Sunteți pe pagina 1din 20

INGINERIA GENETIC

Poate fi definit ca un ansamblu de metode i tehnici moderne prin care


este posibil manipularea materialului genetic la nivel celular i molecular.

Acest domeniu poate fi definit ca un ansamblu de metode si tehnici care permit fie introducerea
n patrimoniul genetic al unei celule a uneia sau mai multor gene noi, de interes, fie
modificarea expresiei unei/unor gene prezente, deja, n celul. Genele transferate sunt denumite
transgene.
Ingineria genetic mai este numit, uneori, i modificare genetic, transformare genetic
sau transgenez, iar produsele obinute poart numele de organisme modificate genetic
(OMG) sau organisme transgenice.

Transgeneza presupune, deci, parcurgerea a trei etape:


- identificarea, izolarea si clonarea genelor de interes (Fig.1.);
- transferul genelor de interes la plantele de cultur ;
- selecia plantelor care exprim, la un nivel optim caracterul transferat i testarea acestora n
cmp pentru evaluarea stabilitii expresiei transgenei n timp, n condiii naturale.
Transgeneza reprezint unul din domeniile ingineriei genetice vegetale, iar la ora actual cele
mai importante strategii i probleme care se pun sunt concentrate asupra nelegerii tiinifice i
dezvoltrii tehnice a unor sisteme bine puse la punct pentru transformarea a numeroase specii
de plante.
Capacitatea de a introduce i exprima diferite gene strine la plante a fost descris pentru
prima dat n 1984 la tutun (De Block M., De Sonville A., Debrouwer D., 1995) i apoi a fost
extins la peste 120 specii de plante aparinnd a cel puin 35 de familii. Succesul transformrii
genetice a plantelor s-a concretizat prin obinerea de plante ornamentale, plante de cultur cu
proprieti mbogite, plante medicinale i fructe.
Fig. 1 Sinteza genei de
interes direct pe
molecula vectorului,
dup metoda
Heideker Messing
Procesele de diversificare i rafinament a tehnicilor de transformare pentru
convenien, eficacitate mare, genotipuri variate i caracteristici moleculare
superioare vor continua cu efecte de lung durat, astfel c transferul genelor
i regenerarea de plante transgenice sunt factori limitativi ai dezvoltrii i
aplicrii sistemelor de transformare practic pentru multe specii de plante.
Atenia cea mai mare n procesul transformrii este dat de studiul interreaciei
i expresiei genelor strine transgenelor introduse n plante i interreacia
acestora cu genomul plantei gazd.
Aprofundarea cunotinelor de genetic molecular, cunoaterea structurii fine
a genelor i a cromozomilor, a deschis noi posibiliti de izolare i sintez a
genelor, de transfer de la o specie la alta, uneori chiar ndeprtate filogenetic,
de cultur in vitro a celulelor i de hibridare a acestora.
La nivel celular, ingineria genetic a nsemnat extinderea hibridrilor celulare n
afara granielor determinate de specie, obinndu-se hibrizi celulari ntre
diferite specii de procariote i eucariote, ntre celule vegetale i animale.
Ingineria genetic la nivel molecular se realizeaz prin izolarea i sinteza
artificial de gene, realizarea de ADN recombinant i transferul de gene de
la un organism la altul.
n sens strict, ingineria genetic const n crearea ADN recombinant,
derivat de la dou specii diferite i integrarea urmat de clonarea acestuia
ntr-o celul bacterian unde poate funciona normal, realizndu-se n felul
acesta transferul de gene, nu pe cale sexuat ci pe baza ADN recombinant.
n acest fel se deschide calea transformrii dirijate a ereditii
organismelor la nivel molecular, acionndu-se direct asupra bazei
moleculare a ereditii.
Primul transfer de gene a fost realizat n anul 1928 de Griffith E., prin
experienele de transformare genetic. A urmat apoi transferul de gene cu
ajutorul ADN purificat efectuat n anii 1944 de ctre Avery O. T. i
colaboratorii si, dar de data aceasta cu o eficien mult mai mare.
n sens mai larg, tot ingineriei genetice i aparin i tehnicile de
modificare a structurii i numrului cromozomilor prin mutaii, putndu-se
transfera cromozomi ntregi de la o specie la alta, fie segmente de
cromozomi, domeniu denumit chirurgie cromozomal.
Tehnologia ADN recombinant

