CAPITOLUL III

BIOTEHNICI DERIVATE SAU FINALIZATE PRIN TRANSFER DE

EMBRIONI

3.1. Fecundaia in vitro

Este o biotehnic de actualitate, prin intermediul creia procesele
fiziologice de maturare a gameilor femeli i de capacitare a spermatozoizilor,
fecundaie i cultur a embrionilor pn la stadiul transferului acestora n
organismul femelelor receptoare, sunt dirijate i se produc, parial sau total, n
afara organismului femelei (in vitro) n diferite medii de cultur. Aceast
biotehnic, dei bazele teoretice i practice au fost puse cu circa 4-5 decenii mai
nainte, a cptat un interes mai deosebit n ultimele dou decenii. Cu toate
preocuprile destul de intense n acest domeniu, succesul nregistrat la mamiferele
domestice este destul de limitat.
La mamifere, fecundaia fiind intern, analiza intim a mecanismelor
implicate n acest proces biologic este delicat i costisitoare. Fecundaia in
vitro constituie o biotehnic ce permite studierea in vitro a interaciunilor
dintre cei doi gamei sub rezerva reproducerii artificiale a condiiilor identice
existente ,,in vivo. Dup cum s-a studiat la capitolul Fecundaie, elementele
eseniale ale acestui interesant i complex proces, constau dintr-o serie de
interaciuni ntre cei doi gamei care, n final, conduc la unirea lor i la
combinarea genotipurilor.
Principalele secvene ale fecundaiei se refer la:
- fixarea spermatozoizilor de zona pelucid, urmat de strbaterea
acestei membrane;
- fuzionarea membranelor plasmatice ale celor doi gamei;
- ncorporarea spermatozoidului n ooplasm i activarea ovocitului;
- singamia.
n momentul ovulaiei, ovocitul este captat de pavilion i descinde de-a
lungul oviductului. La majoritatea animalelor de ferm, celulele coroanei radiata
sunt eliminate rapid dup ovulaie. Spermatozoizii dobndesc puterea lor
fecundant n cursul naintrii prin tractusul genital femel. Numrul gameilor
masculi care ajung la nivelul oviductului, n momentul ovulaiei, este foarte
restrns, astfel nct raportul dintre spermatozoizi i ovocite la rumegtoare
variaz de la 1 la 10. De asemenea, reacia acrozomului spermatozoidului se
produce la nivelul zonei pelucide. n consecin, rolul oviductului este de a
asigura dezvoltarea embrionului pn la stadiul de 8-16 celule, apoi acesta trece n
vrful cornului uterin.
Cercetrile efectuate au relevat faptul c fluidul oviductului (sau lichidul
tubar) nu este un simplu transsudat sanguin, ci este un mediu cu unele nsuiri
fizico-chimice speciale: concentraie mai ridicat a ionilor de K+ i un nivel mai
sczut al concentraiei ionilor de Mg++, comparativ cu serul sanguin. Volumul
secreiei tubare este hormono dependent. Lichidul tubar poate suferi unele
schimburi cu lichidul peritoneal.
n condiii naturale, embrionul prsete oviductul, n general, dup al 3lea clivaj, iar dezvoltarea zigotului la nivelul oviductului nu este strict specific.
Astfel, embrionii bovini se dezvolt n oviductul ligaturat de oaie sau iepuroaic.

93

Aceast dezvoltare a embrionului pn la stadiul de blastocist la nivelul

oviductului chiar provenind de la alt specie, constituie un fenomen remarcabil.
Primele rezultate obinute cu ovocite maturate in vivo au fost obinute n
anul 1954 la iepuroaic, n 1969 la oarece i n 1980 la bovine (Marquant B. i
colab.,1991). Primul produs obinut printr-o astfel de biotehnic este consemnat n
anul 1959 la iepure, 1978 la om i n 1982 la bovine. n ceea ce privete produii
rezultai prin fecundaia cu ovocite maturate in vitro, n 1972 s-au obinut primii
zigoi de oarece prin fecundarea ovocitelor cu spermatozoizi recoltai de la
nivelul epididimului; n anul 1973 s-au obinut produi la iepure prin fecundarea
ovocitelor cu spermatozoizi capacitai n uter; n anul 1986 s-au obinut primii
miei, prin folosirea la fecundarea ovocitelor a spermatozoizilor ejaculai; n 1986
s-au obinut primii viei folosindu-se pentru fecundarea ovocitelor spermatozoizi
conservai prin congelare (Marquant B. i colab.,1991).
Dup aceste prime succese nregistrate, fecundaia in vitro s-a
generalizat, dup cum s-a vzut, la toate mamiferele de interes zootehnic, ns
obinerea unui nivel ridicat de fecundaie in vitro s-a nregistrat mult mai trziu.
Nivelul relativ sczut de fecundaie nregistrat n perioada de nceput a aplicrii
fecundaiei in vitros-a datorat n special, folosirii unei temperaturi inadecvate
acestei etape. S-a demonstrat c temperatura central la mamifere este de 39 oC
ceea ce face ca nivelul procentului de fecundaie nregistrat la incubarea gameilor
la 37oC s fie extrem de sczut.
Etapele fecundaiei in vitro sunt:
- obinerea ovocitelor;
- maturarea in vitro a ovocitelor;
- capacitarea spermatozoizilor;
- fecundarea i cultura in vitro;
- transferul embrionilor rezultai.
3.1.1. Obinerea ovocitelor
Sursele posibile pentru ovocite sunt:
- ovocite provenite prin puncia foliculilor maturi de la femele cu estru
spontan sau superovulat, recoltate nainte sau imediat dup ovulaie;
- ovocite obinute din foliculi imaturi, recoltate din ovarele femelelor
sacrificate sau ovariectomizate;
- ovocite rezultate din oviducte, imediat dup ovulaie. Prima i a treia
surs de ovocite sunt limitate, deoarece numai un numr mic de foliculi se
matureaz i ovuleaz spontan, sau numai un numr relativ restrns de foliculi pot
fi activai prin injectarea hormonilor gonadotropi. Ovocitele mature pot fi
recoltate din foliculi maturi sau din oviduct n primele 6 ore de la ovulaie, plasate
ntr-un mediu Krebs-Ringer i incubate la 38oC, umiditatea relativ de 100% i
5% atmosfer de CO2.
Ovocitele obinute prin puncia ovarelor provenite de la animalele
sacrificate la abator sau a ovarelor obinute prin ablaia acestora, constituie o surs
important de gamei femeli, ns aceste ovocite necesit a fi maturate ,,in vitro.
Puncia foliculilor pe animalul viu permite folosirea donatoarelor de ovocite cu
potenial genetic cunoscut. Pentru recoltarea ovocitelor n astfel de condiii se mai
poate folosi un endoscop, cuplat la un sistem de aspirare, n vederea prelevrii
lichidelor foliculilor cu un diametru de 2-6 mm, de la vaci stimulate sau nu cu
hormoni gonadotropi exogeni. De asemenea, puncia foliculilor, ghidat prin
94

