BIOTEHNOLOGII DE REPRODUCERE IN

AMELIORAREA ANIMALELOR

BIOTEHNOLOGII DE REPRODUCȚIE

Controlul biotehnologic al funcȚiei de reproducere la animale

Prof.dr. PĂCALĂ Nicolae Masterand:BUDAE Marius

1
CUPRINS:
1.Fecundația „in vitro“:
 Obținerea ovocitelor;
 Maturarea „in vitro “ a ovocitelor;
 Capacitarea spermatozoizilor;
 Fecundația și cultura „in vitro“ a embrionilor;
 Transferul embrionilor obținuți „in vitro“;
 Importanța, perspectivele și aplicațiile fecundației„in vitro“;

2.Bisecția embrionilor;

3. Sexarea embrionilor;

4.Transplantarea nucleilor și obținerea de clone:

 Pregătirea ovocitelor receptoare;
 Izolarea nucleilor embrionului donator;
 Reconstituirea embrionilor;

5. Transgeneza.

2
INTRODUCERE

Creșterea populației globului concomitent cu tendințele de ridicare a

standardului de viață, au impus cercetătorilor și specialiștilor din agricultură
preocuparea pentru accelerarea ameliorării producțiilor vegetale și animale în
vederea asigurării necesarului de substanțe proteice din hrana omului. Dintre
produsele animale, în zona temperată, unde se situează și țara noastră, atenția
specialiștilor a fost îndreptată spre creșterea producției de carne, lapte și ouă,
produse strict necesare unei alimentații raționale.
Mijlocul prin care se poate interveni în grăbirea ameliorării efectivelor de
animale îl constituie permanenta îmbunătățire a reproducției celor mai valoroși
indivizi, selecționați pe baza unor criterii științifice. Așa se explică faptul că în
ultimii 20-30 de ani, s-a acordat o atenție specială folosirii celor mai noi tehnologii
în creșterea animalelor, cu scopul grăbirii ritmului de ameliorare a efectivelor, prin
introducerea pe o scară din ce în ce mai largă, a biotehnologiilor de reproducție.
Biotehnologiile de reproducție reprezintă ansamblul metodelor,
procedeelor sau operațiilor care se folosesc pentru obținerea în condiții optime, a
unor noi generații de animale, din ce în ce mai performante.
Biotehnologiile de reproducție, sub aspect cronologic și al complexității
tehnicilor pe care le includ, sunt sistematizate în patru generații (Thibier, M. și
colab., 1991):
- însămânțarea artificială;
- transferul de embrioni;
- fecundația „in vitro“, clonarea și sexarea embrionilor (în curs de
aplicare);
- transgeneza, în curs de studiu și de aplicare sporadică la diverse speciii
de animale.

3
1.Fecundația „in vitro“
Este o biotehnică de actualitate, prin intermediul căreia procesele fiziologice de
maturare a gameților femeli și de capacitare a spermatozoizilor, fecundație și cultură a
embrionilor până la stadiul transferului acestora în organismul femelelor receptoare, sunt
dirijate și se produc, parțial sau total, în afara organismului femelei („in vitro“) în diferite
medii de cultură. Această biotehnică, deși bazele teoretice și practice au fost puse cu circa 4-
5 decenii mai `nainte, a căpătat un interes mai deosebit în ultimele două decenii. Cu toate
preocupțrile destul de intense în acest domeniu, succesul înregistrat la mamiferele domestice
este destul de limitat. Rezultate recente referitoare la numărul de embrioni produși „in
vitro“ pe plan mondial sunt redate în tab. 1

Tabelul 1 Situația mondială a transferului de embrioni produși „in vitro“

(după AETE*, 1997)
Regiunea Embrioni Embrioni Total embrioni
proaspețI congelați
Asia
Japonia 1791 2851 4642
Europa
Fran]a 150 70 220
Ungaria 6 - 6
Irlanda 1487 97 1584
Italia 100 3050 3150
Olanda 1603 282 1885
Spania 3 - 3
Total 5140 6340 11490
AETE*=Asociația europeană a transferului de embrioni.

La mamifere, fecundația fiind internă, analiza intimă a mecanismelor implicate

în acest proces biologic este delicat și costisitoare. Fecundația „in vitro“ constituie o
biotehnică ce permite studierea „in vitro“ a interacțiunilor dintre cei doi gameți sub
rezerva reproducerii artificiale a condițiilor identice existente ,,in vivo“. Elementele
esențiale ale acestui interesant și complex proces, constau dintr-o serie de interacțiuni
între cei doi gameți care, în final, conduc la unirea lor și la combinarea genotipurilor.
Principalele „secvențe“ ale fecundației se referă la:
- fixarea spermatozoizilor de zona pelucidă, urmată de străbaterea acestei
membrane;
- fuzionarea membranelor plasmatice ale celor doi gameți;
- încorporarea spermatozoidului în ooplasmă și activarea ovocitului;
- singamia.
In momentul ovulației, ovocitul este captat de pavilion și descinde de-a lungul
oviductului. La majoritatea animalelor de fermă, celulele coroanei radiata sunt
eliminate rapid după ovulație. Spermatozoizii dobândesc puterea lor fecundantă în
cursul înaintării prin tractusul genital femel. Numărul gameților masculi care ajung la
nivelul oviductului, în momentul ovulației, este foarte restrâns, astfel încât raportul
dintre spermatozoizi și ovocite la rumegătoare variază de la 1 la 10.De asemenea,
reacția acrozomului spermatozoidului se produce la nivelul zonei pelucide. In
consecință, rolul oviductului este de a asigura dezvoltarea embrionului până la stadiul
de 8-16 celule, apoi acesta trece in vârful cornului uterin.
Cercetările efectuate au relevat faptul că fluidul oviductului (sau lichidul tubar)
nu este un simplu transsudat sanguin, ci este un mediu cu unele însușiri fizico-chimice
speciale: concentrație mai ridicată a ionilor de K+ și un nivel mai scăzut al concentrației
ionilor de Mg++, comparativ cu serul sanguin. Volumul secreției tubare este hormono

4
dependent. Lichidul tubar poate suferi unele schimburi cu lichidul peritoneal.

