Culturi de celule n suspensii

Metodele de cultivare a celulelor izolate are la baz principiul totipotenei fiecrei celule de
a regenera ntregul organism. Materialul iniial provine din celulele individualizate, rezultate prin
triturarea mezofilului foliar i cultivarea acestora n suspensii lichide sau pe un substrat de agar.
Fragmentele de frunze cu dimensiuni de 5x5mm, servesc la izolarea celulelor, pe cale mecanic,
mai ales din esutul palisadic i din parenchimul lacunar.
De regul, dintr-un gram de esut vegetal proaspt se pot obine circa 10.000 de celule
dintre care 70% sunt intacte, avnd capacitatea de a ncepe procesul de diviziune mitotic. Cu
ajutorul culturilor de celule n suspensii se reduce semnificativ spaiul necesar multiplicrii.

Cultura de celule n
suspensii lichide i pe
strat de agar
 Suspensiile celulare sunt culturi de celule, n medii lichide care prolifereaz nelimitat
dublndu-i numrul la fiecare 24-72 ore. Cultura se face n aparate automatizate (bioreactoare,
agitatoare rotatorii sau vibratorii, fitostate), avnd condiii aseptice i perfect controlate (mediul
nutritiv, temperatura, pH-ul, aerisirea, agitarea).
Condiiile de cultivare
Substraturile pentru cultivarea celulelor sunt complexe i constau dintr-un amestec de
aminoacizi, baze purinice i pirimidinice (pentru sinteze proteinelor i acizilor nucleici), glucoz
(ca surs de carbon i energie), vitamine i substane hormonale (auxine, citochinine) i sruri
minerale cu meninerea unui pH = 7,2. De regul se mai adaug antibiotice i ser sangvin.

Mediul de cultur trebuie s aib o for osmotic hipertonic, realizat cu o substan

organic osmotic activ (manitol) la care materialul vegetal se adapteaz treptat. Temperatura
optim de cretere este de 37o C (deoarece sub 36o C nu are loc diviziunea celular, iar peste
38o C unele celule mor).
n urma diviziunii celulare se formeaz un calus din care regenereaz rdcini, lstari i
embrioni somatici. De regul, descendenii celulari pot fi pstrai un timp nedefinit la - 180o C, n
medie cu o anumit compoziie.
Reuita tehnicii de regenerare a plantelor implic i pstrarea materialului biologic (explant,
calus, plantule) la temperaturi sczute pozitive 2-4o C i la lumin difuz, asigurnd conservarea
pe lung durat.

Prin cultura de celule n suspensii s-au obinut linii celulare specializate n sinteza unor produi
metabolici de mare valoare economic.
Obinerea de produi metabolici secundari
n celulele izolate, provenite de la plante superioare, se acumileaz substane foarte variate
(uleiuri, rini, arome, taninuri, esene, colorani, alcaloizi), care pot fi utilizate, direct sau
indirect, n alimentaia uman, la prepararea unor medicamente sau produse cosmetice i ca
materii prime n industrie.

Avnd o natur chimic extrem de divers, aceste substane prezint proprieti variate, ceea
ce lrgete paleta de utilizri. Datorit complexitii lor, anumii compui extrai din celulele
vegetale nu pot fi nlocuii prin sinteze chimice.

Deoarece, ritmul de cretere a plantelor i de acumularea metaboliilor este dependent direct

de evoluia condiiilor climatice din diferite zone naturale, calitatea materiilor prime i costul
acestora impun adoptarea unui sistem de cultivare n condiii strict controlate, asigurnd
randamente la niveluri planificate.
Pentru aceasta s-a considerat c tehnica culturilor de celule in vitro permite realizarea unei
bune independene economice i un control strict asupra cantitii i calitii produselor.
Cercetrile ulterioare asupra posibilitii obinerii de metabolii prin culturi de celule vegetale,
au permis un progres rapid n acest domeniu i acordarea unui mare numr de brevete de
invenie, n Japonia i SUA.

Prin culturi de celule n suspensie sau prin culturi de calus au fost realizate forme specializate
pentru sinteza unor produi metabolici, n cantiti foarte mari, la preuri de cost reduse cu
mare valoare economic i cu largi aplicaii n medicin, industrie alimentar, cosmetic i
agricultur: aminoacizi (orez), alcaloizi (tutun, bob, cafea), saponine (ginseng), caroten
(morcov), precum i fenoli, alcooli, uleiuri eterice, enzime, colorani vegetali, proteine furajere.
Treptat, culturile de celule au devenit metode eseniale de manipulare genetic i de producie
pe scar industrial.
Ciclul de regenerare a plantelor prin culturi de celule
 Medicin i farmacie

n secolul XIX, produsele farmaceutice, erau n majoritate de origine vegetal, pentru ca n

