INGINERIE GENETIC

VEGETAL
Istoricul tiin eiIG
Conf.dr.CoierViorica

Istoriculapari ieiIngineriei
geneticecatiin

Gregor Mendel 1866 - Proceedings of the Society of

Natural Sciences - de la Brno (factori ereditari genele).
Johann Friedrich Miescher (1869)-extract crud
leucocitarformatdinADNiproteine
Frederick Griffith 1923 experimente de transformare
laoarecicuStreptococcus pneumonie
Avery Osvald, Colin McLeod i Maclyn McCarty
1944 - descoper naturagenetic amaterialuluicarea
determinat transformarea bacteriilor utilizate de Griffith n
experimentelepeoareci

Datanateriitiin eiADNeste25aprilie1953

James Watson,
Maurice Wilkins
iFrancisCrick
anun au

descoperirea
structurii dublu
helix a ADN
(Nature, 1953,
171: 737-738 )

F. Crick - 1958 - dogmacentral abiologiei

(ADN - ARN proteine)- expresia genelor
Ochoa S. Nirenberg W.iKhorana G.
1961 1967 codulgeneticicoresponden a

codon-AA

Howard Temin iS. Mizutani (1970)infirm dogmacentral prindescifrarea

reverstranscrip iei

PREMISELEAPARI IEI
Inginerieigeneticecatiin

1. Descifrareaorganiz riigenomuluinucleariextranuclearla
procarioteilaeucariote
2. Descifrareastructuriigenelorlaeucarioteiprocariote
3. Descoperirea instrumentelor moleculare enzimele de
restric ie
4. Dezvoltarea tehnicilor de amplificare in vitro a unui
fragment de ADN tehnica PCR
5. Dezvoltarea tehnicilor de hibridare a acizilor nucleici
6.Dezvoltareatehnicilordesecven iere

7. Sintezaartificial agenelor,etc

Descifrareaorganiz riigenomuluinuclear
iextranuclear la procariote

Descifrareaorganiz riigenomuluinucleari
extranuclear la eucariote

Genomul nuclear eucariot:

Structur liniar

Num rdemoleculeADNdc2n

Model de organizare: ADN (2nm) nucleozom (11 nm)

Solenoid (30 nm) , cromatida (700 nm), cromozom
bicromatidic (1400 nm)

Genomul extranuclear mitocondria

Descifrarea
structuriigenelorlaeucarioteiprocariote

Structura
discontinu la
eucariote (exoni,
introni)
Structuracontinu la
procariote(f r
introni; mai multe
gene - operon)

Descoperireaenzimelorderestric ie

Multiplicarea unei gene prin

PCR (Karry Mullis)

Tehnicile de hibridare ale acizilor nucelici

(1. i de transfer pe membrane de nylon -

Southern blotting 2. pe microplci tehnica

microarray )

Tehnicile de hibridare ale acizilor nucleici

pe microplci tehnica microarray DNA

chip)

Secven iereaADN(Sanger)

Ingineria genetic este definit ca

ansamblul de metode i tehnologii
efectuate in vitro cu gene, cromozomi
sau celule ntregi, n scopul construirii
unei structuri genetice cu propriet i
ereditare premeditate. (L. Popa i Rodica
Repanovici)

Condi iilecetrebuiendeplinitepentrucaorice
metod sautehnic s poat fiinclus n
domeniul ingineriei genetice:

(1) S conduc laapari iaunorforme

completnoidevia cupropriet igeneticei
func ionalepremeditate;
(2)Combina iilegeneticenois fierealizate
n laborator (in vitro)inafaraactului
natural al reproducerii;
(3)S seporneasc delaunasaucteva
celule (molecule) noi careapois poat fi
izolateiclonate.

Tehnici i tehnologii care aparin Ingineriei

genetice
I. Recombinarea in vitro a materialului genetic peste
barierele de specie prin tehnologia ADN recombinat

Elemente:
(1) pasagerul
(2) vectorul
(3) Gazda
ienzime:de
restric ie,ligaze,
revestranscriptaze,
ADN polimeraze,
terminaltransferaze

Hibridarea i cibridarea celular

Mutageneza
Haploidia prin androgenez i
ginogenez
sunt cteva dintre descoperirile care au
duslaapari iauneitiin erelativ
recente, care a avut o dezvoltare
exploziv nultimii35deani
Ingineria genetic

Urm toareletehnicinu sunt considerate

aparintoarea IG cucondi iacaeles nu utilizeze

ADN recombinat sau organisme modificate

genetic:

- fertilizarea in vitro;
- procese naturale cum sunt: conjugarea,
transduc ia,infec iaviral ,transformarea;
- inducerea poliploidiei;
- transferul de embrioni;
- regenerarea unei plante ntregi pornind de
laocelul diferen iat saudintr-un esut
nediferen iat(calus)etc.

INGINERIE GENETIC
VEGETAL
CapIElementedegenetic molecular
I.1 Structuri celulare cu rol genetic.
A.Organizareagenomuluinucleari
extranuclear la eucariotele vegetale
B. Organizarea genomului nucleoidal i
extranucleoidal la bacterii

Cap. I. Elemente de genetic

molecular

STRUCTURI CELULARE CU ROL GENETIC N

CELULAVEGETAL

STRUCTURI CELULARE CU ROL GENETIC N CELULA

VEGETAL

La celula vegetal este prezent peretele celular.

Nucleii celulelor eucariote conin molecule de ADN asociate
cu proteine histonice i organizate n structuri liniare numite
cromozomi.
Nucleul este separat de restul celulei (citoplasm i organite
celulare) printr-o membran nuclear care este strbtut de
pori cu dimensiuni de 20-80 nm prin care pot trece molecule nspre citoplasm (moleculele de ARNm care transport
informaia din nucleu la ribozomii din citoplasm unde are loc
sinteza proteinelor) i dinspre citoplasm n nucleu: enzimele
pentru replicarea i repararea ADN, cele pentru transcripie i
proteinele histonice asociate ADN.
La nivelul cromozomilor se gsete zona organizatorului
nucleolar la nivelul cruia se sintetizeaz nucleolii

Citoplasma celulelor eucariote conine

numeroase organite celular dintre care unele
ndeplinesc rol genetic:
Mitocondria
plastidele, organitele productoare de fibrile,
centriolii.

Deinterespentrugenetic esteireticulul
endoplasmaticrugosiribozomiidatorit
coninutuluinARNiroluluiacestora n sinteza
de proteine.

Seconsider c ndeplinescrolgenetic
acele structuri celulare care au
capacitate de autoreproducere n
momentuldiviziuniicelularei
continuitate fizic de la o generaie
la alta de celule.

1. Structuri nucleare cu rol

genetic a) Cromozomii

Structurafizic

Structuramolecular a
cromozomilor
Substanafundamental
Cromatina:
- ADN complexat cu proteine histonice
- Ioni de Mg, Ca
- ARN
- Proteine nonhistonice
Cromatinapoateexistandou st ri
funcionale:eucromatinaiheterocromatina
(constitutiv ifacultativ )

Compactarea cromatinei

Totalitatea cromozomilor din nucleul unei celule

formeaz genomulnuclear (2n, n).
Cromozomiidelaeucarioteaustructur liniar ,
fiecareconinndosingur molecul deADNde
lungimeenorm (6,4x109 pb/46 molecule ADN,
2 m la om)
Pentruanc peannucleuADN-ul este complexat
cu proteine histonice,spiralizat,r suciti
suprar sucitntr-ostructur compact .
Nivelele de compactare: fibra de ADN
nucleozomul Solenoidul Domeniile buclate
iCromatida cromozomul bicromatidic

Fibra de ADN dublu helix

/ rsucire plectonemial
spre dreapta 2nm
Compactarea fibrei cu
proteinele histonice
nucleozom (10-11 nm)
6 nucleozomi pe rnd
Solenoidul (30 nm)
Fibra de 30 nm formeaz
bucle care nfoar un
cilindru central format din
nonhistone Domeniile
buclate i Cromatida (700
nm)- cromozomul
bicromatidic 1400 nm.

ADN dublu-helix

Modelul dublu-helix - Watson,CrickiWilkins

(1953)
Bazatpecercet tileluiCargaff(m sur tori
cantitative ale compozitiei ADN la dif sp.)
(1) %A = %T i %G = %C
(2) Raportul- purine (A,G): pirimidine(T,C)=1:1
(3) A+T/C+G 1
ialeR.FrankliniM.Wilkins(difraciecuraze
X)

Fibra de ADN diametrul de 2 nm

Nucleozomul (10-11 nm)

8 proteine histonice
2x(H2A,H2B,H3i
H4)formeaz un
octamer,nf urat
de 1,75 x cu fibra de
ADN
ntre 2 nucleozomi
ADN linker +histona
H1- fibra
nucleozomal
(m rgelepenur)

Solenoidul (30 nm)

Cromatida -700 nm/cromozom

bicromatidic 1400 nm

2. Nucleolii

sesintetizeaz peanumiicromozomi,n
regiuneacaredeineinformaiagenetic
pentru sinteza ARN ribozomal (ARNr) numit
zona organizatorului nucleolar.
Num rulnucleolilorvariaz nfunciede
specie putnd ajunge la 100 n cazul unor
speciidepeti

Structuri citoplasmatice cu rol genetic

1. Mitocondria
Totalitatea materialului genetic din citoplasm formeaz genomul
extranuclear.Laplanteestereprezentatdemitocondriiiplastide.

Genomul mitocondrial: Mitocondria cel mai larg organit celular. Are rol
esenial n producerea de energie.

Conine ADN particular (ADNmt) cu structur circular asemntoare cu cel

bacterian , necomplexat cu histone

ADNmt conine gene (condriogene) care codific :

- proteinecurolfuncionallocali

enzimemitocondrialepentrureplicareaADNpropriuipentrusinteza
speciilorpropriideARNriARNt,
Conine ribozomi proprii la nivelul crora se sintetizeaz proteinele mt
Are capacitatedereplicareautonom . de cretere, de stocare i transmitere a
informaiei genetice specifice, comportndu-se ca nite organite
semiautonome, cu continuitate citologic i genetic.