In condiții naturale, embrionul părăsește oviductul, în general, după al 3-lea

clivaj, iar dezvoltarea zigotului la nivelul oviductului nu este strict specifică. Astfel,
embrionii bovini se dezvoltă în oviductul ligaturat de oaie sau iepuroaică. Această
dezvoltare a embrionului până la stadiul de blastocist la nivelul oviductului chiar
provenind de la altă specie, constituie un fenomen remarcabil.
Primele rezultate obținute cu ovocite maturate „in vivo“ au fost obținute în
anul 1954 la iepuroaică, în 1969 la șoarece și în 1980 la bovine (Marquant B. și
colab.,1991). Primul produs obținut printr-o astfel de biotehnică este consemnat în
anul 1959 la iepure, 1978 la om și în 1982 la bovine. In ceea ce privește produșii
rezultați prin fecundația cu ovocite maturate „in vitro“, în 1972 s-au obținut primii
zigoți de șoarece prin fecundarea ovocitelor cu spermatozoizi recoltați de la nivelul
epididimului; în anul 1973 s-au obținut produși la iepure prin fecundarea ovocitelor cu
spermatozoizi capacitați în uter; în anul 1986 s-au obținut primii miei, prin folosirea la
fecundarea ovocitelor a spermatozoizilor ejaculați; în 1986 s-au obținut primii viței
folosindu-se pentru fecundarea ovocitelor spermatozoizi conservați prin congelare
(Marquant B. și colab.,1991).
După aceste prime succese înregistrate, fecundația „in vitro“ s-a generalizat,
după cum s-a văzut, la toate mamiferele de interes zootehnic,
însă obținerea unui nivel ridicat de fecundație „in vitro“ s-a înregistrat mult mai târziu.
Nivelul relativ scăzut de fecundație înregistrat în perioada de început a aplicării
fecunda]iei „in vitro“s-a datorat `n special, folosirii unei temperaturi inadecvate acestei
etape. S-a demonstrat că temperatura centrală la mamifere este de 39 oC ceea ce face ca
nivelul procentului de fecunda]ie înregistrat la incubarea gameților la 37 oC să fie
extrem de scăzut (tab. 2).

Influența temperaturii asupra nivelului fecunda]iei „in vitro“

(după Chang și colab., Lenz și colab., cit. de Marquant și colab., 1991)

Specia Temperatura Fecunda]i

a
Suine 37oC 1%
39 oC 89%
Taurine 37oC 7%
39 oC 53%
Ovine 37oC 9%
39 oC 80%

Etapele fecundației „in vitro“ sunt:

- obținerea ovocitelor;
- maturarea „in vitro“ a ovocitelor;
- capacitarea spermatozoizilor;
- fecundarea și cultura „in vitro“;
- transferul embrionilor rezultați.

5
 Obținerea ovocitelor
Sursele posibile pentru ovocite sunt:
- ovocite provenite prin puncția foliculilor maturi de la femele cu estru
spontan sau superovulat, recoltate înainte sau imediat după ovulație;
- ovocite obținute din foliculi imaturi, recoltate din ovarele femelelor
sacrificate sau ovariectomizate;
- ovocite rezultate din oviducte, imediat după ovulație. Prima și a treia sursă
de ovocite sunt limitate, deoarece numai un număr mic de foliculi se
maturează și ovulează spontan, sau numai un număr relativ restrâns de
foliculi pot fi activați prin injectarea hormonilor gonadotropi. Ovocitele
mature pot fi recoltate din foliculi maturi sau din oviduct în primele 6 ore de
la ovulație, plasate într-un mediu Krebs-Ringer și incubate la 38 oC,
umiditatea relativă de 100% și 5% atmosferă de CO2.
Ovocitele obținute prin puncția ovarelor provenite de la animalele sacrificate
la abator sau a ovarelor obținute prin ablația acestora, constituie o sursă importantă
de gameți femeli, însă aceste ovocite necesită a fi maturate ,,in vitro“. Puncția
foliculilor pe animalul viu permite folosirea donatoarelor de ovocite cu potențial
genetic cunoscut. Pentru recoltarea ovocitelor în astfel de condiții se mai poate
folosi un endoscop, cuplat la un sistem de aspirare, în vederea prelevării lichidelor
foliculilor cu un diametru de 2-6 mm, de la vaci stimulate sau nu cu hormoni
gonadotropi exogeni. De asemenea, puncția foliculilor, ghidată prin ecografie
transvaginală permite colectarea fluidului folicular și a complexelor ovocite-
cumulus. Această tehnică poate fi repetată de mai multe ori în cursul aceluiași ciclu,
fără a afecta fertilitatea ulterioară a femelei donatoare.

Maturarea „in vitro “ a ovocitelor

Ovocitele prelevate din foliculii antrali, prin laparotomie sau sacrificarea
femelelor, reiau spontan meioza dacă sunt plasate într-un mediu special de cultură, la
38oC, incubate într-o atmosferă de 5% CO2. Prezența unui cumulus compact și intact în
momentul cultivării ovocitelor favorizează reluarea meiozei pentru majoritatea
ovocitelor. Studii de microscopie electronică au arătat că celulele cumulus-ului emit
numeroase prelungiri ce traversează zona pelucidă și stabilesc legături funcționale
complexe cu citoplasma ovocitului. Aceste legături, parțial sunt întrerupte, după 3 ore
de cultură a ovocitului în mediul special, pentru ca după 16-18 ore de cultură,
contactele dintre celulele cumulus- ului și ovocit să dispară complet. Ruperea
membranei nucleare se produce după 6-12 ore de cultură și emiterea primului globul
polar după 24 de ore. Aceste transformări nucleare, ce deosebesc maturarea „in
vitro“ a ovocitelor, modificări observabile prin tehnici histologice, sunt
însoțite de modificări citoplasmatice mult mai greu de decelat prin
mijloace actuale de investigare. S-a dovedit, prin multiple experiențe, că ovocitele
cultivate în foliculul lor se maturează asemănător celei observate ,,in vitro“.