Tehnologia ADN recombinant denumit i inginerie genetic, reprezint grupul de tehnici


experimentale, care ofer posibilitatea de a identifica, izola i purifica fragmente de material
genetic (ADN), n form pur i a le transfera n alte molecule de ADN, de la alte specii, obinnd
n final organisme modificate genetic.
Aceste manipulri au loc in vitro, cu ajutorul unor enzime, plasmide, virusuri. Pe scurt
tehnologia ADN recombinant, reprezint procesul de combinare ntr-o singur molecul a
materialului genetic provenit din dou sau mai multe surse.
Istoria ADN recombinant
Momentul de vrf al revoluiei n biologie, este anul 1973 deoarece reprezint naterea
tehnologiei ADN-ului recombinat. Atunci apare lucrarea Construcia n vitro a plasmidelor
bacteriene biologic funcionale elaborat de ctre Cohen S. i Boyer H., care descrie
modalitatea construirii unei specii noi de plasmid, denumit himer biologic, prin legarea in
vitro a unor fragmente de ADN de la dou plasmide diferite (Vlaic A., 1997).
Dezvoltarea cercetrilor de genetic molecular a fcut posibil cunoaterea structurii
intime a unor gene i genomuri, fapt care a dus la elaborarea tehnologiei ADN ului
recombinant i la transferul genelor peste barierele de specie.
Printre progresele cele mai importante ale tiinelor biologice care au fcut posibil
apariia tehnologiei ADN ului recombinant se pot cita:
metode pentru determinarea secvenei nucleotidelor n ADN i ARN;
descoperirea, izolarea i purificarea enzimelor de restricie capabile s taie molecula de ADN la
anumite situsuri;
utilizarea unor alte enzime cum ar fi: terminal-transferazele, ADN-polimerazele, ADN-ligazele;
metode pentru sinteza chimic de oligonucleotide i de gene;
descoperirea vectorilor utilizai pentru transferul de gene;
metode pentru includerea vectorilor n celula procariot i eucariot;
metode rapide de identificare a celulelor transformate de ctre moleculele de ADN construite in
vitro (Raicu P. i colaboratorii, 1990).
Etapele tehnologiei ADN recombinant

ADN- recombinant, reprezint molecula de ADN, n care secvenele de


gene nu sunt n ordine natural, ci sunt juxtapuse (alturate) prin
manipulare in vitro. Aceasta se realizeaz prin integrarea unui fragment
de ADN de la un organism (ADN- insert), ntr-un vector de clonare.

Tehnologia ADN-ului recombinant const n introducerea i funcionarea


unei gene sau a mai multor gene numite pasageri (P), ntr-o celul sau un
organism gazd numit receptor (R) care sufer astfel un proces de
transformare genetic.
Pentru ca gena pasager s nu fie degradat enzimatic de ctre DN-azele
celulei receptoare, aceasta trebuie s fie n prealabil introdus ntr-un
vehicul adecvat, numit vector (V) rezultnd astfel o molecul de ADN
recombinant (Fig. 2.).
Fig. 2 Schema obinerii
ADN recombinant

Tehnologia ADN ului recombinant face


posibil introducerea deliberat a
secvenelor de nucleotide din ADN-ul
unei rase sau specii de organisme n
ADN-ul alteia.
Enzimele de restricie sunt utilizate
pentru a fragmenta ADN-ul strin i
pentru a tia ADN-ul circular al
plasmidei.
Dup ce ADN-ul strin (numit i
pasager) a fost recombinat cu ADN-ul
plasmidic, forma circular a plasmidei
poate fi reconstruit cu ajutorul ADN-
ligazei, iar molecula de ADN
recombinant poate fi inserat ntr-o
gazd adecvat.
Dat fiind importana deosebit a tehnologiei ADN recombinant, att n
ceea ce privete cunoaterea bazelor genetice fundamentale, dar i de
manipulare sau clonare a genelor n vederea crerii de organisme programate
este necesar prezentarea principalelor etape :

