tehnici de reproducere asistat in vitro

maturarea in vitro a ovocitelor i embrionilor

fecundaia in vitro
clonarea
transgeneza

maturarea ovocitar presupune:
ruperea membranei nucleare
completarea primei diviziuni meiotice i expulzia primului globul polar ; rezult
ovocita secundar. Se formeaz placa metafazic pentru cea de-a doua
diviziune meiotic
ovulaia

asigurarea condiiilor optime permite maturarea ovocitar in vitro
se recolteaz ovocite din foliculi maturi
se cultiv n medii de cultur suplimentate cu gonadotropine i steroizi

bovine
OPU - aspirare transvaginal ghidat ecografic
IVM - medii de cultur + steroizi + celule ale granuloasei sau linii celulare
speciale
IVF - ovocit + spermatozoizi
IVC - embrion + mediu special (SOF)
IVP = IVM + IVF + IVC
Cabaline
rat sczut a IVF
reuita IVC condiionat de mediul de cultur - n general comercial (15%), dar
dac se adaug lichid folicular, se ajunge la atingerea metafazei II n 68,5%
din cazuri
Porcine
obstacole
maturarea ovocitelor (nuclear i citoplasmatic)
dezvoltarea de la stadiul de unic celul la blastocist
polispermia

fecundaia in vitro
etapele eseniale ale fecundaiei
ataarea gameilor
blocarea polispermiei
formarea pronucleilor (femel i mascul)
unirea pronucleilor
amfimixia

fecundaia in vitro (IVF)
ovocitele reiau meioza - competen meiotic
colectarea i capcitarea spermatozoizilor
colectarea i fecundarea ovocitelor
condiiile necesare realizrii IVF
maturarea nuclear i citoplasmatic a gameilor n gonade
dezvoltarea capacitii fecundante a gameilor n tracturile reproductive ale
masculului i femelei
un numr optim de spermatozoizi cu capacitate fecundant normal i micri
viguroase
o ovocit fecundabil care s posede deja primul globul polar


CLONAREA
ansamblul de tehnici prin care se pot produce pe cale asexuat, celule sau
organisme IDENTICE din punct de vedere genetic
injectarea intracitoplasmatic a spermatozoidului
transferul nuclear

ICSI = Injectarea Intracitoplasmatic a Spermatozoidului
etapele premergtoare fecundaiei
zigoii generai prin ICSI: remodelri nucleare anormale ; afectarea cromatinei
pe parcursul decondensrii ADN
organismele obinute consecutiv ICSI:
infertilitate crescut la masculi
aberaii cromozomiale la hetero- i autozomi
anomalii mentale, fizice, reproductive

ROSNI = Tehnica Injectrii Intracitoplasmatice a Nucleului Spermatidelor
Rotunde
dac nucleul spermatidei posed o capacitate redus de a activa ovocita, se impune
i aplicarea unui tratament de activare a ovocitei

transferul nuclear
introducerea nucleului aparinnd unei celule totipotente (ovocit fecundat sau
zigot) donatoare ntr-o ovocit matur enucleat
embrionul dezvoltat va fi transferat unei mame surogat pentru a se dezvolta n
continuare

totipotena
potenialul de a iniia i regla un proces normal de dezvoltare
OVOCITA FECUNDAT i ZIGOTUL au proprietatea de a genera un nou
organism = TOTIPOTENTE
materialul genetic donator este introdus n citoplasma reecptoarei prin
fuziunea realizat ntre celulele donatoare i receptoare
se produce implicit introducerea materialului genetic i a citoplasmei
nucleul donator (i NU celula receptoare) trebuie s rspund provocrilor
noului mediu, din acest motiv nucleul putnd fi definit drept TOTIPOTENT

etap: nlturarea materialului genetic din ovocita receptoare (enucleerea)
nlturarea unor componeni citoplasmatici i reducerea viabilitii citoplasmei
descreterea numrului total de celule ale blastocitilor clonai
numrul redus de celule determin gradul redus de viabilitate a embrionilor
clonai

sincronizarea ciclurilor celulare ntre carioplastul donator i citoplasma receptoare
remodelarea nuclear i sinteza de ADN sunt desvrite n primele 24 de ore
consecutiv transferului nuclear n ovocita enucleat

sincronizarea ciclurilor celulare:
blocarea embrionilor n profaz prin intermediul unor ageni medicamentoi
care blocheaz funcionarea citoscheletului
ntrebuinarea ovocitelor enucleate pre-activate, pe post de citoplasm

Nucleii donatori trebuie s fie n fazele G0 sau G1, altminteri rezult alterri
ireversibile ale cromatinei i aneuploidie
Lungimea primului ciclu celular al embrionului determin capacitatea de
supravieuire (dac este mai lung, rezult embrioni viabili)