Mitocondria reprezint ereditatea extranuclear

celular (genomul extranuclear) att la plante ct i
la animale, fiind important n studii, amprentare
genetic, de filiaie, fenomenul de apoptoza celular
etc.
n timpul diviziunii mitocondriile nu se distribuie cu
exactitate n celulele fiice i se transmit pe linie
matern. ntr-o celul pot exista pn la 100
mitocondrii.
Dimensiunea genomului mitocondrial la plante mult
mai mare i variabil fa de cel animal.

2. Genomul plastidial
Plastidele sunt organite citoplasmatice proprii

celulelorvegetale,curolesenialnprocesulde
sintez istocareasubstanelororganice.
Plastidele pot fi colorate (cloroplastele,
cromoplastele)iincolore(amiloplastele,
proteoplasteleioleopalstele).
Cloroplastele rolfotosintetizantipropriulaparat
genetic (ADNcl)

Conintoateelementeleunuisistemgeneticavnd
astfel rol ereditar

Sistemul genetic plastidic este reprezentat de gene

situate la nivelul plastidelor numite plastogene.
Estealc tuitdincirca10moleculedeADN/plasmid
asamblate la majoritatea plantelor ntr-osingur
structur circular de m rime120-170 x 103 pb. La
unelealgeacestaestefracionatncirca40molecule
mici.
Caigenomulprocariotgenelecloroplastice(circa100)
sunt organizate n operoni.
Genomulcloroplasticpoart informaiagenetic pentru
sinteza ribozomilor proprii a ARN-r, ARN-tiARN
polimerazaprecumiagenelorpentrusintezaenzimelor
implicatenprocesuldefotosintez .
Setransmitecaigenomulmitocontrialpeliniematern .

Importanaeredit ii
extracromozomale

Ereditateaextracromozomal prezint importan

deosebit attdinpunctdevederepracticctiteoretic.
Unelensuiricuimportan practic nmuncade
ameliorare sunt determinate de gene extracromozomale.
Astfel,laalegereagenitorilorsevainecontdecaracterele
determinate de gene citoplasmatice, utilizndu-se ca
genitormaternp rintelecarepoart factorideinteres
(rezistenalaboliid un tori,lapesticideetc.).
Segregarea materialului genetic citoplasmatic are
importan nprocesuldiferenieriicelulare.
n cazul hibrizilor heteroplasmatici, la nivelul
plasmagenelor,maialesacelormitocondriale,afostpus
neviden posibilitateamanifest riifenomenului
heterozis.
Priningineriegenetic lanivelulplastogeneloresteposibil
sporirea randamentului fotosintetic.

3. Ribozomii - particulele lui

Palade

Ribozomii granule sferice dense formate din

proteineiARNrisuntsediul sintezei proteice.
Laeucarioteribozomiipotexistancitoplasm
sauataaidereticolulendoplasmatic.
Unnum rmarederibozomisepotcuplacuARNmnprocesuldebiosintez proteic formnd
polizomii.ARNrocup 2/3dinribozomiidela
eucariotei1/3dinceidelaprocariote.

Toiribozomiiconindou subunit i- unamic ialta

mare,difereniabileprinconstantadesedimentare
Svedberg (S).
OunitateSvedbergesteegal cu1x10-13 secunde.
Ribozomii 80S aufostevideniailaeucariote isunt
formaidintr-o subunitate mare 60S iosubunitate
mic 40S.
Subunitateamare60Sestealc tuit dinARN5S,5.8S
i28S.
Subunitateamic 40SconineARN18S.
MoleculeledeARNrconinunnum rvariabilde
nucleotide,nfunciedespeciadeARNr.Aceast
compoziiepoatefiexploatat caindicatormolecularal
gradului de nrudire dintre specii.

A.Organizareagenomuluinucleoidali
extranucleoidal la procariote bacterii

Procariotele (bacterii, alge unicelulare) nu au

nucleuadev rat,separatprinmembrana
nuclear decitoplasm .
Genomul nucleoidal de la majoritatea
bacteriilor const dintr-un singur cromozom
careconineosingur molecul deADN
circular.
n citoplasma bacteriilor ntlnim molecule
mici de ADN dublu-catenareicirculare
numiteplasmidecareformeaz genomul
extranucleoidal.

Genomul nucleoidal
procariot:
1 cromozom circular
Osingur molecul de
ADN dc 1100m
Pliere (40-50bucle)i
superpliere(r suciri
secundare, cte
400/bucl );
ARN linker
Absente histonele, ns
sunt prezente alte
proteinecareseasociaz
la ADN bacterian
denumite histone-like

Organizarea genomului
extranucleoidal al bacteriilor

Plasmidele bacteriene
molecule mici de ADN dublu catenar, circular nchis,
In IG plasmidele recombinate genetic pot fi introduse n
celulele bacteriene determinnd transformareagenetic

Printratarecuclorur decalciu,octermicsauprin
electroporare, bacteriile de tipul E. coli devin permeabile
pentru ADN.
Plasmidele au capacitatedereplicareautonom , fiind
prezente la majoritatea speciilor, dar nu la toate tulpinile
de bacterii.
Plasmidelenusuntcomponenteesenialealebacteriilor,
daracesteapringenelecareledein,confer avantaje
selective celulelorpurt toare.

Tipuri de plasmide
bacteriene

-Plasmidele conjugative (transmisibile) numite

i factori de sex, controleaz apariia pililor de
sex. n aceast categorie intr plasmidele de sex
(F, Hfr, F);
Plasmide neconjugative, cum sunt plasmidele
Col i R care nu sunt transmisibile dect n
prezena unui fag prin procesul de transducie,
sau ajutate de un factor de sex prezent n
aceeai celul.

Clasificareaplasmidelordup genelece
ledeinifunciilendeplinitencelule:

1. plasmidele R sunt plasmidele care determin

rezistena la antibiotice a celulelor gazd i pot fi
transferate de la celulele care le dein la celulele care
nu le dein, conferindu-le proprieti noi de rezisten
la unul sau mai multe antibiotice;
2. Plasmidele F, Hfr, F (plasmidele de sex sau
fertilitate) mediaz transferul de gene de la celulele
care dein aceast plasmid la celule care nu o dein,
prin procesul de conjugare.
3. plasmide Col, care determin sinteza unor
proteine numite n general Colicine care pot omor
tulpini apropiate de bacterii lipsite de aceast
plasmid

Plasmidele Ti (tumor inducing) de la bacteria

Agrobacterium tumefaciens care produce la
dicotiledonate tumori. Inducerea tumorii este
mediat deplasmideleTi(tumorinducing)
Careconinpelng geneledevirulen vir gena
tADN (de transfer). ninteriorulsecveneise
g sescgeneptrsintezaregulatorilordecretere
care induc tumorogenitatea. Sunt utilizate in IGV,
n metodele indirecte de transformare a plantelor.
Prin nlocuirea genelor de inducere a tumorilor cu
gene de interes economic regiunea ADNt este
integrat nnucleulcelulelorgazd (caresufer
prinaceastaunprocesdetransformaregenetic )
Transferul este mediat de genele vir, situate, de
asemenea pe plasmid nafarasecveneitADN.

Plasmidele neconjugative sunt de dimensiune

mic , se g sesc n multe copii/celul i nu au
capacitatea de a realiza conjugarea. Ele
reprezint 0,2-4 din cromozomul bacterian.
permit amplificarea moleculelor de ADN str in
inserate n genomul lor formnd o molecul de
ADN recombinat;
Prezint gene ce sunt utilizate ca markeri de
selecie a coloniilor transformate n tehnologia
ADN recombinat (de rezisten la antibiotice,
gena lacZ).

Ribozomii la procariote

Ribozomii 70S de la procariote sunt

formaidintr-o subunitate mare 50S
(conineARNr5Si23S)
iosubunitatemic 30S(conineARN
16S)

INGINERIE GENETIC
VEGETAL
ACIZII NUCLEICI ADN iARN

Aciziinucleici:ADNiARN

Acizii nucleici sunt macromolecule care

con innmagazinat informa iagenetic
dincelul .
Exist dou tipurideacizinucleici,
diferen iabiliprinstructurachimic i
func iilendeplinitencelul ianume
ADNsauaciduldezoxiribonucleiciARN
sau acidul ribonucleic.

ADN

ADNestepurt torulinforma ieiereditare

latoateorganismeleeucarioteilaunele
organismeprocariote(bacterii)precumi
la unele dezoxiribovirusuri (virusuri cu
genom ADN)
iARN-ulndeplineteaceast func iela
ribovirusuri.

Compoziia chimic i
structura acizilor nucleici

ADN(aciduldezoxiribonucleic)iARN(acidul
ribonucleic) sunt acizii nucleici n care
informa iagenetic estecodificat subform
de codoni.
Ambele sunt molecule polinucleotidice
rezultate prin polimerizarea monomerilor
(nucleotidele)prinintermediulleg turilor
fosfodiester.
Ocaten polinucleotidic estealc tuit din
unit imaisimplenumitenucleotide.
Nucleotidele preiau denumirea acizilor
nucleicincompozi iac roraintr

ADN-ulareostructur primar iuna

secundar .
Structuraprimar aADNserefer la
elementeledincareestecompus o
caten iarstructurasecundar se
refer laduplexulsauconforma ia
bicatenar aADN.
ARN-ul(cumiciexcep ii)este
ntotdeauna monocatenar

Nucleotida-monomerul acizilor
nucleici

Nucleotidele(monomerii)dincompozi ia
ADN se numesc dezoxiribonucleotide iar
cele din ARN ribonucleotide.
Fiecarenucleotid const dintr-o
pentoz (zahar),obaz azotat io
grupare fosfat.

(1) Pentoza

n ADN pentoza este dezoxiriboza iar n ARN

riboza. Ele difer ntreelepringruparea
ataat lacarbonulnum rul2(HsauOH).

