TEHNOLOGIA TRANSFERULUI

DE EMBRIONI LA VAC

CUPRINS
BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE................................1
1.1. Importana transferului de embrioni.............................................................................1
1.1.1. Importana zooeconomic....................................................................................1
1.1.2. Importana tiinific............................................................................................2
BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA VAC........................................3
2.1. Selecia i pregtirea vacilor donatoare........................................................................4
2.2. Selecia i pregtirea vacilor primitoare (receptoare)..................................................4
2.3. Sincronizarea estrului i ovulaiei la vacile donatoare i primitoare............................4
2.4. Inducerea poliovulaiei i nsmnarea artificial a vacilor donatoare.......................5
2.5. Scheme de tratament pentru inducerea poliovulaiei...................................................6
2.6. Fecundarea ovocitelor..................................................................................................9
2.7. Recoltarea embrionilor.................................................................................................9
2.8. Cutarea i aprecierea calitii embrionilor................................................................12
2.9. Conservarea i deconservarea embrionilor................................................................14
2.10.
Decongelarea embrionilor i nlturarea crioprotectorului.....................................15
2.11.
Transferul embrionilor............................................................................................16
BIBLIOGRAFIE.......................................................................................................................18

BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE

1.1. Importana transferului de embrioni

Importana transferului de embrioni poate fi zooeconomic i tiinific.
Importana zooeconomic.

Lucrrile de selecie i ameliorare a efectivelor de animale sunt limitate de numrul

redus de produi care se obin de la o femel n cursul vieii sexuale i de intervalul dintre
generaii. Transferul de embrioni d posibilitatea folosirii cu eficien crescut a rezervelor de
ovocite de la animalele de nalt valoare zootehnic numite donatoare, prin provocarea
maturrii i eliberrii mai multor gamei femeli (poliovulaie) cu obinerea unui numr mai
mare de produi de la aceeai femel prin transferul embrionilor n uterul femelelor
receptoare. Astfel, n decursul vieii sexuale este valorificat doar o infim parte din rezerva
de ovocite cu care femela ajunge la maturitatea sexual.
De exemplu, vaca ncepe perioada genital cu o rezerv de circa 150000 de ovocite
( n ambele ovare), rezerv care diminu la circa 21000 la vrsta de 2-3 ani i la circa 2500 la
12-14 ani. Numrul de ovocite eliberate n ntreaga via sexual nu depete 50, din care n
condiii normale rezult maxim 10-12 viei. Prin asigurarea numrului corespunztor de

animale primitoare, de la vacile donatoare se pot obine, n medie 3-4 viei pe an, fiind
cunoscute cazuri cnd n condiii de supraovulaie, de la o vac donatoare s-au obinut 30-35
viei. Transferul de embrioni se practic i pentru scurtarea intervalului dintre generaii. Prin
instalarea gestaiei, femela intr n repaus productiv (sub raportul procreerii) pe ntreaga
durat a gestaiei. n cazul practicrii transferului de embrioni, produii de concepie sunt
transferai n alte organisme, ceea ce d posibilitatea obinerii de noi produi de la aceeai
femel n intervalul de timp n care n mod normal, ar fi trebuit s fie gestant.
Mai mult, n prezent se pot obine gamei i de la tineretul femel prepuber prin
provocarea prin mijloace hormonale a maturrii i expulzrii ovocitelor, care vor fi apoi
transferate n uterul femelelor receptoare. Scurtndu-se mult intervalul dintre generaii, se
accelereaz ameliorarea efectivelor de animale. Transferul de embrioni reduce considerabil
costurile de transport, carantin i eventualele restricii sanitar-veterinare n comerul cu
animale, prin conservarea prin congelare a embrionilor. Totodat, prin practicarea transferului
de embrioni, se pot obine produi de la femelele valoroase dar cu diverse afeciuni genitale
incompatibile cu meninerea gestaiei sau cu parturiia. De asemenea, prin transferul de
embrioni se reduce intervalul de timp necesar crerii de noi rase de animale cu nsuiri morfoproductive performante care pot forma linii de femele consangvine n vederea folosirii lor la
ncruciri industriale.
n sintez, n practica de producie, transferul de embrioni se aplic pentru rezolvarea
urmtoarelor probleme:
- reproducerea accelerat a animalelor de prsil, de calitate superioar, a raselor rare,
a animalelor din rezerva genetic a purttoarelor unor nsuiri valoroase (producii ridicate,
capacitate de utilizare intens a furajelor, prolificitate mare, longevitate productiv, rezisten
la anumii factori nefavorabili etc.);
- obinerea unui numr mare de descendeni de la femelele cu producii ridicate i cu
durat prelungit de exploatare, n vederea crerii de familii cu aceste nsuiri;
- raionalizarea importului i exportului animalelor valoroase, ca urmare a
transportului embrionilor congelai, nlturndu-se astfel barierele sanitarveterinare i
nlesnirea aclimatizrii materialului importat, dezvoltarea lui embrionar avnd loc n
organismul primitoarelor;
- obinerea de embrioni liberi de leucoz cu posibilitatea transferului acestora
femelelor leuco-negative;
- crearea unor bnci de embrioni n vederea pstrrii raionale a rezervelor genetice,
ceea ce este mai economic dect ntreinerea unor efective numeroase din rezerva genetic.
Importana tiinific

Transferul de embrioni reprezint o biotehnologie prin intermediul creia se poate

efectua, n condiii optime, un aprofundat studiu tiinific al proceselor intime legate de
fecundaie i de influenele matern i patern asupra produsului de concepie. Totodat, poate
fi studiat dezvoltarea embrionar la animale, diversele abateri de la dezvoltarea normal,
cauzele i factorii care genereaz mortalitatea embrionar.
Produii obinui prin transferul de embrioni permit studierea influenelor factorilor
genetici i ai mediului extern asupra dezvoltrii embrionilor, ereditatea grupelor sanguine,
obinerea de animale mozaic de gene, a concentrrii mai multor caractere pe acelai individ,
a instituirii unei profilaxii i terapeutici genetice pentru unele boli de metabolism. Pe aceeai
linie, transferul de embrioni reprezint baza unei noi generaii de biotehnici care deriv din
aceasta sau i sunt asociate: bisecia embrionilor, sexajul, fecundaia in vitro clonarea,
transferul de gene, iar ingineria genetic folosete ca verig important, n metodologie,
aceast biotehnologie.