ecografie transvaginal permite colectarea fluidului folicular i a complexelor

ovocite-cumulus. Aceast tehnic poate fi repetat de mai multe ori n cursul
aceluiai ciclu, fr a afecta fertilitatea ulterioar a femelei donatoare.
3.1.2. Maturarea in vitro a ovocitelor
Ovocitele prelevate din foliculii antrali, prin laparotomie sau sacrificarea
femelelor, reiau spontan meioza dac sunt plasate ntr-un mediu special de cultur,
la 38oC, incubate ntr-o atmosfer de 5% CO 2. Prezena unui cumulus compact i
intact n momentul cultivrii ovocitelor favorizeaz reluarea meiozei pentru
majoritatea ovocitelor. Studii de microscopie electronic au artat c celulele
cumulus-ului emit numeroase prelungiri ce traverseaz zona pelucid i stabilesc
legturi funcionale complexe cu citoplasma ovocitului. Aceste legturi, parial
sunt ntrerupte, dup 3 ore de cultur a ovocitului n mediul special, pentru ca
dup 16-18 ore de cultur, contactele dintre celulele cumulus-ului i ovocit s
dispar complet. Ruperea membranei nucleare se produce dup 6-12 ore de
cultur i emiterea primului globul polar dup 24 de ore. Aceste transformri
nucleare, ce deosebesc maturarea in vitro a ovocitelor, modificri observabile
prin tehnici histologice, sunt nsoite de modificri citoplasmatice mult mai greu
de decelat prin mijloace actuale de investigare. S-a dovedit, prin multiple
experiene, c ovocitele cultivate n foliculul lor se matureaz asemntor celei
observate ,,in vitro.
La oaie, Staigmiller i Moor, 1984 (citai de Marquant B., 1991) au artat
c adugarea unei suspensii de celule obinute din granuloasa foliculilor ovarieni
n mediul de cultur, permite o maturare normal a ovocitelor. La vac, nivelul
maturrii ovocitelor n medii cu sau fr adaos de celule din granuloas, nu
variaz mult, ns prezena acestor celule permite restabilirea potenialului de
dezvoltare a ovocitelor dup fecundaia in vitro.
Ovocitele obinute prin puncia foliculilor dispui mai n profunzimea
cortexului ovarian au un potenial de maturare i dezvoltare ulterioar mult mai
slabe, comparativ cu ovocitele obinute prin puncia foliculilor mari, maturi,
situai la suprafaa ovarului.

3.1.3. Capacitarea spermatozoizilor

Spermatozoizii mamiferelor nu sunt capabili de fecundare a ovocitelor, din
momentul ejaculrii. Spermatozoizii trebuie s parcurg o perioad de pregtire,
numit capacitare, care are loc in vivo, n tractusul genital femel. Capacitarea
este o etap pregtitoare necesar, n urma creia spermatozoizii dobndesc
capacitatea de a se fixa pe zona pelucid a ovocitului i sufer, apoi, reacia
acrozomului.
Studiile de microscopie electronic au artat c n decursul etapei de
capacitare au loc dou fenomene mai importante:
- modificri la nivelul membranelor spermatozoidului i acrozomic
extern, precum, migrarea proteinelor de acoperire cu formarea de zone libere de
proteine, ceea ce permite fuziunea membranelor plasmatice i acrozomic extern,
n momentul reaciei acrozomului. Prin orificiile create, se elimin o cantitate din
colesterolul care antreneaz o diminuare a raportului colesterol/fosfolipide,
95

asociate unei permeabiliti membranare crescute pentru ionii de calciu. Pe baza

acestei constatri, toate mediile de capacitare folosite au n comun prezena
serului albuminic, care este un acceptor de colesterol;
- modificarea micrii spermatozoidului care, din liniar (prin nurubare)
traiectoria devine, mai mult sau mai puin circular, micare ce se datoreaz
creterii permeabilitii pentru ionii de calciu. Amplitudinea micrilor cozii se
mrete, spermatozoidul fiind calificat ca hipermobil.
Diversele medii i tehnici ntrebuinate pentru capacitarea spermatozoizilor
,,in vitro au n vedere faptul de a permite spermatozoizilor s sufere toate aceste
modificri i mai ales s le menin o mobilitate ridicat.
Capacitarea spermatozoizilor s-a obinut prin incubarea acestora la 37oC,
timp de una-dou ore, ntr-un mediu cu o for ionic crescut, ceea ce a dus la
detaarea proteinelor de acoperire. Aplicarea acestei tehnici la sperma recoltat
prin ejaculare de la taur, a permis obinerea unui procent de fecundaie ridicat i
naterea de viei normali, dup transferul embrionilor obinui prin fecundarea
gameilor n astfel de medii. Diversele studii ntreprinse pe aceast problem, au
artat c fenomenul de capacitare a spermatozoizilor ,,in vitro este mult diferit de
cea realizat in vivo. n oviduct, n condiii naturale, fecundaia are loc n
absena celulelor din cumulus, pe cnd in vitro ovocitele nude, n momentul
contactului cu spermatozoizii sunt fecundate ntr-o proporie foarte sczut
comparativ cu ovocitele nconjurate de celule din cumulus. Aceasta presupune c
celulele din cumulus au probabil un rol n capacitarea in vitro a
spermatozoizilor.
Majoritatea cercettorilor care se ocup de aspectele fecundaei in vitro
folosesc sperma congelat, cu rezultate bune. Alte medii capacitante pentru
spermatozoizi sunt cele care conin ionoforul calcic, asociat sau nu cu cafeina.
Totodat, cafeina pare a fi un agent capacitant mai apropiat de condiiile naturale,
deoarece aceast substan se gsete pe traiectul cilor genitale dup ovulaie. S-a
dovedit c spermatozoizii de taur posed receptori pentru heparin, acetia
acionnd n funcie de doz i uureaz ptrunderea calciului n spermatozoid. Se
mai folosete, n mediile capacitante, lichidul folicular, care, ntre altele, conine i
heparin.
Un nivel de capacitare satisfctor se obine atunci cnd se practic o
concentraie ridicat de spermatozoizi n mediu, care trebuie s fie de 3-4 miliarde
spermatozoizi/ml, cnd nivelul fecundaiei atinge 87% dintre ovocite.
3.1.4. Fecundaia i cultura in vitro a embrionilor
Fecundarea se realizeaz prin cultura timp de o zi ntr-un mediu special a
0,1ml suspensie de spermatozoizi, cu concentraie ridicat, mpreun cu ovocite
mature, n atmosfer de 5%CO2, 5%O2 i 90%N2.
Dup 24 de ore de cultur mpreun cu spermatozoizii, ovocitele fecundate
sunt transferate ntr-un mediu special n vederea dezvoltrii ulterioare. Ovocitele
se examineaz la stereolup i sunt considerate ca fecundate atunci cnd se
constat:
- prezena spermatozoizilor n spaiul perivitelin;
- prezena spermatozoizilor n ovoplasm;
- prezena pronucleilor i apariia segmentaiei.
In vivo, dup fecundaie, embrionul ncepe dezvoltarea sa n oviduct,
nainte de a ajunge n uter (ziua 4-5 la rumegtoare), n stadiul de morul tnr.
In vitro, oricare este mediul de cultur folosit, zigoii se blocheaz n
stadiul de 8 celule. Pentru mult timp, singurul mijloc de a asigura depirea
stadiului de blocaj evolutiv l-a constituit transferul tinerilor zigoi n oviductul
96

