CONSERVAREA

MATERIALULUI SEMINAL
 Conservarea materialului seminal

urmăreşte menţinerea mobilităţii şi capacităţii fecundante a

spermatozoizilor un timp cât mai îndelungat, în afara căilor genitale
femele.

Principiul crioconservării materialului seminal = reducerea temperaturii

spermei determină o scădere a activităţii metabolice a spermatozoizilor
permiţând stocarea lor.

3
 Sperma recoltată poate fi utilizată sub formă:

a.Proaspătă

b.Conservată la temperatura camerei (18-20oC)

c.Refrigerată

c.Congelată

4
• În cadrul protocoalelor de conservare a spermei se
utilizează doar cea de a doua fracţiune a ejaculatului.

• Indiferent de metoda de conservare, se prelucrează

doar materialul seminal de bună calitate:
mobilitate progresivă ≥ 70%, anomalii
morfologice primare și secundare ≤ 20%.
Diluarea spermei reprezintă o etapă premergătoare
şi obligatorie pentru conservarea spermei

Diluarea permite:

- creşterea volumului total al masei spermatice

- fracţionarea ejaculatului în mai multe doze
- asigurarea unui mediu favorabil prelungirii viabilităţii şi capacităţii
fecundante a spermatozoizilor
- reducerea formării şi acumulării produşilor rezultaţi din metabolismul
spermatozoizilor
- trecerea parţială sau definitivă a spermatozoizilor în anabioză

6
Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească un bun diluant:
a.Trebuie să conţină substanţe nutritive care să facă posibilă menţinerea activităţii
vitale a spermatozoizilor pe toată durata conservării (fructoză, glucoză, galactoză)
b.Să nu conţină substanţe toxice
c.Să aibă acelaşi pH cu sperma (substanţe tampon = citraţi, fosfaţi, tartraţi)
d.Să aibă aceeaşi presiune osmotică (izoton)
e.Să conţină substanţe coloidale care să protejeze spermatozoizii (gălbenuş de ou,
lipoproteine, lecitină, lapte, smântână ecremată etc)
f.Să conţină substanţe crioprotectoare (glicerol, etilen glicol)
g.Să aibă încorporate antibiotice cu efect bacteriostatic sau bactericid într-un spectru
cât mai larg
h.Să posede însuşiri antioxidante
i.Să se prepare uşor
j.Să îşi menţină proprietăţile un timp îndelungat
k.Să fie aseptic
l.Să fie economic

7
Refrigerarea spermei = păstrarea spermei diluate la temperatura de
0 - 4oC (în frigider) timp de 4 - 20 zile

• rezultate foarte bune la ECVINE, OVINE şi SUINE și rezultate bune la

CÂINE

8
 ETAPELE REFRIGERĂRII SPERMEI
• sperma se centrifughează (eliminarea completă a plasmei seminale)
• se diluează materialul seminal. Diluantul protejează membranele
spermatozoizilor de şocul provocat de modificarea de temperatură
şi de transport, asigurând în acelaşi timp rezerva energetică şi
menţinerea constantă a pH-ului şi presiunii osmotice.
• Există mai mulţi diluanţi comerciali pentru refrigerarea
spermei, majoritatea necesitând adăugarea gălbenuşului de ou.
• ! ! ! Înainte de a dilua materialul seminal, trebuie să ne asigurăm că
sperma şi diluantul se găsesc la aceeaşi temperatură (de regulă,
temperatura camerei).
• Sperma diluată este răcită şi menţinută la 4oC 30-60 de minute
• Pe tot parcursul transportului este esențial ca temperatura să
rămână constantă 4o C. Pentru aceasta se utilizează cutii speciale
de transport sau poate fi transportată într-un termos sau într-o ladă
frigorifică.
• Fiola în care se află materialul seminal diluat trebuie izolată de
contactul direct cu gheaţa pentru a preveni o răcire accentuată a
acesteia
• Înainte de inseminare, sperma refrigerată se încălzeşte lent la
temperatura camerei
CONGELAREA SPERMEI = păstrarea spermei diluate în gheaţă
carbonică sau în azot lichid (-196oC)

 Rezultate foarte bune la TAUR şi bune la armăsar și câine

11
 Etapele congelării spermei
1. Centrifugarea
- eliminarea plasmei seminale care are efecte negative asupra
crioconservării
- standardizarea concentraţiei finale
- 600-700 g 5-10 minute

Dezavantaje:
- Are efecte negative asupra viabilității și mobilității spermei după
congelare-decongelare

- Recoltarea fracționată a ejaculatului dacă este posibil (CÂINE)

- Separarea fracțiunilor spermatice pe medii cu gradiente
diferite de densitate
 Etapele congelării spermei
2. Diluarea
-cu diluant specific speciei
- se calculează rata de diluţie pentru a obţine concentraţia finală dorită per
doză de inseminare
- se poate realiza în una sau două etape