Micromanipularea i microchirurgia ovocitelor i a embrionilor permit desfurarea

unei cercetri tiinifice interesante, i obinerea din punct de vedere practic a unor nalte
performane n reuita transferului de embrioni, prin transferul jumtilor de embrioni.
Sexul embrionului poate fi precizat cu mult acuratee, baza investigaiei fiind dat de
transferul embrionilor. Reproducerea, fr contribuia genetic a partenerului, se poate realiza
prin ginogenez, fiind deja obinui primii oareci homozigoi, (Groza I., 1996). Aspecte
similare ridic androgeneza n care se poate induce bispermia, adic ptrunderea n ovul a doi
spermatozoizi, cu retragerea ulterioar a pronucleului femel i n consecin diviziunea va
continua numai n zona masculin (Groza I., 1996).

BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA VAC

La bovine, transferul de embrioni a devenit o biotehnologie de reproducie larg

rspndit n lume. Tehnicile de lucru sunt foarte bine stpnite, astfel nct aceast modern
biotehnologie poate fi extins la aproape toate fermele de creterea vacilor din lume. Astfel, n
Europa se obin anual circa 100000 de produi prin transfer de embrioni, iar pe plan mondial
circa 300000 de produi, extinderea biotehnologiei fiind limitat de costurile destul de
ridicate. Transferul de embrioni constituie, totodat, baza unei noi generaii de biotehnici, care
deriv din aceasta sau i sunt asociate, cum ar fi: bisecia embrionilor, sexajul, fecundaia ,,in
vitro, clonarea, transferul de gene.
Transferul de embrioni presupune parcurgerea urmtoarelor etape (fig. 1): selecia i
pregtirea vacilor donatoare; selecia i pregtirea vacilor primitoare (receptoare);
sincronizarea estrului i ovulaiei la vacile donatoare i primitoare; inducerea poliovulaiei i
nsmnarea artificial a vacilor donatoare; recoltarea embrionilor; conservarea embrionilor;
transferul embrionilor.

Fig. 10 Schema transferului de embrioni la animale

2.1. Selecia i pregtirea vacilor donatoare

Vacile donatoare de embrioni trebuie s ntruneasc la cel mai nalt nivel caracterele
zootehnice care intereseaz. De aceea, cnd se face selecia donatoarelor, se are n vedere
evaluarea urmtoarelor criterii: performana reproductiv, superioritatea genetic i valoarea
produsului obinut prin transfer embrionar.
Vaca donatoare va fi mai performant reproductiv atunci cnd vrsta se situeaz ntre 3
i 10 ani, a nscut anual cte un viel, a rmas gestant n maxim dou cicluri sexuale,
ciclurile de clduri au o succesiune fiziologic i nu a avut antecedente ginecologice (distocii,
retenii placentare, infecii genitale etc.).
Practic, criteriile care se au n vedere sunt: o stare ginecologic perfect, intervalul
dintre parturiie i primul estru s fie mai mic de 60 de zile, intervalul parturiie nsmnarea
fecund s fie mai redus de 80 zile iar indicele de gestaie s fie mai mic de 1,5.
Superioritatea genetic const ntr-un ritm superior de cretere, nainte i dup
nrcare i un randament ridicat la sacrificare. n cazul vacilor de lapte, nsuirile cu
heritabilitate ridicat se refer la producia de lapte, procentul de grsime din lapte i
conformaia corporal.

Vacile donatoare trebuie s fie sntoase, ele suportnd mai multe intervenii de
supraovulare i recoltare de embrioni. O atenie deosebit trebuie s se acorde alimentaiei
raionale a acestei categorii de vaci.
2.2. Selecia i pregtirea vacilor primitoare (receptoare)
Vacile receptoare de embrioni trebuie s fie sntoase, fr afeciuni ginecologice, s
aib aceeai talie cu donatoarele, s fie apte s nasc descendeni cu aceeai greutate la
natere ca donatoarele, avndu-se n vedere c gestaia constituie un fenomen morfofiziologic complex ce presupune eforturi suplimentare deosebite din partea organismului
matern. Cele mai bune rezultate se obin atunci cnd transferul de embrioni se face la tineretul
femel n vrst de 18-20 de luni.
2.3. Sincronizarea estrului i ovulaiei la vacile donatoare i primitoare
Sincronizarea ciclului sexual la vacile donatoare i receptoare de embrioni se poate
realiza pe cale natural sau medicamentoas. n cazul sincronizrii femelelor prin mijloace
naturale se urmresc, n lotul receptoarelor femelele care n mod spontan manifest estrul n
acelai timp cu donatoarele. Principalul dezavantaj const n fapul c sunt necesare multe
animale receptoare n ateptare. Aceast modalitate de sincronizare s-a practicat n perioada
de nceput a transferului de embrioni, cnd s-au folosit pentru transfer embrionii proaspt
recoltai. n aceast situaie, n aceeai unitate trebuia s fie i vaci donatoare i receptoare, iar
transferul embrionilor trebuia s se realizeze ntrun timp relativ scurt (4-6 ore de la recoltare).
Sincronizarea estrului prin mijloace medicamentoase se bazeaz pe faptul c se
urmresc succesiv dou-trei cicluri de clduri la vacile donatoare i se stabilete durata
ciclului. n acest fel se poate calcula data apariiei ciclului care intereseaz n transferul de
embrioni. n funcie de data previzibil, se acioneaz prin tratamente hormonale asupra unui
grup de femele primitoare n vederea inducerii cldurilor, sincronizate cu cldurile naturale
ale donatoarei. n acest caz se acioneaz asupra donatoarei numai n ceea ce privete
inducerea poliovulaiei. Sincronizarea medicamentoas a ciclului estral al femelelor donatoare
i receptoare de embrioni se realizeaz pe dou ci: blocarea eliberrii hormonilor
gonadotropi sau prin inducerea luteolizei.
Prima cale presupune folosirea progesteronului, sau a progestinelor sintetice care prin
retroaciune i exercit efectul negativ asupra hipotalamusului, diminund nivelul hormonilor
gonadotropi. (Vezi capitolul Sincronizarea estrului).
2.4. Inducerea poliovulaiei i nsmnarea artificial a vacilor donatoare
Provocarea eliberrii concomitente la aceeai perioad de clduri a unui numr sporit
de ovocite dect cel caracteristic speciei se numete poliovulaie (supraovulaie,
superovulaie) si este asigurata prin multiple scheme de tratament.
Tratamentele actuale aplicabile in vitro se sprijin pe cunoaterea mecanismelor
foliculogenezei, a efectului tonic al hormonilor gonadotropi (FSH, LH) care intervin
ndeosebi n ultima faz a creterii i maturrii foliculare.
Potenialul ovarian de foliculi teriari (cu antrum) rmne relativ constant (ns
variabil cu individul) de la vrsta de dou luni pn la 12 ani (Nibart M., 1991). Fiziologic, la
vac, un singur folicul ajunge la maturitate n preajma ovulaiei, n timp ce, n timpul unui
ciclu sexual, 10-20 de foliculi degenereaz. Injecia unui hormon cu activitate de FSH
mpiedic atrezia unor foliculi i stimuleaz dezvoltarea i maturarea simultan a mai multor
foliculi teriari, n cursul aceluiai ciclu estral.
n prezent, dou scheme clasice de tratament poliovulator sunt aplicate, ambele bazate
pe efectul foliculo stimulant al hormonilor gonadotropi: serul gonadotrop de iap gestant,
liofilizat i standardizat - PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) denumit i Ecvin

