Crioconservarea spermei de păstrăv

1
 Cuprins

Introducere……………………………………………………………………………….3

Principiile criobiologiei…………………………………………………………………..4

Protocolul crioconservării spermei de păstrav…………………………………….……9

Bibliografie………………………………………………………………………………10

2
 Introducere

Reproducția peștilor din majoritatea regiunilor este marcată de un caracter sezonier, având loc în
general o singură dată, într-o anumite perioadă a anului când un cumul de factori reproductivi sunt
propice speciei de pește în cauză. Acest caracter sezonier al reproducției peștilor reprezintă o
piedică în managementul piscicol, iar din această cauză se încearcă îmbunătățirea tehnicilor de
gestionare ale reproducției, existând diverse mijloace din care vreau sa amintesc: controlul
parametrilor apei, deplasarea icrelor embrionate, tratamentele hormonale și conservarea gameților.

Crioconservarea este procesul prin care materialele biologice cum ar fi celulele și țesuturile sunt
conservate prin racire la temperaturi foarte scăzute, de obicei la temperatura azotului lichid și
anume -196 C, acestea rămânând viabile dupa o încălzire ulterioară la peste 0 C. Aceasta face
posibilă stocarea aproape nelimitată a grupurilor dorite de gene și asigură disponibilitatea pe o
perioadă lungă de timp.Conservarea spermei reprezintă un succes pentru criobiologie având
aplicații atât în medicina umană cât și în medicina veterinară, îmbunătățind tehnologiile
reproductive.

Avantajele crioconservării spermei de pește sunt evidente, iar pe lângă faptul că este un instrument
de gestionare al reproducției aceasta mai aduce beneficii ca: protecția stocurilor de material genetic
în cazul epidemiilor de boală și dezastre naturale, transportul facil al materialului genetic în orice
colț din lume, stocare și transport pentru cercetarea de laborator.

Pioneratul criosonservării în acvacultură a avut loc în anii 50, cu o primă raportare a criosonservării
spermei de hering (Clupea harengis) in 1953 de către J. H. S Blaxter, după care urmând o serie de
multe studii pe numeroase specii de pești cu predilecție pe salmonide, acipenseride și ciprinide. Cel
mai mult s-a lucrat pe păstrăvul curcubeu (Onchorhynkus mykiss) și păstravul de munte (Salmo
trutta fario). De asemenea s-a lucrat și pe tilapia (Oreochromis mossambicus) și alte specii cu
potențial pentru piscicultură cum sunt sângerul (Hypophthalmicthys molitrix), labanul (Mugil
cephalus), crapul (Cyprinus carpio), pangasius (Pangassius sutchi), cteno (Ctenopharyngodon
idella), labeo (Labeo rohita), stiucă (Esox lucius), cambulă (Pleuronectes ferrugineus). Dintre
speciile marine cu importanță economică, se utilizeză în cercetare sperma de la barramundi (Lates
calcarifer), peștele de lapte (Chanos chanos), tonul roșu (Thunnus thynnus), caras negru de mare
(Acanthopagrus schlegelii).

3
 Principiile criobiologiei

Natura dictează daca materialul biologic evoluează sau involuează până la disparitie, structura și
funcția organismelor modificandu-se cu trecerea timpului. Cu scopul de a opri sau a încetini ceasul
biologic, experimentele cu temperatura și conținutul de apă al celulelor sunt baza cercetării în
criobiologie. Folosirea temperaturilor foarte scăzute se dovedește a fi o modalitate de stocare a
celulelor pe perioade mai lungi de timp. Îndepărtarea apei din materialul biologic în starea de
înghețare sau acea uscare prin înghețare, reprezintă un alt mijloc de a opri ceasul biologic, care
poate fi ulterior reactivat prin adăugare de apă. Toate aceste lucruri dovedesc faptul ca apa este
componenta vitală pentru apariția proceselor chimice ale vieții. Metabolismul celular se oprește
cand apa din sistem este transformată în gheață, mai mult, temperatura redusă scade mișcarea
moleculelor, iar la -273 grade celsius toate mișcările moleculare sunt inhibate și toate reacțiile
biochimice încetează. În practică, nu există schimbări biochimice semnificative la o temperatură
mai scăzută de -150 grade celsius, astfel depozitarea materialelor biologice în azot lichid la
temperatura de -196 grade celsius este cea mai folositoare.