(2)Bazaazotat

Exist dou tipuridebazeazotatei

anumepurinele,structuricudou nuclee
cicliceipirimidineleformatedintr-un
singur nucleu ciclic
nADNiARNpurinele sunt A (adenina)
iG(guanina)
n ADN pirimidinelesuntC(citozina)i
T (timina) iar n ARN Testenlocuit cuU
(uracil)

Prin legarea unei baze azotate la

opentoz rezult unnucleosid

Leg turilentre
acestea sunt
covalenteise
realizeaz ntre
carbonul C1 din
pentoz iazotul N9
dintr-opurin sau
N1 dintr-o
pirimidin .

(3) Radicalul fosforic

Radicalul fosforic +
nucleosid Nucleotida
Prin intermediul
radicalului fosforic are
loc polimerizarea ADN.
Leg turilesestabilesc
ntre carbonii 3 i5 din
pentoze.

Compozi iaacizilornucleici
Structura primar a ADN istructura
ARNestemonocatenar

Notarea
monocatenei prin
niruirea
abrevierilor bazelor
azotateiadirec iei
catenei :

Structura secundar aADN

estebicatenar

Modelul dublu-helix al ADN - Watson,

Crick i Wilkins (1953)
Bazatpecercet tileluiCargaff(m sur tori
cantitative ale compozitiei ADN la dif sp.)
(1) %A = %T i %G = %C
(2) Raportul- purine (A,G): pirimidine(T,C)=1:1
(3) A+T/C+G 1
ialeR.FrankliniM.Wilkins(difrac iecuraze
X)

Conform modelului propus de

WatsoniCrickncelul ADN-ul
este bicatenar,structur rezultat
prin legarea bazelor azotate
complementare de pe cele dou
catene antiparalele prin leg turi
dubleitripledehidrogen.
Leg turiledublesestabilesc
ntotdeauna ntre bazele azotate
AiTiarceletriplentreCiG,
adic ntreobaz azotat
purinic iunapirimidinic .
Specificitatealeg rii
complementaritate

Catena3-5estecatena
ascendent iarcealalt ,
cudirec ia5-3este
descendent .
La eucariote n procesul
dereplicarecatena3-5
senumeteprogresiv (i
conduc toarela
procariote) deoarece
sinteza ei se face continuu
iarcatena5-3este
denumit retrograd (i
decalat laprocariote)
deoarece sinteza ei se
face discontinuu, pe
fragmente scurte Okazaki.

Func iileADN
1.func iaautocatalitic prin care are loc replicarea ADN

ntimpulfazeisinteticeSdininterfaz .Cantitateade
materialgeneticsedubleaz ninterfaz cndareloc
replicareasemiconservativ aADNiarnum rulde
cromozomisedubleaz nmetafazamitozeicndare
loc duplicarea cromozomilor.

Func iaautocatalitic asigur autoreproducereai

continuitateamaterialuluigeneticdelaogenera iela
alta(adic asigur rolulgenetic)
2.func iaheterocatalitic princareinforma iacodificat

subform decodonilanivelADNestetranscris n
ARNmitradus lanivelulribozomilorntr-o protein .

Compoziia i structura chimic a ARN

LaARNnusemairespect regulilelui
Cargaff deoarece ARN-ul este monocatenar
DeitoatetipuriledeARNdincelul sunt
monocatenareuneleprezint numeroase
por iunifalsbicatenarerealizatenurma
unor plieri ale catenei cnd apar regiuni
complementare ntre care se stabilesc
leg turidehidrogen.
Aceast conforma ielaARNestedenumit
structurasecundar .

Speciile de ARN din celule

ARN-ul este material genetic doar la unele

virusuri ribovirusuri
ntr-o celul se gsesc mai multe specii de
ARN care ndeplinesc roluri funcionale
diferite - ARNmesager (ARNm), ARN de
transfer (ARNt), ribozomal (ARNr) i
diferite specii cu rol reglator sau speciile
mici de ARN, denumite astfel datorit
lungimii reduse a moleculelor;

ARNm sauinforma ional senumeteastfeldeoarece

transport informa iacodificat deADN(mesajul
genetic)ncitoplasm laribozomi,loculsintezei
proteice.Estemonocatenaridirec ia5-3.
Lungimeasaestevariabil nfunc iedecantitateade
informa iecopiat (transcris )dinADN.
Printranscrip ie,informa iagenetic (succesiunea
nucleotidelor)dincatenamatri aADN-ului (3'5')
estecopiat pebaz decomplementaritatencatena
deARNmcudirec ia5'3.Prinurmarem rimea
ARNmesteaceeaicuaADNmatri pebazac reias-a
sintetizatisecven complementar cuacesta.
La eucariote ARNmcon ineinforma iatranscris de
peosingur gen (ARNmprecursor-intermediar matur)

LaprocarioteARNmcon ineinforma ia
copiat depeungrupdegeneadiacente
(operon) ARNm policistronic. Cu
excep iaregiunilorreglatoarealegenei
laprocariote,ARNmcon inecopiatedoar
unit iinforma ionale.
Duratadevia aARNmesterelativscurt
fiinddegradatdup sintezaproteinei
ntimpcelaprocarioteexist osingur ARN
polimeraz caresintetizeaz ARNmla
eucariotesintezaserealizeaz cuajutorulARN
polimerazei II.

ARN ribozomal (ARNr) reprezint 80-85%

dincantitateadeARNdincelul ,este
monocatenaristabilinusemodific ncursul
sintezei proteinelor.
Monocatenasepliaz structur secundar i
ter iar cupor iunidc.Deregiunile
monocatenareseataeaz ARNmiARNt

ARNr este asociat cu proteinele ribozomale

formnd poliribozomii
To iribozomiicon indou subunit i- unamic
ialtamare,diferen iabileprinconstantade
sedimentare Svedberg (S) (1uS- 10-13 s).

Ribozomii 80S de la eucariote sunt

forma idintr-o subunitate mare 60S
(con ineARNr5S,5.8Si28S)
iosubunitatemic 40S(con ne
ARN18S) .
Ribozomii 70S de la procariote sunt
forma idintr-o subunitate mare 50S
(con ineARNr5Si23S)
iosubunitatemic 30S(con ineARN
16S)

Laprocarioteexist 7unit igenice(operoni)

pentru sinteza ARNr, cu un singur promotor
Laeucarioteexist maimultecopiialegenelor
pentrusintezacelorpatrusubunit i
ribozomale.
Genelepentrusubunit ile18S,5,8Si28Sale
ARNrsuntplasateunadup altantr-osecven
repetat ntandemde100-1000 n sute, chiar
mii de copii n zona oragnizatorului nucleolar iar
transcrip ialor ARN polimeraza I
Sinteza ARNr5S gene situate diferit n genomcu ajutorul ARN polimerazei III

ARN de transport (ARNt)

reprezint 10-15%dintotalulARNcelulari
are rol n procesul de
biosintez aproteinelor, deoarece are
proprietatea de a transporta aminoacizii
activa ilaribozomi,centruldesintez al
proteinelor.
Exist celpu inatteatipurideARNtc i
aminoaciziesen ialiexist ,diferen ierease
facepebazacompozi ieiparticularenrNTP.
Arestructuramonocatenar cu4regiuni
bicatenareiformadetrefl

Regiunea acceptoare are dou

extremiti: 3' i 5' libere

Toate speciile de ARNt au la
extremitatea 3' tripletul CCA
(citozin -citozin -adenin )care
servetecalocdeataarepentru
aminoacizi n vederea
transportului lor iar extremitatea
5'estepermanentguanilat ,fiind
destructur GGG.
Bucla I dihidrouracil (DHU),
sau bucla D
Bucla numrul II secv
anticodon format dintrei
nucleotidecareseleag pebaz
de complementaritate codonului
din ARNm.

Braul suplimentar III

(extrabra ul)cunum rvariabilde

nucleotide
Bucla IV T C G (ribotimin pseudouracil-citozin -guanin )

diferen ele nstructuranucleotidic explic

abilitateafiec ruitipdeARNtdeatransporta
un anumit aminoacid specific la ribozomi. Tipul
aminoacidului transportat este dictat de codonul
din ARNm recunoscut de bucla anticodon din
ARNt

Sinteza ARNt labacteriiesteasigurat degene

careseg sescnunapn lactevacopiin
cromozomul bacterian (realizat desinguraARN
polimeraz )iar la eucariote de gene care se
repet demaimulteoringenom (cu ARN
polimeraza III)

Speciile mici de ARN din celule

smallRNA

n ultimii ani au fost descrise mai multe specii de

ARNcarenucodific proteine.
Deisunttranscrisedepesecven edeADNacestea
nusuntdecodificatensecven edeaminoacizi.
Deoarecetoateaudimensiuneredus aufost
grupate generic sub terminologia de specii mici de
ARNsaunenglez small RNA.
SpeciilemicideARNexercit rol reglator n
transcrip iaitransla iagenelorcarecodific celelalte
specii de ARN care intervin n sinteza proteinelor.

Interferena ARN (ARNi) Inactivarea expresiei

genei
Interferen aARN-ului (ARNi) este un proces
celular normal prin care molecule scurte de ARN
inactiveaz expresia (transla ia)unei gene de la
eucariote
Procesulconst n:
1. producereaadou tipurideARNdc:siARNi
miARN(ntlinitelafungi,planteianimale)
2. Digestia moleculelor ARNdc cu enzimele Dicer
n fragmente scurte
3. AtaareasiARNimiARNlacomplexulproteic
RISC (RNA induced silencing complex) care
degradeaz unadintrecatenedinduplex

ncelul exist maimultemecanismeprin

carepoatefiinactivat expresiauneigene
(transla ia)prinmecanismuldeinterferen a
ARN
1) expresianormal auneigene:
A.TRANSCRIP IAB.
TRANSLA IA(EXPRESIA)
ARNmsintetizatnnucleutrecencitoplasm
laribozomi,undeareloctransla iasau
decodificareaunidirec ional ainforma iei
genetice 5 3 (cte trei nucleotide din
ARNm corespund unui AA specific care este
adus la ribozomi de ARNt).