Reprogramarea nuclear
evoluia de la stadiul de ZIGOT la stadiul de BLASTOCIST, a necesitat un
interval identic de timp pentru embrionii obinui prin fecundare sau transfer
nuclear
nucleii donatori au fost reprogramai (s-au ntors n acelai cadru de
dezvoltare morfologic i temporal ca i zigotul)

Dominko i col., 1998
citoplasma ovocitelor de bovine deine capacitatea de a reprograma nucleii celulelor
somatice provenii de la diferite specii de mamifere i de a iniia dezvoltarea
embrionar timpurie

CLONAREA - ETAPE
extragerea materialului genetic din celula receptoare (ovocit)
transplantul nucleului n citoplasma ovocitei enucleate
materialul este plasat ntre ZP i ovocit
fuziunea are loc n urma unui stimul electric, care creeaz spaii n membran
iniierea diviziunii celulare are loc prin modificarea concentraiei intracelulare a
calciului
Se prefer ca ovocita s nu fie fecundat, a.. s accepte nucleul donator ca fiind
cel propriu
Este bine ca celula donatoare s fie n stadiul G
o
(Gap Zero), un stadiu de
somnolen. n stadiul G
o
procesele metabolice sunt inactivate, nucleul este mai
uor reprogramat i mai bine acceptat de ctre ovocita receptoare.

Tehnica ROSLIN:
1. Celula donatoare (care va asigura materialul genetic) se cultiv (etapa este
foarte util cnd se urmrete modificarea materialului genetic)
2. Din cultur se ia celula donatoare creia i se restricioneaz nutrienii pn la
limita supravieuirii. Astfel, toate genele i vor nceta activitatea i vor intra n
stadiul G
o
.
3. Ovocia va fi enucleat i plasat lng celula donatoare i prin intermediul
unui stimul electric, cele dou celule se vor contopi, n acelai timp activndu-
se i dezvoltarea embrionului.
4. Dac embrionul supravieuiete, va fi cultivat timp de ase zile (n incubator
sau n oviductul unei femele cu rezultate mult mai bune), i n final transferat
n uterul mamei purttoare.
Tehnica Honolulu.
Spre deosebire de precedenta, care oblig celulele s intre n G
o
, tehnica Honolulu
utilizeaz celule Sertoli, celule cerebrale (care rmn n mod natural n G
o
), precum
i celule ale cumulus oophorus, care aproape ntotdeauna se afl n stadiul G
o
sau n
stadiul G
1
.

Animalele obinute consecutiv transferului nuclear (NT) nu sunt clone n adevratul
sens al cuvntului, fiind diferite de gemenii monozigotici prin:
ADN mitocondrial diferit provenit de la ovocita receptoare
mutaii punctiforme
mecanisme diferite de inactivare a cromozomului X la femele
alte modificri EPIGENETICE determinate de cultivarea in vitro
diferene aprute ca rezultat al influenei mediului

Transfecia (transfection) = inseria construciei genice (ADN propriu + ADN strin)
n celul ; nu se poate anticipa locul de inserie i nu se poate ti dac va funciona
corect, sau nu va genera o mutaie nociv

METODE ALTERNATIVE LA MICROMANIPULARE
1. Bombardamentul cu microproiectile
microproiectile de tungsten cptuite cu o plasmid
se bombardeaz embrionul i se introduce ADN-ul n embrion
2. Electroporaia spermatozoizilor
Presupune introducerea materialului genetic strin (plasmide) n SPE, cu
ajutorul unor microocuri electrice (50 V timp de 40 microsecunde) care nu
afecteaz mobilitatea SPE ; utilizai apoi pentru IVF
Studiile efectuate pe sperm de taur au demonstrat c:
SPE de taur pot captura ADN exogen naintea fecundaiei
SPE de taur transfectai pot produce fecundaia
embrionii rezultai exprim genele transfectate i ARNm al acestora
3. Lipofecia
ADN-ul exogen poate fi introdus n SPE prin cuplare spontan sau lipofecie
(utilizarea lipozomilor pentru transportarea ADN-ului exogen n celule)