unei gazde intermediare (iepuroaic) i apoi transferul lor n uterul femelelor

receptoare. Experienele au dovedit c cultura zigoilor de rumegtoare pe un strat
de celule tubare a permis obinerea blastocitilor i a nou-nscuilor, dup
transferul la femelele receptoare. Totodat s-a demonstrat c prin co-cultura
zigoilor cu vezicule trofoblastice permitea la circa 40% dintre acetia s
depeasc stadiul de 8 celule (Marquant B. i colab.,1991).
Oule fecundate in vivo, apoi cultivate in vitro pe un strat de celule
prelevate din oviduct, unde evolueaz pn la stadiul de blastocist, au un aspect
morfologic normal. Totui, studiul histologic atent a relevat faptul c aceti
blastociti, comparativ cu cei prelevai in vivo sunt alctuii dintr-un numr
redus de celule, multe dintre ele pe cale de degenerare. ns cultura embrionilor pe
un strat de celule tubare, apoi uterine i adiionarea unui factor de cretere n
mediul de cultur a permis realizarea unui nivel important de dezvoltare pn la
stadiul de blastocist ca i a unui nivel de ecloziune, comparabil cu cel realizat in
vivo. Aceste experiene demonstreaz faptul c oviductul nu ndeplinete un rol
specific n trecerea de la starea de blocaj spre stadiile ulterioare evolutive,
deoarece blastocitii pot fi obinui i prin co-cultura cu celule trofoblastice, din
cumulus, ca i cu celule prelevate din oviduct.
3.1.5. Transferul embrionilor obinui in vitro
Se face n uterul femelelor receptoare, din aceeai specie, a crei ciclu
sexual a fost sincronizat cu vrsta embrionilor obinui in vitro.
Nivelul gestaiei n urma transferului sincron i asincron a embrionilor bovini
cultivai in vitro arat c nivelul cel mai ridicat de gestaii s-a obinut atunci
cnd femelele receptoare se gsesc n ceea ce privete ciclul sexual, n ntrziere
cu una-dou zile, fa de vrsta teoretic a embrionilor (tab. 1).
Embrionii obinui conin un numr mai redus de celule, cu toate c
morfologic apar normali, de aceea nivelul gestaiei este mai ridicat atunci cnd
receptoarele sunt din punct de vedere al ciclului sexual n ntrziere, n raport cu
vrsta teoretic a embrionului. Aceasta evideniaz faptul c mediile de cultur
folosite nu sunt adecvate integral. Nivelurile de dezvoltare a embrionilor obinui
in vitro transferai receptoarelor i a gestaiei sunt mai sczute comparativ cu cei
obinui dup transferul de embrioni in vivo.
Tabelul 1
Nivelul gestaiei dup transferul sincron al embrionilor bovini dup
maturare, fecundare i cultur in vivo n condiiile transferului a cte 2
embrioni/receptoare (Kajihira i colab.,1990 cit. de Marquant B. i colab.,
1991)
Sincronism ntre stadiul de
dezvoltare al embrionilor i stadiul
ciclului sexual al receptoarelor
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
0 la +1

97

Numr de
receptoare

Gestaii
(%)

