UNIVERSITATEA MEDICIN

DE TIINE VETERINAR DE

AGRONOMICE BUCURETI

FACULTATEA

AGRICULTUR

CERCETRI PRIVIND MICOTOXINELE GRU I PORUMB

DIN

TEZA DE DOCTORAT

CONDUCTOR T I I N I F I C , Prof. univ. dr. Petru NICULI DOCTORAND,

I n

9 . Mihaela Nicoleta AVRAM

BUCURETI 2007

CUPRINS
pagina

LIST DE ABREVIERI INTRODUCERE PARTEA I STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII N DOMENIUL MICOTOXINELOR DIN CEREALE l PRODUSE ALIMENTARE Capitol STUDIU DOCUMENTAR PRIVIND PROBLEMATICA 1 MICOTOXINELOR DIN CEREALE l ALIMENTE 1.1. Consideraii generale privind micotoxinele 1.2. Fungi productori de micotoxine 1.3. Clasificarea micotoxinelor 1.3.1. Micotoxine principale 1.3.2. Micotoxine secundare 1.4. Caracterizarea micotoxinelor 1.4.1. Aflatoxine 1.4.2. Ochratoxine 1.4.3. Trichotecene 1.4.4. Zearalenona 1.4.5. Fumonizine 1.5. Incidena micotoxinelor n cereale i produse alimentare 1.6. Influena condiiilor de depozitare a cerealelor asupra contaminrii cu fungi i producerii de micotoxine 1.7. Aspecte legislative privind micotoxinele din alimente 1.8 Concluzii Capitol POSIBILITI TEHNICE l METODE ANALITICE DE REDUCERE A 2 CONTAMINRII CU MICOTOXINE A CEREALELOR l PRODUSELOR CEREALIERE 2.1. Metode fizice
1

1 3 6

15
1 5

6
1 7

18 22 24 26 28 29 32

34 39 41

4 2

2.2. Metode chimice 2.3. Metode microbiologice 2.4. Concluzii Capitol TEHNICI 3 ANALITICE DE DETECIE l DETERMINARE ALE

4 5

4 6

? 9

MICOTOXINELOR 3.1. Metoda cromatografiei n strat subire (TLC) 3.2. Metoda cromatografiei lichide (LC) 3.3. Metoda gaz cromatografiei (GC) 3.4. Metode imunologice 3.5. Concluzii 50 51 56 57 58 60

PARTEA a II a CERCETRI EXPERIMENTALE PRIVIND MICOTOXINELE DIN GRU l PORUMB Capitol MATERIALE, TEHNICI DE EXPERIMENTARE, CONDIII l LOCURI 4 DE CERCETARE 4.1. Determinarea contaminrii microbiene a grului i porumbului 4.1.1. Materiale i echipamente folosite n experimentri 4.1.2. Metoda de determinare a contaminrii microbiene 4.2. Determinarea contaminrii cu micotoxine a grului i porumbului prin metoda ELISA 4.2.1. Materiale i echipamente folosite n experimentri 4.2.2. Metoda ELISA de determinare a micotoxinelor din gru i porumb 4.3. Materiale i metoda HPLC dezvoltat pentru determinarea micotoxinei DON din cereale 4.3.1. Materiale i echipamente folosite n experimentri 4.3.2. Metoda HPLC pentru determinarea micotoxinei DON din cereale 4.4. Material biologic folosit n experimentri

61

61 61 62 64

65
7 0

75

75 77

77

Capitol CERCETRI PRIVIND CONTAMINAREA GRULUI CU FUNGI l 5 MICOTOXINE N FUNCIE DE CONDIIILE CLIMATICE 5.1. Analiza condiiilor de mediu pe zone de cultur n funcie de proveniena probelor de gru utilizate n experimentri 5.2. Stabilirea experimental a contaminrii cu fungi a probelor de gru din recolta anilor 2002, 2003, 2004, 2005 din Romnia 5.3. Experimentri preliminare privind contaminarea cu aflatoxine totale i OTA din recolta de gru a anului 2002 5.4. Stabilirea experimental a contaminrii cu DON a probelor de gru din recolta anilor 2002, 2003, 2004, 2005, 2006 5.5. Stabilirea experimental a contaminrii cu fungi i micotoxine (aflatoxine totale i DON) a altor probe de gru i produse din gru 5.6. Concluzii Capitol CERCETRI PRIVIND CONTAMINAREA PORUMBULUI CU 6 BACTERII, FUNGI l MICOTOXINE N FUNCIE DE CONDIIILE CLIMATICE 6.1. Analiza datelor climatice din zona de cultur a porumbului utilizat n experimentri 6.2. Stabilirea experimental a contaminrii cu bacterii i fungi la recoltare i n timpul depozitrii porumbului 6.3. Experimentri privind contaminarea cu DON i ZON la recoltare i n timpul depozitrii porumbului 6.4. Stabilirea experimental a contaminrii cu fungi i micotoxine (fumonizine i DON) a altor probe de porumb i produse din porumb 6.5. Concluzii Capitol CERCETRI PRIVIND EFECTELE TRATAMENTULUI TERMIC 7 ASUPRA MICOTOXINELOR DON l ZON DIN PROBE DE CEREALE CONTAMINATE NATURAL