Chorionic Gonadotropin (ECG), produs de celulele corionice ale iepei gestante si hormonul
de stimulare folicular (FSH) extras din hipofiza anterioar.
PMSG se extrage din serul sanguin al iepei gestante i are o dubl activitate: de tip
FSH i LH, raportul FSH/LH variaz de la 1/1 la 1/5 (Saumande J., 1987). Perioada de
njumtire destul de lung - 120 ore - a acestui hormone determin o uurin n folosire, o
singur injecie de 2000-2500 U.I. i.m. fiind eficient n provocarea poliovulaiei. La doutrei zile de la injectarea PMSG se administreaz i.m. o doz de 500-750 g prostaglandin
F2, cldurile aprnd la circa 48-60 de ore de la injectarea prostaglandinei. Folosirea PMSG
antreneaz i unele efecte negative traduse prin creterea folicular i secreia ridicat de
estradiol i dup descrcarea preovulatorie de LH. Acest efect negativ poate fi contracarat prin
injectarea i.v. a unui anticorp anti PMSG concomitent cu prima sau cea de a doua nsmnare
artificial (de ex. Neutra -PMSG intervet).
Fecundarea ovocitelor se face, de regul, prin nsmnarea artificial a vacilor la un
interval de 12 ore de la nceputul estrului cu repetare la 8-12 ore interval.
FSH se prepar din extractele purificate parial, provenite din hipofiza mamiferelor n principal de suine - care conine FSH i LH. Coninutul n cei doi hormoni i raportul dintre
acetia variaz cu lotul. Perioada de njumtire foarte scurt (circa 70 minute a acestui
hormon necesit injectarea lui bicotidian timp de 4 zile, n vederea meninerii unui nivel
sanguin suficient de ridicat. Funcie de preparatul comercial, raportul dintre FSH i LH, de
regul variaz de la 1 la 0,5.
Dozele totale care se administreaz, n vederea producerii poliovulaiei, variaz de la
28 mg la vielele de lapte, la 40 mg pentru vaci, injeciile fcndu-se n ritm descresctor,
intramuscular sau subcutanat. Preparatele care conin aceti hormoni au denumiri care difer
cu unitatea productoare: FSH-p, Stimufol, Ovaset, Follitropin, Superov, Ovagen, Pluset etc.
Ca i cealalt schem de tratament, injectarea prostaglandinei F2, n doz de 500-750
g se face la 48-72 de ore de la nceperea tratamentului, estrul aprnd la circa 50-60 ore de
la injectarea prostaglandinei. Fecundarea ovocitelor se face prin nsmnarea artificial a
femelelor supraovulate de dou ori, la 12 i 24 ore de la apariia estrului.
2.5. Scheme de tratament pentru inducerea poliovulaiei
Preparatele medicamentoase care conin hormoni gonadotropi sunt injectate n faza
luteal a unui ciclu natural sau indus, cel mai frecvent ntre ziua a 9-a i a 13-a. Dou zile
dup injecia de PMSG sau concomitent cu a 5-a injecie de FSH, se injecteaz un analog de
PGF2 (de ex. 0,5-1 mg Cloprostenol) care are efect luteolitic permind ovulaiile (fig.2 i
3).

Fig. 2 Scheme de inducere a poliovulaiei la vacile donatoare de

embrioni (dup M. Thibier i M. Nibart, 1991)
O alt schem de tratament const n utilizarea progestinelor pe cale oral, parenteral,
intravaginal sau implant subcutanat timp de 9-12 zile. Progestinele blocheaz axul
hipotalamo-hipofizo-ovarian, prin neeliberarea de FSH dar mai ales de LH. Ct timp
receptorii axului hipotalamo-hipofizar se gsesc sub aciunea temporar a progestinelor,
femela nu va manifesta estru i nici nu va ovula. Dup suprimarea terapiei cu progestine, se
produce o descrcare rapid, compensatoare de Gn-RH, ceea ce va determina, n decurs de 57 zile, intrarea n clduri ovulatorii a femelelor tratate. n cursul unui astfel de tratament de
blocare a ciclului se poate injecta hormonul de stimulare (FSH-p) bicotidian, n ritm
descresctor ncepnd cu a 6-a zi de la blocarea ciclului, concomitent cu o injecie
intramuscular de PGF2.

Fig. 3 Scheme de inducere a poliovulaiei la vacile donatoare de embrioni

(dup I.C.P.C.B. Baloteti)
n cazul ntrebuinrii preparatelor hormonale pe baz de PMSG, acestea se injecteaz,
mpreun cu o doz de prostaglandin F 2, n a 6-a - a 7-a zi de la introducerea implantelor,
pesariilor etc., urmat de injectarea unei doze de anti PMSG concomitent cu a 2-a nsmnare
artificial (fig. 2 i fig. 3).
O schem mai simpl de provocare a poliovulaiei const n nceperea tratamentului cu
hormoni gonadotropi n a 15-a, a 16-a zi a ciclului estral la viele i n a 16-a, a 17-a zi a
ciclului sexual la vaci, ns numrul de embrioni obinui este mult mai redus.
Rezultate bune n provocarea poliovulaiei s-au obinut prin injectarea unei doze de
Gn-RH la vacile poliovulate nainte de prima nsmnare artificial sau concomitent cu
aceasta, n vederea gruprii ovulaiilor.