8
22
17
27
13

63
82
59
59
46

Pe ansamblul aplicrii acestei biotehnici, nivelurile gestaiei sunt mai slabe

n raport cu numrul ovocitelor folosite, chiar atunci cnd zigoii sunt cultivai n
oviductul unei gazde intermediare.
3.1.6. Importana, perspectivele i aplicaiile fecundaiei
in vitro
Contrar ameliorrilor tehnice aduse n ultimii ani acestei biotehnici,
randamentul global rmnea relativ sczut, fapt ce a ncetinit ritmul aplicrii n
practic pe o scar mult mai mare. Cercetrile ulterioare trebuie s fie orientate,
mai ales, spre creterea randamentului diverselor etape, n particular cea a culturii
embrionilor.
Cu toate dificultile ntmpinate, fecundarea in vitro rmne un necesar
i indispensabil stadiu pentru nelegerea diferitelor fenomene, ndeosebi a
stadiilor dezvoltrii iniiale a embrionului.
La bovine, folosirea pentru fecundaia in vitro a ovocitelor provenite de
la femele fr valoare genetic (recoltate de la abator) permite stabilirea unui
diagnostic precoce a fertilitii taurilor folosii la nsmnri artificiale. ntradevr, s-a pus n eviden o corelaie ntre nivelul dezvoltrii globale in vitro
(numrul de blastociti/numr ovocite supuse fecundrii) i fertilitatea taurilor in
vivo (nivelul NR% la dou-trei luni).
Tehnica maturrii in vitro permite producerea la preuri sczute a unui
numr mare de ovocite care pot fi utilizate ca receptoare de nuclei ai embrionilor
provenii de la vacile cu nalt potenial genetic, n cursul clonrii. Acest aspect este
valorificat comercial de unele firme americane.
Puncia foliculilor antrali, pe animalul n picioare, prin folosirea metodelor
endoscopice sau ecografice transvaginale permite folosirea femelelor donatoare de
ovocite de un nalt potenial genetic, ntr-un numr ridicat. Acest tip de colectare
i maturare in vitro a ovocitelor va deveni rentabil numai atunci cnd
randamentele realizate vor permite producerea, pe donatoare, a unui numr de
embrioni superior celui obinut n prezent prin superovulare, fecundaie in vivo
i colectare transcervical a zigoilor.
Prin practicarea acestei biotehnici exist posibilitatea reducerii numrului
necesar de spermatozoizi pentru a obine o fecundaie, i n consecin, folosirea
cu intensitate sporit a spermei provenit de la animale valoroase pentru
fecundarea unui numr crescut de ovocite, comparativ cu celelalte biotehnici
(nsmnri artificiale i transfer de embrioni).
Totodat, fecundaia in vitro va permite n viitorul apropiat
intensivizarea procesului de ameliorare genetic a efectivelor de animale.
Prin aceast biotehnic, se pot obine mai multe ovocite de la aceeai
femel, ovocite care pot fi fecundate cu spermatozoizi provenii de la mai muli
reproductori, fapt ce ar constitui un mare avantaj pentru testarea reproductorilor
masculi i femeli.
Microinjecia de spermatozoizi n ovocitele maturate in vitro reprezint
o alt cale de obinere de embrioni normali. Dup activarea ovocitei, oule au fost
cultivate pn la stadiul de morul-blastocist i transferate la femele receptoare,
obinndu-se, deja, unele rezultate.
Posibilitatea de a avea, dup fecundaia in vitro, un numr crescut de
embrioni ntr-un stadiu precis de dezvoltare prezint un mare avantaj pentru o alt
biotehnic de reproducie, transgeneza. ntr-adevr, microinjecia artificial a unei
gene se efectueaz n stadii precise de dezvoltare, n general n stadiul de doi
pronuclei sau de dou blastomere. Deja, unele echipe de cercettori i-au propus

98

s foloseasc spermatozoidul ca vector al genei ce urmeaz a fi transferat, n

cazul fecundaiei in vitro, rezultate ncurajatoare obinndu-se pe oareci.
Oricare ar fi biotehnicile utilizate (clonaj transgenez), rezultatul este
totdeauna un ou n stadiul de una-dou celule pe care trebuie testat dezvoltarea
ulterioar prin tehnici mai puin costisitoare, comparativ cu transferul pe cale
chirurgical n oviductul unei femele receptoare.
Maturarea ovocitelor, fecundaia in vitro i cultura embrionilor obinui
sunt etape de mare interes pentru mamiferele domestice, ns dirijarea acestor trei
etape prezint importan pentru dezvoltarea tehnicilor de clonare i transgenez.
3.2. Bisecia embrionilor

Tehnicile de micromanipulare perfecionate i simplificate n ultimul timp,

au fcut posibil microchirurgia embrionar. Micromanipulrile sunt facilitate de
faptul c oule (zigoii) majoritii speciilor de mamifere sunt circumscrise de o
zon pelucid acelular. Zona pelucid ndeplinete mai mult atribuii referitoare
la protecia fizic a zigotului. Rezistena acestei membrane permite meninerea
oului
n depresiunea extremitii unei micropipete fr a afecta structura intern a oului.
Aceast nsuire uureaz mult intervenia microinstrumentelor. Prin practicarea
tehnicilor de micromanipulare, n prezent se poate interveni pe zigot pentru:
- obinerea jumtilor monozigote, prin bisecie;
- sexarea embrionului;
- producerea de himere;
- obinerea de indivizi transgenici;
- producerea clonelor.
Bisecia
embrionilor
const n secionarea n dou
jumti a zigoilor aflai n
stadiul de morul trzie sau de
blastocist tnr (6-8 zile) (foto
25). Aceast biotehnic are ca
baz fiziologic constatarea c
la mamifere, n mod natural,
apar jumti i uneori chiar
triplete monozigote. Primele
studii fcute pe embrioni de
oareci i iepure au artat c un
blastomer protejat de propria
Foto 25 Bisecia embrionilor
zon pelucid este capabil de a
se dezvolta i de a produce un
individ normal. ns, un blastomer izolat, transferat fr zona pelucid sau
reintrodus ntr-o zon pelucid larg deschis este incapabil de evoluie (Nibart M.,
1991).
Ozil, 1982 (cit de Nibart M.,1991) a propus secionarea n dou pri egale
a embrionilor de 6-8 zile, stadiu n care rolul zonei pelucide nu mai prezint
importan. El a dezvoltat un sistem de microchirurgie cu ajutorul mai multor
instrumente, folosite n aa fel nct s lezioneze ct mai puin posibil zona
pelucid i repunerea fiecrui demiembrion n cte o zon pelucid. Rezultatele
obinute, exprimate n G% dup transfer, au fost considerate ca excelente: 27 de
produi pentru 25 de embrioni secionai. Numeroi autori au continuat bisecia
99

