Manipularea genetică la

animale

Student: Asavei Elena

Ailoaei Angela

http://www.free-powerpoint-templates-design.com
 Cuprins
1 Ce este un organism modificat genetic? OGM

2 Transferul nuclear

3 Domenii de aplicare ale transgenezei

animale
4 Avantaje și riscuri generate de transgeneza
animală
 Ce este un organism modificat genetic? OGM
Odată cu începutul anilor 1970, o serie de tehnici de manipulare
directă a genelor de către om permit extragerea unei gene din genomul
unui organism și reimplantarea ei în genomul unui alt organism.

OGM desemnează, așadar, orice organism al cărui patrimoniu genetic a fost

modificat prin mecanisme specifice. Practic, obținerea unui OGM implică
următoarele etape principale:
 identificarea și pregătirea (multiplicarea) genei de interes;
 introducerea ei (prin diverși vectori) în celula gazdă;
 selectarea celulelor
Your Picturegazdă
Here care au integrat transgena în genomul lor;
 obținerea, în cazul organismelor pluricelulare, a unui nou organism pornind de la o
singură celulă transgenizată;
 verificarea transmiterii ereditare a caracterului codat de transgenă, la descendenții
organismului transgenic.

Pentru introducerea transgenelor în celule există două mari tipuri de metode:

metode indirecte, care fac apel la anumite bacterii capabile de a introduce, în mod
natural, o parte din ADN-ul lor în celulele gazdă și metode directe. Acestea din urmă
folosesc o serie de tehnici, cum ar fi microinjecția celulară, electroperforarea
membranelor celulare (prin șocuri electrice care produc micro-pori), biolistica (,,gene
gun’’, utilizarea unui tun de gene, în care proiectilele sunt microparticule de aur sau
tungsten învelite de genele de interes).
 Your Picture Here
Manipularea genetică a animalelor a revoluţionat modul în care percepem biologia,
Your Picture Here

făcând posibilă testarea funcţiei şi expresiei genelor la nivelul întregului organism animal.
Tehnicile de transfer ale genelor au condus la obţinerea animalelor transgenice, în care
fiecare celulă poartă noi informaţii genetice.

În cele mai multe cazuri, aceasta implică extragerea ADN-ului dintr-un organism si
reimplantarea lui ovocitului în dezvoltare, oului sau embrionul timpuriu altui organism.
La șoareci, este de asemenea posibil să se utilizeze celule stem din culturi de celule, care
pot contribui/participa la formarea/diferenţierea tuturor țesuturilor animale în curs de
dezvoltare (inclusiv linia germinală) dacă acestea sunt introduse într-o celulă embrionară
în etapa corectă de dezvoltare embrionară.
 Aceste celule sunt remarcant de ameliorabile în recombinarea
omoloagă, care le permite să fie utilizate pentru țintirea genelor,
înlocuirea exactă a unui segment al genomului endogen cu un segment
omolog de ADN exogen. Ţintirea genelor poate fi utilizată pentru
înlocuirea genelor endogene cu o copie complet nefuncțională (o alelă
nulă) sau la efectuarea unor modificări subtile, ambele permițând
testarea funcției genelor endogene. Aceeași tehnologie poate fi utilizată
şi în scop opus, adică la înlocuirea unei alele mutante cu o copie
funcțională.

Cele mai mari progrese s-au făcut cu o varietate de tipuri de

organisme cum sunt Drosophila, Xenopus şi soareci.

Dolly, prima oaie produsă în urma transferului nucleului dintr-o

celulă somatică adultă într-o celulă ou anucleată, a deschis calea
clonării animalelor și producerea rapidă a unei cirezi transgenice de
elită.
Au fost dezvoltate trei metode majore pentru producerea
șoarecilor transgenici
1.

Toate aceste metode necesită

recoltarea de ouă fertilizate sau de
embrioni timpurii de la mamele
donatoare, o scurtă cultură in vitro și
2.
apoi reimplantarea lor la mame 3.

purtătoare, unde continuă dezvoltarea

până la termen.
Mamiferele modificate genetic nu au fost
utilizate doar pentru a studia funcția şi reglatorii
genelor, dar și ca producători de bioreactori -
proteine ​recombinante valoroase, de ex. în
laptele lor.
 Microinjecția pronucleului implică transferul direct de ADN în pronucleul masculin a
oului fecundat de șoarece
Această tehnică a fost prima
strategie folosită pentru a obţine şoareci
transgenici în 1974, prin injectarea unui
virus SV40 (Simian virus) în ovocitul
fecundat.
Ovocitul a fost implantat mamei
purtatoare, unde a continuat dezvoltarea
embrionului, astfel obtinându-se prima
generaţie de şoareci transgenici.
 În 1986 au fost obtinuţi şoareci transgenici prin injectarea ADN-
ului viral în proucleul de origine paternă, înainte de fuziunea dintre cei
2 pronuclei. Embrionii injectaţi au fost ţinuţi in vitro până în stadiul de
morulă (mură) si apoi implantaţi în mama purtătoare.