Obinerea unui ADN-insert prin clivarea unei molecule de ADN cu ajutorul


endonucleazelor de restricie (enzim ce confer bacteriilor proprietatea s
recunoasc i s degradeze rapid ADN introdus din surse strine ca: bacterii,
virui, plasmide).
Stabilirea unui vector de clonare, respectiv a unei molecule de ADN autonome,
n care s poat fi inclus ADN insert
Obinerea unui ADN recombinant prin includerea ADN insert n vectorul de
clonare
Clonarea ADN recombinant, prin multiplicarea fragmentelor de ADN
recombinant obinute
Obinerea de organisme modificate genetic, prin introducerea ADN
recombinant, ntr-un organism receptor.
Vectorii de clonare
Pentru ca gena sau eventual genele pe care trebuie transferate ntr-
un organism, s-i poat ndeplini misiunea este nevoie ca genele noi,
purttoare ale informaiilor genetice, s fie sudate de o molecul de ADN
s aib i capacitatea de a se automultiplica n celulele respective. Deci,
este nevoie de un vector, capabil de a transporta genele i de a le
multiplica n celule.
Aceast funcie de vector poate fi ndeplinit de plasmidele
bacteriene, plasmidele din drojdii, din virusuri (bacteriofagul , virusul SV
40, adenovirusul), cosmide, etc. (Cbulea I., 2001).
Pentru ca o molecul de ADN s poat ndeplini rolul de vector,
trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:
s poat fi obinut n cantiti mari i s se purifice uor;
s aib markeri genetici asociai (de exemplu, markeri de selecie gene
care determin rezistena la antibiotice) pentru a le permite n acest caz
izolarea celulelor transformate;
s posede un numr limitat de situsuri de secionare cu ajutorul enzimelor
de restricie, n aa fel nct scindarea vehiculului s poat fi specific;
s conin elemente de reglaj ale unui operon procariot tipic i anume:
promotorul (P), operatorul (O) i o parte a unei gene structurale din cadrul
operonului respectiv;
Pentru ca un vector s fie sub controlul cercettorului, este astfel construit sau
modificat ca multiplicarea acestuia s se fac numai n condiii de laborator.
De aceea construcia unui vector ideal trebuie s ndeplineasc dou condiii
eseniale:
s fie eliminate din vector toate prile neeseniale sau generatoare de efecte
nedorite, dar fr a afecta proprietile sale de replicare;
replicarea lui trebuie s fie dependent de anumite condiii experimentale de
cretere n care se replic.
1. Plasmidele, reprezint molecule mici de ADN circular, care pot fi introduse n celule prin
transformare, deoarece prin tratarea cu clorur de calciu bacteriile de tipul Escherichia
coli devin permeabile pentru ADN (Fig.3.).
Folosite ca vectori aproape c pot fi considerate microzomi care se replic autonom n
celul i prezint capacitatea de a conferi celulei gazd rezisten la antibiotice (de
exemplu plasmida pBR 322 utilizat n mod obinuit, poart genele care confer celulei
gazd rezisten la ampicilin i tetraciclin).
Plasmidele bacteriene sunt elemente extracromozomale, reprezentate prin molecule
de ADN bicatenare, circulare, covalent nchise capabile de multiplicare autonom, avnd
mrimea variabil de la 1 la 300 kilobaze.
Multe tipuri de plasmide se gsesc n diferite tulpini de Escherichia coli, dar cele mai
multe informaii s-au obinut de la trei tipuri destul de diferite:
plasmidele F (de sex sau de fertilitate) mediaz transferul de gene cromozomale de la
celulele care au aceast plasmid la celulele care nu o posed;
plasmidele R, sunt acelea care determin rezistena la antibiotice a celulelor gazd i pot
fi transferate de la celulele care le posed la cele care nu le posed;
- plasmidele Col, care determin sinteza de colicine i pot ucide tulpini apropiate la care
aceast plasmid este lips.
Fig. 3 ADN plasmidic introdus
n plasmid prin procedeul numit
Transformare

Plasmidele cele mai des utilizate n


tehnologia ADN recombinant sunt
provenite de la Escherichia coli, dar
prezint o deosebit importan
plasmidele P care provin de la
Pseudomonas sp., deoarece pot fi
meninute la majoritatea bacteriilor.