RISCURILE CLONRII
procent crescut de eecuri - rata succesului n cazul TN variaz ntre 0,1 i 3% (din
1000 de ncercri, rezult ntre 1 i 30 de clone)
ovocita enucleat i nucleul transferat pot fi incompatibile
ovocita cu noul nucleu poate s nu se divid sau dezvolta corespunztor
implantarea embrionului poate eua
gestaia poate eua
probleme n dezvoltare
LOS clonele au organele interne anormal de mari probleme respiratorii,
circulatorii i de alt natur
deoarece LOS nu apare ntotdeauna, nu se poate prevedea care clone l vor
exterioriza
unele clone fr LOS au malformaii renale sau cerebrale, disfuncii imunitare,
genernd probleme ulterioare
deficiene imunitare
vieii produi prin clonare au evideniat deficiene n funcionarea sistemului
imunitar
scderea imunitii este normal odat cu mbtrnirea dar la animalele
clonate este accelerat, determinnd apariia pneumoniilor i altor insuficiene
imunitare
la oarecii clonai, morbiditatea i mortalitatea crescute s-au datorat
disfunciilor hepatice i pulmonare
modaliti anormale de exprimare a genelor
n embrionul natural, ADN-ul este programat s exprime UN ANUMIT set de
gene.
pe msura diferenierii celulelor embrionare, programul se modific
pentru fiecare tip de celule difereniate (piele, elemente sanguine, esut osos
sau nervos, de exemplu) programele sunt diferite
la clone, nucleul transferat NU are acelai program ca embrionul natural.
Reprogramarea complet (artificial realizat de om) este necesar
dezvoltrii ct mai apropiate de normal. Reprogramarea incomplet condamn
embrionul.
telomerii
telomerii secvene terminale ale ADN alctuite din repetri ale TTAGGG.
la fiecare diviziune telomerii se scurteaz cte un pic, pn ajung att de
scuri nct nu mai sunt posibile diviziuni
prezena lor la captul cromozomilor previne pierderea materialului genetic pe
parcursul diviziunilor, precum i alipirea accidental a capetelor diferiilor
cromozomi
telomeraza
enzima (ribonucleoprotein) care adaug secvene repetate de telomer la
captul 3 al ADN-ului
se gsete n celulele germinale
se gsete n celulele canceroase
n unele tipuri de celule umane, scurt timp, de-a lungul fazei S a ciclului celular
activitate INTENS n blastociti, sistemele IVF, partenogenetice i de TN
la om i oarece a fost evideniat un mecanism de reprogramare a telomerazei
pe parcursul dezvoltrii embrionare timpurii
embrionii clone bovine au evideniat o dinamic a telomerazei similar cu cea
a embrionilor generai prin IVF sau PA
telomerii i mbtrnirea
majoritatea celulelor de om se divid de 30-50 de ori nainte de a-i nceta
reproducerea, ajungnd la senescen
se admite c senescena este legat de lungimea telomerilor deoarece prin
adugarea telomerazei, enzima care lungete telomerii, celulele se pot
reproduce la infinit
telomerii i cancerul
telomeraza este enzima care regleaz orarul mitotic sau celular; telomeraza
lungete i consolideaz telomerii scurtai, nlocuind fragmentele de ADN
pierdute pe parcursul diviziunilor obinuite
la om, exist tot mai multe dovezi c telomerii scuri contribuie direct la
declanarea fazelor timpurii n anumite tipuri de cancer
telomeraza se regsete n peste 90% din formele de cancer ntlnite la om
diferene ale telomerilor
lungimea telomerilor (secvenele de ADN de la capetele cromozomilor) scade
pe msura parcurgerii diviziunilor celulare, fiind un etalon al vrstei
telomerii cromozomilor aparinnd VACILOR sau OARECILOR clonai sunt
MAI LUNGI dect normalul
la OAIE (vezi Dolly) sunt MAI SCURI mbtrnire mai rapid ?


t tr ra an ns sg ge en ne ez za a
rezultatul injectrii directe a genelor strine n celula primordial a unui organism n
dezvoltare
animalele transgenice pot exterioriza o larg varietate de noi fenotipuri consecutiv
exprimrii ADN-ului moleculelor exogene

tehnologia transgenic = transferul unui segment de ADN supus ingineriei genetice
(o construcie de ADN) n materialul genetic al altei (altor) specii
TT - n laptele vacilor:
promotorul genei -globulinei (orice protein)
alfa1-antitripsina (tratament fibroza chistic)
fibrinogen (hemostaza n plgile de mari dimensiuni)
lipaz (tratament de substituie n pancreatite)

XENO-TRANSPLANTUL = utilizarea organelor provenite de la alte specii (animale)
SUA:
la fiecare 16 minute un nume nou se adaug listei de ateptare
zilnic mor 11 pacieni n ateptare
anual : 30 miliarde dolari cheltuii cu pacienii aflai n stadiile finale ale
afeciunilor fatale
supravieuirea organelor transplantate
incorporarea n sistemul circulator al corpului omenesc
interfaa dintre afluxul sanguin al corpului omenesc i organul transplantat
(porc)
respingerea grefelor
supra-acut
tardiv (DXR = delayed xenograft rejection)
pe termen lung (LTR = long time rejection)