Majoritatea reacțiilor asociate înghețării sunt rezultatul proprietăților osmotice ale celulelor. Celula
este alcatuită din apă, organite, săruri minerale, zaharuri, proteine și lipide, toate acestea fiind
învelite într-o membrană semi-permeabilă. Această membrană permite apei să treacă prin ea, în
timp ce este și o barieră de trecere pentru alte soluții. Mediile intra si extracelulare asociate cu
transportul apei și permeabilitatea membranei creează bazele crioconservării celulelor. Prin natura
ei, apa tinde sa se deplaseze în interiorul membranei celulare pentru a menține o concentrație egală
de substanțe dizolvate în interiorul și exteriorul celulelor (concentrația soluțiilor dizolvate este
masurată ca osmolaritate).

Deteriorarea celulară din timpul procesului de înghețare se datorează șocului osmotic, formării
gheții intracelulare și creșterii substanțelor dizolvate intracelulare. Pentru a reduce aceste daune se
adaugă crioprotectori care interacționează cu membranele și le face mai flexibile. Astfel, principiul
de bază al crioconservării este de a determina deshidratarea celulelor și de a se concentra lichidul
intracelular cu leziuni minime. Totuși, formarea gheții și schimbările presiunii osmotice sunt
cauzele majore ale defectelor spermatozoizilor din timpul crioconservării, iar abilitatea membranei
plasmatice a spermatozoizilor de a rezista deteriorării structurale poate fi legată de tipul de acizi
grași din membrana plasmatică și rezistența legaturilor între componentele membranei. Se
presupune că acizii grași alături de soluția crioprotectoare protejează celula de presiunea osmotică și
deshidratare.

4
 Protocolul crioconservării spermei de păstrăv

Echipamente și materiale necesare:

-Tuburi Eppendorf sterile pentru colectarea materialului seminal
-Hemocitometru
-Micro centrifuga cu rotor hematocrit
-Pipete franceze de 0,5 ml de diferite culori
-Pulbere de alcool polivenilic sau granule
-Flux laminar
-Congelator programabil
-Cutii termice și suporturi
-Containere cu azot lichid (Criocan BA-3, BA-20, BA-35)
-Agent de răcire: LN2 sau gheață uscată pentru răcire alternativă
-Baie de apă
-Unitate de incubație cu flacără
-Echipament de siguranță: mănuși, ochelaro etc.

Procesul crioconservării respectă o serie de pași de bază care includ:

1. Achiziționarea reproducătorilor. Reproducătorii se pot captura din mediul natural sau pot
sa provină din stocul unor unități piscicole. Masculii trebuie ținuti în acelasi bazin cu
femelele pentru a stimula reproducția, dimorfismul sexual ajutând la diferențierea sexelor.

5
2. Colectarea spermei. Colectarea spermei trebuie sa se facă întotdeauna cu ușurință de la
masculi maturi, care sunt sedați în prealabil pentru o manevrare sigură a acestora. Trebuie
evitată contaminarea spermei cu fecale, mucus,sange și apă, astfel primele picaturi de
spermă se vor arunca. O eventuală contaminare poate activa sperma diminuând calitatea.

3. Stocarea la rece a spermei și transportul probelor. Materialul seminal poate fi înghețat cu

succes timp de 4 ore de la colectare, în tot acest timp fiind nevoie de o stocare la 4 grade
celsius, evitându-se condensarea în interiorul vasului.
4. Analiza calității spermei. Succesul crioconservării depinde în mare masură de calitatea
spermei precongelate. Crio-rezistența și compoziția bio-fizică-chimică a spermei diferă de la
specie la specie. Calitatea spermei mai poate sa varieze și în funcție de condițiile de
precongelare, sezonul de reproducție, starea de sănătate și dieta reproducătorilor și metoda
de recoltare. Cele mai importante aspecte care caracterizează calitatea spermei sunt:
 Culoare. Culoarea materialului seminal este în general albă, dar poate sa fie și alb-
crem, consistența rezultând în funcție de colorație. Daca materialul seminal colectat
apare roșiatic sau gălbui, înseamnă că acesta a fost contaminat și că viabilitatea
spermei este drastic redusă.
 Volum. Volumul de spermă poate să fie masurat cu ajutorul unui recipient gradat și
poate varia în funcție de starea de maturitate a masculului și nu neaparat de marimea
acestuia.
 Ph. Ph-ul este un parametru important pentru examinare în timpul preparării
mediului de extindere pentru crioconservare. La păstravul curcubeu ph-ul variază
între 7.29 și 7.39

6
  Motilitatea spermatozoizilor. Este cel mai frecvent paramentru pentru a evalua
calitatea spermei, de acest fapt depinzând o fertilizare reușită. Sperma nu este mobilă
în gonade sau în lichidul seminal, aceasta se activează în apa mediului extern. După
activare aceasta se poate evalua pe o scară de la 0 la 4 cu ajutorul unui
microscop(100x). Perioada în care spermatozoizii sunt mobili poate să fie de la
cateva secunde până la cateva minute, cu cât aceasta este mai lungă cu atât șansele
de reușită la crioconservare sunt mai mari.
 Densitatea spermei. Numărul spermatozoizilor viabili în cantitatea totală de spermă
are un impact important asupra succesului fertilizării. De obicei această densitatea
este mai mare la începutul sezonului reproductiv și se poate estima cu ajutorul
hemocitometrului.
 Valoarea spermatocritului. Determinarea spermatocritului este o metoda ușoară și
rapidă de evaluare a concentrației spermei. Tehnica presupune folosirea tuburilor
capilare și a unei centrifuge hematocrite. Timpul de centrifugare depinde de specie,
iar la păstrăvul curcubeu se recomandă aproximativ 30 minute la 7000 rpm.

