consideră că reacţia este pozitivă atunci când coagulul ocupă mai mult de ¾ din volumul ocupat
iniţial de lichid. În paralel se efectuează controlul prin adăugare de 0,1 ml bulion de inimă –creier
steril la 0,3 ml plasmă citratată. După incubare în eprubeta martor nu trebuie să existe semne de
coagulare. O altă metodă o constituie testul latexaglutinării care constă în prelevarea cu ansa
bacteriologică sterilă a unei colonii selecţionate şi punerea în contact cu particulele latex. Reacţia
pozitivă constă în formarea unei aglutinări cu grunji evidenţi. Pentru evidenţierea toxinei
stafilococice se foloseşte tehnica ELISA. Modul de lucru şi confirmarea prezenţei stafilococului se
face conform STAS ISO 6888/1992.

22
PROBA
Tehnica diluţiilor decimale
ALIMENT

.
1ml 1 ml ………………………… 1 ml

Reacţie
+ -

Din tuburile + (galbene) se pasează cu ansa pe

suprafaţa mediului Chapman solid

10-1 10-2 10-6

………………….

Mediul Chapmann, lichid

IMBOGĂŢIRE
Rezultat pozitiv după
incubare la37oC 24 h

Mediu Chapman solid

CONFIRMARE

23
15.3. Bacteriile coliforme. Escherichia coli
Coliformele sunt bacterii care la temperatura de 30oC, 35oC, 37oC, provoacă fermentarea lactozei cu
producere de gaz.
Bacteriile coliforme se cultivă, conform STAS ISO 4831, 4832/1992 pe medii de îmbogăţire
selective: bulion cu triptoză şi lauril sulfat (ce poate fi mediu dublu concentrat sau mediu simplu
concentrat), BBLV (bulion lactozat cu bilă şi verde briliant)- simplu şi dublu concentrat, mediul ce
se introduce în eprubete cu tub Durham pentru a putea urmări degajarea de gaze.
Din produsul omogenizat şi din diluţiile acestuia se însămânţează câte 1 ml într-o eprubetă ce
conţine unul din mediile selective enumerate mai sus.
–1
În cazul produselor solide (când se verifică prezenţa în 1 g produs), din fiecare diluţie (10 ) se
inoculează 10 ml într-o eprubetă cu 10 ml mediu BBLV dublu concentrat.
În cazul că se urmăreşte determinarea numărului cel mai probabil, se inoculează din produsul
omogenizat şi din fiecare diluţie, câte 1 ml în 3 eprubete cu mediu, iar stabilirea numărului se face
folosind tabelele McCrady. Eprubetele cu mediul însămânţat se incubează la 37oC, 24-48 h.
Dezvoltarea unei culturi bacteriene cu gaze în tubul de fermentaţie, formată exclusiv din
bacili sau cocobacili Gram negativi (frotiu), se consideră prezenţă de bacterii coliforme.
În funcţie de diluţii sau de numărul de eprubete din fiecare diluţie care conţin bacterii coliforme, se
raportează prezenta sau absenţa la cantitatea de produs sau numărul de b. coliforme pe g/ml produs.
15.4. Escherichia coli. Din cultura dezvoltată cu ajutorul unei anse bacteriologice sterile, se striază
pe agarul Levine. Plăcile însămânţate se incubează la 35-37oC, 24 h. Coloniile caracterisice pentru
E. coli închise la culoare cu luciu metalic verzui sunt considerate E. coli prezumtive. Pentru
confirmare din două sau mai multe colonii caracteristice se însămânţează o eprubetă cu BBLV sau
bulion EC sau bulion triptoză şi lauril sulfat cu tuburi de fermentare; o eprubetă cu apă triptonată şi
un agar nutritiv înclinat. Aceste 3 eprubete se incubează la 45oC timp de 24 h, considerându-se
confirmată E. coli când s-a înregistrat producere de gaze în tubul Durham, reacţia indolului pozitivă
(după adăugarea reactivului Erlich-Kovacs în apa triptonată) şi creşterea de colonii specifice pe
agarul înclinat (colonii mici de 2-6 mm diametru, opace nepigmentate de tip S).
De pe mediul cu agar înclinat se face o seroaglutinare rapidă pentru identificarea antigenului
somatic O cu seruri polivalente şi teste biochimice, conform tabel 16. Determinarea E. coli se face
conform STAS ISO 7251/1996.

24
10-1 10-2 ……10-6

Evidenţierea lui E. coli

1 ml 1 ml 1 ml

+
CONFIRMARE E. COLI

Reacţie de seroaglutinare rapidă pe

lamă +

25
 Principalele caractere biochimice ale enterobacteriilor
Tabel 12
Denumirea Fenil Ureează Produ- Produ- Lisin Folosi- Mobilit
bacteriilor alanin- cere de cere de decarbo- rea ate la
dezami indol H2 S xilază citratu- 37oC
-nază lui
Escherichia coli - - + - ± - ±
Yersinia - + ± - - / -
enterocolitica
Shigella sp. - - ± - - - -
Salmonella sp. - - - + + + +
Citobacter freundi - ± - + - + +
Enterobacter - ± - - - + +
cloacae
Seratia marcescens - ± - - + + +
Proteus vulgaris + + + + - ± +
± diferă de la o bacterie la alta

15.5. Bacillus cereus. Bacillus cereus este un germen Gram pozitiv se întâlneşte în produsele
alimentare deshidratate (lapte praf, etc) şi se identifică conform STAS ISO 7932/1997. Pentru
confirmarea lui se foloseşte ca mediu de cultură mediul MYP (emulsie de gălbenuş de ou) soluţie
de polimixină .
Din proba de analizat după o mojarare sau prelucrare în stomacher corespunzătoare se va
lua cu o pipetă sterilă 0,1 ml eşantion pentru analiză şi se depune pe suprafaţa mediului agarizat
pentru izolare, mediul existent în două plăci Petri. Atunci când este necesar se repetă operaţia şi
pentru diluţiile decimale următoare.
Se dispersează inoculul cu ajutorul baghetei de etalare sterilă, pe suprafaţa mediului, evitându-se
atingerea marginilor cutiei Petri. Se incubează la 30oC, 18- 24 de ore. Dacă coloniile nu sunt
vizibile se prelungeşte incubarea încă 24 h.
Coloniile suspecte a fi Bacillus cereus sunt mari, de culoare roz şi aproape întotdeauna înconjurate
de o zonă de lecitinoliză (zonă de precipitare).
Confirmarea: - se face astfel:

26
1. Pe mediul cu agar glucozat: - coloniile suspecte se însămânţează, în picătură în centrul eprubetei
cu agar glucozat recent topit. Se incubează în etuvă la 30oC, timp de 24 h. Reacţie pozitivă: culoarea
galbenă a zonei însămânţate.
2. Mediul pentru reacţia Voges- Proskauer- se însămânţează coloniile izolate în eprubete cu mediul
VP. Se incubează în etuvă la 30oC, timp de 24 h.
Reacţie pozitivă: coloraţie roz-eozin.
3. Mediul cu nitrat:- Idem mai sus, cu deosebirea că însămânţarea se face în mediul cu nitrat.
Reacţie pozitivă: apariţia culorii roşii în interval de 15 minute.
Pentru definitivarea numărului de B. cereus/g (ml) se numără coloniile tipice din cele două plăci
inoculate cu aceaşi diluţie, în care s-au dezvoltat coloniile izolate. Numărul obţinut se împarte la 2
şi se înmulţeşte cu diluţia. Confirmarea coloniilor tipice dezvoltate pe mediile selective se face prin
confirmări biochimice – fermentarea glucozei, Voges-Proskauer şi reducerea nitratului, sau prin
confirmare microscopică. Se consideră colonii confirmate cele care dau reacţii de fermentare a
glucozei, reducerea nitratului şi Voges- Proskauer pozitive, iar la examenul microscopic se observă
bacili aşezaţi în lanţuri scurte cu sporul central sau subterminal, ce conţin globule de grăsime
intracelular.
Reprezentarea schematică a identificării Bacillus cereus:
5 g lapte praf
Proba de analizat
reconstituită
45 ml ser fiziologic

Se depune cu ansa o
picătură în centrul plăcii
Petri

REACŢIE +

Incubare la 30oC,
24-48 h Confirmare

mediu cu agar glucozat

mediu pentru reacţia Voges-Proskauer
mediu cu nitrat
biochimic şi microscopic

27
15.6. Listeria. Listeria cuprinde 5 specii larg răspândite în natură, care pot fi diferenţiate pe baza
caracteristicilor biochimice. Cea mai importantă este Listeria monoitogenes. Faţă de alte bacterii
nesporulate este mai rezistentă la acţiunea factorilor de mediu. Se distruge la 63oC în zece minute
sau la 65oC în două minute. Listeria se prezintă sub sub formă de bastonaşe mici, singure sau în
palisadă, Gram pozitive, aerobe, asporogene. Se dezvoltă pe medii uzuale, dezvoltarea mai
abundentă se observă pe medii cu sânge.
Pentru identificare se analizează produsul conform SR ISO 11290/1996 Din alimentul
incriminat, 25 grame se introduc pe medii de îmbogăţire selective lichide pentru o îmbogăţire
primară (bulion semi Fraser) după care se incubează la 30oC timp de 24 de ore. Se execută şi o
îmbogăţire secundară într-un bulion cu concentraţie normală de agenţi selectivi (bulion Fraser),
incubare la 35-37 oC , 48 h. Din culturile obţinute se pasează pe două medii solide selective Oxford,
se incubează 24 de ore la 30- 35 - 37oC aerob şi Palcam cu incubare 24- 48 de ore la 30- 35 - 37oC,
microaerob.
Modul de executare a testelor de identificare – confirmare Cutiile obţinute pe suprafaţa agarului
nutritiv se supun următoarelor examene pentru confirmare şi identificare:
Reacţia catalazei: o ansă de cultură se introduce într-o picătură de peroxid de hidrogen 3%, depusă
pe o lamă de sticlă. Apariţia imediată a bulelor de gaz se interpretează ca reacţie pozitivă şi este
specifică pentru listerii.
Colorarea cu metoda Gram. Listeriile apar ca bastonaşe, relativ subţiri - Gram-+
Mobilitatea: Cultura se însămânţează într-o eprubetă cu bulion nutritiv, se incubează la 25oC, timp
de 18-24 h, până mediul se tulbură uşor. O picătură de cultură pusă între lamă şi lamelă se
examinează la microscop. Listeriile apar ca bastonaşe scurte, subţiri. O alternativă a testului de
mobilitate este reprezentată de inocularea culturii într-o eprubetă de reacţie cu agar moale, în
coloană. Inocularea se face prin înţeparea agarului în mijlocul coloanei. După o incubare de 48 h la
25oC, cultura de Listeria ssp. se dezvoltă sub forma unei umbrele. Incubarea se poate prelungi până
la 5 zile.
Pentru identificarea şi confirmarea speciei L. monocytogenes, culturile care au răspuns pozitiv la
testele de mai sus se supun următoarelor teste suplimentare:
Testul hemolizei. Suprafaţa agarului cu sânge de oaie se striază cu cultura de verificat. Se incubează
24 h la 35-37oC şi se examinează culturile dezvoltate; L. monocytogenes formează colonii mici cu o
zonă clară în jur, specifică pentru hemolizinele β, L.innocua este hemolitică, L. seeligeri poate
prezenta o activitate hemolitică slabă, iar L. ivanovii are o activitate hemolitică puternică, formând
în jurul coloniilor zone clare, întinse. Utilizarea diferitelor substanţe hidrocarbonate – menţionate în
tabelul 13 , dintre care D- glucoza, D – xiloza, D – manita şi L – ramnoza sunt absolut obligatorii

28
Testul CAMP. Pe suprafaţa agarului cu sânge de oaie turnat în cutii Petrii se striază în linie dreaptă,
pe tot diametrul cutiei, cultură de 24 h de S aureus şi R. equi, la distanţă de 3-4 cm una de alta şi pe
cât se poate paralele. Tulpinile de testat se striază pe suprafaţa agarului, perpendicular pe primele
două strii, în aşa fel ca striile culturilor de testat să se oprească la 2-3 mm de acestea. Răspunsul
caracteristic pentru fiecare specie este prezentat în tabelul 13
Răspunsul necesar identificării speciilor de Listeria
Tabel 13
Specia Hemoliză Producere de acid din Testul CAMP
Rhamnoză Xiloză S. aureus R. equi
L. monocitogenes + + - + - sau +
L. inocua - v - - -
L. ivanovii + - + - +
L. seeligeri (+) - + (+) -
L. welshimeri - v + - -
L.grayi - - - - -
V = reacţie variabilă; (+) = reacţie slabă; + = > 90 % reacţii pozitive; - = nici o reacţie

29
 DECELAREA LISTERIEI MONOCYTOGENES
ISO 11290/1996
Diagrama modului de lucru
Porţiuni din proba
(x g sau x ml)
+
Mediul de îmbogăţire primară ( demi Fraser)

Incubare la 30 OC timp de 24h±2 h

0,1 ml cultură în 10 ml mediul de striere pe agar OXFORD 1)

îmbogăţire secundară (Fraser) şi confirmare
agar PALCAM2)

Incubare la 35oC sau 37oC timp de 48 h±2 h

Striere pe: agar OXFORD 1)

agar PALCAM 2)

Confirmare coloraţia Gram

Reacţia catalazei
Testul mobilităţii
Producerea de acid
Testul CAMP
1)
Cutiile cu agar OXFORD se incubează timp de 24 h la 30 oC, 35 oC sau 37oC, aerob
2)
Cutiile cu agar Palcam se incubează timp de 24 h la 30 oC, 35 oC sau 37oC,micro- aerob, dacă
este necesar.

15.7. Anaerobi. Clostridium perfringens este un germen sub formă de bastonaş, Gram pozitiv,
sporogen şi capsulat, producător de hidrogen sulfurat şi de gaze prin descompunerea de zaharuri,
capabil să se dezvolte le temperaturi de 46-47oC. Identificarea lui Clostridium perfringens se
bazează pe următoarele caracteristici:
- morfologie şi proprietăţi tinctoriale specifice,
- lipsa de mobilitate (faţă de celelalte clostridii),
- fermentări cu degajare de cantităţi mari de gaze,
- temperatura de multiplicare ridicată,
- producerea de hidrogen sulfurat,
- capacitatea de a produce liza hematiilor de oaie.
30
Pentru identificarea acestuia se folosesc două metode de cultivare:
1. Din produsul de cercetat şi diluţiile acestuia se inoculează o cantitate de 1g sau 1ml într-o
eprubetă cu mediu - bulion cu ficat sau bulion cu tioglicolat sau bulion- glucoză- amidon- cistină. În
general proporţia dintre inocul şi mediul trebuie să fie de 1/5-1/10.
Se incubează 24 de ore la 45oC, după primele 5 ore de incubare ţinându-se sub observaţie din oră în
oră; orice degajare continuă de gaz din bucata de ficat, atunci proba este suspectă de contaminare cu
Clostridium perfringens.
2. Determinarea clostridiilor sulfito-reducătoare se face pe 2 eprubete cu mediu agar cu sulfit şi
azidă de sodiu, agar cu sulfit- polimixină-sulfadiazină. Din fiecare diluţie de inocul inactivat
(omorârea formelor vegetative se face la 80oC timp de 10 minute) se însămânţează câte 1 ml în cele
2 eprubete încălzite în prealabil pentru fluidificarea mediului la ∼ 45oC, după care inoculul se
omogenizează în mediu prin mişcări de rotaţie a eprubetei evitându-se formarea bulelor de aer.
Eprubetele se imersează în poziţie verticală sub jet de apă rece, pentru solidificarea rapidă a
mediului.
Se termostatează 5 zile la 44 oC, urmărindu-se din a 2-3-a zi apariţia coloniilor caracteristice (
colonii negre) şi eventuala degajare de gaze. Din acestea 5 colonii se verifică prin examen
bacterioscopic.
Confirmarea pentru Clostridium perfringens se face în baza testelor biochimice (vezi tabel 14).
Teste biochimice pentrut confirmarea lui Cl. perfringens
Tabel 14
Clostridium botulinum Clostridium perfringens
Mobilitate + -
Hidroliza gelatinei + +
Hidroliza caseinei +/- -/d
Producerea de urează - D
Producerea de lipază +/- -
Producerea de lecitinază - +
Produc. de indol - -
Prod. de H2S +/- -
Reducerea nitriţilor - D
Hemoliza +/- D
Fermentare -glucoză +/- +
-zaharoză d/- +
-lactoză - +
-manită - -
-amidon - +
+ = pozitiv; - = negativ; d = diferit de la o tulpină la alta
În cazul metodele descrise mai sus şi în tabelul 15 trebuie să existe o repetabilitate (rezultate
obţinute cu aceaşi metoda din aceaşi probă în acelaşi laborator, utilizând aceaşi aparatură, într-un
interval scurt de timp).

31
 Metode de determinare a parametrilor microbiologici
Tabel 15
Parametrii microbiologici Metode de determinare
Număr de germeni aerobi mezofili SR ISO 6610 STAS 6349/3
Număr de bacterii coliforme SR ISO 5541/1 sau SR ISO 5541/2 sau
STAS 6349/4
Număr de Escherichia coli SR ISO 11866 STAS 6349/4
Germeni patogeni Salmonella SR ISO 6785 STAS 6349/11
Număr de germeni patogeni stafilococi coagulază STAS 6349/12
pozitivi
Număr de germeni patogeni Bacillus cereus STAS 6349/9
Germeni patogeni: Listeria SR ISO 10560 SR ISO 10560
Număr de germeni patogeni Clostridium perfringens STAS 6349/10
Număr de drojdii şi mucegaiuri SR ISO 6611 STAS 6349/6

15.8. Examen micologic general

Din probele pentru analiză se recoltează din stratul superficial şi/sau din profunzimea lui o
cantitate de 5 sau 10 g, care se solubilizează prin mojarare sau prelucrare în stomacher cu 45
respectiv 90 ml ser fiziologic peptonat 0,1 % sau soluţie citrat de sodiu 2%, acesta reprezentând
diluţia 10-1. Din alimentele lichide se ia 1 ml care se omogenizează cu 9 ml ser fiziologic peptonat.
Din fiecare diluţie obţinută se însămânţează câte 1 ml în 2 plăci Petri. Mediul de cultură topit şi
răcit până la 45oC (mediul Sabouraud sau agar extract de malţ) se aduce la pH de 3,5, după care se
toarnă 10-15 ml mediul, în fiecare placă. Se omogenizează inoculul cu mediul şi se lasă să se
solidifice. Se termostatează la 25±1oC. Citirea rezultatelor se face prin numărarea CFU de drojdii
separat de cele de mucegai în ambele plăci inoculate, numărul total se împarte la 2 şi se înmulţeşte
cu factorul de diluţie. Pentru confirmarea identităţii coloniilor dubioase, se vor executa preparate
microscopice, conform examenului micologic calitativ.
Examen micologic calitativ Examenul microscopic se execută pe colonii de o săptămână în placa
iniţială sau de preferinţă prin obţinerea de colonii izolate, prin replicare. Se va urmări: topografia
generală, care poate fi neregulată sau netedă, vălurită, reliefată; textura ce poate fi catifelată,
prăfuită, pufoasă; ritmul de creştere care poate fi: rapid sau lent; pigmentarea , care poate fi de
suprafaţă sau de profunzime. Examenul cu stereolupa - urmăreşte detaliile aparatului vegetativ şi de
reproducere, pentru diagnosticul de gen.
Examinarea microscopică: se raclează cu ajutorul unei anse ac, din colonia urmărită care se
pune într-o picătură de Lugol şi se examinează cu obiectivele: 10, 20, 40; pentru a se observa spori
sau alte structuri de diagnostic. O atenţie deosebită trebuie să se acorde identificării coloniilor de
mucegaiuri cu morfologie caracteristică genurilor: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Mucor şi
Rhizopus, datorită potenţialului lor micotoxigen.

32
Examinarea drojdiilor se efectuează cu ajutorul examenului microscopic pe frotiuri colorate cu
albastru de metilen sau Gram, observându-se forma (ovală, sferică sau alungită), mărimea, care este
mult superioară bacteriilor. De asemeni se vor examina caracterele metabolice şi biochimice,
efectuându-se auxonograma pentru sursele de azot şi carbon, zimograma pentru fermentarea
zaharurilor. Identificarea drojdiilor şi verificarea purităţii tulpinei va ţine cont de legile
fermentaţiei:
- orice levură care fermentează glucoza va fermenta atât fructoză cât si manoza.
- orice levură care nu fermentează glucoza nu va fermenta nici un alt zahar.-
- nici o levură nu poate fermenta şi maltoza şi lactoza ci numai una dintre ele.

