Biotehnologia transferului

de embrioni la bovine
In vivo

Șef Lucr Dr. Ștefan Gregore CIORNEI

UNIVERSITATEA DE ȘTIINTE AGRICOLE SI MEDICINA VETERINARA – IASI
TITULAR DISCIPLINA:
MANAGEMENTUL SI BIOTEHNICA REPRODUCTIEI ANIMALELOR DE RENTA
 Definiţie

• Transferul de embrioni reprezintă procesul prin

care mai mulţi embrioni sunt extraşi de la nivelul
coarnelor uterine ale unei vaci donatoare, cu
caracteristici morfo-productive superioare, şi
transplantaţi în uterul mai multor vaci receptoare
care vor purta gestaţia până la termen.
TRANSFERUL EMBRIONAR = metodă de intensivizare a
reproducţiei
 primele cercetări (1890-1897) în domeniul transferului de
embrioni - iepure -Walter Heape la Universitatea din Cambridge

1930 Hartman C. şi col., descoperă embrionul bovin -

ontogeniei embrionare.

1936, Pincus şi Enzemann descrierea tehnicilor utilizate în

recoltarea şi transferul embrionilor la şoarece şi iepure, ajungând
la o concluzie practică "uterul femelei receptoare trebuie să fie în
fază progestagenă pentru ca diferenţierea embrionului transferat
să continue în condiţii normale".
 1930-1940, Nicholas transferul ectopic al embrionilor şi prima
încercare de separare artificială a blastomerelor embrionare
1932, Warwick şi Berry realizează prima recoltare a unui embrion
de la capră însă, datorită lipsei receptoarei, după o scurtă
examinare a fost repus în uterul donatoarei, unde şi-a continuat
dezvoltarea până la parturiţie.
1933 Warwick primul transfer interspecific - oaie donatoare la o
capră receptoare, experimentul nereusit - resorbţiei embrionului
ovin în jurul zilei 50 de gestaţie.
 1949, Umbangh pune bazele Fundaţiei pentru Cercetare Aplicată la
San Antonio, Texas - program de transfer de embrioni la bovine punând
accent pe studiul superovulaţiei şi pe valenţele comerciale ale
transferului de embrioni
1951 Willett la Universitatea din Wisconsin, se naşte primul viţel ca
urmare a unui transfer embrionar
1951 Kvasnicke raportează obţinerea primilor purcei prin transfer.
1978, pe 25 iulie se naşte Louise Joy Brown, primul copil obţinut prin
transfer embrionar - clinica din Baltmore.
 Scurt istoric
• Primul transfer de embrioni - Walter Heape în 1890.
– 2 embrioni de iepure Angora la o femelă gestantă Uriaş Belgian;
– cuib mixt (Angora şi Uriaş Belgian).
• La animalele de rentă:
– 1930 – caprine şi ovine;
– 1950 – bovine şi suine (Jim Rowson la Cambridge, Anglia).
• Primele transferuri comerciale – SUA la începutul anilor
1970.
– Iniţial transferuri chirurgicale;
– La sfârşitul anilor 1970 – metodele nechirurgicale – creşterea
popularităţii acestei biotehnologii.
De ce transferul de embrioni la bovine?
• Obţinerea mai multor produşi de concepţie de la o vacă valoroasă
decât s-ar putea obţine în mod natural pe parcursul vieţii ei, din cauza
duratei lungi de gestaţie;

• Folosirea de femele inferioare din punct de vedere genetic ca mame

purtatoare de embrioni si realizarea unui progres genetic rapid;

• Scurtarea perioadei necesare pentru îmbunătăţirea rasei;

• Minimizarea riscului de transmitere de boli;

• Costuri de transport mai mici;

• Posibilitatea obţinerii unui produs de valoare fără achiziţionarea unei

vaci de valoare, care poate fi foarte scumpă.
 AVANTAJE
MULTIPLICAREA NUMĂRULUI DE PRODUŞI DE LA
ACEEAȘI ANIMAL

CREŞTEREA VALORII GENETICE A EFECTIVELOR DE

ANIMALE
 AVANTAJELE transferului de embrioni

• Asigurarea progresului genetic al raselor prin creşterea

numărului genotipurilor valoroase.