Prin provocarea poliovulaiei se pot obine de circa 8-10 ori mai muli embrioni, dect
n cazul recuperrii unui singur ou de la femelele nesupuse tratamentului poliovulator (foto 1).

Foto 1 Ovare superovulate

Exist o variaie mare n ceea ce privete rspunsul la tratamentul poliovulator, din
partea vacilor. Aceast variaie pronunat se datoreaz hormonului utilizat, puritii acestuia
i de specificul individual al femelelor. Cercetrile au relevat faptul c circa 10- 20% dintre
vaci nu rspund la tratamentul poliovulator, alte 20-25% rspund slab la un astfelde tratament
(1-3 embrioni transferabili pe vac tratat) i doar 30-40% dintre vaci au un rspuns ideal la
tratamentul de superovulaie furniznd 7-12 embrioni/vac/tratament iar 5-10% dintre
femelele tratate furnizeaz mai mult de 20 de embrioni. n prezent, stimularea ovarian pare a
fi atins un anumit plafon ntruct, se colecteaz, n medie 9-10 embrioni (limite ntre 0-50), iar
cel al embrionilor viabili este de 5-6 (limite ntre 0-30), din care 3 congelabili (Nibart,
Thibier, Chouke 1988).
n ceea ce privete repetarea tratamentelor de superovulaie la aceeai donatoare, s-a
constatat c tratamentele pot fi repetate pe intervalul a mai multor luni sau a mai multor ani.
Producia total de embrioni de la aceeai donatoare depinde de aceasta i de ritmul de
colectare . Este necesar un interval de cel puin 60 de zile dup ftare n vederea nceperii
tratamentului poliovulator. Unii cercettori constat o reducere a numrului de embrioni
transferabili o dat cu repetarea tratamentului cu PMSG, fapt ce se explic prin formarea n
organismul femelei tratate a anticorpilor anti- PMSG i reducerea categoriilor de foliculi
sensibili la stimulare. Pentru a se Evita acest efect negativ, repetarea tratamentului trebuie s
se fac la un interval de 54-60 de zile i s se intercaleze tratamentele pe baz de PMSG i
FSH-p. Rezultatele tratamentelor de superovulare sunt influenate de vrsta femelelor, ras,
mascul, sezon, nivelul produciei de lapte, starea general, etc. De regul, vielele produc un
embrion viabil mai puin dect vacile adulte.

2.6. Fecundarea ovocitelor

Ovocitele sunt fecundate n urma nsmnrii naturale sau artificiale. De regul, se
efectueaz dou nsmnri artificiale la interval de 12-24 de ore de la nceputul cldurilor
observate clinic sau, sistematic, dup 56 i 72 de ore de la injecia cu PGF 2, sau dup 36 i
48 de ore de la retragerea implantelor sau pesariilor.
2.7. Recoltarea embrionilor
Embrionii sunt colectai atunci cnd se gsesc n cornul uterin, dup ieirea lor din
oviduct (ntre zilele 4-5). Din motive sanitare i de congelare se prefer colectarea
embrionilor nc inclui n zona lor pelucid (ies n a 9-a zi). Cel mai frecvent, colectarea se
realizeaz ntre zilele 6-8 dup fecundaie, de regul n ziua a 7-a. Recoltarea embrionilor se
face chirurgical i nechirurgical. Mult timp, metoda chirurgical a fost singura utilizat.
Tehnica operatorie presupunea parcurgerea a dou etape: laparotomia, cu exteriorizarea
aparatului genital n plag i recoltarea propriu-zis a embrionilor prin splarea cu un lichid
cu o compoziie special, a oviductelor (dup un interval de timp mai mic de 3 zile dup
nsmnare) sau a coarnelor uterine (dup un interval de timp mai mare de 4 zile de la
nsmnare). n prezent, metoda chirurgical de recuperare a embrionilor la vac este
abandonat, datorit inconvenientelor pe care le prezint.
Astzi, este generalizat metoda nechirurgical de prelevare a embrionilor, a crei
principiu const n splarea coarnelor uterine cu un mediu special preparat, splare care se
realizeaz n condiii de asepsie n a 7-a zi de la nsmnare. Tehnica nechirurgical de
colectare a embrionilor s-a perfecionat continuu, firme specializate produc pe scar
industrial mediul de recoltare, congelare, decongelare i ntreaga aparatur necesar
recoltrii i transferului embrionilor. Tehnicile nechirurgicale de recoltare a embrionilor
presupun mai multe operaii: contenia femelei, anestezia, vidarea rectului, toaleta vulvei i a
regiunii perivulvare, identificarea prezenei corpilor galbeni pe ovar, introducerea lichidului
de splare n lumenul coarnelor uterine, splarea acestora, recuperarea lichidului mpreun cu
embrionii, identificarea i recuperarea embrionilor din lichidul recuperat i supus decantrii i
aprecierea morfologic a acestora. n condiii de ferm, recoltarea embrionilor se face la locul
unde se gsete femela donatoare,dupa contentia adecvata. Pentru a suprima durerea, se
practic anestezia epidural cu 4-6 ml procain 2% sau cu 10 ml ludocain 1%, care
blocheaz nervii coccidieni i ultimele perechi de nervi sacrali (S 3, S4, S5). Acul se introduce
ntre prima i a doua vertebr coccigian sau ntre ultima vertebra sacral i prima vertebr
coccigian, anestezia instalndu-se dup circa 10-15 minute i dureaz n jur de 90 de minute,
zonele insensibilizate fiind: coada, anusul, rectul, vulva, vaginul i uterul. Se introduce, cu
precauiile de rigoare, mna n rect, acesta se videaz de coninut, apoi se apreciaz rspunsul
femelei la tratamentul poliovulator, palpndu-se cu atenie ambele ovare i numrdu-se
corpii galbeni (foto 19). n cazul n care rspunsul la tratamentul de superovulare este pozitiv,
se procedeaz cu precauie la introducerea cateterului de tip Folley cu dou sau trei ci, prin
conductul cervical pn n cornul uterin. Pentru rigidizarea cateterului, se introduce pe
lumenul acestuia un mandren (tij metalic), care se menine pn se ajunge n lumenul
cornului uterin, apoi se retrage. Cateterul este introdus circa 5-8 cm de la bifurcaia coarnelor
uterine, pe unul dintre acestea, apoi se introduce de la exterior, cu seringa, 8-15 ml de aer n
scopul fixrii cateterului i pentru a mpiedica refularea din cervix a lichidului de splare.
Vasul din sticl, ce conine lichidul de splare se suspend la 1,5 m de la sol i, prin cdere,
acesta ajunge prin calea de admisie a cateterului n coarnele uterine. Irigarea acestora se face
continuu, calea de evacuare a lichidului este conectat, printr-un tub de plastic, la vasul de
colectare a mediului recuperat (de splare). Recuperarea lichidului de splare se face prin
calea de admisie (n cazul cateterului cu dou ci la care s-a adaptat o pies n forma literei y)