6
 La oaie, Staigmiller și Moor, 1984 (citați de Marquant B., 1991) au arătat că
adăugarea unei suspensii de celule obținute din granuloasa foliculilor ovarieni în
mediul de cultură, permite o maturare normală a ovocitelor. La vacă, nivelul
maturării ovocitelor în medii cu sau fără adaos de celule din granuloasă, nu variază
mult, însă prezența acestor celule permite restabilirea potențialului de dezvoltare a
ovocitelor după fecundația „in vitro“.
Ovocitele obținute prin puncția foliculilor dispuși mai în profunzimea cortexului
ovarian au un potențial de maturare și dezvoltare ulterioară mult mai slabe, comparativ cu
ovocitele obținute prin puncția foliculilor mari, maturi, situați la suprafața ovarului.

Capacitarea spermatozoizilor
Spermatozoizii mamiferelor nu sunt capabili de fecundare a ovocitelor, din
momentul ejaculării. Spermatozoizii trebuie să parcurgă o perioadă de pregătire, numită
„capacitare“, care are loc „in vivo“, în tractusul genital femel. Capacitarea este o etapă
pregătitoare necesară, în urma căreia spermatozoizii dobândesc capacitatea de a se fixa pe
zona pelucidă a ovocitului și suferă, apoi, reacția acrozomului.
Studiile de microscopie electronică au arătat că în decursul etapei de
„capacitare“ au loc două fenomene mai importante:
- modificări la nivelul membranelor spermatozoidului și acrozomică externă,
precum, migrarea proteinelor de acoperire cu formarea de zone libere de
proteine, ceea ce permite fuziunea membranelor plasmatice și acrozomică
externă, în momentul reacției acrozomului. Prin orificiile create, se elimină o
cantitate din colesterolul care antrenează o diminuare a raportului
colesterol/fosfolipide, asociate unei permeabilități membranare crescute pentru
ionii de calciu. Pe baza acestei constatări, toate mediile de capacitare folosite
au în comun prezența serului albuminic, care este un acceptor de colesterol;
- modificarea mișcării spermatozoidului care, din liniară (prin
înșurubare) traiectoria devine, mai mult sau mai puțin circulară, mișcare ce
se datorează creșterii permeabilității pentru ionii de calciu. Amplitudinea
mișcărilor cozii se mărește, spermatozoidul fiind calificat ca „hipermobil“.
Diversele medii și tehnici întrebuințate pentru capacitarea spermatozoizilor ,,in
vitro“ au în vedere faptul de a permite spermatozoizilor să sufere toate aceste modificări și
mai ales să le mențină o mobilitate ridicată.
Capacitarea spermatozoizilor s-a obăinut prin incubarea acestora la 37oC, timp de
una-două ore, într-un mediu cu o forță ionică crescută, ceea ce a dus la detașarea
proteinelor de acoperire. Aplicarea acestei tehnici la sperma recoltată prin ejaculare de la
taur, a permis obținerea unui procent de fecundație ridicat și nașterea de viței normali,
după transferul embrionilor obținuți prin fecundarea gameților în astfel de medii. Diversele
studii întreprinse pe această problemă, au arătat că

7
fenomenul de capacitare a spermatozoizilor ,,in vitro“ este mult diferit de cea realizată „in
vivo“. În oviduct, în condiții naturale, fecundația are loc
în absența celulelor din cumulus, pe când „in vitro“ ovocitele nude, în momentul
contactului cu spermatozoizii sunt fecundate într-o proporție foarte scăzută comparativ
cu ovocitele înconjurate de celule din cumulus. Aceasta presupune că celulele din
cumulus au probabil un rol în capacitarea „in vitro“ a spermatozoizilor.
Majoritatea cercetătorilor care se ocupă de aspectele fecundației
„in vitro“ folosesc sperma congelată, cu rezultate bune. Alte medii capacitante pentru
spermatozoizi sunt cele care conțin ionoforul calcic, asociat sau nu cu cafeina. Totodată,
cafeina pare a fi un agent capacitant mai apropiat de condițiile naturale, deoarece această
substanță se găsește pe traiectul căilor genitale după ovulație. S-a dovedit că
spermatozoizii de taur posedă receptori pentru heparină, aceștia acționând în funcție de
doză și ușurează pătrunderea calciului n spermatozoid. Se mai folosete,
în mediile capacitante, lichidul folicular, care,între altele, conține și heparină.
Un nivel de capacitare satisfăcător se obține atunci când se practică o concentrație
ridicată de spermatozoizi în mediu, care trebuie să fie de 3-4 miliarde spermatozoizi/ml,
când nivelul fecundației atinge 87% dintre ovocite.

Fecundația și cultura „in vitro“ a embrionilor

Fecundarea se realizează prin cultura timp de o zi într-un mediu special a 0,1ml
suspensie de spermatozoizi, cu concentrație ridicată,
împreună cu ovocite mature, în atmosferă de 5%CO2, 5%O2 și 90%N2.
După 24 de ore de cultură împreună cu spermatozoizii, ovocitele fecundate sunt
transferate într-un mediu special în vederea dezvoltării ulterioare. Ovocitele se
examinează la stereolupă și sunt considerate ca fecundate atunci când se constată:
- prezența spermatozoizilor în spațiul perivitelin;
- prezența spermatozoizilor în ovoplasmă;
- prezența pronucleilor și apariția segmentației.
„In vivo“, după fecundție, embrionul începe dezvoltarea sa în oviduct, înainte de
a ajunge în uter (ziua 4-5 la rumegătoare), în stadiul de morulă tânără.
„In vitro“, oricare este mediul de cultură folosit, zigoții se blochează în
stadiul de 8 celule. Pentru mult timp, singurul mijloc de a asigura depășirea
stadiului de blocaj evolutiv l-a constituit transferul tinerilor zigoți în oviductul unei
gazde intermediare (iepuroaică) și apoi transferul lor în uterul femelelor
receptoare. Experiențele au dovedit că cultura zigoților de rumegătoare pe un strat
de celule tubare a permis obținerea blastociștilor și a nou-născuților, după
transferul la femelele receptoare. Totodată s-a demonstrat că prin co-cultura
zigoților cu vezicule trofoblastice permitea la circa 40% dintre aceștia să
depășească stadiul de 8 celule (Marquant B. și colab.,1991).
Ouăle fecundate „in vivo“, apoi cultivate „in vitro“ pe un strat de celule
prelevate din oviduct, unde evoluează până la stadiul de blastocist, au un aspect
morfologic normal. Totuși, studiul histologic atent a relevat