Uneori ncitoplasm moleculele mici de ARN pot

ini iaprocesul de inactivare a ARNm prin:
degradarea ARNm sau prininhibareatransla iei.
Aceste molecule sunt speciile mici de ARN denumite
siARN (ARNmicdeinterferen )imiARN (micro
ARN) care au lungimea de 20-26 nt.
1. siARN rezult dinmoleculelungideARNcaredevin
dublucatenare - ARNdc pe anumite portiuni. Acestea
provinfiedincelul (virusuri)fiesuntintrodusen
celul printehnicileIG
n continuare, oprotein cufunc iedeenzim
(Dicer) taie aceste molecula dc n segmente scurte
de 20-25 nt formnd molecule de siARN (small
interfering RNA)

2. miARN rezult n nucleu, din secvenele

de ARNm care devin complementare pe
regiuni scurte denumite - bucle ac de pr.
Acestea sunt decupate de aceeai protein
Dicer, rezultnd secvene scurte de 20-21 nt
denumite miARN
Att siARN ct i miARN se leag la
complexul proteic de interferen RISC
(RNA induced silencing complex) care
degradeaz una din catene

Secvenele monocatenare de siARN i

miARN mpreun cu proteinele RISC se
leag la ARNm pe care l scot din funcie
(prin degradarea lui sau inhibarea
translaiei). Rezulatul interferenei siARN i
miARN cu ARNm este inactivarea expresiei
genei.

Mecanismul
interferenei
siARN i
miARN

Aplica iipracticealeARNi
Iningineriagenetic ARNiesteutilizat n
strategia antisens
- Presupuneintroducereanceluledesecven e
scurte de ARN antisens 3-5(miARN, siARN)
complementare unei molecule sens 5-3de
ARNm.Acesteapotficomplementarefiecap tului
5fiecap tului 3alARNm iaucaefect
inactivareasauscoatereadinfunc ieaARNm
- Aplica iilaplante:creterearezisten eilavirusuri,
fortificareaplantelorprincretereasintezeide
antioxidan i,producereadetomaterezistentela
nmuiere, flori variabil colorate la petunii etc

INGINERIE GENETIC
VEGETAL
CapIElementedegenetic molecular
II Structura iexpresiagenelor la
procariote i la eucariote

Structuraiexpresiagenelorla
procariote

Genomul procariot este reprezentat aproape exclusiv de

secvene informaionale, care se transcriu i se traduc
ntr-un produs polipeptidic. Fac excepie genele pentru
sinteza ARNr i ARNt care se transcriu dar nu se traduc
i secvenele cu rol de reglaj ale genelor.
Structura genelor la procariote este continu (fr
introni) adic fiec ruicodondingenastructural icorespunde
unaminoacidnproteinasintetizat .
Segmentul structural sau gena structural este un fragment
discretsaucontinuudeADNcareconineinformaiagenetic ce
specific sintezaunuiprodusfuncional(caten polipeptidic ,
enzim etc.)
nainteaidup genastructural seg sescsecvenele cu rol
de reglaj ielenuspecific niciunaminoacid.

Modelulfuncionalalgenelorlaprocariote
cuprindeattgenelestructurale,cti
secvenelecuroldereglaj:promotorul,

locul de iniiere, operatorul, locul de

legare de ribozom (SD) i terminatorul.
Acestea sunt utilizate pentru controlul
expresiei genice prin semnalizarea locului unde
ARN polimeraza s nceap s -iexercite
funcia (lanivelulpromotorului)ialoculunde

aceast enzim s seeliberezedepematria

ADN,semnalizndsfritultranscripiei
informaieigenetice(lanivelulterminatorului).
Laprocarioteexist osingur ARNpolimeraz

Secvene din amonte de gena

structural
Promotor- loc de semnalizare a
ARN polimerazei ptr nceperea
funciei;cuprindesecvenele
consensus: cutia TATA (-10)i
secvena(-35)derecunoatere
Iniiatorul - locul n care ARN
polimerazaincepefuncia
Regiunea operatorului- locul
specific de legare a represorului
(protein cufunciereglatoarecare
nu permite ca ARN-polimerazas
nceap sintezaARNm)
Locul de legare la ribozom(SD)
Gena structural ncepe cu
codonul START care transcris n
ARNm devine codonul AUG, iar
cap tulgeneiestemarcatdeunul
din codonii non-sens (STOP)
Secvene din aval de gena
structural - terminatorul

Promotorii diferitelor gene

procariote

variaz semnificativnlungimeistructur ,dartoi

coninctevasecvenescurteidenticede6-10 perechi
denucleotide.Acestesecvenecaresentlnescila
alte organisme, diferite prin 1-2baze,poart numelede
secveneconsensus.
Primasecven estesituat lapoziia-10 de la
nceputul transcrierii, formnd cutia TATA (5 TATAAT
- 3)(numit cutia Pribnowlaprocariote)iaradouala
poziia-35delanceputultranscrieriiformat din
succesiunea5 TTGACA - 3.Secvena-35 (5TTGACA-3)estesecvenaderecunoatere.

Terminatorul

Sfritulmesajuluigeneticestemarcat
de unul din cei trei codoni STOP iar
eliberarea ARN polimerazei de pe
matriaADNeste marcata dec tre
terminator

Operonul

La bacterii, un grup
de gene adiacente,
asociate cu regiunile
cu rol de reglaj, se
transcriumpreun
iformeaz un
operon.

Operonul lactozei

Toate genele structurale din operon sunt

exprimateunitaradic setranscriuisunt
traduse n bloc.
Exemplul operonului tipic de la E. coli este
operonul lactozei (Monod, 1961), care
coninetreigeneimplicatenconversia
dizahariduluilactoz ndou monozaharide:
glucozaigalactoza.

Cele trei gene ale

operonului lactozei
denumite lacZ, lacY i
lacA seexprim (se
transcriu) mpreun
Gena lacZ din cadrul
operonul lac de la E.
coli esteutilizat ca
marker genetic
pentruseleciacoloniilor
transformate pe medii
culactoz

Transcripiaitranslaia
(expresia genelor) la bacterii

La procariote enzima ARN polimeraza (oholoenzim )este

format dintr-unmieziosubunitate implicat niniierea
transcripiei.
ARNpolimerazanainteaz de-alungulcateneideADNf cnd
transcrierea mesajului genetic n ARNm, ncepnd cu codonul
STARTiterminndlacodonulSTOPpn ntlnete
terminatorului.
Secunoscdou tipurideterminatori: intrinseci caredetermin
terminareatranscripieiprinns ienzimaARNpolimerazai
terminatori extrinseci denatur proteic cunoscuisubnumele
de factor Rho ().

ARNm de la procariote ncepe la captul 5 cu o grupare

trifosfat i este lipsit de cozile poli (A) la captul 3.

Laprocariotetranscripia(ADN-ARNm)i
translaia(ARNm- proteine) nu sunt separate n
timpispaiudeoarecenuexist membran
nuclear ,spredeosebiredeeucarioteunde
prelucrareainformaieigeneticencepennucleu
isetermin ncitoplasm .
Genele de la procariote nu sunt divizate n exoni
iintroni.
LanivelulARNmdelaprocarioteseg sescmai
multe situsuri de legare la ribozomi, astfel nct
sepotsintetizadirectdepeomolecul deARNm
mai multe proteine ARNm policistronic.
Translaiancepelanivelulsitusuluidelegarela
ribozom,reprezentatnARNdesecvenaShineDalgarno(SD)adiacent codonuluiAUG,
secven denucleotidecomplementare
cap tului3alARNr

STRUCTURA GENELOR LA
EUCARIOTE I ELEMENTELE DE
REGLAJ

Laeucariotegenele(carecodific
proteine) sunt formate din:
segmentul structural (START---STOP)isecvenele cu rol de
reglaj situatenainteidup gena
structural (promotor,secvenede
conducere, trailer).
Structura genei este discontinu :
Discontinuitatea genelor de la
eucarioteconst nalternarea
segmentelorinformaionaledenumite
exoni, cecodific aminoacizi,cu
segmentedeADNnoninformaionale
denumite introni icarenucodific
aminoacizi,

Principalele elemente reglatoare ale unei

gene eucariote

Elementele reglatoare ale genelor la

eucariotendeplinescfunciadepromotori,
secvenedeconducere,iaraltelefunciade
terminatori(secvenelepentrucoad ).