33
 Extras din Norme microbiologice conform Ordinului M.S. 975-1998
Tabel 16
N Denumirea alimentului Număr Bac- Esche- Salmone- Stafilo- Baci- Bacterii Drojdii
r total de terii richia lla coc llus sulfito- şi
cr germeni coli- coli 25 g coagu- cereus reducă- muce-
t aerobi, forme lazo toare gaiuri
mezofili pozitiv
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1. Lapte crud 1 000000 1 000 100 abs Abs 10 - -
2. Lapte consum 300 000 10 1 - - - - -
3. Lapte UHT 1) - - - - - - -
4. Lapte praf 100 000 10 1 abs 1 10 100 -
5. Produse lapte praf pentru
copii
- sub 4 luni 10 000 1 Abs. abs. abs. abs. abs. 10
- peste 4 luni 50 000 10 1 abs Abs abs - 10
6. Produse lactate acide - 100 10 abs 1 - - -
7. Iaurt cu fructe - 100 10 abs 1 - - -
8. Smântână dulce pentru
frişcă şi frişcă bătută 100 000 10 1 abs 1 - - -
9. Brânzeturi proaspete din
lapte pasteurizat (brânză
proaspătă de vacă) - 100 10 abs 10 - - -
10. Brânzeturi proaspete din
lapte nepasteurizat - 1 000 100 abs 10 - - -
(brânză proaspătă de
vacă)
11. Brânzeturi proaspete
(caş, telemea)din lapte - 10 1 abs 10 - - 100
pasteurizat
12. Brânzeturi proaspete(caş,
telemea) din lapte - 100 10 abs 100 - - 300
nepasteurizat
13. Brănză proaspătă din zer - 1 000 100 abs 10 - - -
(urdă)
14. Brânzeturi maturate în
saramură din lapte - 10 Abs abs 10 - - 1 000
pasteurizat
15. Brânzeturi maturate în
saramură din
lapte nepasteurizat - 100 10 abs 100 - - 2 000
16. Brânzeturi fermentate cu
pastă tare, semitare, - 10 Abs abs 10 - - 2 000
moale (8
17. Brânzeturi cu pastă filată
(caşcavaluri) afumate şi
neafumate - 10 Abs abs 10 - - 1 000
18. Brânzeturi frământate - 100 10 abs 10 - - 200
19. Brânzeturi topite - - - abs 10 - - -
20. Unt - 10 1 abs 1 - - 100
21. Margarină de consum - 100 10 abs Abs - - 100
22. Margarină cu lapte - 100 10 abs Abs - - 100
23. Îngheţată, torturi de - 10 Abs abs abs abs - -
îngheţată
24. Praf de îngheţată - 1 Abs abs abs abs - -
25. Carne zvântată, 20 (2
refrigerată, congelată şi abs (3 - - abs - - 1 -
organe de pasăre
26. Carne tocată şi
semipreparate din carne - 1 000 100 abs 10 10 100 -

34
 tocată
27. Preparate din carne
sărate şi/sau afumate - 100 10 abs 10 10 100 -
28. Salamuri crude uscate - - - abs 10 - - -
(tip Sibiu)
29. Mezeluri (prospături,
salamuri semiafumate) - 10 1 abs 10 abs 10 -
30. Peşte proaspăt, decapitat
şi evişcerat - 10 Abs abs 10 - 10 -
31. Peşte refrigerat sau - - - - - - 10 -
congelat
32. Icre sărate - 10 1 abs 1 - 10 -
33. Peşte sărat - 10 Abs abs 10 - - 100
34. Peşte afumat
- la cald - 10 Abs abs 10 - 100 -
- la rece - 10 Abs abs 10 - 100 100
35. Gelatină alimentară - 10 1 abs 1 - - -
36. Prăjituri cu creme 100.000 10 1 abs 1 - - -
37. Torturi cu diferite crème, - 100 10 abs abs - - -
frişcă, fructe
38. Maioneză 10000 10 Abs abs 10 - - 100
39. Vegetale congelate - 10 Abs abs - abs - 100
40. Vegetale deshidratate - 10 Abs abs abs 10 - 100
41. Paste făinoase
(macaroane, fidea) - 10 Aba abs 1 10 - 100
42. Paste cu umplutură
-ciuperci - 10 Abs - abs - - -
-carne - 10 Abs - abs 10 10 -
-brânză - 10 10 - abs - - -
43. Condimente şi
amestecuri de - 100 10 abs 10 10 1 000 1 000
condimente
44. Băuturi răcoritoare şi
sucuri de fructe cu
termen de valabilitate 300 10 Abs - - - - 10
mai mic de 14 zile
45. Băuturi răcoritoare şi
sucuri de fructe cu
termen de valabilitate 30 abs - - - - - abs
mai mare de 14 zile
46. Bere nepasteurizată
- filtrată - 1 Abs - - - - 1 000
- nefiltrată - 1 Abs - - - - 3 000
47. Bere pasteurizată - abs - - - - - 10
48. Făinuri alimentare, altele
decât făina pentru
panificăţie 100 000 100 10 - - abs - 1 000
49. Făină pentru panificaţie
şi făinuri gata pregătite (4
- - - - - 100 - 1 000
50. Pâine, chifle, cornuri - - - - - - - 100
simple(4
51. Produse de panificaţie - 10 Abs abs 1 1 - 100
umplute
52. Biscuiţi uscaţi şi biscuiţi - 10 Abs abs abs abs - abs
glazuraţi
53. Biscuiţi, fursecuri, - 100 10 abs abs abs - 100
napolitane, nuga
54. Cacao pudră, ciocolată - abs - abs abs abs - 100
tablete
55. Ciocolată umplută cu - abs - - abs abs - 100

35
 creme grase sau creme
tip fondant
56. Specialităţi din ciocolată 100.000 10 - - - - - 100
57. Siropuri din suc de fructe - - - - - - - 100
cu zahăr
58. Sirop din zahăr cu arome - - - - - - - 10
şi coloranţi sintetici
59. Arome alimentare natrale - 10 1 - - abs - 10
şi sintetice
60. Concentrate alimentare: 50000 10 Abs abs - - 100 10
supe, cuburi din carne,
legume
61. Muştar alimentar 1.000 - - - - - - 100
62. Oţet alimentar - 1 - - - - 10
63. Vin - - - - - - - 100
64. Ulei nerafinat - - - - - - - 100
65. Cafea crudă, - 100 10 - - - - 1.000
prăjită şi instant - 10 1 - - - - 100
66. Melanj din ouă praf 10 000 10 - abs 1 - - 100
67. Glucoză solidă şi - - - - - - - 100
aromatizată (5
68. Produse din grâu 10000 10 Abs - - - - 100
germinat
69. Amidon (6 - - - - - 100 - -
70. Mălai, gris - - - - - 100 - 1 000
71. Miere - - - - - - - 100
72. Polen 50 000 - - - - - - 200
73. Fructe de mare, 100.000 100 1 abs 10 - 10 -
refrigerate, congelate
74. Nuci (miez) - - - - - - - 10
75. Pepsină - 10 Abs abs 10 - - 300
76. Culturi de fermenţi - - - - - - - -
lactici (7
77. Ketchup 1000 - - - - - - 10
(1
pentru acest gen de produs se determină numai numărul total de germeni aerobi, mezofili, prin
incubare timp de 15 zile la 30oC şi apoi se face examenul organoleptic.
(2
se referă la numărul maxim de germeni/câmp microscopic pentru recoltările de suprafaţă.
(3
se referă la probe recoltate în profunzime.
(4
în afara criteriilor înscrise în tabel se mai fac determinări de spori de Bacillus subtilis (B.
mezentericus): pentru făină 100/g, pentru pâine 10/g.
(5
în afara celor două criterii înscrise în tabel se mai fac determinări de Leuconostoc- absent/ 15 g
produs
(6
se fac numai determinări ale numărului maxim de spori de Bacillus cereus.
(7
la examenul microbiologic prin culturi trebuie să fie pure şi necontaminate cu germeni patogeni.
(8
brânzeturile de tip Camembert, Taga şi Năsal nu se normează

36
 16. ANALIZA MICROBIOLOGICĂ A CĂRNII ŞI PRODUSELOR DIN CARNE
Calitatea microbiologică a cărnii reprezintă cel mai important factor în privinţa conservării
şi comercializării acesteia. Compoziţia şi originea ei o fac să fie un produs sensibil la alterare
microbiană şi chiar uneori contaminată cu germeni patogeni, răspunzători de producerea
toxiinfecţiilor alimentare.
Transformările produse de către microorganismele contaminante ale cărnii sunt direct
dependente de factorii intrinseci (compoziţie, pH, aw) cât şi de factorii extrinseci (microclimatul
spaţiilor de depozitare).
• Compoziţia chimică diferă în funcţie de specie, fiind în linii generale următoarea: apă 75%,
proteine 19%, grăsime 2,5%, hidraţi de carbon 1,2%, diferite substanţe solubile şi vitamine
1,5%.
• De asemenea şi pH-ul variază în funcţie de specie, variind între 7 îmediat după tăiere până la 5.
Valoriile < de 5,5 sunt optime, fiind nefavorabile dezvoltării microbiene.
• Valoarea aw este cuprinsă între 0,98- 0,99 ceea ce reprezintă optimul pentru dezvoltarea
microorganismelor.
Obiectivele examinării microbiologice diferă în funcţie de scop şi anume:
- aprecierea calităţii microbiologice generale;
- decelarea germenilor patogeni;
- stabilirea gradului de prospeţime;
- stabilirea cauzelor în cazul modificărilor produse în carne.
16.1. Microbiologia cărnii crude refrigerate
Carnea pentru consum public trebuie să provină de la animale sănătoase, sacrificate în
unităţi autorizate sanitar-veterinar, sub supravegherea medicului veterinar. Gradul de contaminare a
cărnii în timpul sacrificării animalelor, diferă în funcţie de tehnologia de tăiere şi igiena din unitate.
Astfel în timpul manipulării cărnii prin contactul direct cu pielea sau conţinutul tubului digestiv sau
indirect prin mâinile şi îmbrăcămintea personalului şi în unele cazuri apa folosită la spălarea
carcaselor sau aerul din spaţiile de lucru, pot mări încărcătura bacteriană normală a cărnii-
contaminare de suprafaţă. Prin prelucrările ulterioare, în special prin tranşare, ţesutul muscular din
profunzime, iniţial liber de microorganisme este contaminat.
Carnea se poate contamina ulterior sacrificării şi prin microflora spaţiilor de refrigerare,
depozitare, prelucrare.
Microorganismele care contaminează carnea se pot împărţi în microorganisme de alterare
(Microccocus 45-65%, Pseudomonas 30-50%, Bacillus 10-12% şi Aeromonas , Flavobacterium,
Enterobacteriaceae, Corynebacterium, Acinetobacter, Moraxella) şi microorganisme patogene

37
(Salmonella, E. coli, Staphilococus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum,
Campilobacter jejuni).
Frecvenţa acestor specii bacteriene diferă de la unitate la unitate, fiind condiţionată de
factorii intrinseci şi extrinseci.
Evidenţierea microorganismelor de pe suprafaţa cărnii se face prin examene de laborator a
tampoanele de sanitaţie recoltate de pe suprafaţa carcaselor şi introduse pe medii specifice
microorganismelor de alterare. În cazul controlului eficienţei măsurilor pentru reducerea
contaminării acestea se realizează prin programul de identificare a lui E. coli (E. coli/ cm2 suprafaţă
de carne). Există o relaţie strânsă între numărul iniţial de microorganisme ce poluează carnea şi
momentul apariţiei alterării; astfel cu cât numărul acestora este mai mare, alterarea apare într-un
timp mai scurt, fiind afectat termenul de valabilitate al produsului. Într-o carne neprelucrată,
menţinută în condiţii corespunzătoare de refrigerare şi ventilaţie, predomină asociaţia
Pseudomonas- Acinetobacter- Moraxella; dacă carnea este bine zvântată locul bacteriilor va fi luat
de levuri şi mucegaiuri (Trichosporon scotti, Cladosporium, etc).
16.2. Alterarea cărnii
Sunt cunoscute 2 tipuri de procese alterative:
Putrefacţia superficială. Acest tip de putrefacţie este cel mai frecvent. Putrefacţia
superficială se manifestă prin apariţia unui miros dezagreabil, înţepător, amoniacal, ihoros, miros
produs de amestecul a mai multor produşi volatili ce provin din descompunerea unor aminoacizi.
Mirosul este primul semn ce apare la scurt timp după apariţia alterării, apoi suprafaţa cărnii
devine lipicioasă. Pe suprafaţa cărnii alterate apare o mâzgă care este un mucus de culoare
albicioasă cu o grosime de 1-2 mm ce este format dintr-un covor de colonii microbiene ce
confluează vizibil (numărul de gerneni este de aproximativ 109)
Cauza principală a acestei putrefacţii este multiplicarea excesivă a bacteriilor din genul
Pseudomonas, Moraxella, Actinobacter.
Putrefacţia profundă. Această putrefacţie se întâlneşte mai rar. Apare la carcasele menţinute
la temperaturi de peste 20oC (35-45oC). Aspectul carcaselor este dezagreabil, prezintă o culoare gri-
cenuşiu.
În cazul acestei alterări se observă apariţia anaerobilor (clostridii). Triptofanul prin
descompunere duce la obţinerea de scatol, indol, substanţe cu miros caracteristic produse la început
de Clostridium perfringens şi apoi şi de alte specii de clostridii mai exigente faţă de condiţiile de
anaerobiooză ( C. hystolyticum, C. sporogens, C oedematiens). Aminoacizii cu sulf prin
descompunere duc la formarea de hidrogen sulfurat. Semnele putrefacţiei profunde apar când
densitatea lui C. perfringens ajunge la valori de 107/g. Acest lucru este posibil ţinându-se cont că C.
perfringens se divide de 4,5 ori pe oră la 39oC.
38
 Salmonelele – contaminează frecvent carnea animalelelor de măcelărie, ceea ce face ca
îmbolnăvirile produse de ele prin consumul de carne, să predomine toxiinfecţiile alimentare în cele
mai multe ţări. Contaminarea se face prin contactul cărnii cu sucul ruminal care poate conţine
Salmonella. Respectarea igienei şi a tehnologie de tranşare (temperaturi de max 10oC în spaţiile de
tranşare, folosirea sterilizatoarelor de cuţite) asigură o carne salubră, în caz contrar există condiţii de
difuzare şi multiplicare a Salmonelei.
Stafilococul aureus contaminează frecvent carcasele care au suferit mai multe manipulări până
la desfacerea în reţeaua comercială. Deşi în număr mic iniţial, el se multiplică în special atunci când
lipseşte flora concurentă şi temperaturile de depozitare depăşesc 10 oC.
Clostridiile ajung în carne de pe suprafaţa animalelor sau din microflora spaţiilor de lucru sau
împreună şi cu alte bacterii prin depăşirea barierei intestinale în cazul eviscerărilor tardive. În mod
frecvent se găseşte în profunzimea maselor musculare.
Identificarea microorganismelor enunţate mai sus se face conform procedurii descrise la
examenul microbiologic general.
16.3. Microbiologia cărnii congelate
Congelarea nu reprezintă o metodă de distrugere a germeniilor existenţi în carne, doar o mică
parte din microorganismele contaminante mor, ci doar o cale de oprire a multiplicării lor. Bacteriile
sporulate rezistă la temperaturi negative ridicate, de asemenea salmonelele nu sunt distruse de
temperaturile de congelare.
În concluzie microflora cărnii congelate este aproape identică cu ceea a cărnii înaintea de a fi
supusă procesului de congelare.
16.4. Microbiologia cărnii tocate
Încărcătura microbiană inţială a cărnii tocate depinde de încărcătura de germeni a cărnii din care
este preparată, de condiţiile în care se realizează dezosarea, tranşarea, şi procesul de tocare.
La carcasa dezosată mecanic numărul de germeni este mai mic faţă de carnea dezosată
manual. Carnea tocată obţinută în condiţii igienice are o încărcătură bacteriană de 104 bacterii/gram,
fiind de 10-100 de ori mai mare decât la carnea în carcasă.
În comerţ contaminarea creşte până la 106 bacterii/gram. Bacteriile care există în mod
obişnuit în carnea tocată sunt:
- Bacterii coliforme;
- Pseudomonas;
- Staphylococus aureus (patogen);
- Clostridium perfringens;
- streptococi fecali.
-
39
16.5. Microbiologia cărnii de pasăre
Prin carnea de pasăre se înţelege ţesutul muscular, pielea aderentă, ţesutul conjunctiv şi
organele comestibile provenite de la speciile de păsări folosite obişnuit în alimentaţia omului.
Datorită proprietăţilor sale fizico- chimice şi a componentelor (apă 58-71%, proteină 16-20%,
grăsime 2,7-28% aw 0,98-0,99%, pH 5,7-7,2%) carnea de pasăre reprezintă un mediu favorabil
dezvoltării microorganismelor. Contaminarea de suprafaţă este asigurată în principal de către
Pseudomonas, Aeromonas, Moraxella, Acinetobacter, Enterobacterii, Clostridii. Aceste bacterii se
reduc în mod semnificativ prin procesul de opărire (55-65oC). Sporii de Clostridium perfringens, E.
coli şi unele salmonele rezistă acestui proces de opărire. Deplumarea, eviscerarea şi spălarea
carcaselor reprezintă timpi tehnologici în care dacă nu s-au respectat condiţiile de igienă, numărul
de microorganisme poate creşte. Răcirea carcaselor este foarte importantă pentru numărul total de
germeni final.
Microorganismele de alterare ce contaminează carnea de pasăre sunt reprezentate în primul
rând de Pseudomonas (fluorescens, putrida) şi mai rar Aeromonas (Pseudomonas) putrefaciens,
Acinetobacter şi Moraxella. Fenomenele de alterare la carcasele de pui prelucrate corespunzător şi
depozitate la 4oC apar abia după 12 zile.
Microorganismele patogene sunt reprezentate în principal de Salmonella, Cl. perfrigens, Cl
botulinum, S. aureus, Campylobacter jejuni a căror identificare se realizează conform procedurilor
din examenul microbiologic general.
16.6. Microbiologia preparatelor din carne sărate
Calitatea microbiologică a preparatelor din carne sărate este influenţată în principal de către
factorul aw, existând şi o împărţire în două grupe:
1. produse cu aw > de 0,92 (salamurile semiuscate, baconul)
2. produse cu aw < de 0,92 (salamurile crude tip Sibiu)
În cazul primei grupe de produse, microorganismele patogene cel mai des întâlnite sunt
Salmonella şi Staphilococus aureus, ambele fiind inhibate de către un pH mic. De asemenea în
unele salamuri sunt prezenţi şi germeni din genul B. cereus şi Cl. perfringens. Deşi evidenţiat în
unele probe de bacon şi şuncă crudă, Cl. botulinum nu se multiplică şi nu elaborează toxina datorită
prezenţei nitritului.
În ceea de-a doua grupă, microorganismele patogene sunt inhibate de culturile starter folosite la
fabricarea salamurilor, în special lactobacilii, rareori identificându-se patogeni cum ar fi unele
mucegaiuri micotoxigene (Aspergilius glaucus) sau bacterii din genul Staphilococus şi Salmonella.
Lactobacilii sunt germeni Gram- pozitivi de formă bacilară sau cocobacilară, dispuse izolat în
perechi sau în lanţuri, nesporulate şi necapsulate, aerobe şi facultativ aerobe, homo- sau
heterofermentative.
40
 Cercetarea lor furnizează elemente importante privind evoluţia proceselor tehnologice şi
calitatea microbiologică generală a unor produse alimentare
Evidenţierea lor se bazează pe capacitatea de a se dezvolta în medii acide şi în prezenţa unor
substanţe inhibitoare.
Din produsul omogenizat şi din fiecare diluţie, se inoculează câte 1 ml în eprubetă ce
conţine mediu de îmbogăţire (mediu lichid cu mangan şi acetat). Se incubează la 35oC, 3 zile. Din
culturile dezvoltate pe mediu de îmbogăţire şi în care în frotiurile colorate Gram se constată forme
caracteristice lactobacililor, se striază cu ansa pe suprafaţa unuia din mediile selective de izolare
(agar cu mangan şi acetat, agar APT). Se incubează la 35oC, 3 zile, pentru a se dezvolta şi speciile
ce nu se dezvoltă la 37oC. Două sau mai multe colonii caracteristice, dezvoltate pe suprafaţa
agarului selectiv, se însămânţează în două eprubete cu agar glucozat 1% drept.
Interpretarea rezultatelor:
- producere de gaze în agar glucozat: specii heterofermentative,
- lipsa de gaze în agar glucozat: specii homofermentative
- creştere la 40oC în agar glucozat: specii termofile
- creştere la 30oC în agar glucozat: specii mezofile
16.7. Microbiologia preparatelor din carne tratate termic la nivel de pasteurizare
Aceste preparate sunt reprezentate de salamuri şi prospături care au fost tratate termic la
temperaturi de 70-75oC timp de 10 minute, temperatură măsurată în centrul geometric al batonului.
După acest tratament termic bacteriile Gram negative sunt distruse, putând avea loc o contaminare
ulterioară, după tratarea termică, cu spori de Bacillus şi Clostridium. Sporii prezenţi pot germina, se
pot multiplica, producând alterarea produselor în cazul nerespectării temperaturii şi umidităţii în
spaţiile de depozitare. Există două fenomene cu consecinţe asupra dezvoltării microbiene, întâlnite
în mod frecvent la preparatele din carne şi anume: formarea condensului si transpiraţia. În ambele
cazuri se creează un mediu favorabil dezvoltării microorganismelor în special a celor Gram
negative, proteolitice care vor forma un strat de mucus caracteristic.
Dintre germenii patogeni, in cazul nerespectării temperaturii tratamentului termic aplicat, ar
putea avea rol în declanşarea toxiinfecţiilor alimentare: Salmonella şi Staphilococus aureus. De
asemenea prezenţa bacteriilor coliforme şi a E. coli ridică probleme de salubritate a preparatelor
contaminate.
Identificarea acestor germeni se realizează conform procdurilor descrise la examenul
miocrobiologic general.