• Posibilitatea creării unor bănci de embrioni care să asigure

conservarea genofondului.

• Oferă posibilitatea descifrării mecanismelor ce guvernează

procesele biologice de bază.

• Tehnicile embrio-transferului sunt implicate în

biotehnologiile avangardiste, reprezentate de clonare,
obţinerea de animale transgenice, sexarea embrionilor.
 Etape
• Selecţia vacilor donatoare;
• Poliovulaţia vacilor donatoare;
• Inseminarea donatoarelor;
• Recoltarea embrionilor;
• Evaluarea embrionilor recoltaţi;
• (Sexarea şi/sau crioconservarea embrionilor);
• Selecţia şi pregătirea receptoarelor;
• Transferul propriu-zis la receptoare.
 Selecţia vacilor donatoare
• Femele de mare valoare, care să justifice
investiţia:
– pe baza criteriilor genotipice (ascendenţă,
performanţele fraţilor şi surorilor)
– pe baza criteriilor fenotipice (însuşiri morfologice,
productive, etc. proprii);
– după performanţele descendenţilor;
• Femele sănătoase din punct de vedere
reproductiv:
– aparat genital normal (examen clinic transrectal);
– puerperium fiziologic,
– cicluri regulate (18 - 24 zile);
– 60 zile postpartum.
• Alte criterii:
– cicluri regulate de călduri, care au apărut la o
vârstă timpurie;
– nu mai mult de 2 însămânţări/concepţie;
– calving interval de aproximativ 365 zile;
– parturiţii eutocice;
– fără defecte conformaţionale;
– scor de masă corporală adecvat (2,5-3,5)
 SELECŢIONAREA DONATOARELOR:
CRITERII
Din punct de vedere zootehnic
– Originea şi valoarea genetică
• Ascendenţa
• Performanţele proprii
– Însişiri morfoproductive
Din punct de vedere sanitar veterinar
– Starea fiziologică
• Stare de întreţinere bună
• Furajare echilibrată
– Situaţia reproductivă
• Examen transrectal; ecografic
 Selecţia donatoarelor de embrioni

• Pentru a intra în programul de recoltare a embrionilor,

selecţia donatoarelor se realizează pe baza anchetei
ginecologice globale, a examenului clinic şi a examenului
transrectal individual.
• Rezultatele trebuie menţionate în Fişa de Observaţie
Ginecologică

• Fişa ginecologică - se întocmeşte individual şi stă la baza

selecţiei donatoarelor
Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară ANEXA 1
Facultatea de Medicină Veterinară
Clinica de Reproducţie, Obstetrică şi Ginecologie Veterinară Nume examinator
…….………………………

FIŞĂ GINECOLOGICĂ DE SELECŢIE A DONATOARELOR

Numele vacii……………………………nr. matricol……………….rasa…………………...

vârsta………………………proprietatea…………………….producţia…………………….
starea de întreţinere…………………………………………………………………………...

DATE ANAMNETICE ASUPRA PRODUCŢIEI

Nr.fătări anterioare………………………………..când a avut loc ultima fătare sau
avortul………………………………………………………………..cum a decurs (eutocic,
distocic, complicaţii)…………………………………………………………………………...
…………………………………………………………………………………………………..
eliminarea placentei…………………………………comportarea în puerperium………...
…………………………………………………………………………………………………..
De ce boli a suferit animalul………………………………………………………………….
Apariţia primului ciclu de călduri……………………………………………………………..
dacă se repetă…………..caracteristicile căldurilor (neregulate, liniştite, inaparente,
intense)…………………………………………………………………………………………
La al câtelea ciclu de călduri a fost poliovulată……………………..……………………..
Ce tratament de poliovulaţie s-a aplicat…………………………………………………….