Promotorul eucariot

Promotorul eucariot este format din

cutia TATA (Hogness)situat npoziia

-30iesteprecedat dealtedou
secvenelocalizatecu-75pb(CAT)i
respectiv -90pb anterior nceputului
transcripiei(ARNm).
Rolul promotorului este de a semnaliza
ARN polimerazei II loculundes
nceap transcripia.
La eucariote exist mai multe ARN
polimeraza ns ptr transcripiagenelor
structuraleesteutilizat ARN
polimeraza II.
SintezaARNr18S,5,8Si28Seste
realizat deARN polimeraza I iar a
ARNr5SiARNtdec treARN
polimeraza III. Aceste gene se
transcriu dar nu se traduc

Secvenele de conducere (antileaders - L) sunt acele

secvenedenucleotidecaresesitueaz ntrecutiaTATA
icodonuldeiniiereSTART.
Secveneleantileadersconinrepetiiiinversatescurte
(palindrom)caretranscrisenARNmdevinsecvene
leader
Laeucariotensecvenageneilipsescsecvenele
cosnsensus de legare la ribozomi.
PrinprelucrareaARNmtranscrislacap tul5se
formeaz secvenaCAPcarendeplineteacestrol.
Secvenele pentru terminarea transcripiei
Dup codonulSTOP,seg sescsecvenelepentru
coad care nu sunt transcrise de pe informaiadin
ADNdarsuntsintetizatedenovoilanivelul ARNm
determin complexulpoliA(AAAAAAAA)

Expresia ADN nuclear la eucariote

(Transcripia/translaialaeucariote)

M rimeagenomuluilaeucariote(3-4 x 109) este mult

mai mare dect la procariote dar nu este corelata cu
complexitatea genomului
Exist treiARNpolimerazediferite:ARNpolimerazaI,II
iIII.DoarARNpolimerazaIIparticip latranscripia
ADNnARNmagenelorcecodific proteinele,celelalte
dou nusuntimplicatedirectnsintezaproteic .
Laeucariotecopiereainformaieigeneticecuprins n
ADNitranscripiaeinARNmparcurgemaimulte
etapeimaimultestadiideprelucrare:
ARNm precursor - ARNm intermediar i ARNm
matur

Transcripia are loc n nucleul celulelor eucariote,

procesprincaresesintetizeaz ARNm precursor(care
arecopiat integralinformaiagenetic agenei
structurale)
Tot n nucleu are loc procesul de prelucrare a ARNm
precursor (splicing) n ARNm matur. Procesarea
informaieigeneticelaeucariotecuprindedou faze:
1 - modificareacelordou extremit ialeARNm;
2 - eliminareadinARNmprecursoraintronilori
asamblarea exonilor

Prelucrarea capetelor ARNm

ARNmesteprelucratprinadiialacap tul5al
moleculei a unor nucleotide metilate: 5
metilguanozin nprimaetap cuajutorulenzimei
guaniltransferazainfinal
7-metilguanozin, cu enzima
guanilmetiltransferaza, aranjate ntr-oconformaie
special numit cap.
Lacap tul3arelocsintezauneiformaiuninumit
coad (princopiereainformaieidinsecvenapentru
trailersaucoad ),format dinaproximativ150-200
nucleotidececoninadenin (complexul poli-A)

Eliminareaintronilori
asamblarea exonilor

Dup modificareacapetelorARNm,
denumit precursor, acesta este supus
procesului de (splicing) eliminare n
etape a intronilor ( ARNm
intermediar iapoi ARNm matur)
caretrecencitoplasm laribozomi,
locul sintezei proteice.

ARNmeucariotaretranscris
informaiadepeosingur gen

INGINERIE GENETIC
VEGETAL
CAP.2
MARKERII MOLECULARI

Delageneticaclasic la
geneticamodern

ngeneticaclasic studiultransmiterii
caracterelor,structuragenetic aunei
popula iiistudiulcaracterelor
cantitativepornetedelafenotip.
nacestscopsuntutilizatediferen e
genetice specifice care se transmit la
descenden iipotfiurm riten
descenden .

Acetiasuntmarkerii morfologici (culoarea,

form -caractere calitative sau talia,greutatea,
produc iicaractere cantitative).
deipotfieviden ia isimplu,prinobservare
saum surare, prezint multedezavantaje:
suntnnum rlimitat
suntinfluen a idecondi iiledemediu
potfilimita idesex
semanifest ndiferiteperioadede
dezvoltareinconsecin suntdificilde
utilizatnmuncadeselec ie.

Dezvoltarea tehnicilor moleculare n ultimii

30-40 de ani, prin care variabilitatea poate fi
eviden iat lanivelmolecularadusla
schimbareaabord riistudiilorntoate
ramurilegeneticii:fundamental ,
popula ional icantitativ .
Analizadiversit iigeneticeiavariabilit ii
intra sau interspecifice, intra si
interpopula ional sepoaterealizalanivel
molecular cu ajutorul markerilor moleculari

Markerii moleculari suntreprezenta ideorice

diferen elanivelmolecularcaresetransmit
conformlegilormendelieneipotfiurm rite
ndescenden .
Clasificare:Suntcategorisi idup tipul
acestoraimodalitateadeeviden ieren:
A) markerii proteici (sau biochimici) molecule proteice, enzime, hormoni sau
anticorpicareprezint dou saumaimulte
variantemoleculare(secven ediferiten
AA). Variantele moleculare pot fi discriminate
n urma unor tehnici cum este electroforeza.

ntruct n sinteza proteinelor intervin

diferite procese moleculare prin care
informa iagenetic esteprelucrat
(transcrip ie,transla ie) nregistrarea
expresieigenicepoatesuferimodific ri
Deipotfiurm ri iuorndescenden
datorit transmiteriicodominantesuntn
num rlimitat,suntinfluen a ide
condi iiledemediuidestadiulde
dezvoltarealplanteicaimarkerii
morfologici.

Markerii ADN (moleculari) aufostdezvolta i

mairecentodat cuapari iatehnicilorde
eviden iereaapolimorfismelorlanivelADN.
Suntreprezenta ideoricediferen e(varia ii,

polimorfisme) de la nivel ADN care

determin existen aadou saumaimulte
variante alelice la un locus, exprimate sau
nu n fenotip.
Acestediferen esuntdeterminatedemuta ii
care pot fi situate n interiorul unei gene
saunregiunileintergeniceisetransmitla
desecenden i.

Dezvoltarea tehnicilor markerilor moleculari

carepunneviden polimorfismelelanivel
ADNaduslaini iereadenumeroase
aplica iindiferitedomenii:
selec iaiameliorareaplantelori
animalelor (MAS-Marker Assisted Selection)
filogenie,taxonomie,criminalistic /justi ie
etc.

Avantajele markerilor ADN

Suntnnum rnelimitat
Nusuntinfluen a idecondi iiledemediu
Potfieviden ia inoriceetap adezvolt rii
plantei,nusuntlimita idesex
Potfiurm ri indescenden datorit transmiterii
codominanteicuajutorultehnicilormolecularede
laborator
Potfiob inu idincantit iinfimede esutidin
oricare parte a plantei

Potfisitua ilanivelulADNnuclearsau
citoplasmmatic
Markerii ideali:
A) au un polimorfism nalt (mai multe alele la
acelailocus)
B)setransmitcodominantipotfiuorde
urm ritndescenden
C) au reproductibilitate mare
D)neutrifa decondi iiledemediu
E)costuriieftineitehnic minim disponibil
Acestecondi iisuntndeplinitedemarkerii RFLP
iSTR(microsateli i)

Clasificarenfunc iedetehnica
deeviden iereamarkerilor

Markerii ADN baza ipereac iaPCR

Markerii ADN baza ipehibridare

Tehnica PCR

Esteotehnic deamplificarein vitro a unei

gene (fragment de ADN) n miliarde de copii
n cteva ore.
Principiultehnicii:sebazeaz pemodelul
replic riiADNin vivo, realizat de ADN
polimeraza.
Procesulsedesf oar n3etapecare
formeaz unciclucesereiade30-40 ori.

Amesteculdereac iecon ine

ADNmatri 50-100 ng extras din diferite

esuturi
Primerii secven escurtede10-20 nucleotide
cudirec ia5-3 caresevorataapebaz de
complementaritate la capetele 3 - 5 alematri ei
ADNivormarcacapetelefragmentuluicevafi
amplificat.
ADNpolimerazatermostabil - esteextras dela
bacterii termofile (Thermus aquaticus) ptr a
rezista la temperatura de denaturare a ADN (9095oC)

Cei patru precursori nucleotidici dNTP

(dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
Tamponul enzimei ADN polimeraza

Etape

1. DENATURAREA ADN prinnc lzirea

amestecului PCR la 90-95oC are loc ruperea
pun ilordeHdintreceledou catene
2. ALINIEREA PRIMERILOR serealizeaz la
temperaturivariabilenfunc iedelungimeai
compozi iaacestora,ngeneralla50-60oC.
Primeriiseataeaz lamatri aADNpebaz de
complementaritate
3.ELONGA IA ADN polimeraza (Taq
polimeraza)polimerizeaz (sintetizeaz )noile
catenedeADNprinad ugareadenucleotide

complementarecumatri a,imediat
dup secven eleprimeri.Temperatura
optim ptractivitateaTaqpolimerazei
este de 72oC. ADN polimeraza este o
enzim carecatalizeaz sintezanoilor
catenendirec ia5-3
Cele3etapeformeaz unciclucarese
reia de 30-40 ori.
Procesulesteexponen ial,dup 32
cicluriseob in1,7x109 copii ale
fragmentuluiini ial

Alegerea primerilor nreac iaPCR

Sefacenfunc iedecunotin eleanterioarepecarele

avem despre genomsaugen . Din acest punct de vedere
avemdou categoriideprimeri:
Primerii specifici de locus
Primeriispecificidelocussuntalc tui idin18-25 nucleotide
isuntcomplementaricapeteloruneisecven especifice
(gene)custructur cunoscut .Primerul pentru catena 3 5 senumetesens iar cel complementar catenei 5-3
antisens
Primerii arbitrari
Suntalc tui ideobiceidin6-10 nucleotide mperecheate la
ntmplare.Con inutullornG- Ctrebuies fiedecel
pu in40% itemperaturadeataarelamatri redus
35oC.Suntutiliza intehnicaRAPDcteunulntr-oreac ie

VizualizareaproduilorPCR

Prinelectroforez ngeldeagaroz
Gelurile deagaroz sunt medii poroase n care
porii au dimensiuni apropiate cu ale
particulelorsupusesepar rii,caracteriznduseprinefectuldesit molecular .
Electroforezangeldeagaroz esteometod
simpl ,rapid isensibil pentrusepararea,
identificareaipurificareafragmentelorde
ADN.

nsolu ietampon,ADNaresarcin
electric negativ decisevandreptaspre
anod.
Geluriledeagaroz au o putere de
rezolu iemaimic dectcelede
poliacrilamid ns au ogam deseparare
multmailarg , fiind utilizate pentru
separarea fragmentelor de ADN cu
m rimedela200pbpn laaproximativ
50 kb, nfunc iedeconcentra iaagarozei.