embrionilor bovini simplificnd tehnica, ce este format numai din dou

microinstrumente.
Voelkel i colab., (1948), Baker i Shea (1985), Picard i colab.,(1985, cit.
de Nibart M., 1991) .a. au demonstrat c nu mai este necesar repunerea
embrionului ntr-o zon pelucid naintea transferului, ceea ce a simplificat mult
metoda.
Cu ajutorul a dou micromanipulatoare, unul purtnd micropipeta, cellalt
microcuitul, un operator antrenat poate obine n cteva minute doi
demiembrioni, viabili, n condiiile biseciei unice a embrionilor de bun calitate,
apreciai n stadiul de morul compact-blastocist tnr.
Dup transferul celor dou jumti la femelele receptoare, nivelurile
gestaiei se situeaz ntre 50% i 65%, ns pentru majoritatea autorilor, nivelurile
gemelaritii au fost de 50%. Nu s-au nregistrat diferene n nivelul obinerii de
gemeni, indiferent dac acetia au fost repui amndoi n cornul uterin ipsilateral
ovarului cu corp galben sau repus fiecare n cte un corn uterin al aceleiai
receptoare.
S-au obinut unele rezultate (50% gestaii) dup transferul jumtilor de
embrion conservate prin refrigerare timp de 24 de ore la 2-4 oC. Congelarea n azot
lichid a jumtilor de embrion repuse n zona pelucid, a condus la obinerea unui
nivel sczut de gestaii (20%). Dac nainte de congelare embrionii sunt meninui
ntr-un mediu de cultur (2-24 de ore), nivelul gestaiilor obinute este mult mai
ridicat.
Rezultatele obinute arat c embrionii buni de 40-80 de celule, sunt
capabili, prin bisecie, s dea doi demiembrioni care, transferai n uterul
receptoarelor, s evolueze normal, cu toate c au de recuperat circa jumtate din
celulele embrionului iniial. Rezultate n obinerea gemenilor monozigoi, sunt
superioare cnd se lucreaz cu blastociti tineri, comparativ cu stadiul de morul
tnr.
ncercarea de a obine gemeni tripli sau cvadrupli, prin secionarea
embrionilor n stadiul de 40-80 de celule nu s-a soldat cu rezultate satisfctoare,
ceea ce arat c aceast biotehnic este limitat de numrul restrns de gemeni (2)
ce pot fi obinui dintr-un singur embrion. Dac, de exemplu, considerm n medie
pe donatoare 5 embrioni viabili (trei buni i doi medii), dup transferul acestora se
obin n principiu trei viei. Prin bisecia celor trei embrioni buni i transferul
fiecrei jumti la cte o receptoare, este posibil s se obin tot trei viei (50%
gestaie) sau, per total 4 viei. Ctigul de un viel presupune existena a 8
receptoare, n loc de 5. Dac nivelurile gestaiei sunt mai sczute (50%-30%)
sporul de un viel obinut pe o donatoare superovulat este anulat. n condiiile
atingerii unor rezultate normale, prin practicarea biseciei embrionilor se pot
obine, n medie, 4 viei pe donatoare n loc de trei viei, ceea ce presupune un
ctig de 33% a numrului descendenilor provenii de la fiecare femel
superovulat. n aceste condiii, o selecie bine dirijat, accept cu rezerve
pstrarea a mai mult de un singur exemplar al unei familii clonate, din cauza
reduciilor majore survenite n variana genetic i n sporirea consangvinitii. n
aceste circumstane, producerea unor familii biclonate pentru toi indivizii
distinci genetic se poate face numai prin reducerea la jumtate a numrului unor
astfel de indivizi, prin aceasta scznd nsi intensitatea seleciei. Continuarea
bisecionrii embrionilor (clonrii) erodeaz intensitatea seleciei prin reducerea
progresului genetic, mrete consangvinitatea, scderea intensitii seleciei
nefiind compensat prin ctigurile obinute n precizia seleciei sau exactitii
rezultatelor ei (Woolliams G.A., 1989).

100

Biotehnica biseciei embrionilor este totui bun pentru producerea

adevrailor gemeni, necesari testrii unor preparate farmaceutice sau a furajelor,
factorul genetic fiind nlturat.
Obinerea himerelor s-a realizat prin microchirurgie, la rumegtoare i
suine, constnd n amestecul de celule embrionare de la specii diferite.
3.3. Sexarea embrionilor
Determinarea sexului embrionului nu este realizabil dect la vrsta la care
se face transferul acestuia (6-8 zile). Este considerat ca o descoperire economic
de mare importan i const n prelevarea ctorva celule care sunt investigate
citogenetic, imunologic, enzimologic etc. n vederea determinrii sexului
produsului de concepie nc din acest stadiu incipient de dezvoltare.
Metoda genetic (cariotipic) se bazeaz pe recunoaterea citologic a
cromozomului y, specific masculilor. Este vorba de o tehnic ce permite
efectuarea sexrii zigoilor, pornind de la un numr mic de celule prelevate de la
zigoi i care s nu compromit dezvoltarea ulterioar a embrionului. Recent,
folosirea unei sonde moleculare specifice cromozomului y la bovine, pare s
rspund tuturor ateptrilor. Unele echipe de cercetare acioneaz n direcia
trierii spermatozoizilor purttori ai cromozomului x i y , pe baza diferenei
acestora n ce privete coninutul n ADN. Aceast metod, mpreun cu
fecundaia in vitro ar furniza un procedeu ideal care s rspund necesitilor
zootehnice moderne.
Metoda imunologic const n cutarea pe suprafaa celulelor masculine a
antigenului de citocompatibilitate, prin folosirea unor anticorpi monoclonali
specifici pentru acest tip de antigen.
Metoda enzimologic se bazeaz pe faptul c unele enzime celulare sunt
codificate de ctre gene aparinnd cromozomului x. Cantitatea acestor enzime
este , deci, de dou ori mai mare n celulele femele dect n celulele mascule.
Determinarea activitii acestor enzime ntr-un blastomer izolat a permis sexarea
embrionilor ntr-o proporie ridicat.
Tehnica amplificrii ADN (PCR). Dup descoperirea posibilitilor de
amplificare enzimatic dirijate de ADN-ul celular, unii cercettori au dezvoltat o
tehnic de sexare prin amplificarea enzimatic (PCR-Polimerase Chaine Reaction)
a secvenei lor specifice. Sexajul este efectuat pe 5-10 celule prelevate prin
biopsia embrionilor de bun calitate. Plecnd de la aceste celule, determinarea
sexului se sprijin pe detectarea unei secvene specifice a ADN-ului
cromozomului y printr-o sond molecular complementar. Aceast secven este
amplificat de PCR. ADN-ul amplificat este separat prin electroforez i
vizualizat prin fluorescen.
Avnd n vedere tehnicile pentru sexare (evidenierea ADN specific) i
sensibilitatea specific (amplificarea ADN de ordinul a 10 5), biopsia trebuie s fie
realizat n cele mai bune condiii igienice i tehnice.
Sexarea embrionilor nainte de implantare, ofer posibilitatea stabilirii
raportului de sexe ntr-o populaie, n sensul dorit de cresctori funcie de
necesarul de animale de reproducie, carne, lapte etc.