41
16.8. Condiţii microbiologice pentru aprecierea calităţii şi salubrităţii cărnii şi produselor din
carne
Reglementarea condiţiilor de calitate şi elaborare a standardelor care au caracteristici
obligatorii se face de către aceast Institutul . Naţional de Standardizare.
La carne şi preparate din carne condiţiile sunt reglementate de Standardul Român (SR)
2356-2-1994 şi Ordinul Ministerului Sănătăţii 975 din 1998.
Salmonella trebuie să fie absentă întotdeauna, stafilococul variază în funcţie de aplicarea sau
nu a unui tratament termic produsului respectiv, dacă i s-a aplicat tratament termic atunci să fie 10
germeni/g produs, dacă nu atunci 100 germeni/g produs. La fel se procedează şi pentru Escherichia
coli. Bacteriile coliforme şi N.T.G. sunt indicatori orientativi privind calitatea şi inocuitatea
alimentelor. Aceştia sunt consideraţi indicatori sanitari.
Poluarea cu bacterii coliforme, utilizate ca indicatori sanitari poate indica prezenţa şi altor
Enterobactericeae care sunt patogene. Bacteriile coliforme sunt admise de ordinul zecilor sau
sutelor, numărul lor depinde de tipul tratatamentul termic aplicat produsului examinat (vezi tabel
15- Norme microbiologice)

17. ANALIZA MICROBIOLOGICĂ A CĂRNII ANIMALELOR ACVATICE

( PEŞTI, CRUSTACEI ŞI MOLUŞTE)
Din categoria animalelor acvatice fac parte:
-peştele ( de apă dulce şi marin)
-crustaceii (rac, homar,langustă, crevete)
-moluştele (stridii midii,scoici, melci)
Carnea provenită de la numeroase specii de animale acvatice şi melci, reprezintă a 2-a sursă de
proteină animală după carnea animalelor de măcelărie şi pasăre, iar în câteva ţări, cum este Japonia,
ea ocupă primul loc.
Principala problemă a valorificării şi comercializării cărnii animalelor marine o constituie
menţinerea calităţilor ei, dată fiind slaba conservabilitate.
Dezvoltarea tehnicii frigului şi a metodelor de prelucrare pe vasele de pescuit a rezolvat
problema alterării produselor, dar rezistenţa redusă la acţiunea microorganismelor şi variaţia
extremă de calitate, tip de prelucrare, creează probleme bacteriologice multiple.
Un alt pericol reprezentant de aceste cărnuri este sporit de faptul că unele dintre ele se consumă
crude sau insuficient prelucrate termic. Aceste animale pot fi purtătoare de bacterii patogene pentru
om ( Vibrio parahaemolyticus, Cl. botulinum tip E, Salmonella.), de paraziţi transmisibili la om (
Anisakis, unele trematode ), sau pot sta la originea unor intoxicaţii în care sunt implicate şi
bacteriile (intoxicaţia scombroidă).
42
 După pescuire, muşchiul de peşte suferă aceleaşi modificări biochimice ca şi cel al mamiferelor,
dar pH-ul final este aprox. 6,2.
17.1. Particularităţi microbiologice ale cărnii animalelor acvatice supuse diferitelor procese de
prelucrare şi conservare
1.Produse crude refrigerate. Peştele
Datorită slabei sale rezistenţe la atacul microorganismelor de alterare, peştele este supus diferitelor
metode de conservare, cel mai des folosite fiind : refrigerarea, congelarea sărarea.
Contaminarea cu microorganisme în cazul peştelui refrigerat se realizează în timpul prelucrării
cu germeni patogeni din genul: Salmonella, E. coli, Stafilococus (contaminare ce provine de la
persoanele care execută această operaţiune) şi Er. rhisiopathiae- provenit din bazinele, utilajele şi
suprafeţele – mai ales din lemn murdare.
Germenii patogeni ce contaminează peştele nu se multiplică la temperatura de refrigerare, cu
excepţia tipurilor psihrotrofe de Cl. botulinum.
Crustacei:
Microorganismele saprofite de alterare de pe suprafaţa crustaceilor sunt cele din apa din care
provin, la care se adaugă cele luate de pe mâinile pescarilor, ustensile, barcă. Pe corpul lor domină
bacterii G-, corynebacterii, micrococi.
Numărul de bacterii de pe carnea de creveţi creşte considerabil în timpul prelucrării. Astfel
numărul de bacterii creşte de la 1-5 sute de mii la 3-8 mil./g.
Cei mai frecvenţi întâlniţi sunt: V. parahaemolyticus,mai rar Cl. botulinum.
Moluşte:
Carnea de moluşte este contaminată cu un număr mare de microorganisme (104-106/g), cu
microfloră G- (Vibrio, Pseudomonas,Moraxella ). Aceasta se datoreşte faptului că în timpul hrănirii
moluştele filtrează şi concentrează în tubul digestiv microorganisme din apa în care trăiesc; astfel o
stridie pompează 10 l apă pe oră.
Germenii patogeni provin din locuri poluate cu apele de scurgere din aglomerările umane:
Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticum, E coli.
2.Produse crude congelate
Numărul de bacterii de pe produsele congelate reflectă calitatea microbiologică a materiei prime.
Există germeni ce rezistă la congelare- în principal cei sporogeni( Cl. Botulinum, S. aureus,
streptococi )
Oprirea activităţii microbiologice este posibilă dacă se aplică congelarea rapidă.
3.Carnea fiartă
Animalele acvatice se pot supune unui tratament termic prin fierbere şi apoi se refrigerează sau
congelează.
43
 Numărul de germeni rezistenţi este foarte mic în special cei răspunzători de alterare (
Pseudomonas, Moraxella )
4. Peştele sărat şi afumat
În raport cu cantitatea de NaCl conţinut, peştele sărat se împarte în:
-peşte slab sărat (8% NaCl )
-peşte mediu sărat (8 –14% NaCl )
-peşte puternic sărat (14 -20% NaCl)
Numărul microrganismelor este mic exceptând suprafaţa acestuia unde pot persista bacterii
patogene pentru om.
Afumarea - determină o stabilitate microbiană a acestuia în funcţie de severitatea prelucrării (
peştele afumat la rece - stabilitate mare )
La început domină bacteriile G+, ulterior pe măsură ce păstrarea lor la temperatură de refrigerare
se prelungeşte, sunt înlocuite cu G- ce devin tot mai numeroase şi produc alterarea.
17.2. Controlul microbiologic al cărnii animalelor acvatice
Ţesutul muscular al animalelor acvatice imediat după prindere este steril, dar pentru a opri invazia
microorganismelor din tubul digestiv sau din afară, ele trebuie introduse imediat la frig.
Controlul microbiologic are 2 scopuri:- aprecierea stadiului de prospeţime;
- decelarea microorganismelor patogene;
Se fac însămânţări din regiunea musculară dorsală în mediu nutritiv pentru aerobi şi anaerobi. Se
incubează 24-48 h la 30-35oC.
Carnea de primă prospeţime-medii însămînţate sunt sterile.
Microorganisme patogene întâlnite: Salmonella, S. aureus, Cl. perfringens, E. Coli.
17.3. Metode de analiză microbiologică - peşte si produse din peşte
Metode de determinare:
Determinarea numărului total de germeni mezofili se face prin:
-metoda de însămânţare in mediul lichid, in cazul produselor pentru care se prevad valori mai mari
de 3 germeni in 10 g proba, dar nu mai mult de 300 germeni la 1g proba sau mai mari de 3 germeni
in 100 cm³ proba, dar nu mai mult de 30 germeni la 1cm³ proba;
-metoda prin însămânţare in mediul solid, in cazul produselor care se prevad valori mai mari de 300
germeni la 1g proba.
Metoda de determinare în mediu lichid:
Principiul metodei
Din proba nediluata si/sau din dilutiile decimale ale acesteia se insamanteaza o cantitate determinata
in serii de cate 3 eprubete, care contin bulion nutritiv cu glucoza si extract de drojdie. Mediile

44
insamantate se incubeaza in termostat, in conditii aerobe, la temp. de 30±1°C, timp de cel mult
48±3 ore.
Cresterea germenilor mezofili aerobi si facultativ anaerobi se constata prin aparitia tulburarii
mediului si/sau sedimentului si/sau formare de pelicula.
Determinarea numarului probabil, se face luand in consideratie numarul de eprubete pozitive din
fiecare serie de eprubete insamantate si confirmate ca pozitiv. Se citeste in tabel valoarea
corespunzătoare numarului rezultat si se raporteaza la 1g sau la un cm³.
Mod de lucru:
Determinarea numarului total de germeni mezofili se face din proba nediluata şi/ sau din diluţiile
acestuia.
Insamantarea mediilor nutritive
Din proba nediluata si/sau din dilutiile acesteia se fac insamantari, in paralel, in serii de cate 3
eprubete cu mediu bulion nutritiv cu glucoza si extract de drojdie.
In cazul probelor lichide, se insamanteaza (inoculeaza) cate 1 cm³ (echivalentul a 1g proba) din
proba nediluata si din dilutiile succesive ale acesteia.
In cazul probelor solide se insamanteaza (inoculeaza) cate un cm³ si cate 10 cm³ din dilutia 1:10
(0,1), echivalentul a 0,1g si respectiv 1g proba si cate 1 cm³ din dilutiile succesive ale acesteia.
Seriile dilutiilor care se insamanteaza se stabilesc in functie de conditia microbiologica din
standardul de produs, pentru caracteristica respectiva, astfel incat in cel putin una din eprubete cu
dilutia cea mai mare sa nu se dezvolte germeni mezofili aerobi si facultativ anaerobi, la temp. de
30°C.
In cazurile in care se prevede un continut mai mic de 3 germeni mezofili la 1g sau la 1cm³ proba,
insamantarea se efectueaza din proba nediluata si din primele dilutii.
In cazurile in care se prevede un continut egal sau mai mare de 3 germeni mezofili, insamantarea se
efectueaza din dilutiile succesive superioare celei 1:10
Cand proba insamantata (inoculul) este de 1g sau 1cm³, insamantarea se face in mediul (bulion
nutritiv si extract de drojdie) simplu concentrat, iar cand este de 10g sau 10cm³, insamantarea se
face in mediul dublu concentrat
Incubarea
Eprubetele cu mediul de cultura insamantat, se incubeaza in termostat, la temp. de 30±1°C,
timp de cel mult 48 ore.
Examinarea eprubetelor cu mediile insamantate
Dupa 24±3 ore, se examineaza fiecare eprubeta cu mediul incubat si se noteaza pt. fiecare serie de
eprubete numarul de eprubete cu semne de crestere bacteriana, respectiv aspectul tulbure si/sau
sediment si/sau pelicula.
45
In cazul in care nu se evidenteaza semne de crestere bacteriana se prelungeste incubarea inca 24
ore.
In cazul in care dupa 48±3 ore, in unele eprubete insamantate, nu se poate stabili cu certitudine
dezvoltarea microbiana, se efectueaza insamantari pe mediul nutritiv solid (agar nutritiv cu glucoza
si extract de drojdie).
Din eprubetele cu dezvoltare microbiana incerta, se fac treceri cu ansa, pe suprafata uscata a
mediului agar nutritiv cu glucoza si extract de drojdie, turnat in cate doua cutii Petri. Cutiile Petri cu
mediile insamantate se incubeaza la temp. de 30±1°C, timp de 48±3 ore.
Se considera pozitive acele eprubete din care, prin insamantare cu mediu agar nutritiv cu glucoza si
extract de drojdie si incubare s-au dezvoltat colonii de germeni.
Interpretarea rezultatelor:
Rezultatele se apreciaza separat pentru fiecare dilutie. Din ultimele 3 serii de eprubete pozitive se
obtine o combinatie de 3 cifre, din care prima cifra reprezinta proba nediluata sau seria cu dilutia
cea mai mica, iar celelalte 2 cifre reprezinta seriile cu dilutie mijlocie si respectiv cea mai mare de
eprubete pozitiva.
In cazul in care se fac mai mult de 3 dilutii, se iau in considerare ultimele 3 serii de dilutii
pozitive.
Se citeste in tabel valoarea corespunzatoare combinatiei de 3 cifre obtinute, care inmultita cu
factorul de dilutie al primei serii de eprubete luata in considerare, reprezinta numarul total de
germeni mezofili aerobi si facultativ anaerobi la 30°C, la 1g sau la 1cm³ proba.
Exemplu
In cazul in care seria de eprubete pozitive luate in considerare pentru calcul ar fi:
-dilutia 1:10 (0,1), la care s-au confirmat 3 eprubete pozitive;
-dilutia 1:100 (0,01), la care s-au confirmat 2 eprubete pozitive;
-dilutia 1:1000 (0,001), la care s-a confirmat o eprubeta pozitiva.
Din aceasta rezulta numarul 3.2.1 la care in tabel corespunde valoarea 15.
Aceasta valoare se inmulteste, in acest caz cu factorul de dilutie al primei serii luate in considerare
(cu 10).
Deci 15x10=150 reprezinta numarul de germeni la 1g sau la 1 cm³ proba.
Metode de determinare pe mediu solid
Principiul metodei
Din proba nediluata si/sau din dilutiile succesive ale acesteia, se insamanteaza o cantitate
determinata in mediul solid agar nutritiv cu glucoza si extract de drojdie. Mediile insamantate se
incubeaza in termostat la temp. de 30±1°C, timp de 72±3 ore.
Numarul de colonii dezvoltate pe mediile respective se raporteaza la 1g sau la 1cm³.
46
Medii nutritive si solutii de diluare –sunt cele utilizate mai sus
Mod de lucru
Obtinerea dilutiilor Conform STAS 11922/1-90
Insamantarea mediilor nutritive
Se ia cu pipeta cate 1cm³ din proba nediluata si/sau din fiecare dilutie obtinuta si se
introduce, in paralel, in cate 2 cutii Petri.
In cutiile Petri cu inocul, se introduc apoi cate 15±2cm³ mediu agar nutritiv cu glucoza si
extract de drojdie, topit si racit pana la 45±1°C.
Continutul cutiilor se agita in plan orizontal prin miscari circulare in ambele sensuri ale
cutiei, lasandu-se apoi in repaus la temp. mediului ambiant, pana la solidificare.
Scara dilutiilor care se insamanteaza se stabileste in functie de valoarea caracteristicii
microbiologice din standardul de produs, astfel incat sa se obtin cutii Petri in care s-au dezvoltat
intre 30 si 300 colonii caracteristice.
Pe capacul fiecarei cutii Petri se noteaza numarul probei, dilutia, data si ora inceperii
analizei.
Observatie- de la efectuarea dilutiilor si pana la incorporarea inoculului in mediul nutritiv nu
trebuie sa treaca mai mult de 20 min.
Incubarea
Dupa solidificarea mediului insamantat, acesta se incubeaza in termostat, la 30±1°C timp de
72 ore, cu capacul in jos.
4.5 Numarul coloniilor
La sfarsitul perioadei de incubare, se numara coloniile din fiecare cutie.
Numararea coloniilor se face cu ochiul liber sau cu ajutorul lupei, luandu-se in considerare numai
cutiile Petri in care s-au dezvoltat intre 30-300 colonii.
Exprimarea rezultatelor.
Se calculeaza media aritmetica a numarului de colonii constatat in cele 2 cutii Petri inoculate cu
aceeasi dilutie si se inmulteste aceasta valoare cu factorul de dilutie.
Se calculeaza apoi media aritmetica a tuturor valorilor medii obtinute pentru toate dilutiile.
Rezultatul obtinut reprezinta numarul total de germeni mezofili anaerobi si facultativ anaerobi la
30°C, la 1g sau la 1cm³ proba.
Daca numarul de colonii ce s-au dezvoltat pe cea mai mica dilutie este sub 300, rezultatul se
exprima: mai putin de 3,0x10² germeni, la 1g sau la 1cm³.
Daca nu exista nici o colonie in cele 2 cutii Petri insamantate pe cea mai mica dilutie,
rezultatul se exprima: mai putin de 1x10 germeni, la 1g sau la 1cm³ probă.

47
18. ANALIZA MICROBIOLOGICĂ A LAPTELUI ŞI PRODUSELOR LACTATE
Pentru a uşura studiul microflorei din lapte, s-au utilizat mai multe clasificări.
1. Clasificare ce are la bază acţiunea microorganismelor asupra componentelor laptelui:
- bacterii acidifiante
- bacterii proteolitice
- bacterii lipolitice
Această clasificare cuprinde mai multe grupe neomogene.
Există microorganisme care fermentează lactoza din lapte cu formare de gaze fără să fie
înrudite taxonomic,(bacterii coliforme, clostridii, levuri), situaţia fiind similară şi pentru
microorganismele proteolitice.
2. Clasificarea după provenienţă sau sursa de contaminare (sol, apă, aer) bazată pe criterii
taxonomice:
- bacterii
- levuri
- fungi
- richeţii
- virusuri
18.1. Microorganisme nepatogene
În categoria microorganismelor nepatogene sunt incluse: bacteriile lactice, care cuprind
două familii: Lactobacilaceae (genul Lactobacillus) şi Streptococcaceae ( genul Streptococcus şi
Leuconostoc).
Aceste microorganisme sunt Gram pozitive, anaerobe facultativ, au activitate proteolitică
neînsemnată, fermentează lactoza.
Streptococii lactici sunt -dominanţi în lapte, smântână şi brânzeturi proaspete. Practic nu
există lapte crud fără streptococi. Lactobacili se deosebesc de streptococi prin morfologie şi două
caractere importante şi anume: 1. o acidifiere mai lentă dar mai puternică, în urma acidifierii
dezvoltă 2,8% acid lactic şi coboară pH-ul la 3,5.
2. o activitate cazeolică având proteinaze active.
Bacteriile lactice sunt de două tipuri: homofermentative şi heterofermentative.
Bacteriile lactice homofermentative în funcţie de temperatura de dezvoltare sunt de două
feluri:
- termofile din care fac parte genurile Lactobacillus şi Streptococcus, acestea au o
temperatură optimă de dezvoltare-înmulţire, cuprinsă între 37-45oC, procese care încetează între
15-20oC, nu au activitate cazeolitică şi acidifiază puternic laptele dintre acestea cele mai întâlnite ar
fi: Lactobacillus lactis, L. bulgaricus, L. helveticus şi Streptococus termophilus.
48
 - mezofile din care fac parte bacteriile din genul Lactobacillus şi Streptococcus şi au
o temperatură optimă de dezvoltare de 20-30oC, nu se dezvoltă la temperaturi mai mari de 40oC,
aceste bacterii acidifiază lent laptele, prezintă o activitate cazeolitică slabă, din această grupă de
bacterii fac parte: Lactobacillus casei, Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris.
Bacterii lactice heterofermentative sunt bacterii care prin fermentaţie produc 50% acid
lactic, 20-25% CO2 din lactoză, alcooli, acid acetic. Au importanţă mai redusă şi o utilizare mai
limitată dintre acestea fac parte genurile Leuconostoc, Bifidobacterium şi unii lactobacili
(Lactobacillus brevis).
Bacteriile pseudolactice sau fermenţii lactici falşi sunt toate bacteriile care fermentează
lactoza cu formare de gaze. Cele mai importante sunt coliformele şi anume Escherichia,
Enterobacter, Klebsiela, unele anaerobe sporulate din genul Clostridium.
18.2. Microorganisme care acţionează asupra proteinelor din lapte

