UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRICOLE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ ”ION

IONESCU DE LA BRAD” , IAȘI

PRINCIPII MODERNE APLICATE ÎN

CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL
ALIMENTELOR

Conf. univ. dr. Florin-Daniel LIPŞA LUPU Daniela

NEACȘU Gabriel-Valentin

SPECIALIZAREA : SAPCCPA
CUPRINS:
Introducere

Cap. I METODE DE EVALUARE A POPULAȚIILOR MICROBIENE

Cap. II TEHNICI MODERNE DE ESTIMARE A NUMĂRULUI DE MICROORGANISME
I. Metode directe
II. Metode indirect
Bibliografie
 Introducere

Influenţa alimentelor asupra sănătăţii omului este un aspect de actualitate.

Deoarece stilul de viaţă al timpurilor noastre este foarte diferit de cel din trecut, în ciuda
existenţei noilor descoperiri, poate apărea riscul contaminării alimentelor prin
contaminanţi naturali sau care sunt introdusi accidental sau prin tratarea inadecvată a
alimentelor.
Datorită tendinţei actuale de consum a unor alimente proaspete, cu proprietăţi
nutriţionale si senzoriale constante, apropiate de acelea ale produselor naturale, există
o preocuparea la nivel industrial de obţinere a unor produse cu procesare minimă, cu
aplicarea unor tratamente termice reduse sau chiar eliminarea acestora. În schimb,
aceste produse pot fi instabile din punct de vedere microbiologic.
Studiile efectuate au încercat să atragă atenţia asupra calităţii microbiologice a
unor categorii de alimente considerate reprezentative din punct de vedere al
consumatorilor. Prin rezultatele obţinute, s-a demostrat importanţa examenului
microbiologic pentru asigurarea consumului de către populaţie a unor produse
alimentare sigure şi pentru evitarea riscurilor posibile.
 Cap. I METODE DE EVALUARE A POPULAȚIILOR MICROBIENE

În vederea evaluării populațiior microbiene se uitlizează metode directe,

indirecte, culturale și automatizate.
Metodele directe permit evaluarea concentraţiei de celule sau a biomasei. În
cadrul metodelor indirecte, evaluarea se va face prin analiza unui parametru aflat în
corelaţie cu conţinutul de biomasă (turbiditatea mediului cultivat, fluorescenţa,
impedanţa). Metodele culturale necesită o perioadă de incubare pentru creşterea
coloniilor şi stabilirea rezultatului analizei. Metodele automatizate, "on line", permit
analiza directă a probelor din fermentator, sau metodele care necesită prelevarea
aseptică de probe pentru analiză.

1. Tehnici de diluare
În cadrul acestei tehnici se utilizează serii liniare și serii logaritmice. Pentru seriile
liniare concentrația de microorganisme descreşte în progresie aritmetică (de exemplu:
0.8/0.6/0.4/0.2) şi care sunt puţin utilizate. În cazul seriilor logaritmice (diluţii decimale)
concentrația de microorganisme descrește în progresie geometrică (ex.
0,1/0,01/0,001/0,0001 etc.).
Pentru realizarea diluţiilor decimale, într-un număr de eprubete sterile egal cu
numărul de diluţii necesar a se efectua, se pipetează aseptic 9 cm3 de lichid de diluţie
(ser fiziologic steril, apă distilată sterilă, mediu Ringer - pentru Escherichia coli).

2. Tehnici de concentrare
Aceste tehnici sunt utilizate în special pentru punerea în evidență a
microorganismelor patogene.
Metodele de îmbogăţire presupun inocularea probei de analiză într-un mediu
favorabil pentru multiplicarea rapidă a celulelor aflate în concentraţii reduse în proba de
analizat şi, după termostatare în condiţii optime de cultivare, se verifică prezenţa sau
absenţa microorganismelor analizate, cu sau fără o determinare efectivă a concentraţiei
de celule.
 Prin metodele de separare fizică sau fizico-chimică a celulelor prin filtrare,
centrifugare, floculare, sedimentare, se determină concentrarea celulelor pe unitatea de
volum, ceea ce asigură posibilitatea evidenţierii lor ulterioare prin tehnici directe sau
culturale. Mai există și metode de separare prin interacțiuni hidrofobe-hidrofile,
interacțiuni ale sarcinilor electrice, anticorp-antigen, cu lentile.
 Cap. II TEHNICI MODERNE DE ESTIMARE A NUMĂRULUI DE
MICROORGANISME