8 5

8 5

9 6

1 0 2

1 0 5

1 1 3

119 122

1 2

1 2 4

1 2

1 3 3

136 138

7.1. Experimentri privind influena temperaturii i a timpului de coacere asupra reducerii nivelului micotoxinei DON din probe de gru contaminate natural 7.2. Experimentri privind influena temperaturii i a timpului de coacere asupra reducerii nivelului micotoxinei ZON din probe de porumb contaminate natural 7.3. Concluzii Capitol CERCETRI PRIVIND DEZVOLTAREA l OPTIMIZAREA METODEI 8 HPLC PENTRU DETERMINAREA MICOTOXINEI DON DIN CEREALE 8.1. Experimentri preliminare 8.2. Cercetri experimentale privind realizarea curbei de calibrare 8.3. Cercetri privind testarea i verificarea metodei HPLC utiliznd material de referin certificat DON 8.4. Cercetri privind testarea probelor mbogite cu standard DON 8.5. Cercetri experimentale privind analiza i stabilirea corelaiei dintre metodele HPLC i ELISA 8.6. Concluzii PARTEA a III a CONCLUZII FINALE l CONTRIBUII ALE AUTORULUI LA DEZVOLTAREA DOMENIULUI Capitol CONCLUZII FINALE 9 9.1. Concluzii cu privire la contaminarea grului cu fungi i micotoxine n funcie de condiiile climatice 9.2. Concluzii cu privire la contaminarea porumbului cu bacterii, fungi i micotoxine la recoltare i n timpul depozitrii, n funcie de condiiile climatice 9.3. Concluzii cu privire la efectul tratamentului termic asupra micotoxinelor DON i ZON 9.4. Concluzii cu privire la dezvoltarea i optimizarea metodei HPLC pentru determinarea micotoxinei DON

138

143

149

149 153 155 174 177

179 183

184 184

185

186

186

Capitol CONTRIBUIILE AUTORULUI LA DEZVOLTAREA DOMENIULUI 10 10. Contribuiile autorului la dezvoltarea domeniului

88

1 8 8

BIBLIOGRAFIE ANEXA 1 CROMATOGRAME CONTENT REFERENCES

191 1 209 214

INTRODUCERE
Micotoxinele fac parte din categoria contaminanilor alimentari, care sunt definii, conform Ordonanei de urgen nr. 97 / 21 iunie 2001, capitol 1, articol 3, litera h orice substan adugat neintenionat n alimente, prezena n acestea ca rezultat al produciei (inclusiv activitile privind creterea plantelor i animalelor i medicin veterinar), al fabricaiei, prelucrrii, preparrii, tratamentelor, mpachetrii, ambalrii, transportului sau manipulrii acestora sau ca rezultat al contaminrii mediului

nconjurtor. Materiile strine, cum ar fi fragmentele de insecte, prul de animale, nu sunt incluse n aceast definiie. Micotoxinele reprezint un semnal de alarm prin simpla lor prezen n alimente, chiar i n concentraii mici pun n pericol sntatea animal i, implicit, pe cea uman, printr-o afectare a rspunsului imun. nc de la descoperirea acestor toxine, cercetrile au fost focalizate asupra modalitilor de detecie i determinare, gradului de toxicitate indus la om i animale, stabilirea condiiilor favorabile de dezvoltare a fungilor care produc micotoxine, stabilirea unor limite maxime admise de micotoxine n alimente i furaje. La nivel european se apreciaz c nivelul de contaminare cu micotoxine este de 20 %, chiar i n rile dezvoltate, dar acest procent este cu siguran mai ridicat n condiiile practicrii unei agriculturi mai puin competitive. n rile dezvoltate ale Europei este estimat o pierdere de recolt de 5 -10 % din cauza atacului de fungi. ncercrile de reducere a concentraiei de micotoxine au fost extrem de diverse, dar nu s-au dovedit foarte eficiente, datorit, pe de-o parte, diversitii structurale i a modului de aciune al micotoxinelor i, pe de alt parte, a preului de cost ridicat al tratamentelor. Ca urmare, prevenirea apariiei micotoxinelor rmne, pn n prezent, singura i cea mai eficient cale de evitare a aciunilor lor negative. Efectele diverse i extrem de grave pe care le au micotoxinele pe tot parcursul lanului alimentar, potenialul pericol pe care l reprezint pentru om, au fcut ca acest domeniu s reprezinte o prioritate la nivel mondial.