8
faptul că acești blastociști, comparativ cu cei prelevați „in vivo“ sunt alcătuiți dintr-un
număr redus de celule, multe dintre ele pe cale de degenerare. Însă cultura embrionilor pe un
strat de celule tubare, apoi uterine și adiționarea unui factor de creștere în mediul de cultură
a permis realizarea unui nivel important de dezvoltare până la stadiul de blastocist ca și a
unui nivel de ecloziune, comparabil cu cel realizat „in vivo“. Aceste experiențe
demonstrează faptul că oviductul nu îndeplinește un rol specific în trecerea de la starea de
blocaj spre stadiile ulterioare evolutive, deoarece blastociștii pot fi obținuți [i prin co-cultura cu
celule trofoblastice, din cumulus, ca [i cu celule prelevate din oviduct.

Transferul embrionilor obținuți „in vitro“

Se face în uterul femelelor receptoare, din aceeași specie, a cărei ciclu sexual a fost
sincronizat cu vârsta embrionilor obținuți „in vitro“.
Nivelul gestației în urma transferului sincron și asincron a embrionilor bovini
cultivați „in vitro“ arată că nivelul cel mai ridicat de gestații s-a obținut atunci când
femelele receptoare se găsesc în ceea ce privește ciclul sexual, în întârziere cu una-două
zile, față de vârsta teoretică embrionilor (tab. 3).
Embrionii obținuți conțin un număr mai redus de celule, cu toate că morfologic
apar normali, de aceea nivelul gestației este mai ridicat atunci când receptoarele sunt
din punct de vedere al ciclului sexual în
țntârziere, în raport cu vârsta teoretică a embrionului. Aceasta evidențiază faptul că
mediile de cultură folosite nu sunt adecvate integral. Nivelurile de dezvoltare a
embrionilor obținuți „in vitro“ transferați receptoarelor și a gestației sunt mai scăzute
comparativ cu cei obținuți după transferul de embrioni „in vivo“.

Tabelul 3
Nivelul gestației după transferul sincron al embrionilor bovini după
maturare, fecundare și cultură „in vivo“
în condițiile transferului a câte 2 embrioni/receptoare
(Kajihira și colab.,1990 cit. de Marquant B. și colab., 1991)

Sincronism între stadiul de Număr de Gestații

dezvoltare al embrionilor și receptoare (%)
stadiul
ciclului sexual al receptoarelor
-2,5 8 63
-2,0 22 82
-1,5 17 59
-1,0 27 59
0 la +1 13 46

Pe ansamblul aplicării acestei biotehnici, nivelurile gestației sunt mai slabe în raport
cu numărul ovocitelor folosite, chiar atunci când zigoții sunt cultivați în oviductul unei
gazde intermediare.

9
 Importanța, perspectivele și aplicațiile fecundației „in vitro“
Contrar ameliorărilor tehnice aduse în ultimii ani acestei biotehnici, randamentul
global rămânea relativ scăzut, fapt ce a încetinit ritmul aplicării în practică pe o scară mult
mai mare. Cercetările ulterioare trebuie să fie orientate, mai ales, spre creșterea
randamentului diverselor etape, în particular cea a culturii embrionilor.
Cu toate dificultățile întâmpinate, fecundarea „in vitro“ rămâne un necesar și
indispensabil stadiu pentru înțelegerea diferitelor fenomene,
îndeosebi a stadiilor dezvoltării inițiale a embrionului.
La bovine, folosirea pentru fecundația „in vitro“ a ovocitelor provenite de la
femele fără valoare genetică (recoltate de la abator) permite stabilirea unui diagnostic
precoce a fertilității taurilor folosiți la
însămânțări artificiale. Într-adevăr, s-a pus în evidență o corelație între nivelul
dezvoltării globale „in vitro“ (numărul de blastociști/număr ovocite supuse
fecundării)și fertilitatea taurilor „in vivo“ (nivelul NR% la două-trei luni).
Tehnica maturării „in vitro“ permite producerea la prețuri scăzute a unui număr
mare de ovocite care pot fi utilizate ca receptoare de nuclei ai embrionilor proveniți de la
vacile cu înalt potențial genetic, în cursul clonării. Acest aspect este valorificat comercial
de unele firme americane.
Puncția foliculilor antrali, pe animalul în picioare, prin folosirea metodelor
endoscopice sau ecografice transvaginale permite folosirea femelelor donatoare de ovocite
de un înalt potențial genetic, într-un număr ridicat. Acest tip de colectare și maturare „in
vitro“ a ovocitelor va deveni rentabil numai atunci când randamentele realizate vor
permite producerea, pe donatoare, a unui număr de embrioni superior celui obținut în
prezent prin superovulare, fecundație „in vivo“ și colectare transcervicală a zigoților.
Prin practicarea acestei biotehnici există posibilitatea reducerii numărului necesar de
spermatozoizi pentru a obține o fecundație, și în consecință, folosirea cu intensitate sporită
a spermei provenită de la animale valoroase pentru fecundarea unui număr crescut de
ovocite, comparativ cu celelalte biotehnici (însămânțări artificiale și transfer de embrioni).
Totodată, fecundația „in vitro“ va permite în viitorul apropiat intensivizarea
procesului de ameliorare genetică a efectivelor de animale. Prin această biotehnică, se pot
obține mai multe ovocite de la aceeași femelă, ovocite care pot fi fecundate cu
spermatozoizi proveniți de la mai mulți reproducători, fapt ce ar constitui un mare
avantaj pentru
testarea reproducătorilor masculi și femeli.
Microinjecția de spermatozoizi în ovocitele maturate „in vitro“ reprezintă o altă
cale de obținere de embrioni normali. După activarea ovocitei, ouăle au fost cultivate
până la stadiul de morulă-blastocist și transferate la femele receptoare, obținându-se,
deja, unele rezultate.
Posibilitatea de a avea, după fecundația „in vitro“, un număr crescut de embrioni
într-un stadiu precis de dezvoltare prezintă un mare avantaj pentru o altă biotehnică de
reproducție, transgeneza. Într-adevăr, microinjecția artificială a unei gene se efectuează în
stadii precise de