3.4. Transplantarea nucleilor i obinerea de clone

101

Clonajul embrionar const n producerea mai multor animale pornind de la

un singur embrion. Acestea pot fi obinute prin simpla seciune sau disociere a
unui embrion, n stadiul de preimplantare (bisecia embrionilor). Prin aceast
metod s-au produs numeroase perechi de viei gemeni, ns foarte rar s-au putut
obine triplete sau gemeni cvadrupli. Teoretic, tehnica transferului nucleului
permite obinerea unui numr mare de indivizi plecnd de la un singur embrion,
avnd n vedere faptul c patrimoniul genetic al tuturor nucleilor unui embrion
tnr este identic, n sensul c poart aceeai informaie genetic. Transferul
nucleilor celulelor provenite de la acelai embrion n mai multe ovocite enucleate
i activate, este urmat de evoluia ovocitelor spre indivizi genetic identici.
Posibilitatea obinerii de serii de animale identice genetic prezint interese
multiple pentru zootehnie. Astfel, n activitatea de selecie, folosirea unor clone,
chiar limitate numeric, ofer posibilitatea evalurii cu nalt precizie a valorii
reproductorilor. Animale cu acelai genotip, ntreinute n ferme diferite, sunt
exceleni subieci de studiere a influenei factorilor de mediu asupra
performanelor acestora. Totodat, obinerea mai multor copii a reproductorilor
foarte valoroi va contribui la creterea i difuzabilitatea progresului genetic, ns
cu reversul micorrii patrimoniului genetic al efectivelor de animale.
Pentru producie, plecnd de la rasele de carne, embrionii provenii de la
un genitor cu o excelent conformaie (caracter cu coeficient mare de
heritabilitate) vor putea fi multiplicai prin clonare i transplantai, cu producerea
unor loturi de animale cu carcase omogene i de calitate superioar.
De asemenea, pe termen lung, obinerea i comercializarea embrionilor
clonai n mari serii, asociat cu maturarea in vitro vor permite scderea
considerabil a transferului embrionar.
Briggsi i King (1952) au artat c nucleii prelevai, n stadiul de blastul,
la broasc i grefai n ovocite, pot s-i continue dezvoltarea pn la stadiul de
blastul, iar n 1962 Mc Kinnel a obinut, prin aceeai metod, broate adulte.
Pentru embrionul de mamifere, n 1986 Willadsen S., la Cambridge a
obinut pentru prima dat trei miei dup transfer de nuclei, provenii de la un
embrion n stadiul de 8 celule (Heyman Y. i colab., 1991).
La taurine, s-au obinut de ctre diferite echipe de cercettori clone
constituite din 8-9 viei, iar la iepure s-a obinut o clon de 6 indivizi, plecnd de
la un embrion congelat n stadiul de morul.
Transferul de nuclei parcurge trei etape (Heyman Y. i colab., 1991):
- obinerea de ovocite enucleate destinate de a primi nucleii;
- izolarea nucleilor embrionului donator;
- reconstituirea de serii de embrioni monocelulari.
3.4.1. Pregtirea ovocitelor receptoare
Prima operaie const n extragerea genomului maternal al ovocitei
receptoare. Pentru aceasta, se folosesc ovocite mature care, n absena
fecundaiei sau a activrii, se gsesc blocate n stadiul de metafaz II a meiozei.
Retragerea nucleului poate fi realizat prin micromanipulare, ptrunznd cu vrful
unei micropipete n interiorul celulei i aspirnd uor cromozomii. Pentru a se
evita ruperea membranei viteline a ovocitului, cum se ntmpl cel mai adesea,
ovocitele sunt pretratate cu droguri care inhib polimerizarea microfilamentelor i
microfibrilelor scheletului celular.

102

Ovocitele prelevate in vivo, imediat dup ovulaie sau obinute prin

maturare in vitro sunt debarasate de celulele lor periovocitare printr-un
tratament enzimatic cu hialuronidaz i apoi incubate n prezena cytochalasinei B
(5-7 g/ml). Dup denudare, fiecare ovocit este enucleat, prin imobilizare n
depresiunea unei micropipete, apoi cu cea de-a doua micropipet se puncioneaz
zona pelucid, se aspir globulul polar mpreun cu o fraciune de citoplasm
adiacent, coninnd cromozomii metafazici.
3.4.2. Izolarea nucleilor embrionului donator
Embrionul, selecionat ca donator de nuclei, este prelevat n stadiul de
morul, cnd posed 16-64 de celule, funcie de specie i vrsta acestuia. n acest
stadiu evolutiv, punerea n micare a genomului embrionar deja s-a produs. Se
folosesc i embrioni congelai i care se gsesc n stadiul de morul.
Embrionul donator este debarasat cu mult atenie de zona pelucid,
folosind o soluie de tyrode acid. n acest stadiu, celulele au nceput deja s
stabileasc ntre ele relaii funcionale (de exemplu gap-joncion). Pentru
disociere, embrionul este incubat timp de treizeci de minute, ntr-un mediu lipsit
de ioni de calciu, dup care blastomerele pot fi separate, fr leziuni, prin
intermediul unor micropipete.
3.4.3. Reconstituirea embrionilor
Dup separarea blastomerelor, n cel mai scurt timp se introduce fiecare
blastomer n interiorul zonei pelucide a ovocitei receptoare, enucleate n
prealabil.
Dup introducerea blastomerului sub zona pelucid, fuziunea
membranelor celulei donatoare i ovocitul receptor se realizeaz prin
electrofuziune. Pentru aceasta, ovocitul se plaseaz ntre doi electrozi i este supus
la unul sau mai multe impulsuri foarte scurte de curent continuu. Stimulii electrici
provoac pori membranari, destabiliznd straturile de fosfolipide juxtapuse, iar
membranele fuzionate permit astfel nucleului donator s ptrund n noul su
mediu citoplasmatic. Pe de alt parte, stimularea electric activeaz ovocitul
receptor, prin declanarea mecanismelor de reprogramare a nucleului transplantat.
Electrofuziunea se realizeaz ntr-un mediu izotonic i se observ n urmtoarele
treizeci de minute de la stimulare i estimat, fie prin umflarea nucleului donator
n noul su mediu citoplasmatic, fie prin terminarea diviziunii celulare i apariia
stadiului de dou celule.
n prezent, unul din factorii limitani n aplicarea acestei biotehnici l
reprezint numrul relativ redus de ovocite receptoare. Creterea numrului de
ovocite ,,receptoare se poate obine prin maturarea in vitro a acestora, pornind
de la ovarele recuperate n abator de la femelele sacrificate. Tot n plan practic,
este de mare interes posibilitatea congelrii acestor ovocite, astfel nct s se
dispun n orice moment de necesarul de ovocite receptoare. Un alt factor limitant
este reprezentat de numrul relativ redus de celule ale embrionilor de la care
urmeaz s se transfere nucleii.
Cu toate dificultile pe care le ridic, clonajul embrionilor creeaz o nou
cale n optimizarea reproducerii animalelor.