Pe fondul acestui interes mondial privind micotoxinele, Romnia, in postura de membru al Uniunii Europene trebuie s se alinieze la cerinele impuse cu privire la asigurarea calitii produselor comercializate prin control sistematizat i monitorizat, pornind de la controlul calitii materiilor prime pn la obinerea produsului finit. Teza de doctorat prezint cercetrile efectuate n vederea stabilirii contaminrii cu fungi potenial toxigeni i micotoxine a grului i porumbului, avnd n vedere condiiile climatice i de depozitare. De asemenea, s-a urmrit stabilirea gradului de reducere a contaminrii cu micotoxine prin procesarea unor probe contaminate natural, sub influena temperaturii de coacere i a timpului de expunere. n experimentrile efectuate, coninutul de micotoxine a fost determinat prin metoda imunoenzimatic (ELISA), utilizndu-se kiturile de analiz specifice fiecrei micotoxine. Metodele de analiz ale micotoxinelor sunt variate, fiecare prezentnd diferite tehnici de pregtire a probei, precizia i acurateea msurrii fiind elementele definitorii ale unei metode. n cadrul acestei lucrri sunt prezentate, de asemenea, i rezultatele experimentrilor privind dezvoltarea i optimizarea metodei cromatografiei lichide de nalt performan (HPLC) de determinare a micotoxinei deoxinivalenol din cereale. Metoda HPLC reprezint o metoda de referin n determinarea micotoxinelor, permind cuantificarea la nivel foarte sczut, de ordinul ng sau pg. Experimentrile au fost realizate cu sprijinul Institutului de Bioresurse Alimentare i al Centrului de Biochimie Aplicat i Biotehnologie BIOTEHNOL din Bucureti, n cadrul laboratorului de microbiologie al Institutului de Bioresurse Alimentare s-au realizat experimentrile privind contaminarea cu fungi i bacterii a probelor de gru i porumb, precum i analiza micotoxinelor prin metoda ELISA. Experimentrile cu privire la dezvoltarea i optimizarea metodei HPLC de determinare a micotoxinei DON din cereale s-au realizat n cadrul Centrului de Biochimie Aplicat i Biotehnologie BIOTEHNOL din Bucureti. Studiile i experimentrile realizate reprezint o baz material deosebit pentru cultivatori i procesatori (uniti de morrit i panificaie), prin evidenierea factorilor de risc care determin contaminarea cu fungi toxigeni i producerea de micotoxine. Este o cerin unanim, aceea de a evalua calitatea cerealelor destinate consumului uman i

animal, n vederea stabilirii contaminrii cu micotoxine, un rol important avnd metoda de analiz, care trebuie s fie ct mai sensibil. Sunt onorat s amintesc c tema tezei de doctorat, de mare actualitate, mi-a fost propus de ctre doamna doctor inginer Nastasia Bele, director general al Institului de Bioresurse Alimentare, care m-a ndrumat i m-a sprijinit n activitatea de cercetare de la terminarea facultii, oferindu-mi posibilitatea de a lucra mpreun cu o echip dinamic de cercettori a Institutului de Bioresurse Alimentare. Vreau s exprim ntreaga mea recunotin pentru conductorul de doctorat, domnul profesor universitar doctor Petru Niculi care m-a sprijinit permanent n activitate. De asemenea, vreau s mulumesc doamnei profesor doctor inginer Mona Elena Popa pentru ncrederea acordat i ajutor n activitatea tiinific. Vreau s mulumesc ntregului colectiv de cercettori i tehnicieni ai Institutului de Bioresurse Alimentare, i mai ales, doamnei doctor biolog Valeria Gagiu, conductorul laboratorului de microbiologie, pasionat cercettor, care m-a ndrumat direct pe toat perioada experimentrilor realizate n acest laborator. Nu n ultimul rnd, doamnei doctor biochimist Enua lorga, director tiinific, pentru tot sprijinul acordat i doamnei inginer Sabina Ghencea, datorit creia a fost posibil utilizarea n experimentri a probelor din recolta de gru din Romnia. Nu pot uita colaborarea deosebit cu doamna doctor inginer Florentina Israel Roming i vreau s i mulumesc att pentru introducerea n "tainele HPLC-ului", ct i pentru tiina de a mpca profesia i familia. De asemenea, vreau s mulumesc doamnelor tehnician Domnica Dumitriu, Constana Pirvu i Ioana Tira, care mi-au fost alturi i m-au sprijinit permanent, att pe plan profesional, ct i pe plan personal. Nu n ultimul rnd, mulumesc familiei mele, soului i prinilor mei.