10
dezvoltare, în general în stadiul de doi pronuclei sau de două blastomere. Deja, unele
echipe de cercetători și-au propus să folosească spermatozoidul ca vector al genei ce
urmează a fi transferată,în cazul fecundației „in vitro“, rezultate încurajatoare obținându-se
pe șoareci.
Oricare ar fi biotehnicile utilizate (clonaj transgeneză), rezultatul este totdeauna un
ou în stadiul de una-două celule pe care trebuie testată dezvoltarea ulterioară prin tehnici
mai puțin costisitoare, comparativ cu transferul pe cale chirurgicală în oviductul unei
femele receptoare.
Maturarea ovocitelor, fecundația „in vitro“ și cultura embrionilor obținuți sunt
etape de mare interes pentru mamiferele domestice, însă dirijarea acestor trei etape
prezintă importanță pentru dezvoltarea tehnicilor de clonare și transgeneză.

2.Bisecția embrionilor
Tehnicile de micromanipulare perfecționate și simplificate în ultimul timp, au
făcut posibilă microchirurgia embrionară. Micromanipulările sunt facilitate de faptul
că ouăle (zigoții) majorității speciilor de mamifere sunt circumscrise de o zonă
pelucidă acelulară. Zona pelucidă îndeplinește mai mult atribuții referitoare la protecția
fizică a zigotului. Rezistența acestei membrane permite menținerea oului
în depresiunea extremității unei micropipete fără a afecta structura internă a
oului.Această însușire ușurează mult intervenția microinstrumentelor. Prin practicarea
tehnicilor de micromanipulare, în prezent se poate interveni pe zigot pentru:
- obținerea jumătăților monozigote, prin bisecție;
- sexarea embrionului;
- producerea de himere;
- obținerea de indivizi transgenici;
- producerea clonelor.
Bisecția embrionilor
constă în secționarea în două jumătăți a
zigoților aflați în stadiul de morulă târzie sau
de blastocist tânăr (6-8 zile) (foto 1). Această
biotehnică are ca bază fiziologică constatarea
că la mamifere, în mod natural, apar jumătăți
și uneori chiar triplete monozigote. Primele
studii făcute pe embrioni de șoareci și iepure
au arătat că un blastomer protejat de propria

Foto 1 Bisec]ia embrionilor

zonă pelucidă este capabil de a se dezvolta și de a produce un individ normal. Însă, un
blastomer izolat, transferat fără zona pelucidă sau reintrodus într-o zonă pelucidă larg
deschisă este incapabil de evoluție (Nibart M., 1991).

11
 Ozil, 1982 (cit de Nibart M.,1991) a propus secționarea în două părți egale a
embrionilor de 6-8 zile, stadiu în care rolul zonei pelucide nu mai prezintă importanță.
El a dezvoltat un sistem de microchirurgie cu ajutorul mai multor instrumente, folosite
în așa fel încât să lezioneze cât mai puțin posibil zona pelucidă și repunerea fiecărui
demiembrion în câte o zonă pelucidă. Rezultatele obținute, exprimate în G% după
transfer, au fost considerate ca excelente: 27 de produși pentru 25 de embrioni
secționați. Numeroși autori au continuat bisecția embrionilor bovini simplificând
tehnica, ce este formată numai din două microinstrumente.
Voelkel și colab., (1948), Baker și Shea (1985), Picard și colab.,(1985, cit.
de Nibart M., 1991) Au demonstrat că nu mai este necesară repunerea embrionului
într-o zonă pelucidă înaintea transferului, ceea ce a simplificat mult metoda.
Cu ajutorul a două micromanipulatoare, unul purtând micropipeta, celălalt
microcuțitul, un operator antrenat poate obține în câteva minute doi demiembrioni, viabili,
în condițiile bisecției unice a embrionilor de bună calitate, apreciați în stadiul de morulă
compactă-blastocist tânăr.
După transferul celor două jumătăți la femelele receptoare, nivelurile gestației
se situează între 50% și 65%, însă pentru majoritatea autorilor, nivelurile gemelarității
au fost de 50%. Nu s-au înregistrat diferențe în nivelul obținerii de gemeni, indiferent
dacă aceștia au fost repuși amândoi în cornul uterin ipsilateral ovarului cu corp galben
sau repus fiecare în câte un corn uterin al aceleiași receptoare.
S-au obținut unele rezultate (50% gestații) după transferul jumătăților de embrion
conservate prin refrigerare timp de 24 de ore la 2- 4oC. Congelarea în azot lichid a
jumătăților de embrion repuse în zona pelucidă, a condus la obținerea unui nivel scăzut de
gestații (20%). Dacă
înainte de congelare embrionii sunt menținuți într-un mediu de cultură (2-24 de ore),
nivelul gestațiilor obținute este mult mai ridicat.
Rezultatele obținute arată că embrionii buni de 40-80 de celule, sunt
capabili, prin bisecție, să dea doi demiembrioni care, transferați în uterul
receptoarelor, să evolueze normal, cu toate că au de recuperat circa jumătate din
celulele embrionului inițial. Rezultate în obținerea gemenilor monozigoți, sunt
superioare când se lucrează cu blastociști tineri, comparativ cu stadiul de morulă
tânără.
Încercarea de a obține gemeni tripli sau cvadrupli, prin secționarea embrionilor
în stadiul de 40-80 de celule nu s-a soldat cu rezultate satisfăcătoare, ceea ce arată că
această biotehnică este limitată de numărul restrâns de gemeni (2) ce pot fi obținuți
dintr-un singur embrion. Dacă, de exemplu, considerăm în medie pe donatoare 5
embrioni viabili (trei buni și doi medii), după transferul acestora se obțin în principiu
trei viței. Prin bisecția celor trei embrioni buni și transferul fiecărei jumătăți la câte o
receptoare, este posibil să se obțină tot trei viței (50% gestație) sau, per total 4 viței.
Câștigul de un vițel presupune existența a 8 receptoare, în loc de 5. Dacă nivelurile
gestației sunt mai scăzute (50%-30%) sporul de un vițel obținut pe o donatoare
superovulată este anulat. În condițiile atingerii unor rezultate normale, prin practicarea
bisecției embrionilor se pot obține, în medie, 4 viței pe