EXAMENUL CLINIC EXTERN

Temperamentul……………………temperatura…………………pulsul şi caracterele
lui…………………respiraţia…………………..poziţia femelei……………………………..
Bazinul (dezvoltare şi conformaţie)………………………………………………………….
Organul genital extern (vulva) poziţia………………………pigmentaţia………………….
culoarea……………….infiltraţie……………………leziuni şi cicatrici…………………….
Dacă se observă scurgeri vaginale: cantitatea…………………….caracterul lor……….
pH-ul lor………………..examenul bacteriologic……………………………………………
Antibiograma…………………………………………………………………………………...
Leucograma……………………………………………………………………………………
Poliovulaţia vacilor donatoare
• La speciile monotocice (vaca) – un singur folicul
atinge stadiul de folicul matur şi ovulează.
• Procedeul de sporire a numărului de foliculi care
ovulează în timpul unui ciclu estral;
 Inducerea poliovulaţiei la VACILE DONATOARE

Poliovulaţia este procesul prin care se stimulează eliberarea în

cadrul aceluiaşi ciclu a unui număr mai mare de ovule
comparativ cu numărul caracteristic speciei.

Principiul:

administrarea uneia sau mai multor doze de hormoni foliculo-

stimulatori (FSH sau PMSG) pe fondul unui corp galben pe
ovar (producător de progesteron), care este luteolizat de o
PGF2alfa şi suplimentarea hormonului de luteinizare (LH
sau HCG) pentru a stimula fenomenul ovulator natural.
• Protocol poliovulaţie PLUSET
VACILE DONATOARE
gonadotropina serică (PMSG) Folligon - 2500 UI, administrată în ziua 9 – 10 a
ciclului estral i.m.

- 48 h prostaglandină F2 - 15 mg (Prosolvin)

48-72h – I.A. 2x12 ore

2h înainte de prima IA - PMSG (1500 UI) + gonadotropină corionică (Chorulon)

OVAR DE BIVOLITA DUPA TRATAMENTUL DE
POLIOVULATIE
8 FOLICULI DEZVOLTATI (5 ov dr, 3 ov st)
 Inseminarea donatoarelor
• la 36-48 ore de la ultima administrare de Pluset;
• număr mare de ovocite – număr mare de spermatozoizi
viabili în oviduct;
• un protocol – inseminarea la 12, 24 şi 36 ore de la debutul
estrului;
• critic – folosirea unui material seminal de calitate superioară,
provenit de la un taur de valoare, cu indice de mobilitate
ridicat;
• depunerea – la nivelul corpului uterin.
 Recoltarea embrionilor
• la 6,5-7,5 zile de la inseminare;
• anestezie epidurală;
– cateter Foley,
– cateter tip DISSI CH18 cu adaptor Luer,
FLUSHING
• lichid de spălare – ex: mediul BoviPro cu BSA (Minitub), la 37°C.
• flushing - 2 litri mediu, trecut printr-un filtru steril tip Mini Flush
• spălare filtru cu mediul BoviPro filter rinse (Minitub).
• examinare la stereolupă în vederea identificării embrionilor.
• mediu BoviPro Holding medium - aprecierea morfologică.
 RECOLTAREA nCH

Recoltarea embrionilor se efectuează la 6,5 zile după

IA pe cale nechirurgicală, prin utilizarea a trei tipuri de
catetere.

- sonde cu două căi de acces, având următoarele

particularităţi :

➢ Cateterul Rusch

➢ Cateterul MT tip CH 18

➢ Cateterul Lampeter
 Cateterul Rusch - 2 căi, din cauciuc flexibil având 70 cm
lungime şi 7 mm diametru. Este prevăzut cu două căi de acces:

– o cale care permite atât introducerea cât şi recuperarea prin

alternanţă a mediul de recoltare;

– o cale care asigură gonflarea balonaşului obturator.

Rigidizarea - în vederea tunelizării cervixului donatoarei în

momentul recoltării, se realizează cu ajutorul unui mandren
confecţionat din oţel inoxidabil.

Cateterul prezintă patru orificii de evacuare în zona apicală, prin

intermediul cărora se introduce şi se recoltează mediul de spălare din
uter.
 Cateterul MT tip CH 18
- cauciuc fin şi flexibil, 70 cm L şi 7 mm diametru.

Cateterul dispune de două căi :

– o cale pentru introducerea şi recuperarea în

alternanţă a mediului de recoltare ;

– a doua cale asigură gonflarea balonaşului fiind

prevăzută cu valvă şi cu supapă.

– mandren confecţionat din oţel inoxidabil.

 Cateterul Lampeter

- amestec de materiale plastice ce-i oferă elasticitate şi

flexibilitate

- imediat după balonaş un vârf metalic, prevăzut cu 8

deschideri.