Există multe microorganisme care hidrolizează proteinele din lapte la peptone, apoi la
polipeptide până la aminoacizi.
În urma acţiunii lor apar modificări ale laptelui şi brânzeturilor cum ar fi: coagularea dulce,
proteoliza, coloraţii şi mirosuri anormale.
Acţiune asupra cazeinei din lapte o au enzimele, care acţionează în mai multe trepte. Dintre
microorganismele ce acţionează asupra proteinelor din lapte amintim:
• coci Gram pozitivi, bacili, Gram negativi nesporogeni: Pseudomonas, Proteus, Seratia.
• bacili Gram pozitivi sporogeni: Bacilus (B. subtilus, B. firmus, B. cereus v. mycoides B.
circulans) Clostridium butiricum (cu activitate zaharolitică), Clostridium hystolyticum.
- levuri şi mucegaiuri: Torulla, Saccharomyces, Mucor, Aspergillus, Penicillium, Oidium.
18.3. Microorganisme patogene
Laptele reprezintă un excelent mediu de cultură pentru agenţii microbieni ai unor importante
zoonoze (Micobacterium tuberculosis, Brucella, Rickettsia şi unele virusuri) care nu se înmulţesc în
lapte, periculozitatea lor depinzând de gradul iniţial de contaminare.
Alţi germeni patogeni : Stafilococus aureus, E. coli se pot înmulţi în laptele păstrat la
temperaturi optime pentru aceşti germeni. La temperatură de până la 10-12oC activitatea majorităţii
microorganismelor patogene este inhibată. Aceasta este raţiunea pentru care laptele se răceşte
imediat după muls. Acţiunea bactericidă şi bacteriostatică a laptelui în primele ore de după muls se
datorează prezenţei lacteninelor 1, 2 şi 3.
Acidul lactic şi unele substanţe asemănătoare antibioticelor produse de streptococii existenţi
în laptele materie primă, au efect inhibitor asupra bacteriilor patogene.
Agenţii microbieni patogeni din lapte provin de la animale bolnave (cu semne clinice sau
purtătoare asimptomatice), de la manipulatorul uman sau din mediul extern.
49
Bacterii şi toxine bacteriene
Staphylococcus aureus: Se transmite prin lapte şi produse lactate, principalul pericol constituindu-l
eliberarea de către acesta a enterotoxinei stafilococice capabilă să provoace îmbolnăviri grave la
om. Datorită faptului că enterotoxina stafilococică este termostabilă (nu poate fi distrusă de
temperaturile de pasteurizare) îmbolnăvirile se pot produce şi prin consumul de lapte şi produse
lactate ce au suferit tratamente termice. Contaminarea produselor lactate finite se poate face şi prin
oameni aparent sănătoşi,
purtători de germeni patogeni care manipulează aceste produse contaminându-le. La temperatură de
sub 10oC înmulţirea stafilococilor este oprită. Există bacterii lactice şi specii de Pseudomonas care
inhibă înmulţirea stafilococilor.
Rezultă că laptele şi produsele lactate contaminate după pasteurizare sunt mai periculoase
decât laptele crud care conţine o puternică floră acido-lactică, floră concurentă, ce inhibă
dezvoltarea stafilococilor. Termorezistenţa stafilococului este mică, fiind distrus la 72oC în 15
secunde, o pasteurizare corectă distruge stafilococii dar nu şi toxina acestuia.
În brânzeturi stafilococii se multiplică iar după 3-6 zile eliberează enterotoxina. Brânza
fabricată din lapte pasteurizat poate să conţină stafilococi până la 30 zile după fabricare (perioada
de maturare), după care aceştia sunt distruşi de pH-ul nefavorabil dezvoltării lor.
În laptele praf stafilococii pot exista numai datorită unor deficienţe din timpul procesului de
pasteurizare şi atomizare .
În produsele lactate fermentate şi acide prezenţa stafilococului este foarte rară şi este
datorată unei contaminări recente.
Streptococii hemolitici din grupa A - Streptococcus pyogenes produce mai multe afecţiuni clinice:
otită, scarlatină, afecţiuni purulente. Laptele poate fi contaminat de persoane bolnave, convalescente
sau prin purtători asimptomatici. El nu prezintă pericol pentru sănătatea publică, in cazul
consumării produselor lactate pasteurizate, fiind distrus într-o secundă la 61oC.
Streptococi din grupa B au patogenitate mai redusă pentru om, nu infectează decât ţesuturile mai
sensibile cum sunt cele ale uterului şi ale noilor născuţi.
Salmonella produce îmbolnăviri grave, manifestate prin tulburări gastrointestinale; există în laptele
provenit de la animalele bolnave, sau prin contaminarea acestuia de către purtătorii umani ce
manipulează şi prelucrează laptele. Aceasta se distruge la 60oC în 28 de secunde şi la 67oC timp de
o secundă.
Shigella produce dizenterie bacilară prin consumul laptelui contaminat. Se multiplică la temperaturi
mai mari de 15oC, mai intens la laptele pasteurizat decât la cel crud, datorită absenţei florei
concurente.

50
Escherichia coli singură sau împreună cu alte enterovirusuri intervine în etiologia gastroenteritei
acute la copii, sugari şi mai rar la adulţi. Unele produse lactate pot fi contaminate cu serotipuri de E.
coli, ce secretă enterotoxine, producând toxiinfecţii alimentare. Din cercetările efectuate s-a
evidenţiat apariţia unui serotip nou: E. coli O157:H7 care în condiţii optime elaborează verotoxină,
extrem de patogenă pentru om.
Mycrobacterium bovis agentul etiologic al Tuberculozei la om nu se multiplică în lapte sau se
multiplică foarte lent. Rezistă 60 de zile în brânzeturi şi 240 de zile în unt. Printr-o pasteurizare
corectă (minim 67oC) Micobacterium tuberculosis se poate distruge. Legislaţia sanitară-veterinară
interzice fabricarea produselor lactate din lapte de vacă nepasteurizat.
Brucella poate trece din laptele crud în produsele lactate în cazul netratării termice corespunzătoare
a acestuia (este distrusă într-o secundă la 68oC). Aciditatea din produsele lactate 125-200oT, elimină
complet, în câteva zile, această bacterie.
Listeria monocytogenes este o bacterie patogenă pentru om, laptele fiind unul dintre principalii
vectori ai Listeriei de la animale la om. Aceasta se poate multiplica în laptele ţinut la temperaturi
joase, rezistă 33 minute la 62oC multiplicarea este foarte rapidă în laptele incorect pasteurizat.
Leptospirele Contaminarea laptelui se poate face prin oameni bolnavi, purtători de leptospire.
Laptele de vacă şi femeie conţine un factor termostabil care inactivează şi lizează leptospirele,
distrugându-le. Acest factor persistă în laptele conservat la 4oC timp de două luni şi rezistă cinci
minute la 80oC,fiind distrus la temperatura de fierbere.
Bacillus cereus poate provoca toxiinfecţii alimentare la om, manifestate prin tulburări
gastrointestinale, sporii acestuia rezistând la temperaturile obişnuite de pasteurizare. Se întâlneşte în
laptele praf şi produsele alimentare ce au în compoziţie laptele praf. Instalaţia de fabricare a laptelui
praf odată contaminată cu bacili de Bacillus cereus poate contamina toate şarjele de lapte praf
obţinute între două dezinfecţii. Din acest motiv se recomandă ca în cazul depistării într-o şarjă de
lapte praf lui B. cereus, producţia să fie oprită şi să se efectueze dezinfecţii riguroase la instalaţia
contaminată.
Determinarea numărului de unităţi formatoare de colonii de microorganisme -UFC
( numărul total de germeni-NTG)
Din diluţiile realizate, cu ajutorul unei pipete de 1 sau 2 ml, după o prealabilă omogenizare se
repartizează câte 1 ml în 2 plăci Petri, peste care se toarnă 10-15 ml de agar nutritiv, topit şi răcit
până la 45oC. Se omogenizează bine inoculul cu mediu, prin mişcări de rotaţie, în sensuri diferite a
plăcii. Se lasă plăcile până la solidificare în incinta sterilă , după care se introduc la incubare la
30oC, timp de 72 h. Se numără coloniile din fiecare cutie, iar numărul total de colonii din cele două
plăci se împarte la 2 şi se înmulţeşte cu factorul de diluţie.
Determinarea numărului de unităţi formatoare de colonii de drojdii şi/sau mucegaiuri
51
Din fiecare diluţie obţinută se însămânţează câte 1 ml în 2 plăci Petri. Mediul de cultură topit şi
răcit până la 45oC (mediul Sabouraud sau agar extract de malţ) se aduce la pH-3,5, după care se
toarnă 10-15 ml mediu, în fiecare placă. Se omogenizează inoculul cu mediu şi se lasă să se
solidifice. Se termostatează la 25oC, citirea rezultatelor se face prin numărarea CFU de drojdii
separat de cele de mucegai în ambele plăci inoculate, numărul total se împarte la 2 şi se înmulţeşte
cu factorul de diluţie. Pentru confirmarea identităţii coloniilor dubioase, se vor executa preparate
microscopice, colorate prin metode Gram.
La ambele metode trebuie să existe o repetabilitate (rezultate obţinute cu aceeaşi metoda, din
aceeaşi probă, în acelaş laborator, utilizând aceeaşi aparatură, într-un interval scurt de timp), nu
trebuie să depăşească 30% din rezultat.

CONDIŢII MICROBIOLOGICE PENTRU LAPTE ŞI PRODUSELE LACTATE SR

6349/1994
Tabel 18
Parametrii microbiologici
Număr de Număr de Număr de Salmo- Număr de Număr de Număr Număr
germeniae bacterii Escheri- nella stafilo-coci Clostri- de Baci- de
robi coliforme la chia coli la 25 g. coagu-lazo dium llus drojdii-
mezofili la 1 g. max la 1 g. pozitivi la 1 perfrin- cereus muce-
1g.max max g, max. gens la 1 la 1 g, gaiuri la
PRODUS g, max max 1 g. max
Condiţii de admisibilitate
Lapte de consum 300000 10 1 - - - - -
Lapte praf 100000 10 1 abs 1 - 10 -
Produse lactate praf 10000 abs - - - - - -
pentru copii- sub 4 luni
Peste 4 luni 50000 10 1 abs 1 - 10 -
Produse lactate acide - 100 10 abs 10 - - -
Smântână dulce pentru 100000 10 1 abs 1 - - -
frişcă şi frişcă bătută
Brânzeturi proaspete - 100 10 abs 10 - - -
brânză proaspătă de
vacă
caş , telemea - 100 10 abs 10 - - 100
Urdă - 1000 100 abs 10 - - -
Brânzeturi maturate - 10 - abs 100 - - 2000
Brânzeturi fermentate - 10 - abs 100 - - 2000!)
(cu pastă tare, semitare,
moale)
Brânzeturi cu pastă - 100 - abs 100 - - 2000
filantă (caşcavaluri)
Brânzeturi frământate - 1000 100 abs 100 - - 2000
Brânzeturi topite - - - abs 10 - - -
Unt - 100 10 abs 10 - - 1000
Îngheţată pe bază de 300000 100 10 abs 10 - - 1
lapte
Lapte Cu zahăr 50000 abs - abs - - - -
concen-
trat
- zahăr 1002) - - - - - - -

1)
- La brânzeturile cu pastă moale nu se prevăd valori
2)
- Se determină numărul de germeni aerobi mezofili sporulaţi
52
 19. MICROBIOLOGIA CONSERVELOR ŞI SEMICONSERVELOR
SEMICONSERVE DE CARNE ÎN CUTII
Apariţia acestora a fost o necesitate, datorită capacităţii de păstrare integrală a proprietăţilor
organoleptice şi nutritive a cărnii pe de o parte şi pe de altă parte fiind o necesitate de ordin
economic, precum şi o necesitate de conservare a cărnii.
Materiile prime (atât pentru conserve cât şi pentru semiconserve) trebuie să îndeplinească
caracteristici microbiologice specifice unei cărni proaspete necontaminate - nu se utilizează materii
prime cu început de alterare.
19.1. Semiconservele de carne
Sunt produse pasteurizate ce necesită o păstrare la temperaturi de 0-8oC. O parte din floră
bacteriană (micrococii, streptococii) ce poate contamina materia primă este rezistentă la
tratamentele termice de pasteurizare medie (rezistă la 74oC timp de 60 de minute), fiind distruşi
numai la temperaturi de peste 80oC.
O atenţie deosebită trebuie acordată apariţiei în spaţiile tehnologice a unor tulpini de bacterii
termorezistente; acestea trebuie îndepărtate prin spălări şi dezinfecţii repetate; încărcătura
microbiologică înainte de pasteurizare este în directă corelare cu numărul de microorganisme
existente în produsul finit şi cu durata de păstrare a acestuia (termen de valabilitate).
Numărul de microorganisme rămase după pasteurizare, trebuie să fie cât mai mic, iar
germenii patogeni inexistenţi. Carnea trebuie să provină de la animale sănătoase, iar sacrificarea să
fie făcută în condiţii igienice.
19.2. Controlul calităţii microbiologice a conservelor ( SR 8924-1995 )
Examenul microbiologic urmăreşte identificarea şi tipizarea microflorei reziduale care ar
putea exista în aceste recipiente închise ermetic. Odată cu acest examen se interpretează toate
defectele pe care le pot prezenta recipientele şi care pot influenţează salubritatea şi conservabilitatea
acestora.
Examenul microbiologic se desfăşoară în mai multe etape:
1. la sosirea în laborator se confruntă şi se notează ştanţele de pe cutii, aspectul exterior al acestora,
după îndepărtarea etichetei. Toate neregulile observate se notează urmărindu-se ermeticitatea,
prezenţa deformărilor, prezenţa punctelor de rugină şi prezenţa diferitelor tipuri de bombaj. După
această primă etapă recipientele se clasifică în: - normale (ştanţe clare, fără puncte de rugină, fără
deformări, fără bombaje, ermetice),
- recipiente cu ştanţe neclare,
- recipiente cu rugină,
- recipiente cu deformări,
- recipiente neermetice,
53
 - recipiente cu bombaje fizice:
- ambele capace uşor concave sau plane, la presiuni capacul opus se
convexează, revenind la poziţia iniţială la o presiune uşoară “ flippers”,
- un capac este convex la presare el devine concav, iar capacul opus
sare în afară în poziţie convex “springers”,
- suprafaţa unuia sau a ambelor capace prezintă uşoare ondulări care
cedează la presare uşoară însoţite de zgomote pocnitoare.
Aceste bombaje sunt determinate de calitatea inferioară a tablei, de necorelarea între diametrele
recipientelor şi a capacelor, închiderea recipientelor fără vid, manipulare şi păstrare
necorespunzătoare.
- recipiente cu bombaj moale, datorat supraumplerii: ambele capace sunt
convexe, se pot presa cu uşurinţa înăuntru, după eliberare presiunii revin la poziţia iniţială
- recipiente cu bombaj chimic: ambele capace sunt convexe, nu se pot presa,
bombajul apare datorită formării de hidrogen molecular în interiorul recipientului ca urmare a
reacţiilor dintre metalul din care este confecţionată cutia şi conţinutul acesteia. Verificarea constă în
efectuarea unui orificiu în apropierea unei flăcări; dacă gazul eliberat arde este hidrogen şi se
consideră bombaj chimic.
- recipiente cu bombaje biologice (bombaj tare): ambele capace sunt convexe, nu
cedează la presiune şi este provocat de dezvoltarea în conţinutul recipientului a bacteriilor anaerobe
gazogene.
2. proba ermeticităţii- nu este obligatorie şi se execută numai atunci când există suspiciuni sau
scurgeri vizibile de conţinut. Aceasta se execută prin metoda cu vid şi metoda cu apă caldă.
3. termostatarea probelor: -recipientele neermetice scurse cu bombaje chimice sau biologice, nu se
termostatează. O parte din celelalte recipiente se termostatează timp de minim 14 zile la
temperatura de 35oC 1 pentru evidenţierea microorganismelor mezofile; o altă parte a recipientelor
se termostatează la 45oC1, 7 zile (recipiente din material plastic şi sticlă), sau la 55oC1, 5 zile
(recipiente din tablă) pentru evidenţierea microorganismelor termofile urmărindu-se apariţia
bombajului care poate fi fizic sau biologic:
Bombajul fizic apare ca urmare a supraumplerii, nu este bilateral, uneori dispare după răcire,
iar la examenul microbiologic nu se găsesc germeni care ar fi putut să-l provoace.
Bombajul biologic este bilateral şi apare datorită formelor microbiene în medii de cultură,
nu dispare după răcire şi conţinutul poate fi normal sau modificat (miros acru, suc tulbure şi filant,
spumă, degajare de CO2). PH-ul la aceste conserve este sub limita normală.
4. cultivarea pe medii de cultură şi examenul microscopic direct

54
 După termostatare din recipientele deschise steril, se recoltează o cantitate de 8-10 g produs
care se însămânţează în cazul conservelor cu pH 4,5 pe patru medii: pentru germeni aerobi-2
(bulion glucozat şi agar glucozat înclinat), anaerobi-1 (bulion glucozat cu carne fiartă, ficat sau
mazăre), pentru bacterii termofile de acrire-1 (bulion cu purpur de bromcrezol) iar pentru
conservele cu pH 4,5 pe 5 medii: pentru germeni aerobi-1: (bulion glucozat cu suc de tomate);
anaerobi-1 (bulion glucozat cu suc de tomate şi carne fiartă sau tomate şi mazăre), pentru bacterii
termofofile de acrire-1 (bulion acid cu peptonă şi apă de drojdie), drojdii-1 şi mucegaiuri-1 (medii
specifice).
Termostatarea se face 5 zile la 35oC1(55oC1 pentru pentru bacterii termofile de acrire), iar citirea
începe după primele 24 de ore, aerobi se evidenţiază prin apariţia de colonii şi/sau tulburarea
mediului şi/sau apariţia de peliculă pe suprafaţă sau sediment; iar prezenţa anaerobilor se
evidenţează prin degajare de gaz în mediu cu ficat sau prin executare de frotiu colorat prin metoda
Gram.
Din culturile microbiene aerobe, mezofile se fac două preparate microscopice: unul se
colorează prin metoda Gram, iar celălalt prin metode de colorare pentru sporii bacterieni şi se
examinează la microscop. Atunci când identificăm doar bacterii nesporulate se procedează în felul
următor:
- se fac însămânţări pe agar înclinat (din culturile dezvoltate pe bulion glucozat); se incubează la
termostat la 35oC1, 24 de ore, după care se efectuează un examen microscopic pentru sporii
bacterieni. În cazul în care nici după 48 h nu se evidenţiază la examenul microscopic spori
bacterieni, se consideră că proba pentru analiză conţine bacterii nesporulate. Identic se procedează
şi în cazul bacteriilor din eprubetele cu agar gelozat înclinat.
- culturile microbiene dezvoltate pe medii pentru drojdii şi mucegaiuri se examinează conform
STAS 12964 şi STAS 12965; prezenţa microorganismelor cu morfologie caracteristică drojdiilor şi
mucegaiurilor, confirmă existenţa acestora în produsul examinat.

20. ANALIZA MICROBIOLOGICĂ A OUĂLOR ŞI PRODUSELOR DIN OUĂ

Oul este un sistem biologic complex, iar datorită compoziţiei sale chimice complexe
reprezintă un aliment foarte valoros.
Deşi oul conţine cca. 74% apă, el este o sursă bogată de proteine de înaltă calitate, o
importantă sursă de acizi graşi nesaturaţi mai ales acid oleic, de fier, fosfor, de microelemente, de
vitamine A, D, E, K, B, inclusiv vitamina B12. În privinţa vitaminei D, oul se situează pe locul al 2-
lea, după oleul din ficatul de peşte. El este sărac în calciu (care se depozitează în coajă) şi conţine
cantităţi foarte mici sau deloc vitamina C.

55
 Compoziţia chimică a oului ca şi instabilitatea componentelor sale, fac din acesta un produs
relativ perisabil, el reprezentând un mediu convenabil pentru dezvoltarea microorganismelor.
20.1. Microbiologia ouălor în coajă
Coaja este înainte de toate, o barieră mecanică, separând conţinutul oului de mediul extern.
Coaja nu reprezintă un strat continuu ci ea este prevăzută în mod natural cu circa. 17000 de pori cu
diametrul de 9-25 microni, deci suficienţi de mari pentru a trece prin ei microorganisme. Penetraţia
microbilor prin porii cojii nu are totuşi loc în condiţii normale, deoarece ei sunt acoperiţi de resturi
cuticulare şi de cuticulă (situaţie la ouăle proaspete manipulate atent). Membranele cochiliere pot fi
descompuse cu eliberare de compuşi azotaţi de către Pseudomonas maltophilia şi Aeromonas
liquefaciens.
Pe măsura învechirii lor porii se măresc, cuticula devine mai uşor de traversat pentru
microorganisme.
Albuşul, datorită reacţie sale alcaline şi proprietăţilor biologice ale proteinelor componente,
reprezintă un mediu nefavorabil dezvoltării microbiene.
Pe lângă reacţie alcalină, semnificaţie mai mare în apărarea antimicrobiană o are lizozima şi
conalbumina.
Reacţia alcalină este importantă dacă depozitarea este făcută corespunzător, pentru că după 3 zile
de stocare a ouălor la 3oC pH-ul albuşului ajunge la 9,18 iar după 21 de zile pH-ul ajunge la 9,4.
Modificarea pH-ului albuşului este provocată de pierderea CO2 din ou prin porii cojii.
Deci menţinerea ouălor într-o atmosferă cu % ridicat de CO2 (peste 3-5 %), favorizează
acidifierea albuşului.
20.1.1. Microorganisme ce pot contamina oul
Există două căi de contaminare:
1.Contaminarea ouălor în organismul păsărilor (contaminare “Intra vitam” sau contaminare primară
)
2. Contaminarea ouălor în timpul şi după depunerea lor (contaminare secundară)
1.Contaminarea primară a ouălor
În mod obişnuit conţinutul ouălor proaspete este steril, deci nu există posibilitatea infectării lor.
Periodic, dar destul de rar, la păsările sănătoase, unele bacterii trec de la nivelul tubului digestiv în
sânge, ajung în ovar şi se localizează în ovule (numărul acestor bacterii este foarte mic şi nu produc
alterarea oului.)
Mai des ouăle sunt contaminate congenital cu salmonelle (în special la mai mult de 90 % din
cazuri sunt infectate ouăle de palmipede).
Calea prin care ouăle se contaminează intravita cu salmonelle este prin consumul de către
păsări furajelor contaminate şi mai ales a apei contaminate.
56
Contaminarea secundară:
Această contaminare interesează la început numai suprafaţa cojii. Contaminarea se face cu
microorganisme specifice microflorei din cuştile păsărilor sau de pe suprafeţele şi obiectele cu care
ouăle vin în contact. Nivelul de contaminare a cojii este foarte diferit de la câteva sute la zeci de
milioane de germeni. Proporţia coloniilor microbiene este:
-85-95% din colonii sunt coci G+
-2-8% din colonii sunt bacili G+
-3-7 % din colonii sunt bacili şi cocobacili G-
S-au identificat pe coaja oului următoarele bacterii: Micrococcus, Salmonella, Stafilococcus,
Streptococcus, Pseudomonas, E. coli, Proteus, Aeromonas, Bacillus, Sarcina, etc.
Mucegaiurile deţin un rol mult mai puţin important decât bacteriile, în alterarea ouălor şi apare
în special la cele depozitate în atmosferă umedă pe a căror coajă se dezvoltă micelii de mucegaiuri
aspect cunoscut sub numele de “ouă cu mustăţi “.
20.1.2.Controlul calităţii microbiologice al salubrităţii ouălor în coajă
Nu se fac examene microbiologice în mod curent ci numai în situaţie speciale Se determină NTG
anaerobi de pe coajă, prezenţa salmonelelor pe coajă şi în conţinut, sterilitatea conţinutului. Deseori
salmonelle aflate în conţinutul ouălor nu sunt omorâte prin tratamentul termic aplicat produselor
culinare, la care acestea au fost folosite.
Examenul pentru microorganisme de pe coaja oului se efectuează în felul următor: cu un
tampon steril se şterge foarte bine suprafaţa cojii oului, după care se introduce în 10 ml ser
fiziologic steril. Acesta se lasă 30 minute, timp în care se agită, prin loviri succesive de podul
palmei. Din cei 10 ml, 5 ml se pun pe medii specifice pentru Salmonella iar din restul cantităţii se
fac diluţii succesive pentru determinarea NTG.
Examenul pentru determinarea microorganismelor din conţinutul ouălor, se desfăşoară după
următoarea procedură: - coaja oului se va spăla bine cu ajutorul unei perii, după care se introduce în
spirt medicinal timp de 30 minute, apoi se scoate şi se lasă să se usuce. Oul se sparge în apropierea
flăcării de gaz cu ajutorul unui bisturiu steril, se goleşte conţinutul într-un vas Erlenmayer cu perle
de sticlă. Conţinutul se omogenizează forte bine, după care se efectuează însămânţări direct din
conţinut sau din diluţiile succesive ale acestuia, pentru NTGMA şi prezenţa Salmonelelor.
Ouăle cu calitate microbiologică corespunzătoare trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
- NTG pe coajă să fie cât mai mic (max 1.000.000 germeni / coajă),
- Salmonella absentă de pe coajă,
- conţinutul ouălor nu trebuie să prezinte contaminare cu microorganisme inclusiv Salmonella.

