Sunteți pe pagina 1din 13

Reacie de polimerizare n lan

n biologia molecular reacia n lan a polimerazei tradus i ca reacia de


polimerizare in lan este o tehnologie biochimic de multiplicare (sintez) in vitro a
substanei genetice ADN prin amplificarea perechilor de baze componente. Este
frecvent desemnat cu acronimul PCR derivat din limba englez
(Polymerase Chain Reaction).
Metoda a fost dezvoltat n condiii de laborator de Kary Mullis in 1983.

Reacia PCR (Polymerase Chain Reaction = Reacie de Polimerizare n Lan) este


o metod de amplificare enzimatic in vitro a unei anumite secvene de ADN.
n prezent a fost dezvoltat o adevarat tehnologie PCR care este folosit ntr-o
varietate foarte mare de domenii: biologie molecular, tiinele mediului,
criminalistic, tiine medicale, biotehnologie, microbiologie, industria alimentar,
epidemiologie, etc.

Din punct de vedere chimic, reacia PCR este constituit din cicluri succesive de
replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizeaz cu cele
2 catene ale secvenei originale (folosit ca matri n replicare).
Produsul PCR care reprezint o copie a ADN/ARN int original este denumit amplicon.
Aceast metod permite detectarea cu specificitate foarte mare a unor concentraii foarte
sczute ale secvenei int.

Amplificarea se realizeaz ntr-un analizor special (thermal cycler), iar amestecul de reacie
trebuie s conin urmtoarele elemente:

- ADN sau ARN int: extras din proba n cursul etapei de prelucrare;
- enzima care faciliteaz sinteza lanului complementar de acid nucleic:
ADN polimeraza Taq (izolat din Thermophilus aquaticus) pentru o int ADN sau RTth ADN
polimeraza pentru o int ARN - care are activitate att de revers-transcriptaz, ct i de
ADN polimeraza (permite realizarea n acelai amestec de reacie, att a transcrierii inverse
a ARN int n ADN complementar - ADNc- ct i amplificarea ADNc);
-cofactori enzimatici: Mg i/sau Mn ;
2+ 2+

- primeri (P1 i P2): secvene scurte, monocatenare, cu lungimea maxim 20-30 nucleotide,
care se leag de o matri monocatenar prin imperecherea complementar a bazelor;
servesc ca punct de plecare pentru sinteza lanului complementar cu ajutorul ADN
polimerazei, marcnd nceputul i sfritul regiunii care trebuie s fie amplificat;

- deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP i dUTP): folosite pentru sinteza noii catene ADN
prin ataarea lor la captul primerilor, complementar cu matria (observaie: ampliconul va
conine deoxiuridina n loc de o deoxitimidina, deosebindu-l de ADN nativ);

- amperaza: enzima care promoveaz amplificarea selectiv a intei i distrugerea


produilor de contaminare din cursul reaciilor de amplificare anterioare; catalizeaz
clivarea ADN-ului care conine deoxiuridina la nceputul primului ciclu de amplificare i nu
degradeaz ADN-ul sau ARN-ul int.
Reactia PCR se desfoar n 3 etape:
1. Denaturarea: n urma nclzirii amestecului de reacie la 94C, ADN-ul int este separat
(denaturat) n 2 catene;
2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scderii temperaturii la 55-70C, primerii se vor
ataa complementar la capetele 3 ale celor 2 catene;
3. Elongaia: la temperatura de 72C, ADN polimeraza termostabil n prezena Mn2+ i a
excesului de deoxinucleotid-trifosfai (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina i
deoxiuridina) va extinde primerii ataai n lungul matriei int i va produce un amplicon
ADN. Analizorul va repeta automat acest proces pentru un numr stabilit de cicluri (de
obicei 30-35), la fiecare ciclu dublndu-se cantitatea de amplicon ADN.