Pasajul cervixului donatoarei - mandrenului

confecţionat din oţel inoxidabil.
Etapele recoltării enbrionilor la vacă
utilizarea cateterului Foley
Pentru recoltarea nechirurgicală a embrionilor se utilizează mediul
PBS (Phosphate Buffered Salin, Vigro Complete Flush).

Pungile cu mediu se păstrează la temperatura laboratorului, iar în

momentul recoltării se încălzesc într-o baie marină, asigurându-se
30oC vara şi 35oC iarna. Recuperarea mediului de spălare se realizat
în flacoane sterile transparente cu pereţi dubli gradaţi, ceea ce permite
controlul aspectului şi cantităţii mediului introdus şi recuperat.
 Protocolul de recoltare

– Înainte de a fi utilizate, cateterele de recoltare sunt spălate în interior

şi la exterior cu ser fiziologic steril pentru a îndepărta eventualele
urme de dezinfectanţi ce pot avea efect toxic asupra embrionilor.

– De asemenea, cateterele se siliconează cu silicon spray pentru a evita

aderarea embrionilor în timpul recoltării.

– Donatoarele se contenţionează, anesteziei epidurale cu 4 ml

Procaina/Lidocaină 2% şi administrarea i.m. a 10 ml utero-relaxant
(Degraspamin – produs de firma Graner-Elveţia), se leagă coada
animalului, se face toaleta şi dezinfecţia regiunii perivulvare.
Protocolul de recoltare
Introducerea sondei în vagin acoperită cu o cămaşă de protecţie plasticată
de unică folosinţă.

La nivelul intrării vaginale a cervixului, sonda este orientată transrectal în

vederea trecerii barierelor inelare cervicale.
 - control transrectal continu - plasarea sondei făcându-se în treimea
mijlocie a coarnelor uterine, la 4 – 5 cm de bifurcaţia coarnelor
uterine, având astfel posibilitatea recoltării embrionilor aflaţi în
treimea anterioară a acestuia.

- după poziţionarea sondei în lumenul cornului uterin, se umple balonul

acesteia cu 8 – 10 – 12 cm3 de aer, în funcţie de diametrul cornului.

-introducerea mediului de spălare – seringi sterile, recoltarea

intrauterină a acestuia se realizează în vase de recoltare gradate, cu
pereţi dubli - stereolupă

- pentru prevenirea infecțiiolr:

- antibioticoterapie locală +luteoliza CL (Prosolvin 15mg/animal)
 ET la tineretul femel şi primipare
- puţine probleme privind infecţiile genitale

- răspunsul la tratamentele de stimulare este mai bun.

• ET nCH de embrioni la vacile receptoare se poate face cu embrioni

proaspăt recoltaţi, embrioni decongelaţi şi embrioni proveniţi din
fecundarea in vitro.

• Efectuarea transferului nechirurgical constă în depunerea embrionului

în corpul uterin ipsilateral corpului galben cu ajutorul unor

instrumente introduse în lumenul uterin prin traiectul cervical.

Evaluarea embrionilor recoltaţi
– Criterii de evaluare: !!!!!!!!
• Regularitatea formei embrionului;
• Gradul de compactare a celulelor;
• Uniformitatea blastomerelor;
• Culoarea şi textura citoplasmei;
• Diametrul embrionului;
• Prezenţa celulelor desprinse;
• Regularitatea zonei pelucida
• Prezenţa de vezicule în citoplasmă.
Structura embrionului (schema)
– Evaluarea se face şi conform stadiului de
dezvoltare atins:

» Stadiul 1: ovocită nefertilizată;

» Stadiul 2: 2 la 12 celule;
» Stadiul 3: Morulă timpurie;
» Stadiul 4: Morulă;
» Stadiul 5: Blastocist timpuriu;
» Stadiul 6: Blastocist;
» Stadiul 7: Blastocist expandat;
» Stadiul 8: Blastocist eclozionat;
» Stadiul 9: Blastocist expandat.
– Conform acestor criterii, de calitate, embrionii
se clasifică în (conform IETS):

» Gradul 1: Excelent sau Bun; (conservabili)

» Gradul 2: Acceptabil;
» Gradul 3: Slab;
» Gradul 4: Mort sau degenerat.
embrioni la microscop
morfologia EMB degeneraţi
Aspirarea embrionilor in paieta
Sexarea şi/sau crioconservarea
embrionilor
secţionarea blastocistului prin micromanipulare
 ALEGEREA FEMELELOR RECEPTOARE DE
EMBRIONI

Criterii de selecție

- starea generală de sănătate,

- integritatea funcţională a organelor genitale,

- activitatea ciclica a ovarelor şi a căilor genitale.