57
20.2. Microbiologia produselor din ouă
Folosită ca tehnică de conservare; congelarea şi deshidratarea ouălor s-a dezvoltat în ultimul
deceniu, făcând obiectul schimbului comercial între anumite ţări cu plus de produse.
Se urmăreşte pentru creşterea conservabilităţii, distrugerea unor microorganisme prin
procesul de congelare şi deshidratare (procedee insuficiente însă pentru o conservare îndelungată).
În ultimul timp se apelează şi la pasteurizare -prin aceasta distrugându-se principalul germen
patogen conţinut Salmonella.
20.2.1. Influenţa diferitelor stadii de prelucrare asupra calităţii microbiene ale produselor din
ouă
Principalele faze sunt: spălare, spargere, separarea albuşului de gălbenuş, omogenizarea, filtrare,
pasteurizare, congelarea sau deshidratarea.
În ultimul timp s-a renunţat la spălare, deoarece nu se reuşea decât îndepărtarea unor cantităţi
mici de germeni de pe coajă şi avea neajunsul că în cazul în care ouăle nu erau uscate, apa de
spălare se putea scurge în conţinut după spargere.
Spargerea -momentul cel mai important, se face cu ajutorul unor maşini înalt perfecţionate,
evitându-se ajungerea fragmentelor de coajă în conţinut O atenţie deosebită se va acorda igienizării
maşinilor de spart ouă.
Omogenizarea şi filtrarea -se face în recipiente special concepute şi bine igienizate.
Pasteurizarea - operaţie obligatorie se face la temperatură de 65oC, prin adăugarea de polifosfaţi
se creşte eficienţa pasteurizării distrugând salmonelele din albuş. În prezent în marea majoritate a
ţărilor pasteurizarea se face în aparate cu plăci (instalaţiile de pasteurizare-dotate la ieşirea din
pasteurizator cu sisteme de răcire pentru a opri multiplicarea eventualilor germeni rămaşi).

Temperaturile de pasteurizare sunt următoarele:

- albuş de ou lichid: 62- 63oC ; 2,5 minute,
- ou integral: toC > 64-65oC ; 3,5 minute ,
Se distrug bacteriile într-un procent de 99%, un număr mare dintre bacteriile supravieţuitoare
aparţin genului Bacillus, şi un număr mai mic genurilor micrococus, streptococus şi sporilor de
clostridii.
Prin examenul microbiologic se urmăreşte dacă prin tratamentul termic aplicat a avut loc
distrugerea salmonelelor.
Înainte de pasteurizarea albuşului şi gălbenuşului microorganismele mai frecvent întîlnite
sunt: Pseudomonas, Micrococus, Stafilococus, Salmonella.
După pasteurizare normele microbiologice reglementează:

58
-NTG-max.50000
- Salmonella - abs/ 25 g produs
- Stafilococus aureus şi coliformi abs/1g produs
Determinarea acestor parametri se face conform examenului microbiologic general.

21. ANALIZA MICROBIOLOGICĂ A MIERII

Mierea este un aliment natural produs de albine din materie primă furnizată direct de regnul
vegetal ( nectarul ) şi într-o măsură mai mică de cel animal ( mana ). Mierea are acţiune bactericidă
importantă, unii germeni din genul Salmonella, Shigella, Corynebacterium dispar după 1-2 zile.
Poate totuşi conţine prin manipulările produsului la îmbuteliere şi ambalare o serie de
microorganisme mai rezistente şi sporulate (genul Bacillus subtilis, micrococi, mucegaiuri - Mucor,
Penicilium, Aspergilus)
Analiza microbiologică a mierii are o importanţă minoră pentru produsul obţinut natural şi
de calitate superioară. Se execută mai ales cercetarea drojdiilor, mucegaiurilor care pot duce la
alterarea mierii prin fermentare. Gamei largi de drojdii care produce fermentarea i se pot asocia
unele bacterii capabile să fermenteze zaharurile, dacă sunt create condiţii prielnice pentru
dezvoltarea lor. Un rol important în declanşarea procesului fermentativ îl constituie nivelul de
contaminare. Drojdiile datorită faptului că sunt pronunţat osmofile se pot dezvolta în soluţii
concentrate de zaharuri, producând astfel fermentaţia mierii, în condiţiile în care conţinutul de apă
este peste 20%. Există două tipuri de fermentaţie mai des întâlnite: fermentaţia alcoolică şi
fermentaţia acetică. Indiferent de natura fermentaţiei şi de densitatea ei mierea care se găseşte în
acestă stare alterativă aste improprie pentru consum uman, putând fi utilizată ca materie primă la
fabricarea băuturilor alcoolice sau a oţetului.
Un alt produs al albinelor care poate fi contaminat cu bacterii alterative este lăptişorul de
matcă (produsul cu care albinele doici hrănesc larvele în primele zile de la ecluzionarea din ou).
Acesta se poate altera prin dezvoltarea bacteriilor lactice şi a mucegaiurilor ce tolerează pH-ul acid
şi temperaturile scăzute. În timp prin activitatea proteolitică desfăşurată pot simplifica proteinele cu
eliberare de amoniac şi hidrogen sulfurat.
Polenul de asemenea se poate altera datorită păstrării în condiţii necorespunzătoare, de umiditate şi
temperatură, prin mucegăire.

59
 22. ANALIZA MICROBIOLOGICĂ A BERII
Berea este o băutură clasică obţinută prin fermentarea alcoolică a unei infuzii: orz germinat,
aromatizată cu hamei.
În funcţie de tipul de bere se folosesc 2 tipuri de drojdii:
1. Saccharomyces cerevisieae- drojdie de fermentaţie superioară tip ALE
-fermentează la 15-25oC; celulele de drojdii înmuguresc sub aspect de "cojoc"; respiraţie puternică.
- fermentează 1/3 din rafinoza existentă.
2. Saccharomyces carlsbergensis- drojdie de fermentaţie inferioară tip LARGER
- fermentaţie submersă 7-15oC; înmulţire slabă; aceste drojdii provin din culturi pure de laborator
selecţionate (sau mai puţin ) recuperarea drojdiilor derivă la şarja precedentă de fermentare. La
sfârşitul fermentaţiei drojdiile floculează.
Culturi izolate, sunt păstrate în laborator câteva săptămâni, în mediu zahăr 10%, la 8-10oC la
întuneric. Ele se vor verifica prin înmulţirea în trepte, la trei luni se va reînnoi cultura cu o tulpină
multiplicată în laborator.
Singurele microorganisme care există în berea normală sunt drojdiile şi bacteriile sub formă
de bastonaş (bacterii acetice în special).
22.1. Alterarea berii poate fi provocată de un număr redus de microorganisme deoarece în bere
există anumiţi factori defavorizanţi pentru acestea, cum ar fi pH-ul acid, anaerobioza, presiunea,
temperatura de păstrare, această alterare este dată de drojdii şi de bacterii. Datorită filtrării
neeficiente se pot multiplica drojdiile de cultură care continuă fermentaţia în recipient, producând
tulburarea şi formarea de sediment. De asemenea se poate produce (datorită unor drojdii atipice)
contaminarea drojdiei de cultură cu apariţia unui gust specific, berea fiind tulbure cu sediment
pulverulent.
Unele bacterii adaptate condiţiilor existente în bere prin activitatea lor de metabolism produc
modificări de gust şi aspect a berii (Lactobacilus plantarum, L. brevis, unele bacterii G -
Acetobacter, Zimomonas şi G+, Micrococus, Pediococus.

22.2. Recoltarea şi pregătirea probelor pentru analiză microbiologică:

Indicaţii generale:
Probele pentru analiza microbiologică se recoltează şi se pregătesc de personal de specialitate.
Operaţia de deschidere a recipientelor cu probe, pregătirea acestora şi analiza microbiologică
propriu-zisă se efectuează în laboratorul de microbiologie. Pentru prevenirea contaminării
accidentale, uşile şi ferestrele încăperii trebuie să fie bine închise şi să nu permită, în încăpere decât
prezenţa persoanelor care participă la efectuarea analizelor.
Recoltare:
60
- Pentru berea îmbuteliată în ambalaje de desfacere de până la 1000 ml/ ambalaj, se recoltează prin
sondaj, câte trei recipiente din loturi de până la 100 000 recipiente respectiv câte 5 recipiente, din
loturi de peste 100 000 de recipiente.
- Pentru berea din butoaie, cisterne şi de pe fluxul tehnologic, se recoltează prin sondaj, câte 500 ml
în condiţii aseptice, în recipiente sterile.
- Fiecare recipient cu probă pentru analiza microbiologică, trebuie etichetat.
- Probele recoltate se transportă la laborator în condiţii corespunzătoare.
- În laborator se notează toate datele de identificare a probei, data şi ora intrării precum şi
documentele ce o însoţesc.
Introducerea în lucru a probelor se face imediat ce acestea sosesc în laborator. În cazul în
care analiza microbiologică nu se efectuează imediat, probele se pot păstra la temperatura de 4oC,
timp de max. 10 h în cazul berii nepasteurizate.
Reactivi:
- Apă distilată, sterilă, lipsită de substanţe susceptibile să inhibe dezvoltarea microorganismelor, în
condiţiile analizei.
- Alcool etilic 70% (V/V)
- Soluţie fiziologică peptonată, sterilă.
Pregătirea probelor:
- Recipientele se deschid în apropierea flăcării unui bec de gaz, după ce, în prealabil au fost şterse
cu un tampon de vată îmbibat în alcool etilic.
- Se îndepărtează dioxidul de carbon din probă, astfel: se introduce proba într-un pahar cilindric de
1000 ml, cu fundul plat, steril şi se aduce la temperatura de 20oC; se acoperă paharul cu un capac de
cutie Petri steril şi se agită timp de 3 min. Se lasă în repauz până când spuma nu mai este
persistentă ( intervalul dintre eliminarea dioxidului de carbon şi prelevarea probei pentru analiza
microbiologică nu trebuie să depăşească 5 min.)*
*
Eliminarea dioxidului de carbon este necesară numai în cazul determinării, prin metode clasice, a
parametrilor microbiologici, nu şi în cazul determinării acestora prin metode cu membrane filtrante
- Din proba de analiză, recoltată şi pregătită corespunzător, se prelevează în mod aseptic, volumul
de probă necesar determinării fiecărui parametru microbiologic şi anume:
- Pentru determinarea numărului probabil de bacterii coliforme, se prelevează de 3 ori câte 10
ml, pentru însămânţarea produsului ca atare (diluţia 1/1) şi câte 1 ml, pentru realizarea diluţiilor
decimale succesive.
- Pentru determinarea numărului de drojdii şi mucegaiuri, se prelevează de 2 ori câte 1 ml, pentru
însămânţarea produsului ca atare (diluţia 1/1) cât şi pentru realizarea diluţiilor decimale succesive.

61
 23. ANALIZA MICROBIOLOGICĂ A VINULUI
Diversitatea sortimentelor de vinuri este dependentă de compoziţia şi caracteristica soiurilor
de struguri, de calitatea şi cantitatea microorganismelor care acţionează în must şi de factorii
tehnologici de dirijare a activităţii microorganismelor de interes. Microorganismele (cu activitate
enzimatică) care ajung în mustul de struguri şi concură la formarea vinului, pot fi arbitrar încadrate
în următoarele grupe:
- microorganisme permanent utile:- drojdii de fermentaţie denumite şi drojdii de cultură sau
drojdii tipice care aparţin genului Saccharomyces cu specia Saccharomices cerevisiae subspecia
ellipsoideus (vini), la care se adaugă tulpini cu capacitate fermentativă variată: Saccharomices
italicus, Saccharomices florenticus, Saccharomices fructum.
-microorganisme condiţionat utile: - drojdii cu putere alcooligenă redusă, aparţinând genului
Kloeckera (K.apiculata, K.magna) şi din genul Torulopsis (T. stelata şi T.bacilaris). Aceste drojdii
se înmulţesc în must şi produc fermentaţia alcoolică a glucidelor, până când în mustul fermentat se
acumulează de 6-8o alcool etilic, concentraţie la care le inhibă activitatea.
Unele drojdii ce folosesc ca sursă de carbon acidul malic pot fi folosite la reducerea
acidităţii vinului; genul Schizosaccharomyces cu speciile Schiz. pombe şi Schiz. bailii. Sunt bacterii
sulfitoreducătoare şi în anumite condiţii pot produce defectul de refermentare a vinurilor.
-microorganisme dăunătoare , în care pot fi incluse drojdiile oxidative care dau defectul de floare
a vinurilor, bacterii acetice şi unele specii de bacterii lactice care dau alterări ale vinului la păstrare,
unele mucegaiuri care influenţează (în mod indirect) calitatea vinurilor.
23.1. Ciclul evolutiv al drojdiilor la fermentarea vinului.
Mustul fermentează 8-40 zile în funcţie de conţinutul în drojdii şi de concentraţia de zahăr.
Faza I - multiplicare scurtă 2-5 zile pornind de la un inocul de 105 celule /cm3 (inocul
natural) până la 106-108 celule /cm3. Faza se opreşte datorită lipsei substanţelor nutritive. După care
urmează faza a II-a de staţionare şi faza a III-a de declin.
Există antagonisme biochimice ce influenţează calitatea vinului, acestea se observă între
drojdii şi alte microorganisme (exemplu genul Torullopsis spora antagonică cu toate bacteriile
Gram negative.
Cel mai important factor este temperatura, optim este între 22-27oC iar limita de dezvoltare
între 1-40oC. Sub 1oC drojdiile îşi pierd activitatea, peste 42oC drojdiile sunt distruse. Rezistenţa
drojdiilor la temperatură ridicată depinde de aciditate şi conţinutul în alcool.

62
23.2. Analiza microbiologică a vinului îmbuteliat sau în vrac
Scop:- cunoaşterea gradului de contaminare cu microorganisme- drojdiile vinului, bacterii lactice,
acetice- care în anumite condiţii produc degradarea vinului.
Recoltarea probelor:
a. În cazul vinurilor îmbuteliate se ia la întâmplare din lot numărul de butelii necesar pentru
determinările care urmează să fie efectuate.
b. În cazul vinurilor aflate în butoaie sau în recipiente mari, se extrag probe elementare de la diferite
nivele, în cantităţi egale de cel puţin 1 litru, fiecare, după cum urmează:
- din stratul de la suprafaţa vinului
- din stratul situat la 90% din înălţimea vinului
- din stratul situat la 50% din înălţimea vinului
- din stratul situat sub 10% din înălţimea vinului.
Probele elementare se introduc într-un recipient steril, se amestecă şi apoi se ia cantitatea
necesară pentru determinările ce urmează să fie efectuate
La vinurile care au microorganisme care formează peliculă continuă sau insule la suprafaţă,
această peliculă se recoltează separat, în eprubete de cultură sau plăci Petri. Fiecare probă trebuie să
fie închisă ermetic, sigilată şi etichetată.
Transportul şi păstrarea probelor: Probele trebuie transportate la laborator în maxim 24 h după
recoltare. Când nu este posibilă transmiterea probelor în timpul menţionat, acestea se păstrează la
temperatura de 5-8o C.
Condiţii de lucru : Lucrările premergătoare şi determinările microbiologice se execută în boxe
special amenajate, prevăzute cu boxe bactericide cu radiaţii ultraviolete pentru sterilizarea aerului.
Deschiderea probelor se face respectând regulile de asepsie (ştergerea cu alcool etilic 60-70% vol.,
flambarea gurii recipientelor etc).
Înaintea deschiderii probei se apreciază limpezimea vinului, culoarea, prezenţa şi caracteristica
depozitului, dacă ambalajul probei permite aceasta.
Controlul microbiologic al vinurilor
Controlul prezenţei peliculei. Recoltarea probei se face cu ajutorul unei fâşii de hârtie
(sterilizată la 1500C), ce se introduce cu un capăt într-un vas în aşa fel încât să vină în contact cu
pelicula. Se scoate din vas şi se trece peste o lamă microscopică pe care se depune astfel o porţiune
de peliculă şi se exainează la microscop. Pot apare următoarele situaţii:
a) Miros de oţet: Prin examinarea peliculei (ce este subţire, netedă, lucioasă, umedă,
zbârcită sau suindu-se pe pereţi, colorată în albastru sau galben cu iod) la microscop se constată
bacterii amovibile, bastonaşe scurte. Cauza bolii este reprezentată de bacteriile acetice din genul