La rndul su, procesul global de amplificare


desfurat de-a lungul unui numar definit de
cicluri poate fi divizat n 3 faze:
- Exponenial: la fiecare ciclu se dubleaz
cantitatea de amplicon ADN (se admite o
eficiena de 100% a reaciei);
- Linear: pe msur ce componentele
reaciei sunt consumate, se produce o
ncetinire a reaciei, iar produii PCR ncep s
se degradeze;
- Platou (end-point): reacia este stopat, nu
se mai formeaz ali produi de amplificare,
iar dac faza se prelungete mult produii
PCR vor suferi o degradare important.
Diferena esenial ntre o asemenea reacie de replicare i un proces de replicare
ADN in vivo, l reprezint faptul c n reacia PCR etapa de desfacere a dublului
helix matri i, respectiv, cea de ataare a primerilor, nu sunt realizate enzimatic,
ci prin parcurgerea unor trepte de temperatur, iar singura enzim folosit n
reacie este o ADN polimeraz , ADN-dependent (cu funcie de replicaz).
Principalele 3 etape ale unei reacii PCR pot fi sintetizate astfel :

ADN d.c. Matri ADN dublucatenar (dc)



ADN m.c. ADN monocatenar
unele virusuri, de ex. parvovirusuri

ataarea primerilor
polimerizare
ADN polimeraz ADN dependent termostabil
2 molecule ADN d.c. identice cu molecula matri

Termociclator pentru PCR


Principalele componente ale reaciei sunt : ADN matri, o ADN polimeraz
termostabil, primeri oligonucleotidici, deoxinucleotidtrifosfati (dNTP),
tamponul de reacie, ioni de Mg++.
O reacie PCR este format din n cicluri (ntre 25 i 40), n fiecare ciclu fiind
parcurse 3 etape principale: denaturarea termic a matriei (deci, desfacerea
dublului helix ADN), ataarea primerilor i polimerizarea propriu-zis.
La terminarea unui ciclu de replicare in vitro (de amplificare), cantitatea de ADN
rezultat este dubl fa de matri.

Produsele rezultate ntr-un ciclu sunt folosite ca matri n ciclul urmator, astfel
nct numrul final de copii ADN este de 2n x y, unde y = numrul iniial de
copii, iar n = numrul de cicluri de replicare.
Deci, moleculele acumulate exponenial reprezint copii ale matriei care la capete
au incorporai primerii.

In concluzie, reacia PCR este o metod prin care se obin cantiti mari dintr-o
anumit secven ADN. Aceste molecule pot fi ulterior manipulate/analizate fr
a fi necesar o prealabila clonare molecular a acestora.
Matria ADN. De cele mai multe ori, ntr-o reacie PCR se introduc molecule de ADN
d.c. linear/circular ce include secvena de amplificat. Puritatea ADN introdus ca
matri reprezint un parametru important pentru succesul unei reacii PCR. De
exemplu, cantiti mari de ARN dintr-un extract ADN pot chelata ionii de Mg++,
determinnd astfel o activitate sczut a ADN polimerazei. Pe de alt parte, o serie
de contaminani din extractul ADN pot inhiba aciunea ADN polimerazei.
Cantitatea de matri ADN introdus ntr-o reacie PCR influeneaz puternic
performana reaciei. Cantitile recomandate pentru o reacie PCR standard sunt:
maximum 500 ng pentru ADN genomic uman, 1-10 ng ADN bacterian, 0.1-1 ng ADN
plasmidial. Cantitatea ADN trebuie ns corelat cu numrul de copii de secven
matri, aceasta depinznd de complexitatea moleculelor de ADN.
primerii oligonucleotidici.
Se recomand ca primerii s aib un procent molar de guanin + citozin (% mol GC)
cuprins ntre 40 60% i s aib o distribuie echilibrat a domeniilor bogate n A/T i
G/C. Este recomandabil ca cei 2 primeri s aib valori Tm care s permit temperaturi de
ataare ntre 55 i 65oC (pentru specificitate maxim se folosesc temperaturi de 62
65oC). Pe de alt parte, este ideal ca cei 2 primeri s aib valori Tm identice sau foarte
apropiate i s nu prezinte secvene cu complementaritate intracatenar (i care, deci, s
determine structuri secundare interne).

