Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Din punct de vedere chimic, reacia PCR este constituit din cicluri succesive de
replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizeaz cu cele
2 catene ale secvenei originale (folosit ca matri n replicare).
Produsul PCR care reprezint o copie a ADN/ARN int original este denumit amplicon.
Aceast metod permite detectarea cu specificitate foarte mare a unor concentraii foarte
sczute ale secvenei int.
Amplificarea se realizeaz ntr-un analizor special (thermal cycler), iar amestecul de reacie
trebuie s conin urmtoarele elemente:
- ADN sau ARN int: extras din proba n cursul etapei de prelucrare;
- enzima care faciliteaz sinteza lanului complementar de acid nucleic:
ADN polimeraza Taq (izolat din Thermophilus aquaticus) pentru o int ADN sau RTth ADN
polimeraza pentru o int ARN - care are activitate att de revers-transcriptaz, ct i de
ADN polimeraza (permite realizarea n acelai amestec de reacie, att a transcrierii inverse
a ARN int n ADN complementar - ADNc- ct i amplificarea ADNc);
-cofactori enzimatici: Mg i/sau Mn ;
2+ 2+
- primeri (P1 i P2): secvene scurte, monocatenare, cu lungimea maxim 20-30 nucleotide,
care se leag de o matri monocatenar prin imperecherea complementar a bazelor;
servesc ca punct de plecare pentru sinteza lanului complementar cu ajutorul ADN
polimerazei, marcnd nceputul i sfritul regiunii care trebuie s fie amplificat;
- deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP i dUTP): folosite pentru sinteza noii catene ADN
prin ataarea lor la captul primerilor, complementar cu matria (observaie: ampliconul va
conine deoxiuridina n loc de o deoxitimidina, deosebindu-l de ADN nativ);
Produsele rezultate ntr-un ciclu sunt folosite ca matri n ciclul urmator, astfel
nct numrul final de copii ADN este de 2n x y, unde y = numrul iniial de
copii, iar n = numrul de cicluri de replicare.
Deci, moleculele acumulate exponenial reprezint copii ale matriei care la capete
au incorporai primerii.
In concluzie, reacia PCR este o metod prin care se obin cantiti mari dintr-o
anumit secven ADN. Aceste molecule pot fi ulterior manipulate/analizate fr
a fi necesar o prealabila clonare molecular a acestora.
Matria ADN. De cele mai multe ori, ntr-o reacie PCR se introduc molecule de ADN
d.c. linear/circular ce include secvena de amplificat. Puritatea ADN introdus ca
matri reprezint un parametru important pentru succesul unei reacii PCR. De
exemplu, cantiti mari de ARN dintr-un extract ADN pot chelata ionii de Mg++,
determinnd astfel o activitate sczut a ADN polimerazei. Pe de alt parte, o serie
de contaminani din extractul ADN pot inhiba aciunea ADN polimerazei.
Cantitatea de matri ADN introdus ntr-o reacie PCR influeneaz puternic
performana reaciei. Cantitile recomandate pentru o reacie PCR standard sunt:
maximum 500 ng pentru ADN genomic uman, 1-10 ng ADN bacterian, 0.1-1 ng ADN
plasmidial. Cantitatea ADN trebuie ns corelat cu numrul de copii de secven
matri, aceasta depinznd de complexitatea moleculelor de ADN.
primerii oligonucleotidici.
Se recomand ca primerii s aib un procent molar de guanin + citozin (% mol GC)
cuprins ntre 40 60% i s aib o distribuie echilibrat a domeniilor bogate n A/T i
G/C. Este recomandabil ca cei 2 primeri s aib valori Tm care s permit temperaturi de
ataare ntre 55 i 65oC (pentru specificitate maxim se folosesc temperaturi de 62
65oC). Pe de alt parte, este ideal ca cei 2 primeri s aib valori Tm identice sau foarte
apropiate i s nu prezinte secvene cu complementaritate intracatenar (i care, deci, s
determine structuri secundare interne).
2) ADN polimeraza Ampli-Taq. Aceast enzim este o ADN polimeraz recombinant obinut prin exprimarea
unei forme modificate a genei pentru Taq pol n E.coli. Activitatea optim a acestei enzime se desfoar n
range-ul de temperatura la care are loc i ataarea stringent a primerilor (55-75oC, cu maximumul la 60oC).
3) ADN polimeraza Ampli-Taq fragmentul Stoffel este reprezentat de Ampli-Taq din care a fost scos un
fragment de 290 aminoacizi de la capul N-terminal. Fragmentul excizat este responsabil de activitatea
exonucleazica n directie 5 3, i deci, Stoffel-Ampli-Taq nu prezint acest tip de activitate, ceea ce, pe
de o parte, crete mult viteza de polimerizare, iar pe de alt parte permite o amplificare mai eficient a
matrielor circulare (de ex. ADN plasmidial).
Este de 2 ori mai termostabil decat Ampli-Taq i i pstreaz activitatea optim ntr-un range mult mai
larg de concentraii de Mg++.
b) ADN polimeraze ADN dependente termostabile din clasa VENT
1) ADN polimeraza VENT pol este o ADN polimeraz ADN dependent termostabil izolat din
Thermococcus litoralis. Aceast bacterie triete n izvoare marine calde, cunoscute n
literatura de specialitate sub denumirea de vent-uri. VENT pol desfoar ambele tipuri de
activiti exonucleazice(n direie 3-5 i, respectiv, n direcie 5-3).
2) ADN polimeraza VENT pol (exo-) este similar cu VENT pol, dar nu are activitate exonucleazic
5 3.
c) ADN polimeraze ADN dependente termostabile din clasa DEEP VENT
1) ADN polimeraza DEEP VENT pol este o enzim izolat dintr-o tulpin de Pyrococcus
(microorganism ce triete n izvoare marine calde de mare adncime). Aceast enzim
desfoar ambele tipuri de activiti exonucleazice, dar este mai rezistent dect VENT pol,
i dect Ampli-Taq pol la temperaturi de 100oC - temperaturi necesare denaturrii matrielor
(n mod special la matriele circulare, lungi sau cu % mol GC ridicat).
2) DEEP VENT (exo-) pol este similar cu DEEP VENT pol, dar nu are activitate exonucleazic
5 3.
d) ADN polimeraze ambivalente termostabile
1) ADN polimeraza rTth pol este o ADN polimeraz recombinat obinut prin exprimarea unei
forme modificate a genei din Thermus thermophilus, n E.coli. Caracterul ambivalent al acestei
enzime const n faptul c poate fi folosit ca ADN polimeraz ARN dependent (revers-
transcriptaz), n prezena MnCl2, dup care, prin chelatarea ionilor de Mn i adugare de
MgCl2, poate aciona ca ADN polimeraz ADN dependent, desfurnd o reacie PCR.
Platoul amplificrii
O reacie PCR de amplificare ADN in vitro nu este infinit: dup un anumit numr
de cicluri, secvena amplificat nu se mai acumuleaz exponenial, iar reacia intr
ntr-o faz linear (staionar) denumit platoul amplificrii.