Plasmida pBR322 constituie vectorul cel


mai utilizat pentru clonarea genetic. Cu
ajutorul lui s-au clonat genele interferonilor
umani, insulinei, hormonului uman de
cretere i somatostatinei. Acest vehicul
conine situsuri pentru nou enzime de
restricie n vederea introducerii unor
segmente de ADN strin n plasmid prin
tehnologia ADN-ului recombinant.
2. Bacteriofagul este de natur viral i reprezint un vehicul ideal n tehnologia ADN-ului recombinant.
Genomul fagului nu poate fi utilizat pentru clonarea genelor, deoarece prezint proprietatea de replicare dup
ce a scpat independent n mediul nconjurtor, fiind capabil de a propaga nedefinit ADN-ul strin ncorporat.
Genomul bacteriofagului matur este alctuit dintr-un ADN bicatenar, care conine 48.513 perechi de baze i
prezint capete adezive monocatenare. La captul 5 de pe o caten exist circa 12 baze fr pereche, dispuse
monocatenar care sunt complementare cu celelalte 12 baze de la captul 5 de pe catena cealalt. Acest fapt
confer ADN-ului particularitatea de a forma sub aciunea ligazei, molecule circulare, iar acest lucru se produce
n momentul n care molecula de ADN este injectat de ctre bacteriofag n celula gazd.

3.Virusul SV 40 (Virusul Simian 40), reprezint vectorul cel mai utilizat pentru clonarea genelor n celulele
mamiferelor. Acest virus a fost gsit n celulele renale provenite de la maimuele Rhesus i Cynomolgus i s-a
constatat c are potenial oncogen (au produs tumori maligne la hamsteri) i capacitate de transformare in
vitro a celulelor umane (produce modificri morfologice, imunologice, cromozomale i ale capacitii de
cretere a celulelor transformate).

4. Cosmidele sunt vectori hibrizi ntre fagi i plasmide. Ei combin caracteristicile plasmidelor i ale fagului n
vederea creterii probabilitii de a selecta plasmide recombinate ce conin ADN strin. n cosmide pot fi
integrate fragmente de ADN mai mari de trei ori (40 45 kilobaze) dect cele clonate de bacteriofagi.
Unitate de masur pentru marimea acizilor nucleici, genelor sau cromozomilor. 0 k. reprezint
1 000 de perechi de baze pentru ADN si 1 000 de baze pentru ARN. K. este echivalent cu 330
kilodaltoni (kDa). Simbol: kb.

5. Cromozom artificial de tip YAC, este un cromozom artificial de la Saccharomyces cerevisiae care conine
urmtoarele secvene:
- ARS (autonomously replicating sequences) care permite replicarea sa n timpul fazei S1 n celula gazd;
- TEL, care reprezint dou secvene telomerice, originare de la un cromozom de Saccharomyces cerevisiae
sau de la Tetrahymaena sp., necesare pentru a asigura individualitatea cromozomului i comportarea sa
normal pe parcursul diviziunilor celulare;
- o secven centromeric CEN, necesar pentru comportarea normal a cromozomului n timpul diviziunilor
celulare (Corneanu Mihaela, 2001).
Pasagerii
Reprezint fragmentele de ADN strin care conin genele de interes care se
introduc n vector pentru a obine ADN recombinant. Pasagerul poate fi izolat din
celulele n care se gsete sau poate fi sintetizat artificial.
Introducerea pasagerului n vector ridic unele probleme, cauzate de forma
circular a moleculei de ADN. Deschiderea moleculei de ADN, trebuie s se
deruleze n aa fel nct funcia sa esenial de autoreplicare s nu fie afectat.
Deci locul scindrii nu trebuie s se petreac n zona din molecul care controleaz
sinteza ADN. De asemenea se impune ca scindarea s fie fcut ntr-un singur loc
al moleculei, n aa fel nct s se realizeze conversia moleculei circulare ntr-o
molecul liniar.
ndeplinirea acestei condiii este asigurat de enzimele de restricie, care
fragmenteaz ADN in vitro, numai dup interaciunea cu o secven particular de
nucleotide n interiorul lanului molecular la ADN i permit scindarea n locuri
limitate a moleculelor de ADN.
Enzimele de restricie
Sunt enzime care determin depolimerizarea acizilor nucleici (adic
scindeaz hidrolitic legturile fosfodiesterice).
n funcie de acizii nucleici asupra crora acioneaz aceste enzime pot fi:
dezoxiribonucleazele care au rolul de a depolimeriza moleculele de ADN;
ribonucleazele care depolimerizeaz moleculele de ARN.