ADN-ul exogen se poate integra imediat, sau poate rămâne

extracromozomial pentru una sau mai multe diviziuni celulare.
Între 5-40 % dintre embrionii implantaţi ajung să se dezvolte şi să
posede gene transgenice, însă o dată gena integrată în genom, s-a
observat că aceasta se transmite generaţiilor următoare. Locul în care
gena se integrează în genom pare să fie aleatorie şi poate depinde de
rupturile care survin la nivelul cromosomilor, de asemenea deleţiile şi
rearanjamentele din ADN-ul genomic sunt frecvent legate de
integrarea transgenelor.
 Șoarecii transgenici pot fi produși prin
transfecția celulelor stem, urmată de crearea
embrionilor himerici

Celulele stem au capacitatea de a se diferenţia în

orice tip de ţesut care contribuie la dezvoltarea
embrionilor. Capacitatea celulelor stem de a participa
la procesele germinative necesită condiţii speciale de
cultivare în care să poată fi păstrate în stare
nediferenţiată. În culturi, ADN-ul poate fi implantat
prin transfecţie virală sau transducţie în celulele
stem.

Pentru a confirma că transgena a fost integrată,

se efectuează teste de PCR sau blotting.
 Celulele stem transfectate sunt introduse în embrionul şoarecelui gazdă în faza de
blastocit, unde se amestecă printre celelalte celule din embrion. Acest proces produce un
embrion himeric. Majoritatea celulelor stem care sunt folosite, provin de la şoareci maro
(agouti), tulpina 129, cu gena dominantă.

Iar strategic, embrionii folosiţi sunt negri, cu gena recesivă, tulpina C57BL/6J.

Amestecul de gene poate fi observat în faza embrionară prin utilizarea unor markeri
specifici, iar embrionul rezultat în urma acestei combinaţii este o himeră a cărei blăniţă are
pete negre şi maro. Dacă celulele stem implantate au participat la procesele germinative,
atunci împerecherea dintre un şoarece himeric mascul cu un şoarece negru femelă, duc la
obţinerea unei noi generaţii de şoareci transgenici heterozigoţi cu blanita maro (agouti), ceea
ce confirmă că ADN-ul exogen s-a transmis generaţiilor următoare.
 Vectorii care vizează gene pot modifica genele prin adiţie sau substituţie

Injecţia pronucleară este foarte

utilă pentru adiţia ADN-ului exogen în
genomul şoarecelui, însă în multe
cazuri este dorită modificarea întreg
genomului endogen în aşa manieră, de
a introduce o anumită mutaţie într-o
genă preselectată.

Două tipuri de vectori de direcționare au fost dezvoltaţi în acest scop:

 Vectori de inserție/adiţie și
 Vectori de înlocuire/substituţie
Vectorii de inserție sunt aliniaţi în regiunea omoloagă, rezultând inserția întregului vector în locusul țintă.
Vectorii de înlocuire sunt aliniaţi astfel încât regiunea de omologie este aliniată cu regiunea țintă.
 Sunt utilizaţi vectori plasmidiali specializați care iniţiază
recombinarea omoloagă atunci când sunt introduşi în celulele stem. Se
realizează prin includerea unei regiuni de omologie, omoloagă cu gena
țintă, permițând direcționarea vectorilor pentru a sinapsa cu ADN-ul
endogen.
Recombinarea este mai eficientă dacă vectorul este aliniat cu
secvenţa înainte de transfecție. Se urmăreşte perturbarea locilor
endogeni, rezultând o „eliminare genică”.

Se consideră că atât vectorii de inserție cât și vectorii de înlocuire

sunt la fel de eficienţi, însă vectorii de înlocuire au fost utilizaţi în
majoritatea experimentelor knockout. În cazul ambelor tipuri de vectori
este posibil să apară regiuni transcrise în locusul vizat, ducând la
producerea unei cantităţi mai scăzute de ARN.
 Transferul nuclear

Transferul nuclear este o formă de clonare. Deși principiul metodei este

foarte simplu, ea necesită numeroase încercări, deoarece rata reușitei este foarte
scăzută: între 10% și 15% pentru formarea embrionilor și între 1-5% pentru
obținerea indivizilor.
Clonajul reproductiv este o tehnică ce permite obținerea nașterii unui
organism nou, fără a face apel la reproducerea sexuată. Individul clonat se naște
dintr-un ovocit enucleat și nucleul unei celule somatice.
 Procedura de bază, prin care un nucleu celular viu este transplantat la un ou, a fost stabilită de Briggs și
King (1952). Ei au folosit Rana pipiens și au aspirat o blastulă într-o micropipetă, astfel încât peretele celular
a fost rupt, dar nucleul a rămas intact și acoperit de citoplasmă. Întreaga celulă a fost injectată într-un ou
nefertilizat în a doua metafază meiotică (M2).