I. Metode directe
1. Estimarea electronică a numărului de microorganism
Estimarea electronic a numărului de microorganisme se determină cu aparatul
de tip Coulter, care funcționează după următorul principiu: De o parte şi de alta a unui
tub prevăzut cu un orificiu calibrat sunt dispuşi doi electrozi de platină imersaţi într-un
electrolit, ale căror borne sunt conectate la tensiune continuă. Prin aspiraţia provocată
la partea superioară a tubului, celulele aflate în exteriorul tubului trec pe rând prin
orificiu şi deplasează o dată cu fiecare pasaj un volum de electrolit egal cu cel al celulei.
Aceasta provoacă o creştere tranzitorie a rezistenţei circuitului, ceea ce generează un
impuls electric a cărui amplitudine este proporţională cu volumul celulei.
Impulsurile fiind de foarte scurtă durată, aparatul permite numărarea unui număr
mare de celule, una câte una, într-un timp foarte scurt.

Fig.1: Aparat de tip Coulter

 Fig.2: Aparat Coulter

Această tehnică, deşi sofisticată, este considerată extrem de interesantă şi se

aplică cu succes pentru analiza suspensiilor de drojdii, realizând simultan cu numărarea
şi dimensionarea celulelor.
Rezultatele sunt reproductibile când se utilizează suspensii diluate de celule.
Sarcina electrică a celulelor poate influenţa analiza conducând la obţinerea de
rezultate eronate.
Această tehnică nu se poate aplica în cazul culturilor ce conţin în suspensie,
alături de celulele microorganismului cultivat, şi particule solide.

2. Citometrie în flux
Această metodă permite numărarea şi aprecierea stării fiziologice a celulelor,
când detecţia se face prin măsurarea fluorescentei emise de celulele în prealabil
marcate cu un colorant (fluorocrom).
După colorare, celulele sunt antrenate printr-un orificiu îngust şi trec una câte
una prin faţa unei surse luminoase.
Fluorescenta emisă de fiecare microorganism este captată printr-un
fotomultiplicator şi analizată. Rezultatele sunt traduse pe o histogramă care redă
numărul de evenimente în funcţie de intensitatea fluorescentei. Această histogramă
traduce deci un profil al populaţiei.
De cele mai multe ori markerii coloranţi utilizaţi pot oferi diferite tipuri de
răspunsuri:
 dacă colorantul este un marker de viabilitate, din histogramă se deduce numărul
de celule viabile şi starea fiziologică a populaţiei,
 dacă histograma cuprinde net două picuri este posibilă numărarea separată a
microorganismelor dintr-o cultură mixtă (de exemplu, streptococi şi lactobacili),
 dacă markerul este un anticorp se pot număra specific anumite microorganisme
dintr-o populaţie heterogenă.

Fig.3: Principiul de funcţionare al citometrului în flux

a,b- exemple de sisteme de detecţie

c- diagramă de repartiţie a dimensiunilor

 Fig.4: Citometru în flux

3. Tehnica de microscopie în fluorescenţă şi imunofluorescenţă

!!Tehnica de microscopie în fluorescenţă utilizează coloranţi specifici pentru

diferenţierea celulelor vii de cele moarte.(poza)
Prin suspensionarea celulelor de drojdie în soluţie diluată de albastru de metilen
cu citrat în preparat microscopic se vor putea diferenţia celulele vii (incolore) de cele
moarte (colorate în albastru).
În mod similar, pot fi diferenţiate bacteriile vii de cele moarte după colorare cu
acridin oranj.
!! Tehnica de microscopie în imunofluorescenţă permite detectarea unei categorii
particulare de microorganisme cu ajutorul anticorpilor specifici. (poza)