63
Acetobacter cu speciile A. paradoxum Frateur, A. mexoxyidans,Frateur, A. suboxydans, Kluyver,
A.ascendens Heneberg etc.
b) lipsa mirosului de oţet dar apariţia celui caracteristic pentru eterul etilic al acidului acetic
(pelicula este albă, uscată, încărcată cu bule de aer). Microorganismele responsabile de această
formă peliculară sunt: drojdiile din specia Hansenula anomala. La microscop se constată apariţia
unor celule lungi, cu 1-2 picături de grăsime la poli.
c) nu este evident mirosul de oţet, apare o nuanţa plăcută a mirosului (pelicula plisată şi de
culoare cenuşie);microscopic se constată celule de drojdii din genul Pichia membranaefaciens
Hansen.
d) miros de unt rânced - pelicula este subţire fină, netedă, albă- este formată din drojdiile
speciei Candida vini Person.
e) vinul prezintă un miros aldehidic, tipic vinului de xeres – pelicula este de culoare alb-
cenuşie subţire şi se îngroasă pe măsura învechirii. Apare ca urmare a acţiunii drojdiilor de vin
dindiferite specii ale genului Saccharomyces.
Controlul vinurilor opalescente sau tulburi: Se iau probe de vin de la diferite nivele şi se
execută prin omogenizare o probă medie
1) în vinul tânăr apare o opalescenţă persistentă, în primele luni după fermentare. Prin
agitare în pahar se observă văluri mătăsoase cu aspect marmorat. Microscopic în preparat se
observă bacterii (bastonaşe scurte sau coci) şi celule de drojdii în faza fermentativă sau de latenţă.
Bacteriile implicate: Pediococcus cerevisiae, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fructivorum,
Leuconostoc gracile
2) în vinul tânăr apariţia tulburelii de nuanţă argintie şi un gust dulceag (nu se formează
valuri ca şi în cazul precedent). La microscop sunt observate un număr mare de drojdii majoritatea
înmugurite.
3) vin cu tulbureală dar sec – la microscop se observă drojdii în diferite stadii de dezvoltare,
majoritatea fiind moarte.
4) vin tulbure, sec sau cu urme de zaharuri – microscopic apar substanţe coagulate de natură
organică, organizate în grămezi. În alte cazuri se pot observa formaţiuni sub formă de fulgi,
provenite din tratamentele de limpezire aplicate vinului
5) vin de culoare alb- verzui, ce poate deveni cafeniu. Examinate la microscop aceste vinuri,
prezintă părticele amorfe de pigmenţi.
6) vin cu o tentă negricioasă sau verde negricioasă – microscopic apar formaţiuni amorfe
închise la culoare, ce se dizolvă prin picurarea la marginea lamelei a unei soluţii de acid tartic 1/10.
7) vin alb-verzui tulbure, alb-cenuşiu microscopic apar formaţiuni amorfe închise la culoare,
ce se dizolvă prin picurarea la marginea lamelei a unei soluţii de acid clorhidric. La examinarea
64
microscopică a unui vin limpezit la lumină solară prin depunerea pe marginea lamelei preparatului
se depune o picătură de perhidrol, reapar formaţiunile amorfe.
8) apariţia unui gust dulceag-acrişor şi miros înţepător de lapte acru sau borş. La examinare
microscopică se constată apariţia mai multor bacterii lactice: Lactobacillus fructivorum,
Lactobacillus hilgardii şi Leuconostoc gracile
9) vin cu aspect asemănător cafelei cu lapte apare datorită unor specii bacteriene din care
predomină Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Leuconostoc oinos.
Controlul vinurilor voalate sau limpezi
Pot apare următoarele situaţii: - curgere în fir neîntrerupt fără zgomot cu aspect uleios
siropos (simptome caracteristice bolii întinderii) produse de următoarele microorganisme:
Leuconostoc gracile, Leuconostoc oinos, Streptoccocus mucilaginosus.
Controlul microbiologic al vinurilor destinate îmbutelierii În vederea îmbutelierii
vinurilor, se fac pregătiri privind instalaţia de îmbuteliere, încăperea, sterilitatea sticlelor şi a
dopurilor pregătite special.
Examenul microscopic:
Principiul metodei: examenul microscopic permite stabilirea gradului de contaminare a vinului şi
constă din:
1. – examenul preparatului microscopic proaspăt, necolorat,
2. – determinarea numărului de microorganisme pe unitatea de volum,
3. – identificarea microorganismelor pe preparate microscopice colorate.
Aparatură: - Microscop monoocular
- Centrifugă
- Cameră de numărat Thoma
I. Examenul preparatului microscopic proaspăt, necolorat,
Se aplică pe lamă cu pipeta Pasteur sau cu o baghetă de sticlă o picătură de vin limpede, din depozit
sau din vinul omogenizat prin agitare. Se acoperă cu lamela, se elimină surplusul de vin cu hârtie de
filtru şi se examinează la microscop în vederea aprecierii globale a gradului de contaminare.
II. Identificarea microorganismelor pe preparate microscopice colorate
A. Identificara drojdiilor vii
Determinarea se face prin colorarea preparatului microscopic cu albastru de metilen sau cu roşu-
neutru.
a. Colorarea cu albastru de metilen.
Mod de lucru: se aplică pe o lamă cu ajutorul unei pipete Pasteur, o picătură din proba de vin şi o
picătură soluţie de albastru de metilen. Se amestecă cu ajutorul ansei, se montează lamela , se lasă 5
minute şi se observă la microscop prezenţa drojdiilor.
65
 Celulele vii nu se colorează, iar celulele moarte se colorează în albastru închis.
b.Colorarea cu roşu- neutru
Modul de lucru şi interpretarea este identică cu cea de mai sus , cu deosebirea că celulele moarte se
colorează în roşu
B. Identificarea bacteriilor
Determinarea se face prin coloraţia Gram a preparatului microscopic
Mod de lucru: pe o lamă se aplică cu ajutorul unei pipete Pasteur, o picătură din proba de
vin, cu ajutorul ansei, se lasă să se usuce la aer şi se fixează la flacără, urmând colorarea prin
metoda Gram.
Interpretarea rezultatelor:
- bacteriile Gram pozitive, nefiind influenţate de acţiunea decolorantului (soluţia
de alcool-acetonă), apar colorate în violet –cazul bacteriilor lactice.
- bacteriile Gram negative pierzând culoarea violetă în timpul decolorării, apar
colorate în roşu – cazul bacteriilor acetice..
C. Determinarea numărului de microorganisme pe unitatea de volum
Numărului de microorganisme pe unitatea de volum se determină cu ajutorul camerelor de numărat.
Determinarea se face asupra probei de vin omogenizate.
Mod de lucru: pe lamă se depune cu pipeta Pasteur o picătură din proba de vin şi se aşteaptă câteva
minute pentru a se depune celulele. În cazul când celulele sunt aglomerate, este necesar să se facă o
diluare a probei cu acid sulfuric1,81 diluat 1-5, ţinând seama la calcularea rezultatului de diluţia
respectivă a probei.
Drojdiile se numără după 5-10 minute de la aplicarea pe lamă, pe 100 pătrăţele, grupate câte
16 în 5 locuri diferite şi anume la cele 4 colţuri şi la mijlocul cadrilajului.
Bacteriile se numără după 15 minute de la aplicarea probei pe lama camerei de
numărat, pe 25 pătrăţele, grupate câte 5 în 4 colţuri şi la mijlocul cadrilajului.
Numărul de drojdii raportat la 1 cm3 se calculează cu formula:
Xd = 200000 · n · r
în care: n = media valorilor găsite la numărarea drojdiilor
r = diluţia probei
200000 = coeficientul pentru exprimarea rezultatelor la 1 cm3.
Numărul de bacterii raportat la 1 cm3 se calculează cu formula:
Xb = 800000 · n · r
în care: n = media valorilor găsite la numărarea bacteriilor
r = diluţia probei
800000 = coeficientul pentru exprimarea rezultatelor la 1 cm3.
66
Determinarea numărului de microorganisme prin culturi pe medii solide
Determinarea numărului de drojdii vii:
În 3 epubete care conţin 5 cm3 must din struguri proaspăt se însămânţează câte 1 cm3 din proba de
vin omogenizată şi se transvazează conţinutul fiecărei eprubete în câte o cutie Petri sterilă. Se
adaugă câte 10 cm3 gelatină sau geloză şi se omogenizează prin mişcări circulare. Se lasă în repaus
până la solidificare. Se incubează la termostat la 20-22o C timp de 4-6 zile.
Numărarea coloniilor de drojdii crescute se face cu ajutorul lupei pe întreaga suprafaţă a fiecărei
plăcii sau pe sectoare. Se calculează apoi media aritmetică a numărului de colonii de drojdii din cele
trei cutii Petri raportat la 1 cm3 de vin.
Determinarea numărului de bacterii vii
Însămânţarea probei de vin se face idem drojdii, folosind ca mediu de cultură mustul de struguri ,
îmbogăţit cu extract de drojdii. Se incubează la termostat la 20-22o C timp de 4-6 zile în cazul
folosirii gelatinei sau la temperatura de 25-30o C în cazul folosirii gelozei.
Numărarea coloniilor de bacterii crescute se face cu ajutorul lupei pe întreaga suprafaţă a fiecărei
plăcii sau pe sectoare. Se calculează apoi media aritmetică a numărului de colonii de drojdii din cele
trei cutii Petri raportat la 1 cm3 de vin.
Se mai pot face următoarele determinări:
Determinarea numărului de microorganisme prin culturi pe membrane filtrante.
Determinarea numărului de microorganisme prin culturi în medii lichide.
23.3. Investigaţia microbiologică a strugurilor, mustuielii şi mustului
Determinarea microorganismelor care se întâlnesc pe struguri, după caracterul coloniilor pe
medii solide (mediul must de struguri-agar)
de puf: de culoare cenuşie – Botrytis
cenuşiu închis: Mucor
albastru verzui: Penicillium
verzui, galben: Aspergillius
Colonii mărunte ca nişte gămălii, aspect ceros, albicioase închis, cu diverse proeminenţe – drojdii:
- contururi regulate pe suprafaţa şi în profunzimea mediului: genul Saccharomyces
- plate, neintroduse în adâncimeamediului, mate cu margini întretăiate, uneori colorate diferit:
drojdii din genul Candida, Torulopsis, Hansenula, Pichia
1.Colonii sub forma unor picături transparente: bacterii
2.Colonii mărunte, unite ca o brumă uşor opalescentă: bacterii
În mustuială se găseşte microflora prezentă pe struguri şi microorganismele ce vin în contact
prin prelucrare .Pentru determinări se ia o probă medie care se cercetează la microscop: se ia de ex.
un volum determinat – 10 ml care se diluează cu apă sterilă (90 ml sau diluţii mai mari când este o
67
încărcătură bacteriană mare) şi se numără la microscop celule de microorganisme prin tehnicile de
calcul prezentate anterior. Se consideră satisfăcătoare, diluţia care reprezintă cca. 200 de celule/ml.
Din această diluţie se ia un ml şi se însămânţează pe mediul must-agar turnat în plăci Petri. După
dezvoltarea microorganismelor, se poate determina numărul de germeni viabili.
Pentru determinarea microflorei din mustul omogenizat se ia o probă de 10 ml şi se
pregăteşte un preparat microscopic ca şi în cazul mustuielii. Genurile şi speciile de drojdii din must
se determină examinând atât microscopic (tabel 18)mustul ca atare, cât şi coloniile ce sau format
după însămânţarea pe medii de cultură. Încadrarea drojdiilor sporogene în cadrul genurilor se face
cu ajutorul unor chei de determinare.
Microorganisme din must şi mustuială
tabel 18
Includerile Descrierea Micror
eacţia cu iod
Celulele genului De dimensiuni mari (Ø 4-10µ) Se
Sacaromyces şi asemănătoare rotunde, ovale, alungite, cu conţinut mai mult colorează în
acestora, cu muguri sau fără sau mai puţin granulos galben sau
muguri roşu închis cu
ton violet
Celulele drojdiilor de Mai mici şi alungite cu picături de Se
floare, genul Candida grăsime în plasmă colorează în
galben
Hifele miceliului de Rupturi de fire mărunte de culoare albă Se
mucegai sau roşcată de diferite tonuri, fără despărţituri colorează în
în curmeziş sau despărţituri galben
Coloniile micegaiului Mari (Ø20 µ) în formă de ou, cafenii Se
cenuşiu genul Botrytis cu un conţinut compact colorează în
galben
Coloniile micegaiului Mărunte cu ţepi, sferice, incolore 6-8 µ Se
cenuşiu genul Aspergilius (Aspergilius glaucum) sau netede de 3,5-4 µ colorează în
(Aspergilius niger) galben
Conidiile mucegaiului Mărunte Ø 2,5 µ, rotunde, netede, Se
sub formă de ciorchine genul adesea unite la loc colorează în
Penicilium galben
Conidiile lui Mari, multicelulare, rotunjite, în formă Se
Alternaria de pară sau ascuţite, în lănţişoare scurte colorează în
galben
Conidioforii de Conidioforii lungi, multicelulari. Se
Conidioforium celularis Conidiile lungi, rotunjite, măslinii colorează în
galben
Cocii, bacteriile Rotunzi sau sub formă de bastonaşe şi Se
lănţişoare colorează în
galben
23.4. Controlul microbiologic al fermentaţiei
Acest control are ca obiective: verificarea purităţii culturiilor de drojdii, condiţionarea
mustului, prepararea maielei de drojdii şi introducerea în must, urmărirea fermentării mustului şi
mustuielii şi a micşorării acidităţii malice şi tragerea de pe drojdie.
68
 Controlul culturilor de drojdie Folosirea culturilor pure se impune atunci când condiţiile de
mediu sunt nefavorabile, strugurii au un conţinut mare în acid malic şi concentraţie ridicată în
zaharuri sau când recoltele au fost avariate. Se recomandă administrarea unor doze mari de
anhidridă sulfuroasă pentru anihilarea activităţii microorganismelor dăunătoare din must şi
mustuială. Culturile de drojdii sunt preparate din diferite tulpini rezistente la zaharuri, la valori mici
ale pH-ului, la anhidridă sulfuroasă şi capabile să se activeze la variaţii de temperatură. Aceste
culturi trebuie să fie controlate sub trei aspecte: puritate, energie fermentativă şi starea fiziologică a
drojdiilor
Condiţionarea mustului. La examinarea microscopică în mustul corect limpezit nu trebuie
să se găsească bacterii şi mucegaiuri şi celule de drojdii înmugurite.
Fazele prin care trec drojdiile pe parcursul fermentării mustului reflectă starea lor
fiziologică: înmulţire, fermentare, latenţă, moarte.
1. Faza prefermentativă (stadiul de înmugurire)- celulele de drojdii sunt unite câte două;
prezintă muguri de diverse mărimi, au un conţinut transparent bogat în vacuole. Celula mamă în
interval de 15-30 min dă naştere la o nouă celulă bine dezvoltată. La microscop, preparatul (o
picătură de suspensie de drojdii) cu soluţie Lugol, se observă că celulele se colorează în roşu acaju,
datorită prezenţei glicogenului (cu excepţia celulelor bătrâne şi a celor ce nu au atins 1/5 din
mărimea celulei mamă ce se vor colora în galben).
2. Faza fermentaţiei zgomotoase. În acest stadiu se observă microscopic, celule fără muguri
ce nu se mai înmulţesc, dar produc fermentarea. În vacuole se acumulează volutin ce se poate
evidenţia microscopic astfel: se pregăteşte un frotiu dintr-o suspensie de drojdii, se fixează şi se
adaugă soluţie Lofler, menţinând-o 3-5 minute, excesul de soluţie se absoarbe cu hîrtie de filtru.Se
acoperă cu lamela iar alături se pune o picătură de acid sulfuric1%, ce pătrunde treptat în frotiu.
Rezultatul: celulele decolorate iar volutinul se colorează în albastru violet intens.
3.Stadiul fermentaţiei lente sau al refermentării. În acest stadiu apar alături de celulele vii şi
celule moarte. Examinarea se face prin pregătirea unui preparat dintr-o picătură de suspensii de
drojdii şi una de albastru de metilen sau violet de genţiană. Rezultatul: celulele moarte se colorează
în albastru violet intens, iar cele vii rămân incolore sau se colorează foarte palid.
4. Faza de liniştire. Celulele ce se observă microscopic în acest stadiu (celule cu citoplasma
compactă, cu vacuole forte mici), caracterizează sfârşitul fermentaţiei secundare şi începutul stării
de latenţă, moment ce coincide cu acumularea de substanţe nutritive. Atunci când această fază se
prelungeşte, celulele încep să utilizeze propriile lor substanţe de rezervă îmbogăţind mediu în
substanţe de descompunere (aminoacizi), dezvoltându-se pe seama lor alte bacterii.
5. Faza de înfometare apare atunci când se continuă foarte mult faza precedentă astfel încât
celulele se autodigeră iar vinul se îmbogăţeşte în produse de descompunere celulară. Microscopic se
69
evidenţiază celule mici ca volum, zbârcite cu citoplasmă granulară, iar culoarea galben deschis
(obţinută cu soluţia Lugol) semnifică lipsa glicogenului.
6. Faza de rezistenţă. Celulele apar microscopic cu membrana mult îngroşată cu un conţinut
mare de substanţe de rezervă: glicogen, grăsimi, acizi graşi. Pentru identificarea glicogenului se
foloseşte soluţia Lugol iar pentru substanţele grase , se utilizează albastrul de Nil – frotiul fixat se
menţine timp de 15-20 minute într-o baie de soluţie de albastru de Nil; se spală cu multă apă ; se fac
treceri succesive prin băi cu soluţie de acid acetic 1%, apoi se spală din nou cu apă. Microscopic se
observă: grăsimile neutre se colorează în roşu portocaliu, acizii graşi şi alte grăsimi în nuanţe de
albastru-violet, nucleul în albastru închis; citoplasma in albastru deschis.
7. Faza respiratorie (oxidativă) este caracterizată prin formarea insuliţelor, inelelor sau
peliculei la suprafaţa vinului. Microscopic există o cantitate mare de picături de grăsime în celule,
iar în citplasmă apar modificări: nucleul este micşorat, vacuolele devin bine dezvoltate, condrionul
este dispersat.
8. Faza de formare a sporilor este evident mai ales în condiţiile de mare sărăcie în substanţe
nutritiva a mediului. În interiorul celulei se observă 1-4 spori (ascospori) ce prin colorare cu fuxină
fenicată şi albastru de metilen vor apărea coloraţi în roşu.
9. Stadiul generaţiei sexuale la Saccharomyces cerevisiae se poate urmări numai
experimental şi este caracterizat prin contopirea sporilor.
10. Stadiul de îmbătrânire, descompunere. Microscopic celulele au un aspect granulos,
citoplasma este coagulată şi are o tentă albăstruie, forma celulelor devine neregulată iar vacuolele se
micşorează foarte mult.
11. Stadiul descompunerii. La microscop celulele apar cu granulaţii şi picături de grăsime
rezultat al autolizării celulelor; produsele de descompunere (aminoacizii)trec în vin, fiind bine
asimilaţi de bacteriile ce produc îmbolnăviri grave.
12.Stadiul descompunerii avansate. Are loc o descompunene totală, îmbogăţind vinul în
substanţe ce produc o tulbureală persistentă, rebelă la tratamentele de îmbogăţire. Microscopic nu se
constată decât membrane celulare fără citoplasmă, rupte arătând ca nişte resturi fără o formă
definită. Este stadiul degradării celei mai profunde.
23.7. Microbiologia cidrului
Cidrul este o băutură slab alcoolică cu 3-7o alcool. Se obţine prin fermentaţia naturală sau
dirijată a sucului de mere şi se utilizează soiuri care conţin mult tanin care nu pot fi comercializate
datorită defectelor de formă şi dimensiuni dar fără alterări microbiologice. Fermentaţia decurge
spontan, este iniţiată de drojdii apiculate şi continuată apoi de tulpini de drojdii specifice (drojdii ale
genului Saccharomyces). Uneori există şi pericolul de dezvoltare excesivă a speciei Saccharomyces

70
ludwigi, drojdie sulfitoreducătoare, care influenţează negativ calitatea cidrului.Culturile de drojdii
utilizate la fabricaţia cidrului, trebuie să aibă următoarele proprietăţi:
- capacitate fermentativă ridicată
- să nu producă H2S, diacetil acetaldehidă, etc, substanţe ce duc la înrăutăţirea aromei,
- să prezinte stabilitate biochimică şi un anumit grad de floculare (astfel încât. celulele să se menţină
în suspensie pe parcursul fermentaţiei şi să formeze sediment).
Cidrul se păstrează în vase unde se produce autosedimentarea. Sedimentarea se poate face şi
prin centrifugare sau filtrare. Pentru prevenirea alterării (în timpul păstrării cidrului) se aplică
diferite procedee: pasteurizare, sulfitare, carbonatare.
Se va evita favorizarea drojdiilor periculoase din genul Hamsenulla sau a bacteriilor acetice din
genul Acetobacter pentru că au influenţă negativă asupra calităţii cidrului.

24. ANALIZA MICROBIOLOGICĂ A CEREALELOR ŞI A DERIVATELOR ACESTUIA

Microorganismele de pe cereale provin din pământ; o cantitate mare de microorganisme din
sol ajung odată cu particulele de praf, îşi păstrează activitatea în continuare. Numărul de germeni
/1g cereale de bună calitate este de câteva milioane. Acest număr creşte brusc când cerealele se
încing sau se alterează. O mare parte din flora de pe boabele de cereale este constituită din bacterii
din genul Pseudomonas - microorganisme ce se înmulţesc cel mai rapid. Exemplu: Pseudomonas
herbicola - pe medii solide formează colonii galben - aurii. În afară de microflora tipică, pe cereale
există şi alte bacterii aduse de praf sau insecte, dintre care menţionăm: bacteriile butirice, Bacillus
mycoides, Bacillus subtilus. Altă categorie de microorganisme de pe cereale sunt mucegaiurile.
Acestea nu se dezvoltă prea energic numai în condiţii optime de temperatură şi umiditate. Genuri de
mucegaiuri: Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Mucor, şi drojdia Saccharomyces.
24.1. Acţiunea microorganismelor asupra cerealelor
Cel mai important proces fiziologic şi microbiologic este încingerea cerealelor, care are loc
datorită unor degajări de căldură, ce ating în interior 60-70oC. Această încingere are loc datorită
proceselor fizice şi fiziologice ale cerealelor, cât şi activităţii biochimice a microorganismelor vii de
pe cereale şi conductibilităţii termice scăzute. Etapa finală debutează după depăşirea temperaturii de
40-50oC - când dispare complet flora epifită deci are loc o reducere a numărului de microorganisme,
fapt datorat scăderii procentului de apă ce migrează în părţile reci ale masei de cereale.
24.2. Microbiologia făinii
Analiza microbiologică a diferitelor tipuri de făină arată un conţinut diferit în
microorganisme. Flora cel mai frecvent întâlnită este alcătuită din bacterii, mucegaiuri şi
drojdii în cantitate mai mică. Dintre bacteriile cel mai des întâlnite amintim: Bacillus subtilis,
mucegaiuri-Aspergillus niger (neagră), Aspergillus flavus (galben), Penicillium-luteum..