prevzut cu canal de admisie i evacuare al lichidului, ramura de evacuare a lichidului fiind

conectat la un filtru de colectare a crui orificii au un diametru de 75 m, care are rolul de
reinere a embrionilor, lichidul ce traverseaz filtrul fiind colectat ntr-un recipient situat sub
filtru.
Mediul folosit la splarea unui corn uterin se folosete la splarea, n acelai mod, a
celui de-al doilea corn uterin. Cantitatea de mediu care se folosete pentru splarea unui corn
uterin este de 300-500 ml, efectunduse irigri repetate i un masaj transrectal permanent al
cornului uterin perfuzat. Exist diverse sonde de recuperare a embrionilor, imaginate de
diveri cercettori, care se bazeaz pe acelai principiu constructiv .
ntre momentul recuperrii embrionilor i cel al inoculri lor n uterul receptoarelor,
zigoii trebuie s fie meninui n via n condiii speciale i s fie manipulai n cele mai bune
condiii tehnice i igienice. n ultimii ani s-a generalizat folosirea unei soluii tampon fosfat PBS (Fosfat bufferet salin) pentru splarea coarnelor uterine i pentru pstrarea embrionilor
recuperai.

Foto 2 Recoltarea embrionilor prin metoda nechirurgical

Acest lichid are un pH de 7,2, o presiune osmotic de 290 miliosmoli i conine multe
sruri minerale, glucoz i protein (albumin bovin seric, 2-4 g/l, sau ser de viel fetal
decomplementat 10%. Toate mediile, soluiile, serurile, enzimele i substanele
crioprotectoare care vin n contact cu embrionii trebuie s fie sterile. Tot materialul care nu se
arunc (sonde colectoare, filtre, recipieni din sticl, sonde de transfer, etc.) care necesit a fi
sterilizate, se spal cu o soluie de detergent netoxic, se cltete n ap distilat, se usuc i se
nvelete n hrtie n vederea sterilizrii. Alegerea metodei de sterilizare depinde de natura
materialului (cldur uscat, cldur umed, substane antiseptice, vapori de formol etc.).
Rezultatele recuperrii embrionilor depind n cea mai mare msur de abilitatea i
antrenamentul operatorului.
Proporia embrionilor recuperai, oscileaz n medie, ntre 60-70% comparativ cu
numrul de corpi galbeni identificai pe ambele ovare. Dup colectarea embrionilor se
injecteaz donatoarei o doz de PGF 2, care are rolul de a liza corpii galbeni, evitndu-se
astfel gestaia multipl.
2.8. Cutarea i aprecierea calitii embrionilor
Dup prelevarea embrionilor, vasul cu lichidul recoltat (100-150 ml) este lsat timp de
20-30 minute pentru decantare. Se ndeprteaz supernatantul iar stratul inferior n care se
regsesc i embrionii recoltai, se transfer ntr-o plac Petri cadrilat cu diametrul de 10 cm,
(foto 20) sau se agit n mediu din filtrul colector i se toarn n placa Petri. Recipientele de
recoltare a mediului ca i filtrul folosit la recuperarea embrionilor se cltesc de dou trei ori.
Examenul embrionilor n lichidul recoltat trebuie s se fac n cele mai bune condiii de
asepsie, curenie i la o temperatur constant a laboratorului 20 o-25o). Embrionii bovinelor
au un diametru de 150-190 microni, zona pelucid avnd o grosime de 12-15 m. Pentru
identificarea embrionilor, se examineaz la o stereolup (grosisment 30-60 uneori 80-200)
fiecare ptrat de la nivelul plcii Petri.
O dat identificai, embrionii sunt transferai cu ajutorul unei seringi de aspirare, la
care s-a adaptat, printr-un tub de plastic, o micropipet, n plci Petri mai mici, cu diametrul
de 5 cm n care se gsete mediul de splare la care s-a adugat 20% albumin seric bovin
(BSA). Operaiunea se repet de 3-5 ori, embrionii fiind transferai dintr-o plcu n alta,
schimbndu-se de fiecare data pipeta de aspirare. n cazul n care embrionii sunt destinai
exportului, acetia sunt trecui prin zece astfel de bi de splare. Amestecul crioprotectorului
cu mediul de conservare (PBS 40% BSA sau 10-20% ser de viel fetal) provoac o cretere
a presiunii osmotice. Pentru a reduce ocul osmotic, embrionii sunt trecui succesiv i pe cte
o durat de 5 - 10 minute n dou-trei bi cu mediu de conservare cu o concentraie crescnd
n crioprotector: glicerol 0,7 M i apoi 1,4 M, DMSO sau etilen glicol 0,5 M, 1,0 M apoi 1,5
M. Aceast trecere a embrionilor n mediul de conservare cu adaos de crioprotector se face la
o temperatur cuprins ntre+20oC i +30oC.
Dup ultima baie, adic n momentul n care este atins concentraia final n
crioprotector (de exemplu: etilen-glicol 1,5 M), embrionii sunt condiionai pentru congelare,
fie n fiole de sticl de 1,2 ml, fie n paiete de polipropilen de 0,25 ml (de tip paiete fine
folosite la conservarea spermei). Paietele sunt identificate individual. Exist bancuri de
identificare ce permit pe de o parte nchiderea ermetic a paietei i care poart (sunt
inscripionate) toate informaiile necesare.
Pentru fiecare paiet trebuie s se menioneze: identificarea donatoarei, rasa, data
colectrii, numrul de embrioni, centrul de producie. Procedura de umplere a paietelor
comport trei compartimente lichide separate de bulele de aer. Aceasta limiteaz orice risc de
pierdere a embrionilor n momentul manipulrilor efectuate cu umplerea sau evacuarea
coninutului paietelor.