Oul a fost enucleat manual prin îndepartarea plăcii metafazice cu cromozomi. Aceeași procedură a fost
folosită și pentru ouăle de Xenopus, cu excepția faptului că cromozomii au fost distruși prin iradiere cu
ultraviolete. Dimensiunea mare a oului de la amfibieni și puterea scăzută de penetrare a radianții ultraviolete
asigură că nu se produc daune semnificative restului oului. Nucleul donator poate fi introdus în oul enucleat
cu o micropipeta având loc fuziunea lor, în unele cazuri această fuziune se realizează prin aplicarea unui șoc
electric. Șocul electric activează dezvoltarea embrionară prin stimularea mobilizării ionilor de calciu.
Un progres major a fost realizat în 1995 când
s-au obținut prin transfer nuclear din cultură
de celule embrionare 2 miei, Megan și
Morgan.
Același grup de cercetători a raportat nașterea oii
Dolly (5 iulie 1996) în urma transferului nuclear
de la o linie de celule adulte din glanda mamară.
Este primul animal obținut prin transfer nuclear
plecând de la o celulă adultă specializată.
 Your Picture Here
Dolly are trei ,,mame’’: una de la care a provenit oul, una de la care provine ADN-ul și cea care a dus
embrionul până la termen. Producerea lui Dolly a demonstrat că genele din nucleul unei celule somatice
mature diferențiate au capacitatea de a reveni la stadiul embrionar totiponet, rezultând celule nespecializate.
Dolly a produs 6 miei în total, Bonnie nascut in 1998, gemenii Sally si Rosie in 1999 si tripletii Lucy,
Darcy si Cotton in 2000. Dolly a fost eutanasiată pe 14 februarie 2003 deoarece suferea de o boală
pulmonară și artrita severă.

Prima clonare de succes a unei specii de primate folosind aceeași metodă pentru producerea Dolly a
fost raportată în ianuarie 2018. Două clone identice ale unei maimuțe macaque, Zhong Zhong și Hua Hua,
au fost create de cercetătorii din China și s-au născut la sfârșitul anului 2017.
 Domenii de aplicare ale transgenezei animale

Aceste domenii sunt foarte diversificate, căci ele privesc deopotrivă cercetarea în
biologie și medicină, în farmacie și agricultură.

 animale transgenice ca modele experimentale

Ca și înaintea ‘erei transgenice’, șoarecele reprezintă și acum animalul favorit pentru
experimentatori. Mii de mutante transgenice au fost create pentru studierea funcțiilor genelor
și reglarea expresiei lor. Una dintre experiențele cele mai spectaculoase a fost crearea unui
șoarece verde luminescent, realizare a cercetătorilor japonezi, care au transferat gena
responsabilă pentru bioluminescență (GFP= green fluorescent protein) de la o meduză la un
șoarece. Utilizată ca marker, această genă permite observarea, cu ochiul liber în întuneric, a
prezenței unei transgene de interes.
 Tot în Japonia, recent s-a reușit integrarea în genomul unui șoarece a întregului cromozom II
uman, care joacă un rol important în sistemul imunitar. Acest șoarece nou sintetizează atât
anticorpi de șoarece, cât și anticorpi umani, constituind un excelent model experimental.
Inhibând o serie de gene, cercetătorii spanioli au obținut un șoarece rezistent la cancerul de piele,
cei italieni au creat șoarecele ,, Mathusalem’’, a cărui speranța de viață este cu 30% mai mare decât
normalul.
 animale transgenice producătoare de medicamente
Gene umane au fost transferate în genomul animalelor domestice în scopul obținerii in fluidele lor biologice
(în special în lapte) de proteine umane de interes terapeutic.
Exemple : -oi al căror lapte conține α 1-anti-tripsina folosită pentru tratarea anumitor boli ale aparatului
respirator ori factorul IX, în lipsa căruia apare hemophilia B;
-capre în al căror lapte se întâlnește fie anti-trombina III, un anticoagulant, fie anticorpi anticancerigeni;
-vaci care produc în lapte proteina GAD, folosită pentru combaterea diabetului, α-lactalbumine
destinate bebelușilor născuți prematur și incapabili să sugă, lactoferina, cu rol în stimularea sistemului
imunitar la om ori vaci a căror lapte este sărac in β-lactoglobine și în lactoză, produse care nu sunt
tolerate de anumite persoane;
-porci care sintetizează hemoglobina umană;
-țap care deține o genă de la un paianjen, cea care codifică proteina din panza de paianjen, țap folosit ca
genitor pentru obținerea de capre care secretă în laptele lor proteina din panja de paianjen.
 animale transgenice donatoare de organe
Datorită mărimii lor, organele de porc sunt considerate cele mai adaptate pentru a fi folosite la om.
Obținerea, prin ,,adăugarea’’ de gene umane deschide un drum nou pentru xenogrefe (transplantul de
organe de animale în corpul uman): ficat, inimă și pancreas de ,,porci umanizați’’ vor fi imunoserologic
mult mai compatibile cu corpul uman.