APARATURA PENTRU
ELECTOFOREZA

Cuva de migrare
Si sursa electrica

camera obscura

VARIANTE ALE AMPLIFICARII PCR

PENTRU MARCAREA MOLECULARA
VariantePCRptrmarcareamolecular :
Markerii
RAPD
AFLP
STR
si tehnicile de evidentiere a lor

De la dezvoltarea tehnicii PCR mai multe

variante au fost dezvoltate n scopul
eviden ieriidiferitelorpolimorfismelanivel
ADN.
Acesteaseadresez fieunuisingurlocus,
fie mai multor loci sau chiar ntregului
genom.
Rezultatul este oamprent genetic

specific unui individ, de tip:

unilocus
multilocus
sau genomica (RAPD, AFLP)

Tehnica RAPD - Random Amplified

Polymorphic DNA
(Williamsicolab.,1990)

Principiul tehnicii
- ADN izolat de la un anumit individ este supus
uneireac iiPCRutilizndun singur primer de
secven arbitrar caresevaataalasecven e
complementaredinmatri aADN,ncazuln
careacesteaexist .
ADNpolimerazaalungeteprimeriicarei-au
g sitsecven acomplementar is-auataatla
matri .Dac dinntmplaredoiprimeri
consecutiviafla invecin tate(deobiceilamai
pu inde3000bp),seataeaz lamatri n
sensuriopuse,fiecarepeunadinceledou
catene, fragmentul delimitat de ele va fi
amplificat.

Dac unuldinceledou situsurideataareeste absent la

un individ (datorit uneimuta ii), la acesta amplificarea nu
vaavealocivafieviden iatunpolimorfismlanivelul
fragmentelor amplificate.ngeneralnRAPDseob ineun
num rlimitatdebenzipolimorfengel(2-10).
ntehnicaRAPDseutilizeaz primeriarbitraridecameria
Aceast tehnic furnizeaz markeridominan i,adic un
polimorfismdeprezen /absen eviden iatprinfaptulc
unfragmentamplificatesteprezentngel(caalel
dominant A)sauabsentcaalelarecesiv - a, deci
homozigotul dominant nu poate fi distins de heterozigot.

Aplica iipractice

Studiereavariabilit iigeneticeintrai
interpopula ionalelaplante
Construirea arborilor filogenetici

Avantaje /dezavantaje

CuajutorultehniciiRAPDsestudiaz polimorfismulla
nivelul ntregului genom-AMPRENT GENOMIC
tehnica nunecesit cunotin eanterioaredespre
genomul studiat
- estesimpl ,rapid iieftin
- fiindometod rapid poatefiutilizat ndeterminarea
diversit iigeneticelaplante,animaleiom(ntocmirea
dendrogrameloricalculareadistan elorgenetice);n
descoperirea markerilor sex-linka i,
esteieftin ncompara iecualtetehnici.
MarkeriiRAPDpotfitransforma inmarkerispecifici
SCAR
Marele dezavantaj altehniciiconst nfaptulc tehnica
arereproductibilitatefoartemic , iar markerii nu pot fi
urm ri indescenden .

Markerii SCAR (Sequence

Characterized Amplified Regions)

TehnicaSCARpornetedelabenzilepolimorfice
ob inutenreac iaRAPD(Benzispecificeunui
individ)
Benzileseexcizeaz dingeliseextrageADN-ul
ADN-ulestesecven iat(isedescifreaz secven a
n nucleotide)
Pebazasecven eiseconstruiesc2primerispecifici
delocuscarevorfifolosi ilaamplificareaspecific
PCR a unui locus

Prin dezvoltarea primerilor SCAR

tehnicaducelaob inereaunei
amprente specifice de locus.
Potfidezvolta imarkerispecificide
locus(codominan i)pebazamarkerilor
dominan iRAPD

TEHNICA AFLP (Amplified Fragment

Length Polymorphism)

Tehnicaafostdescris pentruprimadat dec tre

Vosicolaboratorii(1992).
AFLPesteotehnic bazat pepunereaneviden
apolimorfismelorntreguluigenomdup
amplificareaselectiv cuajutorulPCR,aunei
categoriiparticularedefragmenteob inuteprintr-o
restric ie, careutilizeaz 2enzimederestric iei
adaptori.
Mareleavantajalmetodeiestec nunecesit
informa iipreliminaredespregenomulanalizat.
Ducelaob inereauneiamprente genomice

Etapele tehnicii AFLP

digestiaADNgenomiccudou enzimederestric ie,

unacaretaiedesialtacaretaierar;
legarea adaptorilor oligonucleotidici la capetele
fragmentelor ob inuteprindigestie;
designul primerilor
amplificareaselectiv prinPCRaseturilorde
fragmente (n cazul genoamelor complexe se fac
dou amplific riselective);
analiza fragmentelor amplificate n gel de
poliacrilamid .

Enzimelederestric ie

Enzimelederestric iesuntendonucleaze de tip II care

ac ioneaz ninteriorulcatenei ADNiproduct ieturinumai
ntre anumite baze particulare denumite sitsuriderestric ie.
Fiecareenzim recunoateunsitusspecificformatdin4-6
pbiproducet ieturispecifice numai la acest nivel
Dup m rimeasitusuluiderecunoateresempartndou
categorii:
cu situsul format din 4pb - care taie des
cu situsul format din 6pb - care taie rar
Dup tipul capetelor produse:
- cu capete boante sau drepte
- cu capete adezive sau coezive

nurmat ieriiproduc:
capete drepte sau boante (blunt ends).
sau coezive (cohesive/sticky ends)

1. DIGESTIA ADN GENOMIC

Pentrupreparareauneimatri eAFLP,ADN
genomicesteizolatidigeratsimultancu2
enzimederestric ieEcoRIiMseI.
Utilizatempreun ,acesteenzimegenereaz
fragmentedem rimi cuprinse ntre 25-1000 pb.
Fragmenteleob inuteprinrestric iepotfi
grupate n 3 clase:
- mareamajoritate(90%)prezint dou situsuri
MseIlaextremit ilelor;
- aprox.10%prezint unsitusEcoRIiunsitus
MseI;
- ctevafragmenteprezint 2situsuriEcoRI.

2. Legarea adaptorilor

Adaptorii sunt fragmente de ADN dublu

catenare, sintetizate in vitro, n a c ror
structur se reg sete situsul de restric ie al
unei enzime
adaptorii EcoRI i MseI, dublu catenari, se vor suprapune
peste capetele fragmentelor de ADN care au fost obinute prin
digestie tot cu cele dou enzime

3. Designul primerilor

n structura primerilor
PCRvomreg sisecven a
situsului enzimei de
restric ie(opartedin
secven aadaptorilor,o
partedincap tulADN
genomic)+onucleotid
selectiv .Num rul
nucleotidelor selective
poate varia de la 0-3 pe
primer.

4.Reac iadepreamplificare
PCR (a)

Dup digestiaADNgenomicilegarea
adaptorilor, fragmentele de ADN vor fi
amplificate prin PCR
Dac selucreaz cugenoamecomplexe(plante
sauanimale),PCResterealizatndou etape
consecutive.
nprimareac ie,numit preamplificare,ADN
genomic este amplificat cu doi primeri AFLP
ce au cte o singur nucleotid selectiv.

5. Amplificareaselectiv PCR 2
(b)

ProdusulPCRalpreamplific riiestediluati
utilizatcamatri pentruadouaamplificarePCR
numit selectiv .
nadouareac iePCRvomutilizadoiprimeri
AFLP cu trei nucleotide selective.
Num ruldefragmentedetectateintr-o amprent
genetic scadecndnum rulnucleotidelor
selectivecrete
Primerii sunt n prealabil marcati astfelncts
poat fivizualizatefragmenteleamplificate(prin
autoradiografiageluluidepoliacrilamid ).

6. Vizualizarea fragmentelor prin

electroforeza in gel de poliacrilamida

Dup amplificareaPCR - AFLP,

fragmentele sunt migrate ntr-un gel de
poliacrilamid depecaresevaob ineo
autoradiografie.
Profilulbenzilorob inutecorespunde
polimorfismului ntregului genom al unui
individ,numitamprent genetic
(genomic )

Aceast strategiedeamplificarendou
etape permite ob inereauneiamprente
genomice foarte clare;
Primerii sunt universali;
Se poate adapta la orice specie;
Seob ineimagineapolimorfismelor
ntregului genom;
Are reproductibilitate foarte mare;
esteutil cuprec derelaplantepentru
determinareaunorsoiuri,variet isau
cultivare

Imaginea amprentei AFLP

la Arabidopsis (I),
roie(II),porumb(III),i
om(IV)ob inut dinADN
genomic digerat cu
enzimele EcoRIiMseIi
trei seturi diferite de
primeri; fragmentele ADN
rezultate n urma
amplific riiaum rime
cuprins ntre45i500
pb.

Aplica ii

Studiidediversitategenetic ,m surarea
variabilit iiinter- sauintrapopula ionale,a
distan elorgeneticesaupentrurealizarea
clasific rilorntaxonomie.
Stabilireah r ilorgeneticelaspeciilepu in
cunoscutesauacoloundesondeleimarkerii
PCRnuaufostnc dezvolta i.

Polimorfismele din ADN

Polimorfism- variaielanivelADNcare
determin existenaa2saumaimultealele.