Embrionii sunt ncadrai n mai multe categorii calitative: excelent, bun, acceptabil,
inferior, degenerat, ovocit nefecundat. n cursul examenului sub stereolup la un grosisment
mai mic de 80, embrionul este ntors cu ajutorul unei micropipete de sticl n vederea
aprecierii morfologiei sale din toate unghiurile, unele imperfeciuni putnd scpa observaiei
n anumite poziii ale embrionului.
Zona pelucid garanteaz protecia embrionului, motiv pentru care ea trebuie s fie
perfect integr, fr fisuri i perfect sferic. Gradul de dezvoltare embrionar n raport cu ziua
colectrii este principalul factor luat n considerare. Embrionii care prezint o ntrziere n
dezvoltare mai mare de 48 de ore sunt eliminai. Embrionii colectai n a aptea zi de la
debutul estrului trebuie s se gseasc n stadiul de morul compact/blastocist. Embrionii
care conin 16 celule sau mai puin, nu se rein pentru transfer sau congelare, fiind ntr-o
ntrziere mare a dezvoltrii. n stadiul de morul compact, limitele celulare sunt mai puin
distincte ntruct blastomerele sunt strns legate ntre ele i dau un aspect de mure. Prezena
ctorva celule detaate, n spaiul perivitelin nu constituie un motiv de eliminare ntruct
majoritatea blastomerelor formeaz o mas sferic fr opacitate marcant. n stadiul de
blastocist, diversele structuri (blastocel, butonul embrionar, trofoblastul) trebuie s fie vizibile
i s prezinte contururi bine delimitate. Prezena blastomerelor n spaiul perivitelin i a unor
granulaii la suprafaa celulelor pot fi observate. Aceste anomalii asociate unei ntrzieri n
dezvoltare, absenei contururilor celulare sau unei opaciti marcante ale blastomerelor
constituie criteriu de eliminare a embrionilor. Embrionii a cror aspect este ndoielnic sunt
conservai una-dou ore apoi vor fi examinai din nou.
Excelent este considerat embrionul perfect ca aspect morphologic i corespunztor
vrstei (foto 3).

Foto 3 Embrioni buni pentru transfer

Embrionul bun calitativ prezint unele imperfeciuni: zona pelucid oval, dimensiuni
mai mici ale embrionului, ntrziere n dezvoltare cu o zi, puine celule extrudate, mici.
Embrionul acceptabil este cel care este bine conturat, ns prezint unele anormaliti: un
numr moderat de celule excluse, dimensiuni mai mici, unele degenerri i ntrzierea cu o zi.
Embrionul inferior prezint diverse degradri considerabile: celule veziculate, variabilitate

mare n ceea ce privete dimensiunile celulelor, ntrzierea n dezvoltare cu dou zile, absena
compactrii.
Embrionul degenerat prezint degenerri evidente, iar ovocitele nefecundate sunt cele
care prezint structur simpl a gametului femel, fr celulele rezultate din segmentare (Seidel
F.G. i colab.,1991).
2.9. Conservarea i deconservarea embrionilor
Embrionii pot fi conservai cteva ore in vitro la 20 oC ntr-un mediu de conservare:
PBS adiionat cu 4 g/l albumin seric bovin, sau cu 10% ser de viel fetal decomplementat.
n acest mediu, embrionii sunt meninui pn cnd sunt transferai la receptoare. n cazul n
care transferul nu se realizeaz n 6-8 ore de la recoltare, se recomand congelarea prin
refrigerare a embrionilor, la o temperatur de 0o-4oC ntr-un mediu de conservare identic. n
acest fel embrionii pot fi conservai una-dou zile fr ca viabilitatea s fie afectat.
Conservarea de lung durat a embrionilor congelarea - rmne cea mai avantajoas
metod de meninere pentru un interval de timp practic nelimitat a viabilitii embrionilor.
Pentru aceasta, embrionii, trebuie s fie meninui n stare solid, n azot lichid, la temperatura
de circa -196oC. La temperaturi mai sczute de -100oC, metabolismul celular este complet
blocat, singura problem mai dificil constnd n atingerea acestor temperaturi fr a omor
embrionii. n timpul congelrii, intervin doi factori letali pentru embrioni: formarea gheii
intracelulare i concentraia salin ridicat. Pentru a prentmpina efectul negativ al acestor
doi factori, metoda de rcire const n deshidratarea parial a celulelor i evitarea ocului
produs de concentraiile ridicate n sruri prin utilizarea unui Crioprotector, n general glicerol
cu o concentraie de 1,5 M (sau 10% n volum) n mediul de congelare. Ca ageni crioprotectori se mai pot folosi: dimetilsulfoxid (DMSO), etilen-glicol, glicerol, propilen-glicol. n
prezent sunt numeroase aparate programabile (freezere) care permit realizarea unei curbe
optimale de rcire. Substanele crioprotectoare (n general polialcooli) sunt capabile s
ptrund uor n celule printr-o simpl difuziune (osmoz), ntrziind formarea cristalelor de
ghea prin coborrea punctului de nghe. Totodat, substanele crioprotectoare limiteaz
efectele negative ale concentraiei saline ridicate, nlocuind o parte din apa intracelular atras
prin creterea presiunii osmotice extracelulare. Ali compui pot avea un rol protector fa de
membranele celulare (hidrai de carbon, polivinilpirolidon), (Baril i colab., 1993).
Viteza de coborre a temperaturii are importan mare n protejarea viabilitii
embrionilor. Mediul care conine embrionii (extracelular) este mai bogat n ap dect mediul
celular. Prin coborrea temperaturii, primele cristale de ghea se produc mai nti n mediul
extracelular, ceea ce va antrena o ridicare a concentraiei n soluie a fraciunii necristalizate.
Aceast concentraie salin ridicat va provoca ieirea unei pri din apa celular, reducnd n
acest fel formarea gheii intracelulare. Dac ritmul de rcire este prea rapid, apa intracelular
nu poate iei n cantitate suficient, cristalele de ghea se formeaz n cantitate mare n
interiorul celulelor i aceste cristale i mresc talia lor n timpul congelrii i decongelrii
distrugnd structurile celulare. n cazul n care ritmul de rcire este lent, deshidratarea
progresiv a celulelor antreneaz o cretere important a concentraiei n electrolii, n mediul
celular, modificnd proprietile fizico-chimice (efectul soluiei), consecina fiind totdeauna
pierderea viabilitii celulelor.
Astfel, integritatea celulelor vii dup congelare este strns legat de dinamica apei
intracelulare n timpul rcirii i deci de viteza de congelare. n cazul embrionilor, ritmul de
rcire trebuie s corespund pentru toate tipurile de cellule care-l compun. Rezultatele
cercetrilor ntreprinse pentru clarificarea aspectelor referitoare la ritmul de congelare
confirm faptul c acesta trebuie s se desfoare n dou etape diferite: o congelare lent, n
dou trepte: la nceput 4oC/min pn la 6 7oC i 0,3-0,6oC/min ntre 7oC i 30 35oC,
apoi o congelare rapid (brusc) de la -35oC pn la temperatura de pstrare -196oC.