La ora actuală există mai multe metode de congelare pentru fiecare

specie, fiecare cu setul său de substanţe tampon, crioprotectoare şi
protocol de congelare.
SPERMVITAL®
= tehnologie nouă prin care spermatozoizii sunt imobilizați
într-o substanță naturală înainte de crioconservare . Această
imobilizare permite conservarea energiei celulei spermatice.
În plus, mediul special eliberează treptat spermatozoizii la
nivel uterin pe o perioadă extinsă de timp se acoperă
o perioadă mai mare de timp raportat la momentul ovulației
și cresc șansele de fertilizare
Doza finală (după diluare) de spermatozoizi necesară pentru o
inseminare în funcţie de specie:

 taur: 10 - 12 milioane spermatozoizi cu mobilitate progresivă

 armăsar: 20 milioane spermatozoizi/ml
 berbec: 200 - 250 milioane spermatozoizi cu mobilitate progresivă
 vier: 3-5 miliarde spermatozoizi (50-150 ml material seminal diluat)
 câine: 150 milioane spermatozoizi cu mobilitate progresivă

15
 Etapele congelării spermei
3. Ambalarea
- paiete de 0,25 sau 0,5 ml
- fiole de 1 ml
- umplere automată sau manuală
- sigilare paiete cu bile metalice sau cu pulbere de polivinil-alcool
 Paietele / fiolele încărcate cu material seminal trebuie
marcate cu:
- Rasa (poate fi abreviată)
- Numele / numărul de identificare al masculului
- Data recoltării spermei
- Locul de recoltare și procesare al materialului seminal
Staţie automată de împaietare a materialului seminal (Minitübe, Germania)

18
 Etapele congelării spermei
4. Echilibrarea
- permite spermatozoizilor să dezvolte o rezistenţă mai mare faţă
de şocul termic asociat congelării
- Se realizează 1-4 h la 4oC (frigider) sau la to camerei
 Etapele congelării spermei
5. Congelarea propriu-zisă

O rată de răcire optimă va permite deshidratarea progresivă a celulei

(membrana celulară a spermatozoizilor este permeabilă pentru apă), fără
formarea cristalelor de gheaţă intracelulare, ceea ce permite supravieţuirea
celulei după decongelare.
• Dacă viteza de congelare este prea mare, se formează cristale de gheaţă
(mari, medii sau mici) intracelular care vor determina leziuni celulare de
diferite grade: de la leziuni structurale minore, dar care afectează în final
capacitatea fecundantă a gametului, la leziuni majore, letale.
• Celulele sunt expuse unor concentraţii mari de săruri în mediul extern şi se
deshidratează până la un grad de ratatinare asociat leziunilor celulare grave
• Atunci când congelarea se face la rate foarte mici, deshidratarea va avea loc
pe o perioadă mai lungă de timp.
 5. Congelarea propriu-zisă
 Protocol automat dinamic (linie automată) – permite stabilirea ratei de
răcire pentru fiecare minut al protocolului
 Protocol manual static (cutie de polistiren) – rata de răcire este
determinată de distanța la care sunt suspendate paietele cu material
seminal față de suprafața azotului lichid
 Ultrafreezere (fără azot) - Echipamentul constă într-un microprocesor
care menţine temperatura internă din cabină la -152oC. Valorile
temperaturii pot oscila între -100 şi -152oC; ratele de răcire programabile
nu sunt disponibile.

În final, paietele sunt plonjate în azotul lichid și stocate în containere speciale

 Etapele congelării spermei

6. Decongelarea materialului seminal

Există o corelaţie între ratele de răcire şi cele de decongelare – se

respectă instrucţunile furnizate de firma/persoana care a făcut
congelarea

 Decongelarea în baie de apă caldă

Pt. paietele de 0,5 ml: 8 secunde la 70°C sau 30-60 secunde la
37°C

 Decongelarea în apă cu gheaţă timp de 3 minute

 Decongelarea în buzunar

23
SEXAREA MATERIALULUI SEMINAL

24
 Sexarea materialului seminal = separarea prin metode fizice a
spermatozoizilor purtători de cromozom Y de spermatozoizii purtători
de cromozom X

 Utilizată în special la BOVINE

La ora actuală, cea mai utilizată metodă de sexare a materialului

seminal = CITOMETRIA ÎN FLUX

25
 Sexarea spermei prin citometrie în flux

Principiul metodei:

 Există o diferenţă cantitativă de ADN între gameţii X şi gameţii Y

- la bovine, diferenţa între gameţii X şi Y este de 3,7-4,22%
- la alte specii – 2,3-7,5%

Sperma este marcată cu un colorant fluorescent specific pentru ADN (Hoechst

33342)

 Se adaugă un marker fluorescent pentru membrane => se sortează doar celulele

spermatice viabile

Citometrul în flux continuu “citeşte” cu ajutorul unui fascicul laser celule marcate şi
le direcţionează în funcţie de conţinutul lor

Acurateţe: 85-95%
26
Procesul de sortare a spermatozoizilor X şi Y
(http://www.sexingtechnologies.com)

27
 Avantajele spermei sexate

 permite obţinerea de produşi de concepţie de un anumit sex în funcţie de cerinţele

de marketing
 în industria vacilor de lapte – permite obţinerea de femele de înlocuire pentru
vacile cu productivitate mare
 obţinerea mai rapidă şi mai eficientă a descendeţilor de un anumit sex pentru a
testa valoarea genetică a ascendentului
 permite obţinerea de linii încrucişate cu capacitate productivă maximă

Dezavantajele spermei sexate

reducerea numărului de spermatozoizi mobili şi viabili datorită menţinerii lor un

timp mai îndelungat la 34-37oC înainte de congelare
 sperma sexată tinde să degenereze mai rapid faţă de sperma nesexată
 cost mai mare al spermei sexate comparativ cu sperma brută
28