 animale domestic transgenice mai performante

-pui care conțin gena hormonului de creștere de la vite și care le conferă o creștere și mai rapidă decât a
celor din crescătoriile industriale, cântărind aproximativ 2,5 kg în momentul sacrificării (la 7 săptămâni)
și având o carne mult mai slabă;
-curci la care a fost blocată gena prolactinei, responsabilă pentru instinctul de clocit, se știe că o curcă
clocitoare depune cu 20-30% mai puține ouă decât celelalte;
-somon cu o creștere ultra-rapidă (de 11 ori mai repede decât normal) datorită unei inserții unei gene
suplimentare, cea a hormonului de creștere, provenind de la propria specie;
-crapi gigantici care conțin ca transgenă, gena hormonului de creștere de la păstrav;
-somon rezistent la ape reci, prin includerea genei ,,antigel’’ provenită de la o specie acvatică de
cambula (Platesa), ceea ce permite o extindere spre nord a zonelor de creștere;
-somoni și păstrăvi sterili, obținuți prin transferarea genei inhibitoare a hormonului hipofizar
care stimulează maturitatea sexuală la pești. Ca toate celelalte organisme, și peștii mobilizează
mari resurse metabolice pentru dezvoltarea organelor și elementelor sexuale, în detrimentul
creșterii lor și a calității cărnii
-sunt în curs cercetări pentru a se mări, prin transgeneză, producția de somatotropină la vacile de
lapte și sporirea în acest fel a producției de lapte. În SUA se practică injectarea de două ori pe
săptămână a acestui hormon (sintetizat de o bacterie transgenică) determinând o creștere cu 20%
a producției de lapte. În Europa este interzisă această practică și ea a generat un război
commercial UE-SUA care durează de mai mulți ani.
 Avantaje
Your Picture Here
și riscuri generate de transgeneza animală
Avantaje
Transgeneza animală va aduce desigur mari progrese în cunoașterea funcționării genelor și a
modalității lor de expresie, în descifrarea mecanismelor de dezvoltare a bolilor la om și în obținerea
de noi medicamente și vaccinuri. În plus, specialiștii estimează că sinteza de medicamente cu ajutorul
animalelor transgenice va reduce cel puțin la jumătate costul de producție al unora dintre ele.
Producerea de organe pentru transplanturi de către animalele ,,umanizate’’ va contribui la umplerea
enormului deficit de organe de transplant, va permite reducerea fenomenului de respingere a
xenogrefelor ce provin de la animale non-transgenice. Creșterea productivității animalelor domestice
va permite o reducere a costurilor de producție și deci un preț mai scăzut de vânzare către consumator
a diverselor produse obținute.
Riscuri
Riscul diseminării în natură a animalelor transgenice. Fenomenul a fost observant în mai multe
rânduri, în special in Norvegia, unde se estimează că aproape o treime din somonii sălbatici sunt de
fapt somoni proveniți din crescătorii. În aceste condiții, anumiți cercetători consideră că, în 5 sau 6
generații, somonul sălbatic ar putea să dispară.
Riscul transmiterii de boli pacienților care au suferit o xenogrefă. O serie de virusuri sau agenți
patogeni inactivi care, în mod normal, se găsesc în organele animalelor donatoare ar putea deveni
patogeni pentru om.
S-au observant grave anomalii de dezvoltare la porcii cu supreaexprimarea hormonului de creștere:
artroză, sterilitate, strabism, greutate în mișcare. Vacile americane stimulate cu Posilac suferă de
infecția colului uterin și prezintă tulburări de reproducere, astfel putem concluziona că acest modificări
genetice determină producții foarte ridicate, dar și o scădere a calității produselor.
 Bibliografie
1. Principles of gene manipulation and genomics, S.B. Primrose, Blackwell Publishing, 2006, 251-271
2. De la biodiversitate la OMG?, Vasile Cristea, Eikon
Mulțumim