Timpul de ateptare al embrionilor din momentul recoltrii i pn la nceperea

congelrii, nu trebuie s depeasc dou-trei ore. Protocolul de congelare a embrionilor
bovini prevede urmtoarele:
alegerea embrionilor
calitate excelent sau bun;
timp de la recoltare pn la nceperea congelrii: dou-trei ore;
introducerea embrionilor n mediul de congelare la temperature laboratorului
(20oC);
introducerea embrionilor n paiete identificate (mediu, bul de aer, embrioni
+mediu, bul de aer, mediu);
rcirea pn la -6oC sau -7oC cu o vitez de 4oC/minut;
inducerea cristalizrii (palier 5-10 minute);
rcirea pn la 30oC sau 35oC cu o vitez de 0,3 - 0,6oC/minut;
introducerea paietelor ce conin embrionii, direct n azot lichid i stocarea lor (196oC).
Paietele se vor pstra n permanen n azot lichid pn n momentul transferului la
femelele receptoare. Durata stocrii embrionilor n azot lichid nu influeneaz supravieuirea
ulterioar a acestora.
2.10.

Decongelarea embrionilor i nlturarea crioprotectorului

Embrionii congelai la -35oC nu sunt dect parial deshidratai, o anumit cantitate de
ghea se formeaz inevitabil n celule, n momentul imersiei n azot lichid (-196 oC). Pentru a
se evita ca prin decongelare s se produc o cretere a acestor mici cristale de ghea care s
distrug celulele, decongelarea trebuie s se fac n timp, ct mai repede posibil (circa
2000oC/minut). Pentru aceasta, paietele se scot repede din containerul cu azot lichid i se
introduc direct ntr-o baie de ap la 37 oC, unde se menin circa 30 de secunde. Imediat dup
decongelare, nlturarea rapid a crioprotectorului este indispensabil supravieuirii
embrionilor. Totui, celulele care conin o concentraie ridicat de crioprotector nu trebuie s
fie introduse direct ntr-un mediu izotonic, ntruct diferena mare de presiune osmotic va
provoca ptrunderea prea rapid a apei n celul, ceea ce va risca s explodeze. De aceea, este
necesar o ndeprtare progresiv a crioprotectorului astfel nct ieirea acestuia i
ptrunderea apei n celul s fie compatibile cu permeabilitatea membranei celulare.
Pentru aceasta sunt mai multe metode care realizeaz o rehidratare lent a celulelor
embrionare.
Diluia crioprotectorului pe etape const n trecerea succesiv a embrionilor prin bi
cu concentraii descrescnde n crioprotector (de ex: etilen glicol 1,5 M, apoi 1,0 M, 0,5 M i
0 M). Meninerea embrionilor n fiecare baie este de 5-10 minute. n acest caz concentraia
mediului n crioprotector este invers celei din perioada congelrii. Dup nlturarea
lichidului de rcire, calitatea embrionilor poate fi apreciat printr-un examen morfologic
efectuat cu ajutorul unei stereolupe (grosisment x80). n urma examenului morfologic, de
regul sunt eliminai ca necorespunztori calitativ, 10-30% dintre embrionii decongelai.
Diluia crioprotectorului prin folosirea unui mediu care conine sucroz are la baz
accelerarea ieirii acestuia din celule. Molecula de sucroz avnd o greutate molecular mare
(344) nu ptrunde n celule prin simpl difuziune; prezena sa n mediu creaz o mrire a
presiunii osmotice din mediul extracelular, ceea ce va determina o difuziune accelerat a
crioprotectorului din celule. Pentru aceasta, embrionii decongelai sunt introdui direct ntr-o
soluie de PBS care conine 0,25-0,5 M sucroz, apoi n dou-trei bi succesive de PBS
nainte de examinare i transfer. Se poate realiza retragerea crioprotectorului prin intermediul

sucrozei, direct n interiorul paietei. Pentru aceasta, n momentul introducerii embrionilor n

paiete pentru congelare, alternana diverselor medii din paiet este: la mijloc embrionul n
mediu PBS+ etilenglicol 1,5 M, nconjurat de bule de aer i apoi la exterior PBS+sucroz 0,25
M. Dup decongelare paieta se scutur n vederea amestecrii mediilor pe baz de etilen
glicol i cele pe baz de manoz, ceea ce va permite difuzia crioprotectorului n afara celulei
n cteva minute. Embrionii sunt transferai fr selecie prealabil, mpreun cu coninutul
paietei direct n uterul femelelor receptoare. Aceast metod mai necesit unele verificri.
Nivelul supravieuirii embrionilor dup decongelare este condiionat de mai muli
factori: stadiul de dezvoltare a embrionilor, calitatea embrionilor nainte de congelare, femela
donatoare etc. Embrionii transferai n stadiul de morul realizeaz o proporie de
supravieuire in vitro mai redus (64%), comparativ cu cei transferai n stadiul de blastocist
(81%), (Martinez i colab., 1985). Congelarea nu trebuie aplicat dect embrionilor de bun
calitate, caz n care procentul de supravieuire dup transfer fiind uor inferior (10%) fa de
nivelul supravieuirii obinut dup transfer direct, fr congelare.
Originea genetic a donatoarei pare a avea un rol nsemnat asupra aptitudinii
embrionului de a fi congelat. Acelai efect denumit i efectul donatoarei a fost demonstrat
prin faptul c procentul de supravieuire a embrionilor congelai n aceleai condiii poate
varia de la 0 la 78% n raport cu donatoarea.
2.11.