4. Tehnica DEFT – Direct Epifluorescent Filter Technique

Această metodă cuplează filtrarea prin membrane cu colorarea vitală a celulelor.
Se aplică în cazul analizei microbiologice a produselor lichide (bere, vin, lapte).
Numărarea se realizează prin studiu microscopic, după filtrarea produsului prin
membrană (sau diluarea sa) şi colorarea vitală a celulelor.
 Fig.5.: Tehnica DEFT

Procedeul este rapid (10-20 min) şi sensibil. Limita de detecţie este de 104
microorganisme/cm3, utilizând volume de probe de 100 cm3. Numărarea se poate
realiza cu un microscop optic obişnuit după colorare cu albastru de metilen, albastru
Loeffler sau amestec fucsină-albastru de metilen.
Rezultate mai bune se obţin când numărarea se realizează cu un microscop cu
fluorescentă sub lumină UV. În acest caz se utilizează coloranţi fluorescenţi
(fluoresceina, primulina, auramina, acridin oranj, galben de acridină, acriflavina) ce
permit studiul la grosismente mici cu evidenţierea celulelor vii şi a celor moarte.
Fig. 6: Evidenţierea celulelor vii şi a celor moarte utilizând un microscop cu fluorescentă
sub lumină UV

II. Metode indirecte

A. Metode de cultivare pe medii dense (metoda culturală Koch);
B. Metode de cultivare în medii lichide (metoda titrului - metoda tuburilor
multiple; metoda diluţiilor limită).
Dezavantaje:
 volum mare de muncă,
 sunt necesare ustensile sterile şi medii de cultură adecvate,
 rezultatul analizei se obţine după un timp de termostatare necesar dezvoltării şi
multiplicării celulelor, diferenţiat în funcţie de natura microorganismelor (în
general: 3-5 zile/25...28°C -pentru fungi; 2 zile/37°C - pentru bacterii aerobe
mezofile).

A. Numărarea microorganismelor prin cultivare pe medii dense

Constă în inocularea unui volum cunoscut din suspensia de celule pe medii de
cultură solidificate, în plăci Petri şi, după o perioadă de cultivare în condiţii optime, se
numără coloniile formate.
Rezultatul se exprimă în:
  număr de microorganisme [N/cm3 sau g] - în cazul microorganismelor care
prezintă celule individuale, neasociate;
 unităţi formatoare de colonii (ufc) [ufc/cm3 sau g] — în cazul microorganismelor
la care celulele formează asociaţii (lanţuri, pachete, pseudomiceliu).

Fi
g.7: Tehnici de cultivare şi numărare a microorganismelor

a-prin filtrare;

b - prin diluare (sau inoculare în volume mari)

A. 1. Tehnica clasică de numărare prin cultivare pe medii dense, în plăci Petri

Metodologia de analiză presupune adoptarea a două modalităţi de inoculare a

celulelor în/pe mediul de cultură solidificat, în plăci Petri, şi anume:
 a. inoculare în masa mediului solidificat, când 1 cm3 din fiecare diluţie se
transferă cu câte o pipetă sterilă în plăci Petri sterile. Peste suspensia din fiecare placă
se repartizează câte o eprubetă de mediu de cultură specific, cu agar (10-15 cm3),
fluidificat şi temperat la 40...45°C. Mediul se omogenizează cu suspensia din placă prin
mişcări orizontale, circulare ale plăcii.
După solidificarea mediului, prin termostatare în condiţii optime, se vor forma
colonii atât la suprafaţa mediului cât şi în profunzimea acestuia. Acest mod de cultivare
este cel mai favorabil pentru microorganismele facultativ anaerobe, dar şi
microorganismele aerobe le tolerează destul de bine. În cazul microorganismelor
anaerobe se recomandă cultivarea în dublu strat, adică după înglobarea celulelor în
mediu şi solidificare, primul strat de mediu se acoperă cu încă un strat de mediu steril;
b. inoculare prin răspândirea celulelor pe suprafaţa mediului solidificat - 0,1
cm3 probă diluată se transferă într-o placă Petri sterilă, în care, în prealabil, a fost
repartizat mediul de cultură cu agar. Suspensia se răspândeşte uniform pe întreaga
suprafaţă a mediului de cultură cu ajutorul unui instrument special (de exemplu, spatulă
Drigalski). Această tehnică prezintă dezavantajul că unele celule pot să rămână ataşate
de instrumentul de etalare, cu efecte negative asupra acurateţei rezultatului analizei.
Pentru obţinerea unor rezultate mai concludente se recomandă inocularea a câte două
plăci în paralel pentru fiecare diluţie analizată.
 Fig.8: Numărarea indirectă a microorganismelor prin cultivare pe medii dense