 Selecţia şi pregătirea receptoarelor
• vaci sănătoase dpdv reproductiv;
• fătări eutocice în antecedente;
• instinct matern dezvoltat;
• se preferă vițele
• scorul de masă corporală 3-4
pentru vaci de lapte, 6 pentru cele
de carne;
• sincronizarea estrului:
– PGF2alfa; GnRH
– Progesteron; PMSG
Ex: Ovsynch (GnRH+PGF2α)
• consecutiv estrului natural,
corespunzător cu vârsta
embrionului
INDUCEREA ŞI SINCRONIZAREA
ESTRUSULUI LA
 SINCRONIZAREA ESTRULUI CU GESTAGENI

administrarea de steroizi cu efect gestagen care inhibă estrul şi

ovulaţia, realizând o blocadă a secreţiei de hormoni hipofizari
(feed-back negativ – efect Rebound).

tratamentul are o durată de 11-14 zile, iar rezultatele cele mai

bune se obţin atunci când se administrează un estrogen la
începutul tratamentului, având ca rezultat sensibilizarea
receptorilor hormonali din axa Hipotal- Hipof – Ovarr./ regresia
timpurie a corpului galben.

durata tratamentului poate fi scurtată (7-9 zile) prin

administrarea unei doze de prostaglandină la sfârşitul acestuia.
Preparate utilizate:
Progesteron;
Gestageni sintetici:
CAP – chlormadinon acetat;
MAP – Medroxiprogesteron acetat;
Melengestrol acetat;
Norgestomet.

Căi de administrare:
Parenteral sub formă injectabilă;
Intravaginal – spirale, bureţi, etc.;
Subcutanat – implante.
 tratamentul cu produse injectabile- dezavantaj- adm.
zilnică

tratamentul intravaginal, cu ajutorul spiralelor –

CIDR/PRID (progesteron releasing intravaginal
device);

cauciuc siliconat -1,5 g progesteron (se eliberează aprox.

60 mg/zi),

uneori la capătul cranial prezintă o capsulă ce conţine 10

mg benzoat de estradiol. !!(interzis in UE)

-speculum tubular, Spirală intravaginală

CIDR
-căldurile apar la 30-40 de ore de la suprimarea
tratamentului.

IA la 56 h de la scoaterea spiralei.
 Metoda cu Norgestomet implant (CRESTAR)
• implant subcutanat, la baza urechii, cu un gestagen
sintetic – norgestomet - eliberarea zilnică a dozei
necesare menţinerii progesteronemiei

• Protocolul administrării

• Inj. 5 mg valerianat de estradiol şi 3 mg Norgestomet i.m

• Se tin in situ - 9 zile după care se extrage;

• se efectuează IA la 56 şi 72 ore;

• se poate administra PMSG 400-700 UI.

Norgestomet ear implant protocol of estrus

synchronization .
 SINCRONIZAREA CĂLDURILOR CU
PROSTAGLANDINE
Prostaglandinele- luteolitic –

căldurile apar la 48-72 h

Inovulare la 7 ziele de la aparitia ovulatiei

- călduri silențioase - supraveghere atentă pentru deterimnarea

momentului optim pt. IA

Produse utilizate:

PGF2alfa naturală – Dinoprost, Lutalyse.

Analogi sintetici:

Cloprostenol (Estrumate);

Luprostiol (Prosolvin); Fluprostenol (Equimate); Prostianol

 SINCRONIZAREA ESTRULUI CU AJUTORUL UNEI
ASOCIERI DE GESTAGENI si PROSTAGLANDINE

administrarea gestageni- inhibiţia apariţiei estrului şi ovulaţiei la vacile

aflate în faza foliculară a ciclului;

dezvoltarea CL mai recenţi de 5 zile până la stadiul în care

reacţionează la PG;

administrarea PG va provoca luteoliza la vacile cu CL funcţional

la 2-4 zile după terminarea tratamentului, vacile vor intra în călduri.