prima jumtate a sec. XX s fie nlocuite cu substane de sintez chimic. Recent au fost
introduse multe preparate realizate prin culturi de celule.
Diosgenina este un hormon steroid, anticoncepional, cu aciune de inhibare a ovulaiei.
Totodat constituie un compus iniial pentru producerea de progesteron i cortizon. Extragerea
diosgeninei se realizeaz din plante care aparin genului Dioscorea, aflate n flora spontan din
Mexic. De aici se colectau anual pn la 1.000 tone de material vegetal utilizat pentru prelucrare.
Dar, n urma epuizrii resurselor naturale de plante, s-au ajuns la recoltri sub 160 tone/an, s-a
trecut la extragerea hormonului din alte specii i anume: Agave, bumbac, soia, dar cu
randamente mai reduse.
O producie ridicat de diosgenin s-a realizat prin culturi de celule n suspensii sau de calus
din specia Dioscorea deltoidea, cu un randament de 1%, raportat la substaa uscat a
materialului vegetal, iar producia mondial a ajuns acum la 200 tone/an la un pre de 674
USD/kg.
Codeina este un alcaloid cu proprieti antitusive i analgezice la atenuarea durerilor
musculare. Ea deriv din morfin, care prin metilare se transform n codein. Se extrage n
cantitate de 0,1% din substana uscat a capsulelor nemature de papaver somniferum, dar n
prezent s-a trecut la tehnica obinerii prin culturi de celale i se comercializeaz la preul de 650
USD/kg produs.
Atropina, hiosciamina i scopolamina sunt alcaloizi cu efecte puternice asupra sistemului
nervos central. Se gsesc n diferite organe ale plantelor din familia Solanaceae (Atropa,
Hyosciamus, Datura) din care se extrag prin tehnica culturii de celule, att din rdcini normale,
dar mai ales din rdcini cu morfologie modificat n urma unor infecii cu bacterii din genul
Agrobacterium rhizogenes sau tumefaciens, care dau producii de 9-10 ori mai mari.
 Rezerpina i serpentina sunt alcaloizi cu 1-2 nuclee indolice existente la diferite specii de
Apocyanaceae. Pentru obinerea acestor alcaloizi se fac culturi de celule din frunze sau
rdcini de la specia Rauwolfia serpentina.
Preparatele de rezerpin i serpentin sunt utilizate n medicina popular Ayurveda din India
pentru vindecarea rnilor provocate de mucturi de erpi sau nepturi de insecte, precum
i n cazuri de tensiune arterial ridicat sau n stri de excitaie nervoas.
Industria alimentar
Se folosesc multe substane naturale obinute prin culturi de celule n suspensii utilizate sub
form de colorani sau condimente.
Betalaina aparine unui grup de antociani de culoare galben (betaxantina) sau roie
(betacyanina) care se extrage din culturi tisulare sau celulare aparinnd unei game largi de
specii: Beta vulgaris var. Rubra, Chenopodium rubrum.
Steviolul este un glicozid ameliorator de gust, prezent n frunzele de Stevia rebandiana (fam.
Compositae), arbust ce crete spontan n zonele tropicale, mai ales n Brazilia i Paraguay.
Are o capacitate de ndulcire de 300 de ori mai mare dect zaharoza, iar consumul alimentar
nu prezint efecte secundare, acesta determinnd o utilizare masiv n dieta bolnavilor de
diabet, mai ales n Japonia.
Producerea acestui nlocuitor natural se realizeaz prin culturi de suspensii celulare, calus i
de esuturi foliare. Din cercetri rezult c, ntr-o cultur de calus se poate acumula steviol n
proporie de de 36,4% din greutatea uscat a masei totale.
Taumatina este o protein edulcorant de 160.000 ori mai dulce dect zaharoza. Prin cultur
de celule n suspensii din planta Thaumatococcus danielii este posibil creterea
considerabil a produciei de taumatin. Tot n scopul mririi produciei s-a reuit transferul
unei gene a taumatinei n celulele drojdiei de bere (Saccharomyces cerevisiae), devenind un
mai bun productor de edulcorant, utilizabil n alimentaie, mai ales la persoanele bolnave de
diabet.
 Agricultura
n domeniul agriculturii se urmrete gsirea unor substane naturale extrase din plante care
s aib capacitatea de a distruge duntorii animali i agenii patogeni din culturi (insecte,
ciuperci, bacterii). Pe prim plan se situeaz substanele naturale care por nlocui insecticidele
de sintez chimic foarte poluante cum ar fi: piretrina extras din plante de Chrysanthemum
cinerariifolium, rotenona extras din plante Derris eliptica i nicotina extrase din plantele
genului Nicotiana.
Despre producerea de piretrin exist puine date tiinifice care arat posibilitatea obinerii de
culturi de calus i de lstari vegetativi. Piretrinele erau exportate, n cantiti mici din Kenya,
tanzania i Ecuador, dar s-au produs n ultimul timp n doze mult superioare prin culturi de
celule sau esuturi sau prin sintez enzimatic.
Protecia mediului
Reprezint domeniul care utilizeaz metode biotehnologice moderne prin culturi de celule
pentru a studia efectele genetice ale polurii mediului. Totodat, culturile de celule ofer
posibilitatea de a tria rezistena plantelor la diferii ageni poluani, de a le examina reaciile
biochimice i de a explica mecanismele de aciune.
K. Tanaka i colab. 1983 au constatat c tolerana la SO2 a plantelor de tutun, regenerate din
calus rezistent la paraquat, sugereaz posibilitatea de triere in vitro a speciilor vegetale pentru
a caracteriza potenialul de rezisten la poluare. Cultura de celule se utilizeaz pentru a
selecta genotipurile rezistente sau sensibile i pentru conservarea la rece a germoplasmei.
Tehnicile moderne de izolare i transfer a genelor vor permite crearea de plante indicatoare, cu
reacii specifice la grade mari de poluare. Genele rezistenei la poluare pot fi transferate la
specii importante dinpunst de vedere economic, dar sensibile la poluarea atmosferic,
urmrindu-se creterea gradului de rezisten a acestora.
 Etapizarea lucrrilor pentru producerea de metabolii