Intr-o reacie PCR, un parametru important l repezint temperatura de ataare a


primerilor la matria ADN (primer annealing temperature).
Metodele PCR tradiionale (convenionale) au la baz o detecie a produilor PCR n faza de
platou a procesului (detectie end-point). In ultimii ani, tehnologia PCR a fost revoluionat
prin dezvoltarea metodelor de detecie n faza exponenial (detecie n timp real: real-time
PCR).
Tehnologia real-time PCR prezint numeroase avantaje fa de cea convenional: -
acuratee mai mare a rezultatelor obinute (efectuarea deteciei se realizeaz n faza
precoce a reaciei, respectiv n faza de cretere exponenial a amplificrii, cnd se
produce o dublare exact a cantitii de amplicon la fiecare ciclu; detecia n acest moment
este optim n sensul c rezultatele se coreleaz mai bine cu nivelul iniial al intei,
comparativ cu tehnica PCR convenional, unde detecia are loc n faza de platou, dup ce
reacia a fost stopat, iar produii au nceput s se degradeze;

- domeniu de linearitate mult extins (sunt necesare mai puine diluii ale probelor);
- limita inferioar de detecie mult mbunatit (se pot detecta cantiti mai mici ale ADN-
ului int, avantaj esenial

Evaluarea rspunsului virusologic


susiut la pacienii cu hepatit cronic
cu VIRUS C
ADN polimeraza termostabil
In prezent n toate reaciile de tip PCR se introduc ADN polimeraze
termostabile.
Variantele naturale ale unor asemnea enzime au fost izolate din microorganisme
termofile, care posed echipamente enzimatice cu temperaturi optime ridicate (mai mari de 70oC)
i care sunt capabile s desfoare activitile specifice i dup treceri peste temperaturi
extreme (n jur de 100oC).
n marea majoritate a cazurilor, pornind de la asemenea variante naturale, ADN polimeraze
termostabile au fost manipulate genetic (cu obinerea unor variante ameliorate) i clonate n
tulpini de E.coli (microorganism ce este mult mai uor de crescut i
manipulat dect bacteriile termofile).
n majoritatea experimentelor, cantitatea optim de ADN polimeraz termostabil (sau de amestec de
ADN polimeraze) este cuprin ntre 0.5 i 0.25 U / 50 l volum de reacie.
Tipuri de ADN polimeraze ADN dependente termostabile
a) ADN polimeraze ADN dependente termostabile din clasa Taq
1) ADN polimeraza Taq
Prima specie molecular de Taq pol izolat (n anii 1976-1980) avea o greutate molecular de
aproximativ 70 KDa i o activitate specific de 2000 uniti/mg.
Ulterior (n 1989), a fost izolat o alt specie molecular de Taq pol, cu o greutate molecular de 94 Kda
i cu o activitate specific de 20.000 uniti/mg. Aceast enzim are temperatura optim de 75-78oC, iar
la temperaturi de peste 90oC activitatea sa scade semnificativ .