 La 7 zile

dupa estru
(17-a zi a
protocolului

Time for ET
 ESTRU
Cu 2 zile inainte de
P4 spirale intravaginale
indepartarea spiralelor
12– 48 ore
PG
9 – 14 zile
E. T.

În ziua ET
indepartarii
spiralelor
La 6 -7
PMSG zile de la
Estru
5 - zile - Progesteron inj., i.m. doza – 100 mg.
a 6 – a zi, PG F2α inj., i.m. doza – 2 ml.
a 7 – a zi, PMSG inj., i.m. doza – 1000 U.I.
a 8 -9 a zi ESTRU

a 15 –a zi ET
• Schema terapeutică utilizată pentru
sincronizarea estrului la capre în sezon
 donatoare potrivită

reuşita embrio-
transferului

număr suficient de receptoare

pregătirea şi colectarea
supraovularea embrionilor
femelei donatoare
recuperarea
embrionilor

pregătirea
receptoarelor transferul
 Schema A
Femela donatoare
Estrul Recuperarea
depistat PMSG PG IA embrionilor

Ziua
0 9 11 13 14 20

Femela receptoare Transferul

PG 1 PG 2 ESTRU embrionului

Ziua
0 10 12 13 14 20
 Schema B
Femela donatoare
Recuperarea
PG1 PG2 PMSG PG3 IA IA embrionilor

Ziua
0 11 23 25 27 28 34

Femela receptoare
Transferul
embrionului
PG1 PG2 PG3 E S T R U

Ziua
0 13 24 26 27 28 34
 Transferul propriu-zis la receptoare
• Încărcarea embrionului într-o paietă de 0,25 ml;
• Pistolet tip Cassou;
• Depunerea embrionului pe cornul corespunzător CG;
• Rata de gestaţie după ET: 28-63%
 Menţionăm că această tehnică necesită pe lângă
operatorul calificat, special pregătit pentru efectuarea acestei
tehnici, şi prezenţa unui ajutor care să acţioneze tija pistoletului.
 2. Tehnica cu inovulatorul tip MT
Acest inovulator are o construcţie mult mai simplă, fiind foarte
asemănător cu un pistolet de însămînţare artificială, alcătuit dintr-o
tija, in interiorul căreia se găseşte un mandren. Prezintă de asemenea
un vârf demontabil şi prezintă un orificiu lateral pentru depunerea
embrionului. Paieta se introduce fie prin demontarea vârfului, fie prin
adaptarea la tijă
 Această tehnică este superioară celei cu inovulatorul
tip Cassou, deoarece :

nu este nevoie de prezenţa ajutorului, şi chiar mai mult, manopera poate

fi executată cu uşurinţă de către medicul veterinar cu minime cunoştinţe
de însămânţare artificială;

nu necesită fonduri suplimentare pentru achiziţionarea ghenelor;

nu există riscul ca ghena să rămână în lumenul uterin;

dispare riscul refulării materialului în interiorul ghenei.

 Factorii care pot afecta transferul nechirurgical al
embrionilor pot fi reprezentaţi de :

calitatea embrionului;

mediul uterin al receptoarei;

sincronizarea estrului dintre donatoare şi receptoare;

prevenirea infecţiilor;

situsul de transfer;

tehnica de transfer şi priceperea operatorului;

calitatea receptoarelor;

statusul nutritiv al receptoarelor.

Material transferat – EMBRION
❖ in vivo (spălarea coarnelor uterine)
❖ in vitro - IVF

A. Blastocist eclozat cod 1.8.

B . Blastocist cod: 1. 6.
Cod 1.7 Cod 1.5

Cod 1.8
 TRANSFERUL DE EMBRIONI

DIRECT (DT) / FL / IN VIVO

Dupa provenienta EMB

FIV / IN VITRO

Sincronizare
intre vârsta
EMB
IMPORT DE EMBRIONI
si cea a
uterului
ET la Bivolite
ET rumegatoare mici
Metoda nechirurgicala
ET rumegatoare mici
Metoda chirurgicala