n cadrul uzinelor unde exist culturi de celule n suspensie sunt efectuate urmtoarele lucrri:
- dotarea uzinei cu aparatur necesar;
- alegerea unui genotip corespunztor;
- selecia permanent a clonelor cu productivitate ridicat;
- nmulirea celulelor n cicluri repetate cu flux continuu.

Urmrind modernizarea i sporirea produciei materiale, tehnologiile bazate pe generarea de

biomas, prin culturi de celule n suspensii, sunt considerate de mare viitor, fiind cele mai
intensive metode de producere a unui sortiment larg de substane utile n alimentaia uman i
animalier, n ind. farmaceutic, cosmetic i chimic.
Compui sintetizai n culturi de celule vegetale
 Producerea de edulcorani

n condiiile unui excedent de zahr din trestie sau sfecl de pe piaa mondial, suprapus
pe o scdere pronunat a consumului din rile industrializate, a aprut n ultimile decenii,
o concuren important a coloranilor semisintetici sau artificiali.
Treptat zahrul este nlocuit de fructoz i edulcorani. Numai pe piaa american au fost
comercializate 70 mil. de tone edulcorani calorici i necalorici.
Paralel cu extinderea edulcoranilor hipocalorici a sczut preul zahrului pe piaa
mondial, iar n unele ri industrializate au aprut cote de import i chiar un embargo care
blocheaz aducerea de zahr din ri n curs de dezvoltare.
Un studiu al puteriii de ndulcire a diferitelor produse alimentare (considernd zaharoza
=100) explic interesul crescnd acordat edulcoranilor.
Puterea de ndulcire a unor produse alimentare
 O serie de firme din domeniul alimentar, farmaceutic i chimic cum ar fi: Monsanto, Pfizer, Du
Pont de Nemours au nceput elaborarea unor edulcorani rezultai din produse naturale.

Taumatina este o protein dulce, existent n fructele arborilor Thaumatococcus danielli

care cresc n zonele umede din Africa Central i de Vest. Firma britanic Tate and Lyle a
obinut clonarea genei care codific sinteza taumatinei n celule de Escherichia.
Continund cercetrile la Universitatea Kent din Marea britanie au transferat aceast gen n
plante de tutun i mai apoi n plante comestibile. Producerea industrial a taumatinei a fost
posibil dup ce firma international genetic Engineering a tranferat gena care codific
taumatina n celulele drojdiei de bere Saccharomyces cerevisiae care se poate cultiva pe
scar larg.
Taumatina are o capacitate de ndulcire de 1.500-2.500 de ori mai mare dect a soluiei de
zaharoz 10%, iar gustul dulce are o perioad mai lung de persisten. De asemenea, aroma
similar cu cea din uleiul eteric de Mentha piperita o face corespunztoare pentru prepararea
gumei de mestecat i n industra farmaceutic.

Steviozida este un glicozid dulce, existent n planta de Stevia rebandiana care crete n
Paraguay, Brazilia i n cteva ri asiatice, mai ales n Japonia. Are o putere de ndulcire de
300 ori mai amre dect cea a zaharozei, dar pstreaz un gust amar persistent. Substana se
utilizeaz la prepararea buturilor nealcooolice, a gumei de mestecat, a produselor de
cofetrie i sosului de soia. Deoarece planta nu se nmulete prin semine, specialitii de la
Hiroshima au realizat tehnica de nmulire prin culturi de esuturi, cu explante preluate din
apexul tulpinii.
Hernandulcina este extras din planta Lippia dulcis, din flora spontan mexican. Acest
edulcorant hipocaloric a fost lansat la universitatea Illinois cu o putere de ndulcire de 1.000
de ori mai mare dect a zaharozei i ungust persistent amar.