103

3.5. Transgeneza
Ameliorarea efectivelor de animale s-a bazat, tradiional, pe progresele
nregistrate n selecia genetic, dirijarea reproduciei, echilibrul raiilor de hran,
etc. Tehnicile geneticii moleculare ofer, n prezent, noi posibiliti care ncep a fi
exploatate eficient. Astfel, sondele moleculare vor permite cunoaterea
patrimoniului genetic al animalelor iar multiplele combinaii rezultate din mutaie
i asocierea secvenelor de ADN ofer multe posibiliti de reprogramare a unei
celule sau a unui organism ntreg. Astfel, dac o gen izolat este introdus ntr-o
celul, aceasta va sintetiza o nou protein i caracteristicile acestei celule vor
putea fi astfel modificate. De asemenea, dac o gen izolat este introdus ntr-un
organism ntreg, nsuirile genetice ale acestuia vor fi modificate. Aceast operaie
poart numele de transgenez. Gena strin, introdus n noul organism, va fi
transmis la descendeni obinndu-se n acest fel o linie de animale care au
nsuiri biologice noi.
Primele observaii n acest domeniu s-au fcut n 1981 pe oareci. Este
posibil, prin transgenez, obinerea de noi animale, perspectivele deschise de
aceast nou biotehnic fiind considerabile.
Obinerea de animale transgenice include mai multe etape:
- izolarea sau construcia genei de transferat;
- colectarea embrionilor;
- introducerea genei n embrioni;
- transferul embrionului la o femel receptoare;
- identificarea transgenei la nou-nscui;
- msurarea expresiei transgenei;
- stabilirea de linii homozigote, pornind de la animale transgenice
fondatoare.
Izolarea sau construcia genelor se face prin tehnici genetice adecvate
care permit att izolarea ct i mutarea dup voin a oricrei gene. O gen
funcional material sau reconstruit conine totdeauna aceleai elemente:
regiunea regulatore, regiunea codant i terminatorul. Astfel, regiunile care
particip la reglarea transcripiei genei se situeaz n amonte de zona codant.
Colecia de embrioni. Transgeneza fiind o operaie cu randament sczut,
sunt necesari mai muli embrioni pentru a economisi la maximum femele
donatoare. Embrionii pot fi obinui n mai multe moduri:
- prelevnd ovare de la femelele sacrificate la abator;
- prin maturarea ovocitelor in vitro;
- prin practicarea fecundaiei in vitro.
Introducerea genei n embrion se poate realiza prin microinjecie, prin
folosirea de vectori retrovirali sau prin folosirea celulelor ES (Embryo stem cels).
Microinjecia const n injectarea direct a soluiei de ADN n pronucleul
mascul, care este mai mare, mai apropiat de periferia zigotului n momentul
injeciei. Un obstacol important la injectare este dat de opacitatea oulor, ceea ce
face dificil vizualizarea celor doi pronuclei.
Virusurile, nainte de a folosi mecanismul celular pentru replicarea lor,
sunt ,,a priori exceleni vectori pentru a introduce gene strine ntr-o celul.
Retrovirusurile se ncorporeaz n genomul gazd, n general, ntr-o singur copie
i fr rearanjare, deci sunt extrem de utile pentru introducerea genei strine n
celulele somatice n cultur i apoi se reintroduc aceste celule n individ.
Utilizarea celulelor ES, const n izolarea celulelor unui embrion precoce
i cultivarea lor n condiii n care celulele nu se difereniaz. Cnd aceste celule
ES sunt reintroduse ntr-un embrion precoce particip la dezvoltarea embrionului,
dnd natere la animale himere. O gen strin poate fi introdus, prin procedee
clasice de transfer, n celule ES, n cultur. Aceste celule reintroduse n embrion
104

constituie vectorul transgenei. Animalele himere transgenice care rezult sunt

mozaicate. Descendenii lor motenesc sau nu transgena numai dac celulele
germinale parentale conin sau nu transgena.
Transgenele introduse, prin una din aceste metode, se inser n genomul
gazd n poziii imprevizibile.
Introducerea transgenelor se mai poate realiza i prin alte mijloace. Unul
dintre aceste mijloace const n a pune n contact ADN-ul i spermatozoizii i a
proceda apoi la o fecundaie in vitrosau in vivo. O alt cale prin care gena
strin poate fi transferat n celule n cultur, cu o eficacitate nalt, este
electroporaia. Tehnica aceasta const n a supune celulele incubate n prezena
ADN, la cmpuri electrice care destabilizeaz membrana i creeaz pori prin care
ADN-ul ptrunde n celule. Aceast tehnic se folosete i pentru spermatozoizii
i embrionii de mamifere.
Detectarea transgenelor se face prin metode clasice ale geneticii
moleculare. Ele constau n a hibrida un fragment de ADN complementar genei,
radioactivat, cu ADN-ul celular total.
Detecia produilor transgenici const n a evalua expresia transgenelor
prin msurarea cantitii de ARN corespondent. Proteinele derivate din transgene
pot fi msurate n snge, dac sunt secretate, cu ajutorul testului RIA
(radioimunoanaliz). Aceste metode permit s se determine n care organ, tip
celular i moment al dezvoltrii, transgena se exprim.
Tansgeneza a fost ncercat pe multe specii de animale, cu anumite
succese. Randamentul biotehnicii, evaluat n numr de celule transgenice obinute,
raportat la numrul embrionilor microinjectai, variaz mult cu colectivele de
cercettori. O evaluare sumar a acestui randament arat c este nevoie de circa
10 oareci aduli pentru a spera obinerea unuia transgenic, 40 de oi pentru un miel
transgenic i 40 de vaci pentru un viel transgenic. Aceste rezultate arat c preul
de cost al unui produs transgenic este foarte ridicat.
Prin transgenez s-a ncercat obinerea de animale cu un ritm de cretere
accelerat, cu o producie de lapte mai mare i cu un coninut n protein mai
ridicat, cu o producie de carne mai bun, cantitativ i calitativ, rezistente la
diverse maladii etc. Cu toate rezultatele ncurajatoare obinute la diverse specii,
aceast biotehnic se gsete doar la perioada de nceput, necesitnd multe
ajustri, astfel nct randamentul obinut s micoreze preul de cost al produsului
transgenic i care s fie conform cu normele sanitare i sanitar-veterinare
internaionale etc.