Tipuri de polimorfisme ADN:

1. SNP
2. RFLP
3. VNTR
4. STR

Marcarea STR(microsateliii)

STR ShortTandemRepeats/secvene
simplenaltrepetateitandemizate,cu
monomerul format din (1-6pb)n.
Noninformaionale(nusetranscriu/traduc)
Polimorfismuldatdenum rulrepetiiilorn
tandem la nivel alelic
Polimorfism mult mai ridicat dect cel al
minisateli ilor
Utilizare/ amprente genetice n scop de

Markerii STR (Short Tandem

Repeats)

Majoritatea markerilor STR sunt dinucleotidici de tipul

(AT)n, (AG)n, (AC)n
Suntrelativabunden ilaplanteiprezint variabilitate
nalt (num rmaredealele/locus)
Tehnicadeeviden ierealor PCR, n care primerii sunt
constitui idinsecven envecinate(de obicei gene) nalt
conservatencadrulspeciei,uneoriiagenului.
Polimorfismulestedeterminatdenum rulrepeti iilor
monomerilor in cadrulalelei,adic delungimeaalelei

Profilul electroforetic al
polimorfismelor STR si mostenirea
acestora in descendenta

Avantaje

Distribu ieuniform ngenom

Polimorfism foarte ridicat
Transmiterecodominant
Aplicabilitate:
Genotipizarea indivizilor
Evaluarea germoplasmei
Evaluareadiversit iigenetice
Cartarea genomului
Studiidefilogenie,taxonomie,amprentaregenetic

Selec iaasistat demarkeri

(MAS)

Este un procedeu prin care un marker

rezisten alaboliid un tori,toleran ala

stresbioticiabioticetc).
Markerul molecular este situat pe
cromozom foarte aproape de gena de
interes (chiar n interiorul ei) astfel nct
transmiterea se face prin linkage complet

molecularesteutilizatpentruselec ia
indirect auneigenecaredetermin un
carcater de interes economic (produc ii,

Markeriimolecularistrnslinka icuogen
deinteresagronomicsuntfolosi ica
instrumentemolecularepentruselec ia
asistat demarkerinameliorarea
plantelor.
Dup stabilireatransmiteriinl n uitea
markerului cu gena de interes nu mai este
necesarurm rireacaracteruluicidoara
markerului.Pentruaceastadistan adintre
markerigenadeinterestrebuies fie
maimic , de 5cM, pentrucamarkeruls
poat fiutilizatnselec ieadic s se
transmit completnl n uitcugena

Stabilireadistan eidiintregen imarkerse

faceprinretroncruci riiurm rireasegreg rii
ndescenden (h r ilegenetice)
Selec iapebazamarkerilormolecularidepinde
de:

- tipul markerilor disponibili

-tehnicadisponibil nlaborator
Costurile impuse
Obiectivelenselec ieiameliorare

Markeriiidealiautransmiterecodominant ,sunt
insensisbililamediuirelev unpolimorfism
foarteridicat.Acestecondi iisuntndeplinitede
markeriiRFLPimicrosateli i

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINAT

CAP.III

definitie
Prin tehnologia ADN recombinat se transfer
ogen provenit delaospeciedonor
denumit PASAGER (I) ntr-ocelul
receptoaredenumit GAZD (III). Pentru a
fiprotejat deaciuneaenzimelorcelulei
gazd , genapasageresteinclus ntr-un
vector sau VEHICUL (II). Gena pasager
mpreun cuvectorulformeaz omolecul
de ADN recombinat.

Transformareagenetic la
procariote
Transformareagenetic esteunprocesdemodificareauneiceluleprinncorporarea de
materialgeneticstr in(ADN)carep trundenceluleprinmembranacelular .Starea
celuleincareaceastapoateacceptamaterialgeneticstr insenumetestarede
competen .
Procesul poate avea loc natural la unele specii bacteriene (Streptococcus pneunomie)
ns laaltespecii_E.coli procesul de transformare poate fi indus prin diferite
metode:
- Tratarea bacteriilor cu CaCl2
- Electroporare
- oc termic de scurt durat (42oC), procese prin care membrana bacteriei devine
permeabil pentrumoleculestr inedeADN
nurmatransferuluidegeneseobinmicroorganisme recombinate genetic (MOMG).
Acesteasemultiplic ninteriorulceluleiodat cumaterialulgeneticalgazdeiproces
denumit clonaremolecular .
Clonarea genelor pasager n celule procariote se face n scopul:
- Producerii de biomolecule de interes economic, farmaceutic, sau pentru
bioremediereahabitatelorpoluate,etcaceast tehnologiefiindbazabiotehnologiilor
moderne.
- Multiplic riisauclon riigenelor nvedereaalc tuiriih rilorfizicesauacelorde
restricie.

Schemageneral derealizare

nscopulclon riigenelornbacteriisuntnecesare
3elementeiseparcurgmaimulteetape:
Elementele tehnologiei ADN recombinat (clonarea
molecular agenelor)
- PASAGER
- VECTOR
- GAZD
n procesul de clonare intervin mai multe enzime:
- Enzimelederestricie
- Ligazele
- Terminal transferazele
- ADN polimerazele
- Reverstranscriptazele

Etape:
1. Obinerea vectorului
2. Izolarea pasagerului
3. Integrarea pasagerului n vector i formarea ADN
recombinat
4. Introducerea ADN recombinat n celula gazd
5. Selecia celulelor care poart ADN recombinat
6. Clonarea propriu-zis a genei
7 Detecia genei clonate sau a produsului de sintez

1. Izolarea vectorului

Vectorii sunt structuri celulare care ndeplinesc rol

geneticncelule.Vectoriicaretransport genepasager
n celule procariote pot fi plasmide bacteriene sau
virusuri ale bacteriilor (bacteriofagi).
ningineriagenetic aufostconstruiiartificialdiferii
vectori hibrizi (ntrefagiiplasmide,cromozomi
artificialidebacteriisaudedrojdii)nscopulclon riiunei
cantit isuperioaredematerialgenetic.

Caracteristici generale ale

vectorilor:
1.Vectoriiconintreielementeeseniale:
- Situsuri unice sau multiple pentru enzime de
restricie lanivelulc roravectorulpoatefi
deschispentruinseriageneipasager
- Origineareplic rii pentrureplicareautonom
- Markerideselecie gene marker incluse n
vectorcuajutorulc rorasefaceselecia
celulelorrecombinate(genederezisten la
antibiotice, gena LacZ, etc).

Exemple de vectori
Dup m rimeainsertuluipecarelpotprimi
vectorii sunt de mai multe tipuri:
Vectorul de clonare
Mrimea insertului
Vectori plasmidiali standard
10 kb
Vectori derivai din bacteriofagul
23 kb
Vectori hibrizi cosmide
44 kb
Vectorii BAC
Mai mult de 300 kb
(cromozom artificial bacterian)
Vectorii YAC
2.0 Mb
(cromozom artificial de drojdie)

Plasmidele ca vectori de clonare

- Plasmidelenativereprezint ereditateaextranucleoidal a
bacteriilor
- Genomul relativ mic (<4,5 kb)
- Seg sescnnum rvariabilncelule
- Sunt molecule circulare de ADN, au capacitate de replicare
autonom (coninregiuneaorigineareplic rii oripunctul
din care ncepe replicarea moleculei)
- Conindiferitegene:
derezisten ladiferiteantibiotice
demetabolizareaunorcompui (lactoz ,triptofan)unii
toxici (hidrocarburi, toluen, etc)
- Nusuntesenialepentrubacteriins leconfer avantaje
selective n diferite procese
- Potintegramoleculestr inedepn la10kb

dup riteriul autotra sfera ilitii:

1. o jugative poart opero ul tra
respo sa il u i iierea o jugrii F, F, Hfr
2. neconjugative (Col, R)
3. mobilizabile transferabile (poart secv.
mob care le asigur o ilizarea eve i e te
de conjugare)

Plasmidele ca vectori de clonare

Pentru a fi utilizate ca vectori plasmidele slbatice sunt
supuse unui proces de modificare mutilare genetic pentru
ca acestea
(1) s poat fi deschise precis (situsuri de clonare unice,
multiple (MCS/Multiple Cloning Sites),
(2) s confere avantaje selective coloniilor care conin ADN
recombinat (markeri de selecie)
i (3) s aib capacitate de replicare autonom (reginea ori)
toate acestea pentru a fi sub controlul cercettorului.

Categorii de vectori dup scopul n care au fost

construii
Clonare n scop general - are ve torii su t utilizai
pentru multiplicarea (clonarea) genelor.
Clonarea pentru expresie: a eti ve tori au fost
o struii s opul expresiei (translaiei ge ei lo ate
adi pe tru o i erea produsului odifi at de ge e.
u t utilizai astzi ioteh ologiile oder e pe tru
produ erea de io eole ule i suli , i terfero ,
vanilina etc) .
Clo area ve tori avet a fost dezvoltat s opul
tra sportrii u ui frag e t de ADN tre dou gazde:
o a terie i o levur sau tre a terii i alte elule
eucariote;

(1) Situsurile de restricie Sunt eseniale pentru

deschiderea vectorului i introducerea genei pasager
pot fi unice (ptr o singur ER) sau multiple ptr mai
multe ER (MCS/PCS- Multiple/PoliCloning Site).
(2) Originea replicrii: este secvena ori din genomul
plasmidial este recunoscut de ADN polimeraza pentru
iniierea transcripiei. Este esenial pentru clonare
deoarece permite multiplicarea genei i expresia ei n
celula gazd.

Markerii de selecie

Sunt gene introduse n vectori n scopul identificrii celulelor transformate, care au

primit ADN recombinat fa de cele nerecombinate genetic
Markerii de selecie sunt n cele mai multe cazuri gene de rezisten la antibiotice (AmpR,
TetR, KanR, ClfR etc) iar selecia clonelor recombinate se face pe baza rezistenei la
antibiotice (n medii rezist doar coloniile transformate ce conin ADN recombinat).
sau gene marker pentru selecie pe medii cu anumii compui pe care i metabolizeaz (gena
LacZ din operonul Lac de la E.coli care codific enzima galactozidaza implicat n
metabolizarea lactozei n glucoz i galactoz). n acest caz selecia clonelor recombinate se
face prin teste histochimice: Pe medii cu lactoz n prezena indicatorului X-gal coloniile
transformate vor fi albe iar cele netransformate (cu gena activ) se coloreaz n albastru.
Gene reporter sunt gene a cror produs este enzima luciferaza (extrase de la licurici sau
meduze) care produce luminiscen la o anumit lungime de und (GFP, YFP, etc) Deoarece
sunt fuzionate la genele pasager expresia lor se realizeaz sub forma unui produs de fuziune
(luciferaz +gena pasager) a crui identificare este simpl, prin vizualizare n lumina UV a
fluorescenei produse
n general se urmrete identificarea prezenei genei marker, alteori gena pasager se include
n gena marker pe care o inactiveaz fenomen denumit inactivare prin inserie.