Citirea şi interpretarea rezultatelor

După termostatarea în condiţii optime, apariţia vizibilă a coloniilor va depinde de
particularităţile fiziologice ale microorganismelor cultivate şi de condiţiile de cultivare, de
obicei după 48-72 h de cultivare.
În funcţie de numărul de colonii evidenţiate în plăcile din care s-a făcut
numărarea se va calcula numărul de microorganisme pe gram sau cm3 probă de
analiză, cu formula: ufc/cm3 (g) = n • d, în care d este coeficientul de diluţie
corespunzător plăcii din care s-a realizat numărarea.
În cazul în care pentru aceeaşi diluţie s-au inoculat câte două plăci în paralel, n
reprezintă media aritmetică a coloniilor numărate în cele două plăci.
 În cazul numărării coloniilor punctiforme se pot folosi sisteme dotate cu sursă de
lumină, lupă pentru mărirea imaginii şi un dispozitiv de marcare şi înregistrare a
coloniilor numărate.

A.2. Utilizarea Petrifilmelor pentru analiza microbiologică cantitativă şi calitativă

"Petrifilms" - discuri în care mediul de cultură specific este deshidratat şi acoperit

cu o folie din plastic. La inocularea a 1 cm3 suspensie de celule, apa conţinută în
suspensie rehidratează mediul şi prin termostatare este posibilă creşterea
microorganismelor.
Există diferite tipuri de Petrifilm pentru: număr total de microorganisme, drojdii,
bacterii coliforme.
Avantaje: reducerea timpului de analiză, reducerea preţului de cost/probă,
creşterea numărului de probe analizate, creşterea calităţii şi îmbunătăţirea substanţială
a productivităţii.
Tipuri de Petrifilme

Fig.9: Petrifilm pentru numărat bacterii aerobe şi facultativ anaerobe

 Fig.10: Petrifilm pentru numărat drojdii şi mucegaiuri

Conţine un mediu selectiv cu 2 antibiotice cu spectru larg, pentru suprimarea

creşterii bacteriilor şi BCIP (brom cloro indoxil fosfat), ca indicator.

Fig.11: Petrifilm pentru numărat bacterii coliforme

Conţine un mediu selectiv cu bilă, lactoză şi 2 indicatori: VR (roşu violet) şi TTC.

 Fig.12: Petrifilm pentru numărat E. coli, coliformi şi necoliformi

Conţine un mediu selectiv cu bilă, lactoză şi BCIG (brom cloro indoxil β

glucuronidă) ca indicator.

A.3. Evaluarea numărului de microorganisme după filtrare prin membrană

Această metodă se pretează la analiza probelor lichide cu un conţinut redus de

microoganisme, care nu conţin compuşi ce produc colmatarea filtrului.
Pentru analiză, o cantitate controlată de lichid de analizat (1 - 10 cm3) se
transferă aseptic în rezervorul aparatului de filtrare, apoi lichidul se trece prin filtru (cu
pori mici, capabili să reţină toate microorganismele), după care membrana se ridică
aseptic cu o pensetă sterilă şi se transferă într-o placă Petri sterilă în care în prealabil s-
a repartizat mediul de cultură adecvat, cu agar. In alte cazuri, mediul de cultură specific
este impregnat în membrană şi astfel, după filtrare, membrana se plasează într-o placă
Petri sterilă.
Prin termostatare în condiţii optime la suprafaţa membranei se formează colonii
caracteristice, care se pot număra şi analiza din punct de vedere morfologic.
A.4. Evaluarea numărului de microorganisme prin utilizarea mediilor de imersie