71
În făina proaspăt măcinată microorganismele provin în special de pe boabele de cereale, există
anumite tipuri de microorganisme care contaminează făina ca produs finit. În funcţie de tipul
de curăţire al boabelor de cereale avem:
-făină uscată
-făină umedă.
Efectul spălării este mai benefic, deoarece un număr mare de microorganisme trec în apă,
care încălzită la 40oC permite o mai bună spălare a boabelor de cereale.
Pe primul loc ca şi contaminare cu microorganisme este: praful de făină, tărâţele mari,
tărâţele fine, făina de calitatea III, făina OOO. Făina în comparaţie cu cereale este mai puţin
rezistentă la acţiunea microorganismelor. În cazul existenţei unei deficienţe de depozitare
temperatura şi umiditatea este ridicată, microorganismele care rămân în contact cu particulele de
făină se dezvoltă foarte activ. Făina depozitată în saci la o atmosferă şi umiditatea relativă 13,5-
14,5% poate determina sporirea multiplicării microorganismelor. La umiditate ridicată făina pe saci
în stelaje din lemn se poate umezii, din stratul de aer persistent în pardosea şi stelaj.
Mucegăirea începe de la marginea sacului către interior, situaţie în care apare încingerea.
24.3. Microbiologia pâinii şi pastelor făinoase
Alterarea pâinii, bolile şi defectele pâinii şi pastelor făinoase
Fabricarea pâinii se face în trei etape:
-Prepararea aluatului
-Dospirea
-Coacerea
Prepararea aluatului: - frământare : făină + apă + drojdie (maia) + sare. Se utilizează drojdii
presate din rasele XII, T, S. Drojdia adăugată variază între 0,5-3%.
Dospirea aluatului -are loc în camere speciale de fermentare la temperatura de 27-30oC şi
umiditate relativă de 75-80%. Sfârşitul dospirii se stabileşte după gradul de aciditate sau după
creşterea volumului aluatului.
Coacerea pâinii - se face în forme diferite sau direct pe vatră la temperatura de 240-250oC. Durata
coacerii depinde de temperatura cuptorului, de calitatea aluatului.
La coacerea pâinii şi pastelor făinoase se creează condiţii pentru a se menţine şi dezvolta
microorganisme în ceea mai mare parte a procesului tehnologic. Înmulţirea microorganismelor are
loc în procesul obţinerii aluatului şi în cel de fabricaţie; iar uneori apar o serie de defecte datorită
dezvoltării nedorite a unor microorganisme, cele mai cunoscute fiind: întinderea pâinii sau boala
cartofului, mucegăirea pâinii etc.

72
 1.Boala întinderii -apare după câteva ore sau 1-2 zile de păstrare a pâinii proaspete, având ca
agenţi bacterii din genul Bacillus (B. subtilis) Miezul pâinii devine mucilaginos, se colorează în
cenuşiu sau galben-brun cu goluri de aer sau caverne, mirosul se aseamănă cu cel de putrefacţie.
Bacillus subtilis se prezintă sub formă de bastonaşe lungi de 1,6-6µ, groase de 0,5µ, formează
spori de formă ovoidală foarte rezistenţi la căldură. Rezistă 6 ore în vapori de apă la 100oC; 10
minute la 122-124oC. În vapori de apă la temperatura de 130oC sunt distruşi instantaneu.
Îmbolnăvirea pâinii are loc în timpul verii, deoarece dezvoltarea acestor bacterii este favorizată de
temperatură (35-40oC ) şi anumită umiditate. Schimbarea culorii miezului de pâine se explică prin
secretarea de pigmenţi de către bacterii şi datorită proceselor oxidative. Distrugerea structurii pâinii
se datorează capacităţii bacteriei de a hidroliza amidonul cu formare de zaharuri şi dextrine ( în
miezul puternic infectat din 63% amidon cât există în pâinea normală rămâne 16%). Bacillus
secretă şi fermenţi proteolitici care au activitate optimă la pH=7. Gustul şi mirosul specific sunt
legate de procesul de proteoliză. Folosirea în alimentaţie a pâinii bolnave produce puternice
deranjamente în organism uneori chiar necroze. De astfel utilizarea ei este limitată datorită
mirosului neplăcut.
Factorii de bază care determină dezvoltarea bolii sunt:
1. Gradul de infestare al făinii cu bacterii din speciile Bacillus subtilis,
2. Regimul de frământare şi preparare a aluatului,
3. Modul de răcire şi de preparare a pâinii coapte.
Cea mai mare însămânţare a făinii cu spori inclusiv cu Bacillus subtilis se va produce ca urmare a
încingerii făinii sau chiar a cerealelor din care a fost fabricată. Pentru aceasta la prelucrarea în făină
a cerealelor ce au suferit încingerea trebuie să se intensifice măsurile tehnologice care conduc la
scăderea numărului de microorganisme. Se recomandă mărirea acidităţii pâinii sub pH 5 (aceasta se
realizează prin adăugarea de acid lactic 0,3 %, acid acetic 0,1-0,2 %, azotat de Ca 0,2- 0,3 % etc.
După scoaterea pâinii din cuptor se recomandă răcirea ei imediată sau păstrarea la temperatură de
18-20oC.
2. Mucegăirea pâinii şi a altor produse
Are loc când depozitarea se face în condiţii de umiditate care depăşesc 80 % umiditate relativă.Se
pot dezvolta următoarele specii de mucegaiuri: Penicilium glaucum, Aspergilius fumigans, Mucor
mucedo etc. Mucegaiurile se dezvoltă întâi pe coajă, apoi pătrund în interior ( sporii de mucegai
sunt distruşi în timpul coacerii normale ) Dacă făina conţine un număr prea mare de spori, aceştia
nu sunt distruşi total astfel încât mucegăirea se produce foarte repede. Mucegaiurile dezvoltate pe
produsele de panificaţie pe lângă că produc o scădere a greutăţii acestora prin distrugerea
amidonului le fac şi improprii consumului.
Alte defecte:
73
În cazuri mai rare pot să apară şi alte defecte legate de dezvoltarea microorganismelor. Printre
aceste defecte - colorarea diferită a miezului de pâine.
Prin creşterea umidităţii se dezvoltă microorganisme, inclusiv bacterii; unele produc pigmenţi ce
determină culoarea necorespunzătoare a miezului.
Se cunoaşte colorarea în roşu a miezului (cu pete roşii asemănătoare sângelui )ce apare datorită
dezvoltării bacteriei Chromobacterium prodigiosum. Această bacterie se dezvoltă repede la o
temperatură de cca. 25oC. Pâinea infectată nu este dăunatoare
Pete roşii pe pâine pot provoca şi diverse mucegaiuri -Oidium aurantiacum
Un defect al pastelor făinoase întâlnit mai frecvent este umflarea macaroanelor, datorită
dezvoltării lui Bacterium levans. Acesta fermentează hidraţii de carbon cu formare de gaze şi acizi.
Pe suprafaţa macaroanelor apar mici băşicuţe sau asperităţi de diferite dimensiuni. Bacterium levans
se găseşte pe toate cerealele şi în făina de toate extracţiile. La un regim normal de uscare a
macaroanelor nu se observă această umflare Umflarea se produce când însămânţarea a fost prea
masivă sau când aluatul a fost menţinut un timp mai îndelungat înainte de uscare. O uscare rapidă a
aluatului modelat la temperatura de 35-40oC exclude posibilitatea dezvoltării bacteriilor şi apariţiei
fenomenului.
24.4. Stabilirea numărului de bacterii, drojdii, mucegaiuri
Principiu:
1. Însămânţarea se face în profunzime pe două medii de cultură, turnate în plăci Petrii, cu o
cantitate determinată de suspensie, în aceleaşi condiţii, se efectuează şi însămânţarea diluţiilor
decimale obţinute.
2. Incubarea se face în condiţii de aerobioză, la 30oC, timp de 3 zile,. iar pentru drojdiilor şi
mucegaiurilor la 25oC, timp de cinci zile.
Mod de lucru: Din proba luată în lucru, se cântăreşte cu o precizie de 0,1 g, următoarele cantităţi:
Produsul Cantitatea de probă luată Volumul soluţiei de
în lucru, g diluare, ml
Boabe de seminţă 40 360
Produse de măciniş (făinuri, 20 180
grisuri, tărâţe)
Prepararea suspensiei iniţiale:
La proba luată în lucru se adaugă volumul corespunzător al soluţie de diluare, indicat în tabel. Proba
se lasă în contact cu soluţia de diluare 30 minute după care se omogenizează.
Însămânţare:
- Se iau patru plăci Petri sterile. Se repartizează în fiecare dintre acestea, cu ajutorul unei pipete
sterile, câte 1 ml din suspensia iniţială 10 –1
Se iau alte patru plăci Petri sterile. Se repartizează în fiecare dintre acestea, cu ajutorul unei noi
pipete sterile, câte 1 ml din diluţia 10 –2
74
- Se reiau operaţiunile şi pentru diluţiile următoare.
- Pentru fiecare grup de patru plăci, se toarnă în două plăci în jur de 15 ml mediu (agar pentru
numărarea bacteriilor) şi în celelalte două plăci, în jur de 15 ml mediu (agar pentru numărarea
drojdiilor şi mucegaiurilor). Se amestecă cu grijă prin mişcări de rotaţie inoculul cu mediu şi se lasă
să se solidifice, punând plăcile Petri pe o suprafaţă orizontală rece. Se prepară de asemenea două
plăci martor, una conţinând 15 ml mediu cu agar pentru numărarea bacteriilor şi cealaltă conţinând
în jur de 15 ml mediu cu agar pentru numărarea drojdiilor şi mucegaiurilor, în vederea controlului
sterilităţii mediilor.
Incubarea:1. Bacterii Plăcile cu mediu se introduc la termostat, reglat la 30oC ±1oC, timp de 3
zile.
2. Drojdii şi mucegaiuri Se introduc plăcile cu mediu, în termostat, reglat la la 25 oC
±1oC, timp de 5 zile.
Interpretarea rezultatelor:
1. Numărarea coloniilor de bacterii.
Se examinează plăcile după perioada de incubare şi se procedează la numărarea coloniilor, pentru
fiecare placă cu mediu, care conţine mai puţin de 300 de colonii.
O placă trebuie să conţină cel puţin 15 colonii.
2. Numărarea coloniilor de drojdii şi/sau mucegaiuri.
Se numără coloniile din fiecare placă după 3 zile, 4 zile şi 5 zile de incubare. După 5 zile se reţin
plăcile care conţin mai puţin de 150 de colonii. Dacă porţiuni din placă sunt invadate de mucegaiuri
sau dacă este dificil să se numere coloniile bine izolate, se iau în considerare numărătorile efectuate
după 4 zile sau chiar după 3 zile de incubare. În acest caz durata de incubare de 3 sau 4 zile trebuie
să fie indicată în buletinul de analiză.
Exprimarea rezultatelor:
1. Calcul
Se calculează numărul de microorganisme (bacterii, drojdii şi/sau mucegaiuri, pe gram de produs,
cu ajutorul formulei:

ΣC
(na + nb) ⋅ d
în care:
ΣC – suma coloniilor pe toate plăcile numărate şi reţinute la nivelul celor două diluţii succesive,
d - Diluţia de la care s-au obţinut primele numărători
na – numărul de plăci numărate şi reţinute din prima diluţie,
nb – numărul de plăci numărate şi reţinute din a 2-a diluţie.
75
Se rotunjeşte rezultatul la două cifre semnificative. Când numărul rotunjit este cinci, fără alte cifre
semnificative, se rotunjeşte în aşa fel încât cifra din stânga să fie pară, de ex. 28500 este rotunjit la
28000; 11500 este rotunjit la 12000.
Rezultatul se exprimă printr-un număr cuprins între 1,0 şi 9,9 multiplicat cu 10X, X fiind puterea
atribuită lui 10. Dacă nu a crescut nici o colonie la nivelul suspensiei iniţiale, numărul
microorganismelor pe gram de produs trebuie să fie raportat ca fiind mai mic de 10.
Exemplu de calcul:
O numărătoare de drojdii şi mucegaiuri a dat rezultatele următoare (două plăci Petri incubate din
aceaşi diluţie)
Diluţia 10-2: 105 şi 97 colonii
Diluţia 10-3: 18 şi 24 colonii

ΣC 105 + 97 + 18 + 23 243
= = = 11045
(na + nb) ⋅ d [2 + (0,1x2)] 10 −2
0.022

Rotunjind rezultatul, se obţine 11000

Numărul estimat de drojdii şi mucegaiuri pe gram este deci 1,1 x 10.
Numărul de drojdii şi mucegaiuri admis este prezentat în tabelul 16.

25. ANALIZA MICROBIOLOGICĂ A ZAHĂRULUI

Sfecla de zahăr, folosită ca materie primă este contaminată cu diverse microorganisme.
Dezvoltarea microorganismelor este favorizată de sucul de difuziune care este un mediu
prielnic pentru acestea. În general, faptul că fabricile de zahăr funcţionează în flux continuu fără
perioade de remont, nepermiţând efectuarea celor mai stricte lucrări de igienizare, duce la fabricarea
unui produs finit în multe situaţii cu o încărcătură microbiană crescută.
Datorită acestei cauze microorganismele se înmulţesc în toate fazele de producţie a
zahărului.
Principalul germen patogen este Leuconostocul care poate produce sucuri mucilaginoase sau
poate distruge siropul de zahăr; prin fermentarea acestuia – producându-se alcool de calitate
inferioară.
De asemenea în zahărul obţinut în condiţii neigienice se găsesc mucegaiuri şi drojdii care
vor contamina produsele finite în care acesta este adăugat.
25.1. Recoltarea şi pregătirea probelor pentru analiza microbiologică
Indicaţii generale: reactivii folosiţi pentru analize trebuie să fie de calitate sau de calitate
echivalentă; apa trebuie să fie distilată, lipsită de substanţe susceptibile să inhibe dezvoltarea
microorganismelor în condiţiile analizei; probele pentru analiza microbiologică se recoltează de
către persoane care cunosc tehnica recoltării probelor pentru acest tip de analiză; recoltarea

76
probelor, deschiderea recipientelor cu probe şi analiza microbiologică propriu- zisă se efectuează în
laboratorul de microbiologie.
Recoltarea probelor:
1. Probele pentru analiza microbiologică se vor prelucra separat înainte de recoltarea probelor
pentru alte analize (fizico- chimice etc).
2. Recoltarea se face în mod aseptic, cu instrumente sterile (scafă, sondă) şi se introduc în recipiente
sterile sau în pungi de polietilenă la prima folosire.
3. Pentru zahărul cristal, recoltarea se efectuează din profunzimea sacilor, cu o sondă sterilă.
4. Pentru zahărul lichid, se lasă să curgă produsul în flaconul de recoltare.
5. Mărimea probei este de aproximativ 250 g pentru zahărul solid şi de min. 250 ml, pentru zahărul
lichid.
6. Fiecare probă recoltată pentru analiza microbiologică trebuie să fie sigilată şi etichetată.
Aparatură şi materiale:
Materialul uzual în laboratorul de microbiologie, cu următoarele completări:
- vată hidrofilă
- spatulă sterilă
- baie de apă
- alcool etilic 70 %
- lichid de diluare
Cantitatea de probă luată în lucru:
10 g, pentru determinarea numărului total de germeni aerobi mezofili
15 g, pentru determinarea germenilor din genul Leuconostoc
20 g, pentru determinarea numărului de drojdii şi mucegaiuri etc.
24.2. Examenul bacteriologic al zahărului
Determinarea bacteriilor din genul Leuconostoc
Bacteriile din genul Leuconostoc sunt coci Gram pozitiv, care la temperatura de 22oC- 25oC,
formează pe medii cu concentraţie ridicată de zaharoză, colonii translucide, filante.
Principiu:
1. Însămânţarea unui mediu de îmbogăţire, cu o cantitate determinată din eşantionul pentru
analiză.
2. Incubarea mediului la temperatura de 22 -25 oC, timp de 5 zile.
3. Trecerea din mediul de îmbogăţire pe un mediu selectiv, în cutii Petri.
4. Incubarea cutiilor Petri însămânţate, timp de 72 h +/- 3 h la temperatura de 22 oC- 25 oC
5. Confirmarea biochimică a coloniilor suspecte a fi Leuconostoc mezenteroides, dacă se consideră
necesară.
77
6. Exprimarea rezultatelor sub forma prezent sau absent în 15 g (15 ml) probă de analiză.
Medii de cultură: Se recomandă ca, pentru prepararea mediilor de cultură, să se utilizeze
componente de bază deshidratate. Reactivii şi apa folosiţi trebuie să corespundă SR 11499-1
1. Mediu de îmbogăţire cu proteoză-peptonă. Preparare: Se dizolvă componentele în apă,
aducând la fierbere. Se repartizează , câte 150 ml mediu în recipiente de capacitate adecvată sau
câte 40 ml mediu, în eprubete şi se sterilizează în autoclav la temperatura de 1200C, timp de 20 min.
Se ajustează pH-ul la 7,0 +/- 0,1.
2. Mediu selectiv agar- zaharoză Se repartizează , mediul în recipiente de capacitate adecvată
şi se sterilizează în autoclav la temperatura de 1150C, timp de 20 min. Se ajustează pH-ul la 7,0 +/-
0,1. Se toarnă câte 15 ml....20 ml mediu selectiv, răcit la 450C, în cutii Petri sterile şi se lasă să se
solidifice pe o suprafaţa orizontală rece. Se usucă cutiile cu suprafaţa mediului întoarsă în jos, într-
un termostat, timp de max. 30 min.
3. Mediu pentru confirmare biochimică (mediu pentru reacţia Voges- Proskauer)
Preparare: Se dizolvă componentele în apă, prin încălzire, apoi se filtrează prin vată. Se ajustează
pH-ul la 6,0 +/- 0,1. Se repartizează în eprubete de 16 mm/160 mm. şi se sterilizează în autoclav la
temperatura de 115 0C, timp de 20 min.
Mod de lucru:
1. Însămânţarea: în flaconul cu mediu de îmbogăţire (cu proteoză- peptonă) se introduc 15 g (15 ml)
probă de zahăr.
2. Incubare: mediul însămânţat se incubează timp de 5 zile, la temperatura de 22 oC- 25 oC.
3. Izolare: Din mediu de îmbogăţire se fac treceri, cu ajutorul ansei bacteriologice, pe suprafaţa
uscată a mediului selectiv (agar- zaharoză), aflat în plăci Petri.
4.Cutiile însămânţate se incubează, timp de 72 h +/- 3 h la temperatura de 22oC- 25oC. Se reţin,
pentru examinările ulterioare, cutiile în care, pe suprafaţa mediului
s-au dezvoltat colonii izolate sau confluente, translucide, cu tendinţă de curgere (filante).
Examinare microscopică: Pe lama de microscop curată şi degresată se depune cu ajutorul unei
pipete efilate, o picătură de apă sterilă. În această picătură se dispersează o porţiune luată cu ansa
din profunzimea coloniilor cu aspect caracteristic dezvoltate pe mediu selectiv, care se întinde apoi
pe suprafaţa lamei. Se usucă , fixează şi colorează Gram şi se examinează la microscop cu
obiectivul de imersie.
Prezenţa, pe frotiuri a unor coci Gram pozitivi, alungiţi sau a unor cocobacili dispuşi în
perechi sau lanţuri scurte, indică prezenţa bacteriilor din genul Leuconostoc.
Confirmare biochimică pentru Leuconostoc mezonteroides
Se completează în cazul când se consideră necesară, examenele de izolare şi examinare
microscopică, cu reacţia Voges- Proskauer. Eprubeta se incubează , timp de 18 h la 22-25oC. La 2
78
ml din această cultură se adaugă 0,5 ml soluţie de α- naftol, soluţie alcoolică 6%, se agită energic,
după care se adaugă 0,5 ml hidroxid de sodiu, soluţie apoasă 16%. Se agită din nou şi se incubează
timp de 10-30 min., în termostat la temperatura de 37oC+/-1oC. Apariţia unui inel de culoare roz
indică o reacţie pozitivă.
Exprimarea rezultatelor:
1. În cazul în care , pe mediu selectiv s-au dezvoltat colonii caracteristice, iar examenul
microscopic a pus în evidenţă coci G+ alungiţi şi/sau cocobacili se consideră prezenţi germeni din
genul Leuconostoc, rezultatul exprimându-se în Leuconostoc prezent în 15 g sau 15 ml.
2. În cazul în care , pe mediu selectiv nu s-au dezvoltat colonii caracteristice, iar examenul
microscopic nu a pus în evidenţă coci G+ alungiţi şi/sau cocobacili se consideră absenţi germeni din
genul Leuconostoc, rezultatul exprimându-se în Leuconostoc absent în 15 g sau 15 ml.
3. In cazul în care confirmarea biochimică atestă prezenţa acetil-metil carbinolului, se
consideră că proba conţine germeni din genul Leuconostoc, rezultatul exprimându-se în
Leuconostoc prezent în 15 g sau 15 ml.( SR 11499-1/1997)
Determinarea germenilor din genul Pseudomonas aeruginosa
Principiul metodei: Se stabileşte gradul de contaminare al probei de analizat, prin încorporarea unei
cantităţi de probă în mediu specific şi incubare la 35 +/- 1oC.
Însămânţarea: din diluţia 1/10 se însămânţează 10 cm3 soluţie în 100 cm3 mediu de îmbogăţire
selenit- cistină. Proba însămânţată se incubează la 35oC, timp de 48+/- 3 h, după care se fac treceri
cu ansa în mediu cu citrimid, turnat în plăci Petri.
Cutiile Petri însămânţate se incubează la temperatura de 35 +/- 1oC, tmp de 48 +/- 3 h. Se
examinează cu lupa suprafaţa mediului şi se observă dacă s-au dezvoltat colonii.
Interpretare: Dezvoltarea unor colonii de culoare verde închis indică prezenţa germenului
Pseudomonas aeruginosa.
Determinarea germenilor din genul Salmonella şi Shigella
În cazul Salmonellei se folosesc aceleaşi etape cunoscute din lucrările anterioare (conform STAS)
iar în cazul Shigellei nu se aplică etapa de preâmbogăţire. În cazul Salmonelei, coloniile suspecte pe
medii selective se confirmă serologic prin reacţii de seroaglutinare.
Determinarea germenilor din genul Proteus
Prezenţa bacteriilor din genul Proteus se evidenţiază prin existenţa fenomenului de invazie (roire)
pus în evidenţă pe mediile cu geloză
Se însămânţează câte 1 cm3 din diluţiile 1/10, 1/100 cu pipeta de 1 cm3, în lichidul de condensare al
eprubetelor cu mediu gelozat, proaspăt, înclinat, fără a atinge suprafaţa mediului. Eprubetele se
incubează la termostat la temperatura de 37 +/- 1oC, cel mult 24 h. Eprubetele pe care se constată
creştere microbiană pe suprafaţa gelozei înclinate sunt considerate pozitive.