Enzimele de restricie se definesc a fi endonucleaze, care acioneaz n


interiorul catenei i au rolul de a tia moleculele de acizi nucleici numai
ntre unele baze particulare sau numai la nivelul unor secvene specifice
de nucleotide.
Secvenele de ADN recunoscute de ctre enzimele de restricie sunt
cunoscute sub numele de situsuri de restricie.
Cele mai utilizate enzime de restricie sunt acelea care produc un numr redus
de fragmente de ADN i pot fi separate uor unele de altele.
O enzim de restricie recunoate o secven particular int, dar numrul de
tieturi executate n ADN-ul unui organism este limitat.
Alte enzime utilizate n tehnologia ADN-ului recombinant pot fi menionate:
ADN-ligazele, sunt enzime implicate n sinteza ADN i au rolul de a cataliza
reaciile de sintez, folosind energia eliberat prin scindarea hidrolitic a unor
legturi macroergice. ADN-ligazele pot fi folosite i pentru sudarea unor
fragmente de restricie. Ele au fost descoperite n anul 1967, n celulele de
Escherichia coli, neinfectate sau infectate cu bacteriofagul T4, dar mai trziu au
fost puse n eviden n splin, timus i mduva osoas de iepure.
ADN-polimerazele, reprezint un grup de enzime implicate n replicaia ADN-ului,
asigurnd sinteza acestuia pe baza unei matrie de o anumit secven de
nucleotide.
Revers transcriptazele sunt enzime care determin transcripia invers a
informaiei genetice de la ARN ADN. Catena de ADN care se sintetizeaz pe
matria ARN-ului are la nceput o bucl care constituie un primer pentru sinteza
celei de a doua catene de ADN, iar acest tip de ADN a fost numit ADN
complementar.
Receptorul
Are rolul de a accepta, multiplica i exprima moleculele de ADN
recombinant ce conin pasagerul cu informaia dorit.
Pentru exprimarea i multiplicarea ADN-ului recombinant, pot fi folosite ca
celule-gazd sau receptori culturile bacteriene de Escherichia coli i de
Bacillus subtilis. De asemenea ca i celule-gazd sau receptoare de gene
strine pot fi folosite i celule de origine animal.

Realizri n tehnologia ADN recombinant

Aceast tehnologie a condus la o serie de realizri, care pe lng valoarea lor


tiinific, reprezint o importan economic i social.
Realizrile de interes tiinific constau n:
stabilirea hrilor genetice la diferite organisme;
izolarea i sinteza unor gene care sunt n acest moment cunoscute sub aspect
fizico-chimic;
cunoaterea modului de organizare al genelor de eucariote cu descoperirea exonilor
i intronilor;
studiul mecanismului de exprimare i de reglare al unor gene cu posibilitatea
sintezei promotorilor.
Cu ajutorul tehnologiei ADN-ului recombinant s-au obinut rezultate n industria
alimentar i anume sinteza ovalbuminei (prima sintez a unei proteine mari),
formate din 386 aminoacizi. Aceast protein este sintetizat de bacteria
Escherichia coli purttoare a unui ADN recombinant, este asemntoare
albuminei de ou, dar nu total identic. Prin perfecionarea tehnologiei de
obinere a acesteia, exist sperane ca ea s aib calitile celei izolate din ou i
s poat fi utilizat n hrana animalelor ca surs de protein.
Cercettorii britanici au n studiu posibilitatea utilizrii tehnologiei ADN-ului
recombinant la producerea taumatinei (protein natural izolat din fructele unui
arbust tropical), care este de 2500 ori mai dulce dect o soluie de 10 % zaharoz
i nu este toxic. Tot prin aceast tehnologie se ncearc modificarea
microorganismelor superproductoare de enzime speciale cu rol de catalizatori,
necesari n industria alimentar.
Transferul genelor fixatoare de azot