Transferul embrionilor
O atenie deosebit va fi acordat seleciei femelelor receptoare, ntruct condiioneaz
n mare parte rezultatele dup transfer. Aa cum s-a menionat n capitolul anterior,
receptoarele trebuie s aib o activitate sexual ciclic, s fie bine dezvoltate corporal, fr
afeciuni ale tractusului genital. Alegerea receptoarelor poate porni de la viele n vrst de 18
luni cu condiia atingerii a cel puin 2/3 din greutatea corporal a adultului. Transferul
embrionilor se face cu foarte bune rezultate i la vaci adulte n vrst de 3-6 ani dac funcia
de reproducie s-a desfurat normal.
Examenul femelelor receptoare se completeaz cu aprecierea ultimului estru, care
trebuie s aib loc ntre parametrii fiziologici (comportament sexual, calitatea mucusului
cervical, starea de sntate a conductului vestibulo-vaginal i al orificiului vaginal al
cervixului).
Pregtirea receptoarelor const ntr-o sincronizare ct mai perfect a ciclului sexual
cu cel al femelei donatoare. Se pot folosi femele receptoare, fie n clduri naturale fie n
clduri induse printr-un tratament de control al ciclurilor sexuale (vezi cele menionate
anterior). O atenie special se va acorda depistrii ciclurilor (dimineaa, prnz, seara) apoi se
determin momentul exact al nceputului estrului. naintea transferului propriu-zis se face un
examen transrectal al ovarelor pentru a identifica corpul galben pe unul din ovare. Transferul
embrionului se va face n vrful cornului uterin adiacent ovarului pe suprafaa cruia este
prezent corpul galben. Rezultate bune s-au obinut i prin depunerea embrionului la circa 10
cm de la bifurcaia coarnelor uterine n lumenul cornului uterin ipsilateral ovarului cu corp
galben. nainte i imediat dup transfer se va evita orice stres: vaccinri, tratamente
antiparazitare, ecornri, lotizri, tuberculinri, recoltri de snge etc. Se va evita schimbarea
brusc a regimului alimentar: de exemplu introducerea masei verzi primvara 4 sptmni
dup transfer. Variaiile climatice determin o cretere a mortalitii embrionilor dup transfer.
n cazul folosirii embrionilor proaspei, receptoarele se in ntr-un grajd curat i ct mai
aproape de donatoare. Transferul propriu-zis al embrionilor la femelele receptoare se
realizeaz prin dou metode: chirurgical i nechirurgical.
Transferul chirurgical s-a aplicat n perioada de nceput i a constat n deschiderea
cavitii abdominale (pe linia alb sau n flanc), exteriorizarea cornului uterin i depunerea
embrionului pe cornul uterin corespunztor ovarului cu corp galben prin puncionarea

peretelui acestuia. Este o metod laborioas, costisitoare, traumatizant pentru femele, ceea ce
a condus la abandonarea ei. Metoda actual care d cele mai concludente rezultate este cea
nechirurgical. Aceast metod folosete calea vagin-cervix, asemntor nsmnrii
artificiale. Pentru transfer se folosete un pistolet tip Cassou n care se introduce paieta cu
embrionul deconservat sau proaspt recoltat. Pentru a se evita contaminarea nveliului din
material plastic al pistoletului Cassou pe timpul traversrii conductului vestibulo-vaginal, se
fixeaz un al doilea nveli din material plastic care este secionat pe toat lungimea sa. Dup
ce pistoletul ajunge n lumenul cervical, acest nveli protector se retrage. Pentru a nvinge
rezisteana cervixului (n aceast faz cervixul fiind nchis) se folosesc uneori dilatatoare. La
circa 10 cm de bifurcaie, pe cornul uterin corespunztor ovarului ce conine corpul galben, se
depune embrionul, asemntor nsmnrii artificiale. Aceast metod este exclusiv folosit
n present. Traversarea cervixului trebuie s se realizeze cu mare precauie n vederea evitrii
lezionrii mucoasei acestuia. n vederea relaxrii cervixului, a evitrii contraciilor organelor
genitale se efectueaz anestezia epidural cu 4-6 ml procain 2%, sau alte preparate
medicamentoase cu efect similar.

BIBLIOGRAFIE

1. Aughtry, S.D., 1987 - Embryo Transfer, 2, 3, p 3-4

2. Baril, G. i colab., 1993 - Manuel de formation pour l'insmination artificielle ches les ovins
et les caprins. Etude FAO, Roma.
3. Baril, G. i colab, 1993 - Manuel de formation practique pour la transplantation embryonnaire
chez la brebis et la chevre. Etude FAO, Roma.
4. Bogdan, Al. i colab., 1981 - Reproducia animalelor de ferm. Edit.Scrisul romnesc,
Craiova
5. Bogdan, Al. i colab.,1984,1985 - Fertilitatea, natalitatea i prolificitatea n zootehnie, vol I i
II, Edit Dacia, Cluj-Napoca
6. Boitor, I., 1979 - Endocrinologia reproduciei la animalele de ferm. Edit. Ceres, Bucureti
7. Bunaciu, P., 1977 - nsmnarea artificial a ginilor de reproducie ntreinute n baterii.
Rev. de cretere a animalelor, nr. 10

8. Crlan, M., 1982 - Sincronizarea cldurilor i ovulaiei la taurine. Redacia de propagand

tehnic agricol, Bucureti
9. Confederat Margareta, 1998 - Cercetri cu privire la influena alimentaiei asupra
supravieuirii embrionilor la caprine n condiiile efecturii transferului de embrioni. Tez de
doctorat, Univ. Agron. i de Med. Vet., Iai
10. Drugociu, G. i colab., 1977 - Patologia reproduciei i clinic obstetrical. Edit. Did. i Ped.,
Bucureti
11. Dumitrescu, I. i colab., 1976 - Reproducia la bovine. Edit Ceres, Bucureti
12. Dumitrescu, I. i colab., 1978 - nsmnrile artificiale la animale. Edit. Ceres, Bucureti
13. Dumitrescu, I., 1987 - Reproducia la cabaline. Edit. Ceres, Bucureti
14. Elsden Peter, R., 1987 - Manual for embryo transfer, 6599 Country Rd. 29C,