79
 Caracteristici CONDIŢII DE
ADMISIBILITATE
Număr total de germeni aerobi mezofili, max. 1000
Drojdii şi mucegaiuri (levuri şi fungi) la 1 g, max 100
Bacterii din genul Leuconostoc, la diluţia 1/10 absent
Bacterii coliforme şi E. coli la 1 g absent
Salmonella, la 10 g absent
Proteus, la 0,1 g absent
Shigella, la 1g absent

26.ANALIZA MICROBIOLOGICĂ A FRUCTELOR ŞI LEGUMELOR

Pe suprafaţa fructelor şi legumelor în mod permanent se află diverse microorganisme. Cea
mai mare parte a acestor microorganisme participă direct la procesul de degradare a fructelor.
Felul microorganismelor depinde de condiţiile pe care le întâlnesc şi mai ales de cantitatea
de substanţe nutritive. Dacă epiderma nu este rănită substanţele nutritive sunt greu puse la
dispoziţie. Din aceasta cauză numai puţine specii se pot dezvolta pe suprafaţa plantelor; cele mai
multe se găsesc în stare inactivă sau de spori. Dacă suprafaţa fructelor şi legumelor este rănită şi
iese sucul, microflora epifită este mai bogată. Fructele sănătoase atingându-se de cele alterate se
îmbogăţesc în microorganisme şi alterarea se face mai uşor.
Microorganismele ce se găsesc pe suprafaţa fructelor şi legumelor provin din aer prin
intermediul prin intermediul prafului sau sunt aduse de insecte. O parte importantă provin şi din
contactul cu pământul sau cu obiectele murdare; ajunse pe fructe formele neadaptate dispar; formele
capabile să se dezvolte sau care trec într-o formă de viaţă lentă formează microflora epifită (de
suprafaţă). Această microfloră are o compoziţie destul de constantă şi de aceea se poate vorbi
despre existenţa unei flore epifite specifice.
26.1. Microbiologia fructelor
Pe fructele proaspete se găsesc microorganisme diverse: bacterii, drojdii, mucegaiuri. De
exemplu în solul pe care se găseşte viţa de vie se găsesc în mod normal drojdii; ele îmbogăţesc
microflora strugurilor prin intermediul prafului şi a insectelor.
Microflora este foarte variată. Sporii de mucegai se găsesc în principal pe fructele citrice;
prezenţa lor este supărătoare pe aceste fructe unde se pot dezvolta cu uşurinţă când rezistenţa
fructului este scăzută din cauza vârstei sau a unei vătămări.
Pe strugurii spălaţi în mai multe reprize cu apă sterilă s-au găsit în primele ape de spălare de
la 38 000 la 3 200 000 de germeni; în apele de spălare următoare de la 3 000 la 120 000 de germeni;
pe fragii examinaţi în aceleaşi condiţii, în primele ape de spălare de la 188 000 las 1 850 000 de
germeni/cm3, iar pe coacăză la 851 000 de bacterii.
Printre microorganismele identificate sunt de menţionat: Penicillium glaucum, Rizopus nigricans,
bacterii: Stafilococus pyogenes, S. aureus, etc.
80
 Unele fructe sunt invadate cu mucegaiuri (genul Monilia, Rhizopus, Penicilium etc.) care
distrug local pericarpul şi permit pătrunderea în interiorul fructului a germenilor dispuşi pe
suprafaţă. La fel se întâmplă când fructele sunt rănite de insecte sau în cazul unor leziuni mecanice.
Prezenţa şi rezistenţa bacteriilor patogene pe fructe
Cele mai recente cercetări au găsit un număr mare de microorganisme, principalele fiind:
Enterobacteriaceae (Salminella typhi, Salmonella paratyphi B). Prin spălare sunt îndepărtate în cea
mai mare parte.
Numărul de microorganisme patogene este mai mare pe fructele expuse în pieţe unde
circulaţia este mai mare. De exemplu: pe mere, lămâi, portocale s-a găsit întotdeauna E. coli.
Spălarea şi dezinfecţia fructelor
Simpla spălare nu este suficientă uneori; este nevoie de tratamente sterilizatoare. După unele
cercetări spălarea căpşunilor, lăptucilor şi a morcovilor cu o soluţie de 2% clorură de var este
suficientă. Exemplu: după o expunere de 30 minute, E. coli este distrusă, iar NTG foarte mult redus.
Proprietăţile organoleptice nu sunt modificate.
De asemenea prin trecerea strugurilor prin apă la 80oC ei nu suferă stricăciuni şi bacteriile patogene
sunt distruse.
26.2. Microbiologia legumelor proaspete
deoarece legumele cresc în pământ sau în apropierea lui, ele transportă microfloră foarte numeroasă
heterogenă. Numărul mare de microorganisme este important atât faţă de posibilitatea de a infecta
corpul omenesc, cât şi în ce priveşte putrezirea legumelor, mai ales dacă ele sunt destinate păstrării.
Pe legume drojdiile şi mucegaiurile sunt puţin frecvente. Pe varză s-au întâlnit următoarele specii de
bacterii: Bacterium herbicola, Bacillus subtilis, Bacillus micoides, Lactobacilus plantarum, etc.
În timpul păstrării legumelor se dezvoltă: drojdii şi mucegaiuri, unele producând alterarea
legumelor (Fusarium, Alternaria, Botritis etc). Legumele crescând în soluri infectate sau care au
fost spălate cu apă infectată pot transporta bacterii patogene: Clostridium tetanii, E. coli, Bacillus
antracis, streptococi).
Prezenţa lui E. coli ca indicator al gradului de infectare (indicator sanitar) a fost utilizat şi în
cadrul legumelor. Eschericia coli a fost evidenţiată pe 31,5% din legumele expuse spre vânzare în
pieţe. Nu se observă nici o diferenţă la legumele care cresc la diferite distanţe deasupra solului, în
afară de cele care se cultivă pe terenuri irigate.
Datorită faptului că nu se poate stabili cu precizie originea lui E. coli (umană sau din sol) şi
deoarece chiar şi în cazul unor rezultate pozitive, sursa este dificil de identificat, examenul
microbiologic pentru depistarea şi identificarea lui E. coli se face numai atunci când se bănuieşte că
ar putea fi responsabil de transmitere, în cazul unei epidemii şi atunci când se urmăreşte controlul
curăţeniei şi dezinfecţiei legumelor şi fructelor neprelucrate termic. După spălarea unei cantităţi de
81
legume sau fructe într-o cantitate cunoscută de apă sterilă sau ser fiziologic steril, se fac diluţii
decimale, după care se fac însămânţări pentru:
- determinarea numărului total de germeni aerobi mezofili,
- determinarea bacteriilor din grupul coliformelor şi a lui E. coli
- determinarea absenţei Salmonelei pe 25 g produs
- determinarea Stafilococului aureus coagulazo-pozitiv
- determinarea drojdiilor şi a mucegaiurilor.
26.3 Examenul microbiologic al legumelor şi fructelor
Principala determinare microbiologică pentru legume şi fructe (suc şi pastă de tomate, nectare de
fructe, conserve pentru copii, paste din legume sau din fructe, etc) este determinarea conţinutului în
filamente de mucegai.

Principiul metodei: Se examinează la microscop 50-100 de câmpuri pe un preparat din produsul de

analizat.
Materiale: -camera Howard pentru numărarea filamentelor de mucegai este formată dintr-o placă
de sticlă, având o suprafaţă plană circulară (cu diametrul de 19 mm) sau dreptunghiulară (20x15
mm) şi de fiecare parte a acesteia câte un suport mai înalt cu 0,1 mm decât suprafaţa centrală şi o
lamă acoperitoare. În lipsa camerei Howard se pot utiliza şi alte camere asemănătoare (Thoma,
Bürker-Türk etc) cu condiţia de a avea o adâncime de 0,1 mm şi o reţea gradată care să permită
calibrarea microscopului.
- Camera Thoma este o placă de sticlă cu o construcţie asemănătoare cu a camerei Howard, dar cu
deosebirea că suprafaţa centrală este mai mică şi are gravată pe ea una sau două reţele pătrate cu
aria de 1 mm2, împărţite în 400 pătrate mici cu latura de 0.05 mm fiecare.
- microscop monoocular sau binocular, echipat cu obiective şi oculare cu putere de mărire de 90 x.
100x, etc, care să asigure examinarea preparatului în câmpul plan al vederii.
- refractometru
Reactivi: reactivii trebuie să fie de calitate pentru analiză sau de puritate echivalentă.
Apa trebuie să fie distilată (în text folosim doar termenul de apă)
- alcool etilic 95%vol., eter sau acetonă
Pregătirea probei pentru analiză:
Probele pentru analiză netermostatate se deschid şi din acestea se recoltează cantitatea de cca. 100 g
produs, respectând raportul componentelor din recipient. Probele cu consistenţa lichidă sau
semilichidă au un conţinut în substanţe solubile sub 9 grade refractometrice, se folosesc ca atare
după o omogenizare corespunzătoare. Produsele cu o consistenţă păstoasă sau sub formă de pireuri,
cu un conţinut în substanţe solubile de 9 grade refractometrice, sau mai mare, se omogenizează în
82
prealabil şi din omogenizat se ia aproximativ 25 g, se introduc într-un pahar Berzelius şi se diluează
cu apă până la un conţinut în substanţe solubile cuprins între 7,9-9 grade refractometrice.
Mod de lucru: camera de numărat şi lamela acoperitoare se spală succesiv cu soluţie de detergent
şi apă. În final cu alcool, eter sau acetonă şi se lasă să se usuce. Se consideră că sunt curate dacă
aşezând lamela acoperitoare pe suporturile laterale, se observă apariţia inelelor Newton în zona de
contact dintre acestea. Pe suprafaţa plană a lamei se depune cu ajutorul vârfului unui bisturiu, o
picătură din proba pregătită, conform indicaţiilor de mai sus. Cu acelaşi instrument se întinde cât
mai uniform proba de analizat, pe toată suprafaţa centrală a lamei şi se aşează lamela acoperitoare,
astfel încât să se obţină o distribuţie uniformă (în caz contrar filamentele de mucegai se vor
aglomera spre mijlocul suprafeţei centrale). În cazul în care nu se obţine o distribuţie uniformă,
preparatul trebuie îndepărtat şi refăcu ca mai sus. Camera de numărat pregătită se examinează la
microscop. Pentru fiecare probă se examinează în cel puţin două preparate câte 25-50 de câmpuri
microscopice pe fiecare preparat (în cazul camerei Howard) sau cel puţin 25 de câmpuri
microscopice pe fiecare preparat(în cazul camerei Thoma, Bürker-Türker etc.), astfel să se cuprindă
toate zonele preparatului atât cele centrale cât şi cele marginale.
Se observă fiecare câmp microscopic, notând prezenţa sau absenţa filamentelor de mucegai
Hifele de mucegai sunt segmentate(d) având citoplasma granulată(a,d), ramificată (b,c,d,e) formând
unghiuri aproximativ drepte, iar fibrele de celuloză sunt drepte cu aspect sticlos, spiralate în formă
de arc. Se consideră pozitiv un câmp microscopic în care se observă prezenţa unuia sau a mai
multor filamente de mucegai, cu condiţia ca lungimea însumată a cel mult trei din aceste filamente
să fie mai mare decât 1/16 din diametru câmpului microscopic.
Calcul şi exprimarea rezultatelor:
Conţinutul în filamente de mucegai, exprimat în procente câmpuri pozitive, se calculează cu
Numãr de campuri pozitive
formula: Câmpuri pozitive = X 100
Numãr de campuri examinate
Ca rezultat se ia media aritmetică a rezultatelor obţinute pe preparatele examinate

27. MICROBIOLOGIA CONDIMENTELOR

Condimentele sunt plante sau părţi din plante aromate sau picante utilizate pentru aromatizarea
alimentelor sau pentru a le oferi gust picant. Zahărul, sarea nu sunt condimente adevărat; pot
determina ameliorarea aromei, măresc durabilitatea. Se utilizează des piper şi boia.
Importante din punct de vedere microbiologic - datorită aportului de germeni proprii care
influenţează calitatea substanţelor, a produselor finite.
Clasificare:
1.Picante - piper→negru (boabe imature)
83
 →alb (boabe mature)
Proprietăţile piperului sunt date de un oleu volatil.
2.Aromate - scorţişor, nucşoară, usturoi.
Proprietăţile lor sunt date de engemol.
Exctracte aromatizante: vanilia-vanilină C8H8O3; lămâia-oleu citrat C10H16O6.
Proprietăţi:
-sunt necesare pentru sporirea calităţii gustative;
-activitate antibacteriană, nu se extinde asupra mai multor grupe de microorganisme;
-evidentă la leverii, mucegai, mai puţin la bacterii;
-proporţia la aport este de 0,2-5%; cel mai mult în cazul usturoiului 16-19%.
Condimentele se utilizează întregi sau măcinate, cele din urmă având un număr mai mare de
germeni. La prepararea industrială a alimentelor se vor utiliza oleurile care sunt esenţe
obţinute prin distilare la cald, urmând distribuţia şi manipularea în alimente.
Microorganismele găsite în alimente: rezistă la uscare care este o formă de păstrare a
condimentelor.
-spori ale bacteriilor Gram pozitive;
-spori de fungi.
NTG de pe condimentele măcinate este acelaşi cu cel de pe condimentele întregi dacă se
respectă normele de igienă.
- numărul mare de microorganisme ca şi: Bacilus, Megatherium bovis, bacteriile termofile 1 şi a 10-
a parte a bacteriilor, anaerobe-Clostridium, mucegaiuri
Nivel de încărcătură bacteriană 102-107 funcţie de condiment.
-mare la cimbru, scorţişoară (mucegaiuri din genul Aspergillus niger şi glaucus, Penicillium).
Microorganismele de alterare pot determina alterarea produsului în care se adaugă. Speciile
de mucegai se pot multiplica degradând sau secretând micotoxine toxice pentru om (aflatoxine,
ohratoxine).
Microorganismele patogene sunt agenţii toxiinfecţiilor alimentare, exemplu clostridiile şi
bacterii din genul Bacillus. Există ca şi spori şi pot produce toxiinfecţii când ajung la un nivel de
105-1010/gram produs. Numărul microorganismelor este relativ mic. Germenii nesporogeni, Gram
pozitivi ar fi următorii: Salmonella, Stafilococcus, mucegaiuri (unele secretă micotoxine, mai des în
nucşoară).
Metode utilizate pentru reducerea nivelului de contaminare a condimentelor
Recoltare şi uscare în condiţii optime, în spaţii corespunzătoare nepoluante.
Tratarea condimente cu bromură de metil, etilen oxid, propilen oxid pentru insecte şi
microorganisme.
84
 Expunere la vapori de etanol sau acidifiere cu HCl urmat de neutralizare pentru
decontaminarea boielei de ardei.
Iradiere cu raze γ sau UV.
Controlul substanţelor conform ordinului MS. 975/98 care pevede:
- Salmonella absentă pe 25g;
- Stafilococcus aureus < 10/g;
- E.coli < 100/g;
- Clostridii sulfitoreducătoare < 100/1g;
- Mucegai maxim 1000/1g.
Din punct de vedere organoleptic şi fizico-chimic:
-să nu fie paraziţi; să nu fie corpuri străine; fără amion şi coloranţi organici de sinteză.

85
 BIBLIOGRAFIE

1. Adam M.R., M.O. Moss (1995) “Food microbiology”, Cambridge;

2. S. Apostu (2006) Microbiologia produselor alimentare , Vol 1,2,3 Ed. Risoprint Cluj-Napoca;

3. Apostu Sorin (1999) – Cercetări privind incidenţa şi particularităţile morfobiologice ale

speciei Escherichia coli potenţial patogenă pentru om în unele alimente de origine animală în
zona centrală a Transilvaniei. Teză doctorat USAMV Bucureşti;

4. Apostu, S. Mihaela- Anca Rotar (2000) - Microbiologia produselor agro-alimentare, Ed.

Risoprint, ,Cluj- Napoca;

5. Apostu, S. Mihaela- Anca Rotar (2001) - Microbiologia produselor din industria

alimentara”, Ed. Risoprint, 2001, Cluj- Napoca;

6. Apostu S. , Mihaela-Anca Rotar (2003) – Lucrări practice de Microbiologie alimentară Ed.

Risoprint Cluj-Napoca;

7. Apostu S., Stănescu V., Chirilă F., Mihaela Anca Rotar (2000) – Evidenţierea toxinelor de
Escherichia coli prin tehnici “in vitro”. Al VIII–lea Congres de Medicină Veterinară, Băile
Felix, 17-20 octombrie 2000, p. 431;

8. Banu, C. şi col. (1999) - Manualul inginerului de industrie alimentară. Vol II Ed.

Tehnică, Bucureşti;

9. Banu, C. şi col. (2000) - Biotehnologii în industria alimentară. Ed. Tehnică Bucureşti;

10. Banu, C. ; Camelia Vizireanu (1998), Procesarea industrială a laptelui. Ed. Tehnică
Bucureşti;

11. Bărzoi D, S. Apostu (2002) Microbiologia produselor alimentare Ed. Risoprint Cluj-Napoca;

12. Bărzoi D., Lăzărescu Sanda,Maier Natalia, Tuluş lidia, Korn R., Nucă Olga, Dumitrescu
Florina, (1997) – Metode microbiologice pentru examenul de laborator al produselor
alimentare de origine animală M.A.A. Uz intern;

13. Bărzoi D., Meica S., Neguţ M. (1999) – Toxiinfecţii alimentare. Ed. Diacon Coresi;

14. Buiuc D., Neguţ M., (1999) – Tratat de microbiologie clinică. Ed. Medicală Bucureşti;

15. Camelia Guş (2005) - Laptele şi produsele lactate. Ediţia II – a revizuită, Ed. Risoprint, Cluj –
Napoca, ISBN : 973-656-788-5;

16. Camelia Guş, Cristina Semeniuc (2005) - Stabilirea calităţii laptelui şi a produselor lactate,
Ed.
17. Costin M.Gh.; Rodica Segal şi col. (1999) - Alimente funcţionale. Ed. Academiei,
Bucureşti;

18. Dan Valentina (1999) – Microbiologia produselor alimentare, vol I ; Ed. Alma Galaţi;
86
19. Dan Valentina (2000) – Microbiologia produselor alimentare, vol II ; Ed. Alma Galaţi;

20. Daniel J. O’Sullivan (2001)- Screening of intestinal microflora for effective probiotic bacteria
–
21. Emil Boldizsar, Sorin Răpuntean, Nicodim Fiţ (2002) – Microbiologie generală, Practicum.
Ed Genesis Tipo, Cluj-Napoca;
22. G. M. Costin şi colab. (2005)- Produse lactate fermentate. Editura Academică, Galaţi
23. Gheorghe Răpuntean, Emil Boldizsar (2001) Practicum de bacteriologie specială, Editura
Academicpres, Cluj-Napoca;

24. Pintea Adela (2005) - Biochimie structurală – Biomolecule plastice, Editura AcademicPres,
Cluj- Napoca

25. Rajiv I.Dave and Nagendra P. Shah (1997) – Viability of yoghurt and probiotic bacteria in
yoghurt made from commercial starter cultures, ScienceDirect- International Dairy Journal

26. Rotar Mihaela Ancuţa., (2006) Cercetări privind influenţa microorganismelor de fermentaţie
lactică şi de poluare asupra calităţii produselor lactate acide- Teză doctorat Cluj-Napoca

27. Rotaru , O ; Camelia Guş; M. Mihaiu (1997): - Controlul sanitar veterinar al salubrităţii
produselor de origine animală. Lucrări practice Tipo Agronomia, Cluj – Napoca;

28. Stănescu V., (1998) - Igiena şi controlul alimentelor, Ed. Fundaţiei”România de mâine”,
Bucureşti;

SR ISO 4831 (1992) – Tehnica determinării bacteriilor coliforme din alimente

SR ISO 6349 (1996) – Tehnica determinării numărului de germeni din genul

Clostridium

SR ISO 7251 (1996) – Tehnica determinării Escherichia coli din alimente

SR ISO 7954 (2001): Directive generale pentru numărarea drojdiilor şi mucegaiurilor

87