Tehnici moderne prevăd cultivarea microorganismelor pe lame de mediu cu

geloză sau benzi de hârtie impregnate cu medii adecvate.
Lamele cu medii de cultură gelozate se menţin în tuburi speciale, sterile. In
momentul utilizării se extrage aseptic lama din tub, se imersează în proba de analizat,
după care se reintroduce în tubul steril şi se termostatează la temperatura optimă de
creştere, specifică microorganismelor analizate. După termostatare, 16-24 h pentru
bacterii şi 3-4 zile pentru drojdii şi mucegaiuri, se pot număra coloniile caracteristice
care s-au dezvoltat la suprafaţa lamei.
Lame specializate pentru control microbiologic selectiv
 Lame Hychech (Difco) (medii gelozate: PCA + PCA 0,01 TTC*) - destinate pentru
determinarea numărului total de microorganisme;
 Lame pentru evidenţierea bacteriilor din familia Enterobacteriaceae (geloză
tripticază soia + VRBC geloză);
 Lame pentru evidenţierea selectivă a bacteriilor din genul Pseudomonas (mediu
specific cu geloză);
 Lame pentru determinarea fungilor filamentoşi (geloză tripticază soia; tripticază
soia cu TTC + geloză cu roz bengal şi cloramfenicol ş.a.);
 Lame Biokar - pentru număr total de coliformi; număr total de drojdii şi
mucegaiuri;
 Lame Lactocult - pentru controlul microbiologic al laptelui;
 Lame Microtest

Benzile de hârtie impregnate cu medii selective sunt alte sisteme comerciale

pentru controlul microbiologic rapid şi eficient al alimentelor. Constau din benzi sterile
de hârtie impregnate cu mediu specific, pentru care se precizează: timpul necesar de
menţinere în contact cu proba de analizat; volumul de lichid pe care îl adsorb (0,1-1
cm3). Pentru analiză, banda sterilă se imersează în lichidul de analizat, apoi se
reintroduce in ambalajul steril şi se termostatează in condiţii optime.
B. Evaluarea numărului de microorganisme prin cultivare în medii lichide

Prin inocularea celulelor în medii lichide şi termostatare în condiţii optime de

multiplicare se determina statistic numărul de microorganisme în funcţie de observaţiile
privind prezenţa sau absenţa creşterii (determinare de uft - unităţi formatoare de
turbiditate).
Avantajele utilizării mediilor lichide:
 este posibilă analiza unor cantităţi mari de produse, fapt extrem de important
pentru cercetarea, în special, a microorganismelor patogene;
 este posibil studiul unor proprietăţi fiziologice (producere de acid, formare de
gaze ş.a);
 permite cultivarea în condiţii selective, specifice pentru un grup de
microorganisme ce trebuie determinat.

Metoda de cultivare în medii lichide se bazează pe două tehnici de analiză:

metoda diluţiilor limită și metoda titrului (metoda tuburilor multiple).
Metoda diluţiilor limită - prin inoculare din proba de analizat şi diluţii decimale
succesive în câte o eprubetă cu mediu de cultură adecvat şi, după termostatare
corespunzătoare, prin analiza probelor se stabileşte numărul de microorganisme, în
funcţie de ultima diluţie în care a fost observată creşterea. Aceasta este o metodă
semicantitativă şi permite evaluarea orientativă a gradului de contaminare al produsului
de analizat.
Metoda titrului (metoda tuburilor multiple) presupune inocularea
microorganismelor prezente în proba de analiză şi diluţii decimale succesive, în mai
multe eprubete în paralel (2-5) cu mediu de cultură adecvat (9 sau 10 cm), După
termostatare în condiţii optime se fac aprecieri asupra creşterii şi se stabileşte numărul
de microorganisme prin analiza statistică a rezultatelor, folosind tabelul Mac Grady.
 Bibliografie

https://www.scribd.com/doc/296776142/214716732-Curs-Metode-Moderne-de-Control-
Microbiologic-Al-Alimentelor-1
https://slideplayer.com/slide/5212839/
https://www.scribd.com/doc/45318002/Citometrie-in-Flux