12
donatoare în loc de trei viței, ceea ce presupune un câștig de 33% a numărului
descendenților proveniți de la fiecare femelă superovulată. În aceste condiții, o selecție bine
dirijată, acceptă cu rezerve păstrarea a mai mult de un singur exemplar al unei familii
clonate, din cauza reducțiilor majore survenite în varianța genetică și în sporirea
consangvinității. În aceste circumstanțe, producerea unor familii biclonate pentru toți
indivizii distincți genetic se poate face numai prin reducerea la jumătate a numărului unor
astfel de indivizi, prin aceasta scăzând însăși intensitatea selecției. Continuarea
bisecționării embrionilor (clonării) erodează intensitatea selecției prin reducerea
progresului genetic, mărește consangvinitatea, scăderea intensității selecției nefiind
compensată prin câștigurile obținute în precizia selecției sau exactității rezultatelor ei
(Woolliams G.A., 1989).
Biotehnica bisecției embrionilor este totuși bună pentru producerea adevăraților
gemeni, necesari testării unor preparate farmaceutice sau a furajelor, factorul genetic
fiind înlăturat.
Obținerea himerelor s-a realizat prin microchirurgie, la rumegătoare și suine,
constând în amestecul de celule embrionare de la specii diferite.

3.Sexarea embrionilor
Determinarea sexului embrionului nu este realizabilă decât la vârsta la care se face
transferul acestuia (6-8 zile). Este considerată ca o descoperire economică de mare
importanță și constă în prelevarea câtorva celule care sunt investigate citogenetic,
imunologic, enzimologic etc.În vederea determinării sexului produsului de concepție încă
din acest stadiu incipient de dezvoltare.
Metoda genetică (cariotipică) se bazează pe recunoașterea
citologică a cromozomului y, specific masculilor. Este vorba de o tehnică ce permite
efectuarea sexării zigoților, pornind de la un număr mic de celule prelevate de la zigoți și
care să nu compromită dezvoltarea ulterioară a embrionului. Recent, folosirea unei
„sonde“ moleculare specifice cromozomului y la bovine, pare să răspundă tuturor
așteptărilor. Unele echipe de cercetare acționează în direcția trierii spermatozoizilor
purtători ai cromozomului x și y , pe baza diferenței acestora în ce privește conținutul în
ADN. Această metodă, împreună cu fecundația „in vitro“ ar furniza un procedeu ideal care
să răspundă necesităților zootehnice moderne.
Metoda imunologică constă în căutarea pe suprafața celulelor masculine a
antigenului de citocompatibilitate, prin folosirea unor
anticorpi monoclonali specifici pentru acest tip de antigen.
Metoda enzimologică se bazează pe faptul că unele enzime celulare sunt
codificate de către gene aparținând cromozomului x. Cantitatea acestor enzime este ,
deci, de două ori mai mare în celulele femele decât în celulele mascule. Determinarea
activității acestor enzime
într-un blastomer izolat a permis sexarea embrionilor într-o proporție ridicată.

13
 Tehnica amplificării ADN (PCR). După descoperirea posibilităților de amplificare
enzimatică dirijate de ADN-ul celular, unii cercetători au dezvoltat o tehnică de sexare prin
amplificarea enzimatică (PCR-Polimerase Chaine Reaction) a secvenței lor specifice.
Sexajul este efectuat pe 5-10 celule prelevate prin biopsia embrionilor de bună calitate.
Plecând de la aceste celule, determinarea sexului se sprijină pe detectarea unei secvențe
specifice a ADN-ului cromozomului y printr-o sondă moleculară complementară. Aceast
secvență este amplificată de PCR. ADN-ul amplificat este separat prin electroforeză și
vizualizat prin fluorescență.
Având în vedere tehnicile pentru sexare (evidențierea ADN specific) și sensibilitatea
specifică (amplificarea ADN de ordinul a 105), biopsia trebuie să fie realizată în cele mai
bune condiții igienice și tehnice.
Sexarea embrionilor înainte de implantare, oferă posibilitatea stabilirii raportului de
sexe într-o populație, în sensul dorit de crescători funcție de necesarul de animale de
reproducție, carne, lapte etc.

4.Transplantarea nucleilor și obținerea de clone

Clonajul embrionar constă în producerea mai multor animale pornind de la un
singur embrion. Acestea pot fi obținute prin simpla secțiune sau disociere a unui embrion,
în stadiul de preimplantare (bisecția embrionilor). Prin această metodă s-au produs
numeroase perechi de viței gemeni, însă foarte rar s-au putut obține triplete sau gemeni
cvadrupli. Teoretic, tehnica transferului nucleului permite obținerea unui număr mare de
indivizi plecând de la un singur embrion, având în vedere faptul că patrimoniul genetic al
tuturor nucleilor unui embrion tânăr este identic, în sensul că poartă aceeași informație
genetică. Transferul nucleilor celulelor provenite de la același embrion în mai multe
ovocite enucleate și activate, este urmat de evoluția ovocitelor spre indivizi genetic
identici.
Posibilitatea obținerii de serii de animale identice genetic prezintă interese
multiple pentru zootehnie. Astfel, în activitatea de selecție, folosirea unor clone, chiar
limitate numeric, oferă posibilitatea evaluării cu înaltă precizie a valorii
reproducătorilor. Animale cu același genotip,întreținute în ferme diferite, sunt
excelenți subiecți de studiere a influenței factorilor de mediu asupra performanțelor
acestora. Totodată, obținerea mai multor copii a reproducătorilor foarte valoroși va
contribui la creșterea și difuzabilitatea progresului genetic, însă cu reversul micșorării
patrimoniului genetic al efectivelor de animale.
Pentru producție, plecând de la rasele de carne, embrionii proveniți de la un genitor
cu o excelentă conformație (caracter cu coeficient mare de heritabilitate) vor putea fi
multiplicați prin clonare și transplantați, cu producerea unor loturi de animale cu carcase
omogene și de calitate superioară.
De asemenea, pe termen lung, obținerea și comercializarea embrionilor clonați în
mari serii, asociată cu maturarea „in vitro“ vor permite scăderea considerabilă a
transferului embrionar.