5. Pregătirea diluării. Pentru dezvoltarea protocolului de crioconservare, cerința principală

este de crea un mediu de extindere pentru diluarea lichidului seminal, deoarece materialul
seminal nediluat nu este adecvat pentru crioconservare. Extinderea inhibă activarea
spermatozoizilor și prin urmare păstrează viabilitatea prin conservarea energiei.
Crioprotectantul diminueaza crioleziunile celulare datorare formării cristalelor de gheață din

7
 timpul crioconservării. Amestecul preparat din extender și crioprotector se numește diluant,
iar concentrația acestor agenți înca nu este clar stabilită. Diluantul trebuie preparat proaspăt
și trebuie verificat ca acesta sa nu activeze spermatozoizii.
6. Diluarea materialului seminal. Diluarea este importantă pentru că ea crește volumul
materialului seminal, astfel poate fi folositoare pentru multiple inseminări. Pentru preparare,
diluantul este adăugat treptat materialului seminal pentru a nu provoca șoc spermatozoizilor
prin modificarea ph-ului și a osmolarității. După preparare fiecărei probe îi este testată
motilitatea. Sperma este diluată de 4-10 ori. O spermă diluată de 10 ori poate să fertilizeze
aproximativ 300 icre.
7. Timpul de ehilibrare. Pentru o protecție eficentă, trebuie acordat suficient timp ca
amestecul crioprotector să penetreze celulele. Acest timp poate varia în funcție de diluant și
starea gameților, dar nu mai putin de 15 min si mai mult de 60 min, la o temperatură de 0-4
grade celsius.
8. Ambalarea materialului seminal. Materialul echilibrat poate fi ambalat și supus înghețării
în 3 moduri: metoda flaconului, metoda peleților și metoda tuburilor. Cele doua din urmă
sunt folosite pente păstravul curcubeu și presupun stocarea materialului seminal în peletă
sau tub francez, care vin sigilate și păstrate la temperatura de aproximativ -79 grade celsius.
9. Răcirea și înghețarea. Răcirea, dincolo de punctul în care lichidele se solidifică are ca
rezultat inhibarea mișcărilor moleculare și încetarea reacțiilor biochimice. Înghețarea
materialului diluat este completă cu gheță uscată, vapori de azot lichid sau cu congelatoare
programabile specializate.

8
10. Procedura de stocare la rece. După 10-15 minute în vaporii azotului lichid, recipientele cu
materialul seminal sunt etichetate și așezate în vasul de crioconservare cu azot lichid la -196
grade celsius.
11. Procedura de dezghețare sau reconstituire. Efectele încălzirii spermei depind în mare
măsură de istoricul de înghețare. În timpul încălzirii sperma se rehidratează și orice
deteriorare se asociază stresului osmotic, iar procesele fiziologice ce au loc sunt aceleasi ca
în cazul înghețării doar ca sensul este inversat. Aceste deteriorări se pot diminua printr-o
încălzire rapidă a spermei, iar la păstravul curcubeu se recomandă ca proba de sperma să fie
imersată într-o baie de apă la 20-25 grade celsius.
12. Evaluarea motilității spermei. După reactivare, probele sunt evaluate și se face o estimare
cat mai rapidă a motilității spermatozoizilor. Este normal ca procentajul motilității să fie mai
scazut dupa crioconservare, iar acesta nu depinde deperioada de timp în care proba a fost
crioconservată.
13. Evaluare întregului protocol. Succesul crioconservării se poate stabili prin calcularea ratei
de fetilizare, ratei de eclozare și ratei de supraviețuire a larvelor, toate acestea fiind
comparate cu un lot de control care nu a fost supus crioconservării.

9
 Bibliografie

1. Brett Molony, 2001, Fisheries research report, Environmental requirements and tolerances of
rainbow trout ( Oncorhynchus mykiss) and Brown trout ( Salmo trutta)
2. Ergun Akcay, 2014, Cryopreservation of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) semen
3. N.K. Akarwal, 2011, Cryopreservation of rainbow trout semen
4. Rana K.J,1995, Preservation of gamets

10