2) ADN polimeraza Ampli-Taq. Aceast enzim este o ADN polimeraz recombinant obinut prin exprimarea
unei forme modificate a genei pentru Taq pol n E.coli. Activitatea optim a acestei enzime se desfoar n
range-ul de temperatura la care are loc i ataarea stringent a primerilor (55-75oC, cu maximumul la 60oC).
3) ADN polimeraza Ampli-Taq fragmentul Stoffel este reprezentat de Ampli-Taq din care a fost scos un
fragment de 290 aminoacizi de la capul N-terminal. Fragmentul excizat este responsabil de activitatea
exonucleazica n directie 5 3, i deci, Stoffel-Ampli-Taq nu prezint acest tip de activitate, ceea ce, pe
de o parte, crete mult viteza de polimerizare, iar pe de alt parte permite o amplificare mai eficient a
matrielor circulare (de ex. ADN plasmidial).
Este de 2 ori mai termostabil decat Ampli-Taq i i pstreaz activitatea optim ntr-un range mult mai
larg de concentraii de Mg++.
b) ADN polimeraze ADN dependente termostabile din clasa VENT
1) ADN polimeraza VENT pol este o ADN polimeraz ADN dependent termostabil izolat din
Thermococcus litoralis. Aceast bacterie triete n izvoare marine calde, cunoscute n
literatura de specialitate sub denumirea de vent-uri. VENT pol desfoar ambele tipuri de
activiti exonucleazice(n direie 3-5 i, respectiv, n direcie 5-3).
2) ADN polimeraza VENT pol (exo-) este similar cu VENT pol, dar nu are activitate exonucleazic
5 3.
c) ADN polimeraze ADN dependente termostabile din clasa DEEP VENT
1) ADN polimeraza DEEP VENT pol este o enzim izolat dintr-o tulpin de Pyrococcus
(microorganism ce triete n izvoare marine calde de mare adncime). Aceast enzim
desfoar ambele tipuri de activiti exonucleazice, dar este mai rezistent dect VENT pol,
i dect Ampli-Taq pol la temperaturi de 100oC - temperaturi necesare denaturrii matrielor
(n mod special la matriele circulare, lungi sau cu % mol GC ridicat).
2) DEEP VENT (exo-) pol este similar cu DEEP VENT pol, dar nu are activitate exonucleazic
5 3.
d) ADN polimeraze ambivalente termostabile
1) ADN polimeraza rTth pol este o ADN polimeraz recombinat obinut prin exprimarea unei
forme modificate a genei din Thermus thermophilus, n E.coli. Caracterul ambivalent al acestei
enzime const n faptul c poate fi folosit ca ADN polimeraz ARN dependent (revers-
transcriptaz), n prezena MnCl2, dup care, prin chelatarea ionilor de Mn i adugare de
MgCl2, poate aciona ca ADN polimeraz ADN dependent, desfurnd o reacie PCR.

e) dNTP (deoxinucleotidtrifosfai = dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Deoxinucleotidtrifosfaii introdui n


reacie sunt folosii de ctre ADN polimeraz n reacia de polimerizare. In amestecul de reacie
se introduc cantiti echimolare din cele 4 tipuri de molecule; n caz contrar scade fidelitatea
ADN polimerazei.
Concentraia optim a dNTP variaz ntre 50 i 500 M (pentru fiecare dNTP), valoarea cea mai
uzual fiind 200 M. Aceast concentraie trebuie corelat cu concentraia Mg++. In cazul n
care se dorete obinerea unor produi de reacie PCR marcai (radiactiv sau neradioactiv), se
introduc dNTP marcate.
f) tamponul de reacie (conine Tris-hidroxi-aminometan - ca substan amfoter - , i MgCl2,
necesar funcionrii optime a ADN polimerazei termostabile). Exist i variante n care
tamponul de reacie nu conine Mg++, iar acesta este livrat separat, permind optimizarea
concentraiei ionilor de Mg++. Ionii Mg++ formeaz complexe solubile cu moleculele dNTP
pentru a produce substratul propiu-zis recunoscut de ADN polimeraz. Concentraia ionilor de
Mg++ este un factor crucial ce afecteaz performana oricrei ADN polimeraze.
Treptele de temperatur ale unei reacii PCR standard
Denaturarea iniial
Pentru ca oreacie PCR s se desfoare eficient, este foarte important ca
moleculele ADN matri s fie denaturate iniial complet. Acest lucru poate fi
realizat prin nclzirea iniial amestecului de reacie 2 min la 94-95oC.
Treapta de denaturare din cadrul fiecrui ciclu
De obicei, este suficient o denaturare de 20-30 sec la 94-95oC, dar aceasta trebuie
adaptat funcie de termocycler i de tuburile folosite (de ex., dac se lucreaz n
tuburi de 500 l sunt necesari timpi mai lungi dect dac se lucreaz n tuburi de
200 l). Totodat, pentru matrie bogate n GC se recomand folosirea unor timpi de
denaturare mai lungi.
Ataarea primerilor
In marea majoritate a experimentelor, temperatura de ataare a primerilor trebuie
determinat i optimizat empiric. Alegerea acestei temperaturi reprezint unul din
factorii cei mai critici pentru asigurarea unei nalte specificti a reaciei PCR. Dac
temperatura de ataare este mult prea nalt, nu are loc ataarea primerilor, iar
dac temperatura este prea sczut, atunci crete probabilitatea atarilor
nespecifice.
Polimerizarea propriu-zis
Taq ADN pol polimerizeaz aproximativ 60 baze per secund la 72oC. In fiecare
ciclu, o perioad de polimerizare de 45s este suficient pentru amplificarea unor
fragmente de pn la 1 kbp. Pentru amplificarea unor fragmente mai mari de 1 kbp,
timpul se calculeaz n multiplii de 45s, urmat de ajustri pentru diverse matrie.
Numrul de cicluri
Intr-o reacie PCR obinuit, mai puin de 10 molecule de matri pot fi amplificate
n mai puin de 40 de cicluri, obinndu-se un produs (amplicon) detectabil n
electroforez n gel de agaroz. La o cretere mult prea mare a numrului de
cicluri, se pot acumula produi de reacie nespecifici.
Polimerizarea (extensia) final
In multe reacii, dup ultimul ciclu de amplificare, tuburile de reacie se tin 5-15 min
la 72oC pentru a realiza polimerizarea complet a produilor pariali, precum i
renaturarea moleculelor monocatenare.