14
 Briggsi și King (1952) au arătat că nucleii prelevați, în stadiul de blastulă, la
broască și grefați în ovocite, pot să-și continue dezvoltarea până la stadiul de blastulă,
iar în 1962 Mc Kinnel a obținut, prin aceeași metodă, broaște adulte.
Pentru embrionul de mamifere, în 1986 Willadsen S., la Cambridge a obținut pentru
prima dată trei miei după transfer de nuclei, proveniți de la un embrion în stadiul de 8 celule
(Heyman Y. și colab., 1991).
La taurine, s-au obținut de către diferite echipe de cercetători clone constituite din
8-9 viței, iar la iepure s-a obținut o clonă de 6 indivizi, plecând de la un embrion congelat
în stadiul de morulă.
Transferul de nuclei parcurge trei etape (Heyman Y. și colab.,
1991):
- obținerea de ovocite enucleate destinate de a primi nucleii;
- izolarea nucleilor embrionului donator;
- reconstituirea de serii de embrioni monocelulari.

Pregătirea ovocitelor receptoare

Prima operație constă în extragerea genomului maternal al ovocitei „receptoare“.
Pentru aceasta, se folosesc ovocite mature care, în absența fecundației sau a activării, se
găsesc blocate în stadiul de metafază II a meiozei. Retragerea nucleului poate fi realizată
prin micromanipulare, pătrunzând cu vârful unei micropipete în interiorul celulei și
aspirând ușor cromozomii. Pentru a se evita ruperea membranei viteline a ovocitului, cum
se întâmplă cel mai adesea, ovocitele sunt pretratate cu medicamente care inhibă
polimerizarea microfilamentelor și microfibrilelor scheletului celular.
Ovocitele prelevate „in vivo“, imediat după ovulație sau obținute prin maturare
„in vitro“ sunt debarasate de celulele lor periovocitare printr-un tratament enzimatic cu
hialuronidază și apoi incubate în prezența cytochalasinei B (5-7 µg/ml). După
denudare, fiecare ovocit este enucleat, prin imobilizare în depresiunea unei
micropipete, apoi cu cea de-a doua micropipetă se puncșionează zona pelucidă, se
aspiră globulul polar împreună cu o fracțiune de citoplasmă adiacentă, conținând
cromozomii metafazici.

Izolarea nucleilor embrionului donator

Embrionul, selecționat ca donator de nuclei, este prelevat în stadiul de morulă, când
posedă 16-64 de celule, funcție de specie și vârsta acestuia. În acest stadiu evolutiv,
punerea în mișcare a genomului embrionar deja s-a produs. Se folosesc și embrioni
congelați și care se găsesc în stadiul de morulă.
Embrionul donator este debarasat cu multă atenție de zona pelucidă, folosind o
soluție de tyrode acid. În acest stadiu, celulele au
început deja să stabilească între ele relații funcționale (de exemplu gap- joncțion).
Pentru disociere, embrionul este incubat timp de treizeci de minute, într-un mediu
lipsit de ioni de calciu, după care blastomerele pot fi separate, fără leziuni, prin
intermediul unor micropipete.

15
 Reconstituirea embrionilor
După separarea blastomerelor, în cel mai scurt timp se introduce fiecare blastomer
în interiorul zonei pelucide a ovocitei „receptoare“, enucleate în prealabil.
După introducerea blastomerului sub zona pelucidă, fuziunea membranelor celulei
donatoare și ovocitul receptor se realizează prin electrofuziune. Pentru aceasta, ovocitul se
plasează între doi electrozi și este supus la unul sau mai multe impulsuri foarte scurte de
curent continuu. Stimulii electrici provoacă pori membranari, destabilizând straturile de
fosfolipide juxtapuse, iar membranele fuzionate permit astfel nucleului donator să pătrundă
în noul său mediu citoplasmatic. Pe de altă parte, stimularea electrică activează ovocitul
receptor, prin declanșarea mecanismelor de reprogramare a nucleului transplantat.
Electrofuziunea se realizează într-un mediu izotonic și se observă în următoarele treizeci
de minute de la stimulare și estimată,fie prin umflarea nucleului donator
în noul său mediu citoplasmatic, fie prin terminarea diviziunii celulare și apariția
stadiului de două celule.
In prezent, unul din factorii limitanți în aplicarea acestei biotehnici îl reprezintă
numărul relativ redus de ovocite „receptoare“. Creșterea numărului de ovocite ,,receptoare“
se poate obține prin maturarea „in vitro“ a acestora, pornind de la ovarele recuperate în
abator de la femelele sacrificate. Tot în plan practic, este de mare interes posibilitatea
congelării acestor ovocite, astfel încât să se dispună în orice moment de necesarul de
ovocite receptoare. Un alt factor limitant este reprezentat de numărul relativ redus de celule
ale embrionilor de la care urmează să se transfere nucleii.
Cu toate dificultățile pe care le ridică, clonajul embrionilor creează o nouă cale
în optimizarea reproducerii animalelor.

5.Transgeneza
Ameliorarea efectivelor de animale s-a bazat, tradițional, pe progresele înregistrate
în selecția genetică, dirijarea reproducției, echilibrul rațiilor de hrană, etc. Tehnicile
geneticii moleculare oferă, în prezent, noi posibilități care încep a fi exploatate eficient.
Astfel, sondele moleculare vor permite cunoașterea patrimoniului genetic al animalelor iar
multiplele combinații rezultate din mutație și asocierea secvențelor de ADN oferă multe
posibilități de reprogramare a unei celule sau a unui organism întreg. Astfel, dacă o genă
izolată este introdusă într-o celulă, aceasta va sintetiza o nouă proteină și caracteristicile
acestei celule vor putea fi astfel modificate. De asemenea, dacă o genă izolată este
introdusă într-un organism întreg, însușirile genetice ale acestuia vor fi modificate. Această
operație poartă numele de transgeneză. Gena străină, introdus în noul organism, va fi
transmisă la descendenți obținându-se
în acest fel o linie de animale care au însușiri biologice noi.
Primele observații în acest domeniu s-au făcut în 1981 pe șoareci. Este posibilă,
prin transgeneză, obținerea de noi animale, perspectivele deschise de această nouă
biotehnică fiind considerabile.