Cercetrile privind fixarea biologic a azotului atmosferic au fost intensificate n mai


multe ri n scopul ameliorrii eficacitii acestui proces esenial pentru
funcionarea ciclului azotului n biosfer i al creterii productivitii plantelor
vegetale, dar i n scopul crerii unor asociaii simbiotice fixatoare de azot, diferite
fa de cele care exist ntre leguminoase i bacterii de genul Rhizobium. Crearea
unor astfel de legturi ntre bacteriile fixatoare i cereale ar putea avea aplicaii
importante n plan agronomic, ca i transferul de durat mai mare de la bacterii la
plante, al genelor fixatoare de azot.
Plantele din familia Leguminoase (mazrea, fasolea, bobul, lupinul, soia) au
capacitatea de a fixa azotul atmosferic cu ajutorul unor bacterii cu care triesc n
simbioz. Bacteriile fixatoare de azot ptrund n esuturile rdcinilor, formnd aa-
numitele nodoziti, iar din aceast simbioz beneficiaz ambele specii:
- plantele obin azotul atmosferic, iar bacteriile obin de la plante compuii organici
de care au nevoie.
Genele implicate n fixarea simbiotic a azotului, n sensul cel mai larg pot fi mprite
n: nod,nif i gene fixe. Producerea genelor nod este necesar nc din primii pai n
procesul formrii nodulilor (Fischer, 1994).
La nivelul ADN-ului bacterian, genele nod sunt organizate n civa operoni localizai fie
pe cromozom, fie n plasmide de dimensiuni mari.
Fixarea azotului molecular are o importan major n agricultura sustenabil,
mai ales din perspectiva simbiozei dintre Rhizobium i leguminoase. Aceasta
duce la formarea unor structuri speciale, aflate de obicei n rdcinile plantelor,
numite noduli, unde bacteria transform azotul atmosferic n amoniac. Simbioza
rezult prin invazia rdcinilor plantei de ctre bacterii n urma creia se
formeaz un organ extrem de bine organizat numit nodul .
Stabilirea unei simbioze eficiente presupune o serie de etape: colonizarea i supravieuirea
n sol a rizobiilor ca saprofite n concuren cu alte microorganisme endogene; o
compatibilitate genetic ntre gazd i bacteriile din interiorul nodozitilor precum i un
mediu favorabil pentru a permite fixarea azotului la maxim .
n anul 1960 a avut loc (n laboratoarele Du Pont SUA), izolarea enzimei nitrogenaza
de la bacteria Clostridium pasteurianum, care catalizeaz fixarea azotului
atmosferic.
Aceast enzim este alctuit din dou molecule proteice:
o molecul mare alctuit din Fe, Mo i S2 cu o greutate molecular de 220.000
daltoni;
o molecul mic alctuit din Fe i S2, cu o greutate molecular de 55.000 daltoni.

Cele dou molecule nu sunt active individual i numai n absena oxigenului


atmosferic. Protejarea moleculei de nitrogenaz contra oxigenului atmosferic este
asigurat de un pigment denumit leghemoglobina care se combin cu oxigenul i
protejeaz enzima.
Sinteza enzimei nitrogenaza este determinat de un grup de gene (2 gene)notate cu
nif (nitrogen fixation) i o gen reglatoare. Genele nif se afl pe cromozomul
bacterian, ntr-un locus apropiat de cel al genei his (gena marker care implic
sinteza histidinei), care se transmite mpreun cu genele nif.
Transferul genelor nif de la bacteriile fixatoare de azot la altele nefixatoare se poate
realiza pe ci cunoscute de recombinare la bacterii: transformare, conjugare, sex
ducie i transducie.