GENOMICS (genomica) are trei ramuri:
S St tr ru uc ct tu ur ra al l g ge en no om mi ic cs s ( (g ge en no om mi ic ca a s st tr ru uc ct tu ur ra al l ) ) reprezint studiul secvenelor de
ADN la nivel cromozomial precum i la nivelul primei transcrieri. Aceste secvene pot
fi studiate pentru a compara diferenele de secven care creeaz variaia genetic
prin intermediul diferitelor alele. Aceast informaie structural poate fi utilizat pentru
compararea genoamelor diferitelor specii asigurnd o imagine de profunzime
referitoare la funcionarea genelor care codific proteinele
F Fu un nc ct ti io on na al l g ge en no om mi ic cs s ( (g ge en no om mi ic ca a f fu un nc c i io on na al l ) ) are drept scop elucidarea funciilor
multor gene prin studierea diferenelor dintre mecanismele de dezvoltare precum i a
celor de transcripie n diferite esuturi, comparativ cu martorul. De exemplu,
studierea modificrilor pe care le parcurge o celul normal atunci cnd devine celul
canceroas.
P Pr ro ot te eo om mi ic cs s ( (p pr ro ot te eo om mi ic ca a) ) studiaz modul n care transcripia ARN este remodelat
i genereaz proteine, precum i modul n care proteinele interacioneaz pentru a
regla diferite funcii ale organismului.

Markeri ADN
Microsateliii (MCS) sunt compui din secvene repetitive de AND (repetri de 2
pn la 6 baze) dispersate n genom i gsite n general n regiuni necodate. Aceste
regiuni repetitive sunt supuse unor adugiri sau extrageri ale poriunilor repetitive.
Markerii MCS sunt utilizai n identificarea prinilor i a indivizilor la om, cine,
bovine i multe alte specii.

Markerii SNP
Genele care codific informaia (GC) care va fi transcris n ARNm i apoi tradus n
protein, sunt dispersate de-a lungul cromozomului, avnd aezate ntre ele
segmente de ADN care nu codific nimic. La om, genele care codific au fost
identificate la fiecare aproximativ 40 200 de kb (kilobaze). Unele segmente
cromozomiale cuprind grupri de gene, n timp ce altele sunt lipsite de gene. Venter
i al. (2001) au artat c 20% din genomul uman are regiuni mai mari de 500.000 de
baze care nu conin nicio gen.
GC au fost cartografiate n funcie de variaia de secven identificat la interiorul lor
sau lng ele, prin identificarea uneia sau mai multor modificri la nivel de nucleotid
(single nucleotide changes or polymorphisms SNPs). Acest tip de variaie a fost
identificat prin analizarea secvenei de ADN cu o enzim restrictiv care recunoate
modificrile i decupeaz ADN-ul sau l las intact. Polimorfismul este apoi analizat
prin separarea fragmentelor i compararea lungimilor ADN-ului; unde enzima
recunoate secvena, se formeaz dou fragmente mei scurte; unde nu o
recunoate, rmne un fragment mai lung de ADN.
Aceast analiz reprezint fundamentul RFLP (restriction fragment length
polymorphism analysis).
Markerii SNP pot fi identificai chiar dac sunt dispersai de-a lungul tuturor
cromozomilor, conferind avantaje importante n analiza genomului. SNP sunt foarte
rspndii i asigur mai muli poteniali markeri lng locusurile de interes.
Unii SNP sunt localizai n regiunea codificatoare a unei gene afectnd funcionarea
proteinei care poate fi direct responsabil pentru variabilitatea unui anumit caracter
ntre indivizi. Ali SNP sunt situai mai sus sau mai jos de gena codificatoare i pot
influena reglarea exprimrii genei. Alii apar n locuri n care nu influeneaz
structura sau producerea unei proteine.
SNP prezint avantajul de a fi mai stabili i de a nu suferi aa uor mutaii spontane,
fiind transmii ereditar cu o stabilitate mai mare dect MCS.
Markerii moleculari, precum MCS i SNP identific sau marcheaz segmente unice
ale cromozomilor, permind cartarea segmentelor, urmrirea transmiterii unui
cromozom i asocierea cu caracteristicile productive urmrite.

S Se el le ec c i ia a b ba az za at t p pe e m ma ar rk ke er ri i
Se utilizeaz pentru identificarea transmiterii genelor de la prini la descendeni.
Dac markerul a fost testat i validat, poate servi ca indicator al unei anumite gene
care influeneaz un caracter cantitativ (quantitativ trait locus QTL). Acest tip de
selecie este utilizat n cadrul unei familii care are dou copii diferite sau alele ale
genei care influeneaz un anumit caracter, n situaia n care una dintre gene este
preferat celeilalte. Markerul genetic poate fi utilizat pentru a determina care
descendent a motenit forma favorabil a QTL.
Selecia presupune parcurgerea unui program de testare n trei faze:
IDENTIFICAREA localizrii i dimensiunii QTL
RAFINAREA locaiei prin identificarea markerilor situai de fiecare parte a QTL
(markeri de flancare)
VALIDAREA localizrii i efectelor QTL