16
 Obținerea de animale transgenice include mai multe etape:
- izolarea sau construcția genei de transferat;
- colectarea embrionilor;
- introducerea genei în embrioni;
- transferul embrionului la o femelă receptoare;
- identificarea transgenei la nou-născuți;
- măsurarea expresiei transgenei;
- stabilirea de linii homozigote, pornind de la animale transgenice
fondatoare.
Izolarea sau construcția genelor se face prin tehnici genetice adecvate care permit
atât izolarea cât și mutarea după voință a oricărei gene. O genă funcțională material sau
reconstruită conține totdeauna aceleași elemente: regiunea regulatore, regiunea codantă și
terminatorul. Astfel, regiunile care participă la reglarea transcripției genei se situează în
amonte de zona codantă.
Colecția de embrioni. Transgeneza fiind o operație cu brandament scăzut, sunt
necesari mai mulți embrioni pentru a economisi la maximum femele donatoare. Embrionii
pot fi obținuți în mai multe moduri:
- prelevând ovare de la femelele sacrificate la abator;
- prin maturarea ovocitelor „in vitro“;
- prin practicarea fecundației „in vitro“.
Introducerea genei în embrion se poate realiza prin microinjecție, prin folosirea de
vectori retrovirali sau prin folosirea celulelor ES (Embryo stem cels).
Microinjecția constă în injectarea directă a soluției de ADN în
pronucleul mascul, care este mai mare, mai apropiat de periferia zigotului în momentul
injecției. Un obstacol important la injectare este dat de opacitatea ou\lor, ceea ce face
dificilă vizualizarea celor doi pronuclei.
Virusurile, înainte de a folosi mecanismul celular pentru replicarea lor, sunt ,,a
priori“ excelenți vectori pentru a introduce gene străine într-o celulă. Retrovirusurile se
încorporează în genomul gazdă,
în general,într-o singură copie și fără rearanjare, deci sunt extrem de utile pentru
introducerea genei străine în celulele somatice în cultură și apoi se reintroduc aceste
celule în individ.
Utilizarea celulelor ES, constă în izolarea celulelor unui embrion precoce și
cultivarea lor în condiții în care celulele nu se diferențiază.
Când aceste celule ES sunt reintroduse într-un embrion precoce participă la dezvoltarea
embrionului, dând naștere la animale himere. O genă străină poate fi introdusă,prin
procedee clasice de transfer,î n celule ES,
în cultură. Aceste celule reintroduse în embrion constituie vectorul transgenei. Animalele
himere transgenice care rezultă sunt mozaicate. Descendenții lor moștenesc sau nu
transgena numai dacă celulele germinale parentale conțin sau nu transgena.
Transgenele introduse, prin una din aceste metode, se inseră în genomul gazdă în
poziții imprevizibile.
Introducerea transgenelor se mai poate realiza și prin alte mijloace. Unul dintre
aceste mijloace constă în a pune în contact ADN-ul și spermatozoizii și a proceda apoi la o
fecundație „in vitro“sau „in

17
vivo“. O altă cale prin care gena străină poate fi transferată în celule în cultură, cu o
eficacitate înaltă, este electroporația. Tehnica aceasta constă
în a supune celulele incubate în prezența ADN, la câmpuri electrice care destabilizează
membrana și creează pori prin care ADN-ul pătrunde în celule. Această tehnică se
folosește și pentru spermatozoizii și embrionii de mamifere.
Detectarea transgenelor se face prin metode clasice ale geneticii moleculare. Ele
constau în a hibrida un fragment de ADN complementar genei, radioactivat, cu ADN-ul
celular total.
Detecția produșilor transgenici constă în a evalua expresia transgenelor prin
măsurarea cantității de ARN corespondent. Proteinele derivate din transgene pot fi
măsurate în sânge, dacă sunt secretate, cu ajutorul testului RIA (radioimunoanaliză).
Aceste metode permit să se determine în care organ, tip celular și moment al
dezvoltării, transgena se exprimă.
Tansgeneza a fost încercată pe multe specii de animale, cu anumite succese.
Randamentul biotehnicii, evaluat în număr de celule transgenice obținute, raportat la
numărul embrionilor microinjectați, variază mult cu colectivele de cercetători. O
evaluare sumară a acestui randament arată că este nevoie de circa 10 șoareci adulți
pentru a spera obținerea unuia transgenic, 40 de oi pentru un miel transgenic și 40 de
vaci pentru un vițel transgenic. Aceste rezultate arată că prețul de cost al unui produs
transgenic este foarte ridicat.
Prin transgeneză s-a încercat obținerea de animale cu un ritm de creștere
accelerat, cu o producție de lapte mai mare și cu un conținut în proteină mai ridicat, cu
o producție de carne mai bună, cantitativ și calitativ, rezistente la diverse maladii etc.
Cu toate rezultatele
încurajatoare obținute la diverse specii, această biotehnică se găsește doar la perioada de
început, necesitând multe ajustări, astfel încât randamentul obținut să micșoreze prețul de
cost al produsului transgenic și care să fie conform cu normele sanitare și sanitar-
veterinare internaționale etc.

18
BIBLIOGRAFIE

1.Bogdan, Al. și colab., 1981 - Reproducția animalelor de fermă. Edit.Scrisul

românesc, Craiova;
2.Bogdan, Al. și colab.,1984,1985 - Fertilitatea, natalitatea și prolificitatea în
zootehnie, vol I și II, Edit Dacia, Cluj-Napoca;
3. Boitor, I., 1979 - Endocrinologia reproducției la animalele de fermă. Edit. Ceres,
București;
4.Groza, {t. I., 1996 - Actualități și perspective în biotehnologia transferului de
embrioni la specia ovină. Edit. Ceres, București;
5.https://ro.wikipedia.org/wiki/Inginerie_genetică.

19