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
105

1. Aughtry, S.D., 1987 - Embryo Transfer, 2, 3, p 3-4

2. Baril, G. i colab., 1993 - Manuel de formation pour l'insmination artificielle
ches les ovins et les caprins. Etude FAO, Roma.
3. Baril, G. i colab, 1993 - Manuel de formation practique pour la
transplantation embryonnaire chez la brebis et la chevre. Etude FAO,
Roma.
4. Bogdan, Al. i colab., 1981 - Reproducia animalelor de ferm. Edit.Scrisul
romnesc, Craiova
5. Bogdan, Al. i colab.,1984,1985 - Fertilitatea, natalitatea i prolificitatea n
zootehnie, vol I i II, Edit Dacia, Cluj-Napoca
6. Boitor, I., 1979 - Endocrinologia reproduciei la animalele de ferm. Edit.
Ceres, Bucureti
7. Bunaciu, P., 1977 - nsmnarea artificial a ginilor de reproducie ntreinute
n baterii. Rev. de cretere a animalelor, nr. 10
8. Crlan, M., 1982 - Sincronizarea cldurilor i ovulaiei la taurine. Redacia de
propagand tehnic agricol, Bucureti
9. Confederat Margareta, 1998 - Cercetri cu privire la influena alimentaiei
asupra supravieuirii embrionilor la caprine n condiiile efecturii
transferului de embrioni. Tez de doctorat, Univ. Agron. i de Med. Vet.,
Iai
10. Drugociu, G. i colab., 1977 - Patologia reproduciei i clinic obstetrical.
Edit. Did. i Ped., Bucureti
11. Dumitrescu, I. i colab., 1976 - Reproducia la bovine. Edit Ceres, Bucureti
12. Dumitrescu, I. i colab., 1978 - nsmnrile artificiale la animale. Edit.
Ceres, Bucureti
13. Dumitrescu, I., 1987 - Reproducia la cabaline. Edit. Ceres, Bucureti
14. Elsden Peter, R., 1987 - Manual for embryo transfer, 6599 Country Rd. 29C,
Bellvue, , USA
15. Feredean, T., 1974 - Reproducia la porcine. Edit. Ceres, Bucureti
16. Feredean, T., Drume, Ch., 1977 - Transferul de embrioni la animale. Edit.
Ceres, Bucureti
17. Gluhovschi, N. i colab., 1972 - Biologia i patologia reproduciei. Edit. Did.
i Ped.,Bucureti
18. Groza, {t. I., 1996 - Actualiti i perspective n biotehnologia transferului de
embrioni la specia ovin. Edit. Ceres, Bucureti
19. Halga, P. i colab., 1999 Alimentaia i reproducia la erbivore domestice.
Edit. Dosoftei, Iai
20. Hansel, W. i colab.,1983 - Fiziologia ciclului estral. Rev. Soc. de Med. Vet.,
Bucureti
21. Haubebine, L. M., 1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 323-333
22. Heyman, Y., Chesne, Renard, J.P.,1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 315-322
23. Liciu, Gh., Roca, O., 1988 - Ghid tehnic privind nsmnarea la ovine i
caprine. Edit. Ceres, Bucureti
24. Liciu, GH.,Roca, O., 1998 Tehnica nsmnrii artificiale la bovine
Ghid practic. Edit. Ceres, Bucureti.
25. Liciu, GH., Roca, O., 1999 - Tehnica nsmnrii artificiale la suine - Ghid
practic. Edit. Ceres, Bucureti.

106

26. Mantea, {t., 1998 - Contribuii la biotehnologia transferului de embrioni la

suine. Tez de doctorat, Fac. de Med. Vet., Bucureti
27. Mapletoft, R. J., 1987 - Embryo Transfer, 2, 3, p. 4-6
28. Marquant, Le Guienne, 1991 Rec. de Med. Vet., Ian. 167, nr. 314, p. 303312
29. Nibart, M., 1991 - Rec. de Med. Vet., 167(314), 261-290
30. Paraipan, V., 1982 - Hormonoterapia n reproducia animalelor. Edit. Ceres,
Bucureti
31. Paraschivescu, M., 1969 - Reproducia la ovine. Edit. Agro-Silvic, Bucureti
32. Peyraud, J. C., 1986 - La transplantion embryonnaire s'implante, Elevage
2000, nr. 1, p. 47-49
33. Roca, O ., 1994 - Biotehnica reproduciei la porcine prin nsmnare
artificial. Edit. Ceres, Bucureti
34. Runceanu, L.,1995 - Reproducia i patologia reproduciei. Lito., Univ.
Agron. Iai
35. Sauveur, B., Reviers, M., 1988 - Reproduction des volailles et production
d'oeufs. INRA, Station de Recharches Avicoles, Paris
36. Seiciu, Fl. i colab.,1989 - Reproducia normal i patologic la animalele
domestice, vol. I i II, Edit. Ceres, Bucureti
37. Tnase, D.,1993 - Biologia reproducerii animalelor i transferul de embrioni .
Lito., Univ. Agron. Iai
38. Tnase, D.,1995 - Biologia i patologia reproducerii animalelor. Curs, Lito.,
Univ. Agron. Iai
39. Vallet, J. Ch. i colab., 1991 - Rec. Med. Vet., 167(314), 293-301
40. Woolliams, G. A., 1989 - Animal Production, t 48, partea I, p.31-36, Anglia

107