Platoul amplificrii
O reacie PCR de amplificare ADN in vitro nu este infinit: dup un anumit numr
de cicluri, secvena amplificat nu se mai acumuleaz exponenial, iar reacia intr
ntr-o faz linear (staionar) denumit platoul amplificrii.

Marele avantaj al tehnicilor PCR l reprezint faptul c


permite obinerea unei cantiti mari dintr-o anumit
secven ADN, fr a necesita clonarea acesteia n
prealabil ntr-o molecul de tip vector. Pe de alt parte,
tehnologia PCR a revoluionat i implicarea geneticii
moleculare n domenii n care se apeleaz la cantiti
foarte mici de ADN.
Electroforeza n gel de agaroz
2%, TBE 0.5X a ampliconului
de control
Asemenea situaii se ntlnesc n :
- diagnosticul unor boli monogenice, precum i detectarea de noi tipuri de mutaii
n gene importante n anumite boli;
- diagnosticul unor infecii umane: permite detectarea particulelor infecioase
bacteriene i virale chiar aflate ntr-o proporie mic, chiar pentru specii ce se
cultiv dificil in vitro, chiar pentru patogeni cu variabilitate antigenic mare, i
chiar pentru patogeni ce au perioad mare de laten; astfel, pot fi identificai
indivizii umani pozitivi nainte de seroconversie;
- studii privind mecanismele genetice ce acompaniaz procesele maligne
(detectarea secvenei i esutului n care se exprim anumite oncogene n diverse
procese maligne);
- studii de taxonomie, sistematic i filogenie molecular: obinerea rapid a unei
cantiti mari din secvene ADN cu valoare taxonomic i/sau filogenetic;
- biologia populaiilor, inclusiv la organisme mici: tehnologia PCR permite
secvenierea rapid a unor molecule de ADN de la foarte muli indivizi, fr a
necesita n prealabil clonarea acestora;
- studii de antropologie: tehnica PCR permite n prezent recuperarea i analiza
unor secvene ADN din fosile;
- medicin legal: cu ajutorul reaciilor PCR pot fi n prezent analizate la nivel
molecular o serie ntreag de probe biologice.
In afar de toate aceste aplicaii directe ale tehnologiei PCR, pornind de la reacia
iniial de amplificare, au fost imaginate o serie ntreag de variante tehnice ce
permit abordarea unor manipulri ct mai acurate a moleculelor de acizi nucleici.