Exemple de vectori plasmidiali

Tipu Markeri de selecie
ri

Situsuri de restricie

Inactivare prin inserie

ColE Gena de imunitate la

1
colicin

EcoRI

Inactivare prin clonare n MCS Incapacitate de a produce colicin

pBR

Gene AmpR i TetR

Multiple - n markeri i
nafara lor.
La clonare se utilizeaz
situsul unic EcoRI ntre
cele 2 gene

Nu dac clonarea se face ntre

genele de rezisten
Da, n cazul clonrii n interiorul
genei TetR

pUC

Gene AmpR i LacZ

MCS n gena LacZ

Inactivare LacZ selecie dup

fenotip colonii albe transformate
/albastre netransformate

pGE
M-T
easy

Gene AmpR i LacZ

MCS n gena LacZ

Inactivare LacZ selecie dup

fenotip colonii albe transformate
/albastre netransformate

Harta vectorilor pBR322

Are la az ele e te de la
mai multe plasmide pe care le
o i e
od atural E. oli
(R5,R6, pMB)
Co i e regiu ea ori
Ge e arker de reziste la
a pi ili i tetra i li
Situs EcoRI ptr des hidere i
clonarea genei pasager ntre
ele dou ge e arker
ele ie pe edii u
a ti ioti ul tetra i li i/sau
a pi ili

Harta vectorului pUC

Provine din pBR322 de la care s-a
pstrat ge a AmpR la care s-a
adugat gena LacZ opero la i
origi ea repli rii de la plas ida
ColE1
Clo area situsul ultiplu MC i
inactivarea genei lacZ
ele ia lo elor etape:
A pe ediu u a pi ili
B dup fe otip al re o i at,
albastru nerecombinat) pe medii cu
la toz preze a i di atorului X
gal.

ele ia lo elor u ve torul pUC

Harta vectorului pGEM T easy

Ase tor u pUC pri
genele marker (AmpR i
Lac) i situsul PC
interiorul lacZ
Dou regiu i ori f i Col i
doi promotori de la fagii T7
i P6 are per it
tra s ripia a elor ate e
n sens invers.
ele ia si ilar u ea
pentru vectorul pUC.
Are genomul mai mare
de t pUC i poate lo a
u i sert superior fa de
pUC

Ve tori derivai di fagul

Fagul virus bacterian care paraziteaz E.coli (bacteriofag).

Poate exista stare i tegrat ro ozo ul a teria cadrul ciclului lizogen i
independent n citoplasma bacteriei n cadrul ciclului litic care se ncheie cu liza
a teriei i apariia plajelor de liz ulturi
Ge o ul fagi este al tuit di tr-o ole ul de ADN du lu ate ar li iar de 47 kb
u ex epia apetelor are su t o o ate are
u leotide i o plementare
(capete cos . A estea ir ularizeaz ole ula dup ptru dere a terie fr
apul i oada fagului.
Co i e proporie are /
aterial ge eti eese ial zona stuffer- gene
pentru recombinare are poate fi eli i at di ge o i lo uit u ge a pasager.
[Co i e ai ulte ge e ge e ptr si teza apului, ozii, si teza u ei e do u leaze,
ge e pe tru re o i are, ge a l odifi u represor ptr i hi area i trrii
bacteriei n ciclu litic.etc]
Zona stuffer poate fi lo uit u o ge pasager are tre uie s ai 15-20kb
deoare e fagul u poate prelua o a titate ai are sau ai i de ADN, o diie
e esar pe tru a pea apul fagi . A etia su t vectorii de nlocuire (fig__.)
are per it doar tra s ripia ge elor u i expresia lor. Au fost reai pe tru
construirea li rriilor de ge e- ole ii de lo e are o i frag e tele u ui
ge o . Di a east ategorie fa parte ve torii Charo , Ve torii EMBL (au
ex izate di ge o ge ele i pli are re o i are , eea e sea u se
pot dezvolta n ciclu lizogen.

Ve tori de lo uire/tra sfe ie

E.coli i i lul liti

ele ia lo elor re o
plajelor de liz

i ate se fa e la ivelul

Vectori de i serie
derivai di fagul
Tot din genomul fagului a fost o struit o alt ategorie de
ve tori pe tru lo area i expresia u or ge e de di e siu i
mici (6kb de u ii vectori de inserie. Di a east ategorie
fa parte fagii gt.
Fagul gt derivat din genomul bacteriofagului sl ati , este
un alt tip de fag care poate deter i a tra sdu ia
ge eralizat (gt-generalized transduction), iar fagul gt WES
are a eeai origi e u a fagului gt, s ge o ul su au
fost i troduse utaiile amber (codonul stop UAG),
mpiedicndu-i astfel s supravieuias afara o diiilor de
laborator.
o se i , a eti ve tori pot fi propagai o ve io al pri
ultur liti sau lizoge i u ai pe gazda a teria de
laborator, avnd situsuri numai pentru enzima EcoRI. Sele ia
lo elor re o i ate se fa e la ivelul plajelor de liz

3. Vectori hibrizi cosmide

Au fost reai pe tru rirea apa itii ve torului de a pri i u i sert de

44 kb.
Cos idele su t ve tori hi rizi tre fagi i plas ide e o i :
- se ve a cos de la fagul respo sa il u pa hetarea ADN apul
fagului i
origi ea repli rii de la plasmidele Col E1
un arker de sele ie la AmpR.
Colo iile re o i ate e o i ADN de la os ide su t la fel de i fe ioase
a i fagii dar, i teriorul elulelor a terie e os idele se repli a a i
plasmide, deci ele nu pot genera particule fagice noi iar ADN recombinat
se ide tifi la ivelul olo iilor a terie e pe edii u a pi ili i u a
plajelor de liz.
Moleculele concatemere for ate di os ide li iarizate se pot o i e
datorit situsurilor cos fagi e, si gurele se ve e de re u oatere
responsabile cu mpachetarea ADN n particule fagice mature iar
apsidarea lor se realizezaz in vitro.

Clonarea n cosmide

Vectorii de expresie
Suntocategoriefuncional devectoricareau
fostconstruiipentruaplicaiipracticen
biotehnologii.Spredeosebiredeceilalisunt
dotaicupromotori puternici (intensificatori) care
permitotranscripieintens iexpresiagenei
pasager.
Pentrucagenapasagers seexprimencelula
gazd eatrebuieplasat subcontrolulunui
promotordenatur procariot inpoziie
corect fa deelmenteledereglaj
Promotor-Operator-Loc de legare la ribozomgenastructural _terminator

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINAT

CAP.III

2. PASAGERUL
Gena pasager n clonarea molecular n
gazde bacterii este orice gen de interes
care se dorete s fie tranferat n
bacterii n scopul
- multiplicrii genei
- expresiei genei
-studierii funciilor genei prin metodele
mutagenezei

Obinerea genei pasager

Exist 3 metode pentru obinerea unei
gene pasager:
(1) prin reverstranscripie pornind de la
ARNm al genei
(2) prin izolarea din ADN genomic cu
enzime de restricie
(3) prin sinteza chimic

O i erea ge ei de i teres pri tr-o rea ie

e zi ati de revers tra s ripie RTPCR/Reverse transcription PCR)
Reverstranscripia este procesul prin care o enzim copiaz
informaia genetic din ARNm ntr-o caten complementar de
ADNc (ADN complementar)
Enzimele se numesc reverstranscriptaze i au fost descoperite
la virusurile cu genom ARN (retrovirsusuri- virusuri oncogene)
a cror informaie genetic este transcris n ADN dup ce
acestea infecteaz celula.
Pentru sinteza genei pasager se apeleaz la tehnica RT-PCR
(Revers-Transcription PCR) n care se pornete de la o matri
de ARNm extras din celulele unde gena se exprim
Urmeaz reacia de reverstranscripie pentru convertirea ARN
n ADNc
ADNc devine matri pentru sinteza celei de a doua catene cu
ajutorul unei ADN polimeraze (taq polimeraza)

RT PCR

2. Izolarea genei pasager cu ajutorul

e zi elor de restri ie
izolarea ADN de i teres de la o a u it spe ie asupra reia
se efe tueaz er etarea;
- purificarea ADN;
- clivarea ADN cu ajutorul uneia sau mai multor enzime de
restri ie pe tru fra io are seg e te ai i i;
- igrarea frag e telor gel de agaroz pe tru separarea lor
pe aza greutii ole ulare;
- recuperarea fragmentului de ADN de interes din gel pentru
utilizarea lui ca pasager n tehnologia ADN recombinat;
- pregtirea pasagerului vederea i trodu erii ve tor
(formarea de capete adezive complementare la vector ;I
pasager).

Etapele izolrii genei pasager

3. Si teza hi i a ge ei pasager
Ge a are ur eaz s fie lo at tr-un
ve tor poate fi si tetizat artifi ial por i d de
la structura ei n nucleotide.
Deoarece sintetizatoarele de gene produc
se ve e oligo u leotidi e de ir a 8-12
nucleotide, asamblarea acestora se face
enzimatic cu ajutorul ADN ligazei.

Etapele sintezei chimice a genei prin

metoda fosfotriesterilor:
- sinteza trimerilor u stru tura azelor azotate presta ilit;
- cuplarea trimerilor tre ei pe tru o i erea de seg e te
oligo u lotidi e u se ve dorit;
legarea modulelor oligonucleotidice cu ADN ligaza.
Etape: Sinteza trimerilor ncepe prin cuplarea primei nucelotide cu cea de-a
doua preze a u ui age t de o de sare (un derivat de triazol)
rezultnd un dimer total blocat.
Dimerul este ulterior tratat pri detritilare pe tru eli erarea gruprii 5 OH
vederea uplrii u ea de-a treia u leotid.
Rezult astfel primul trimer sau modulul I n cadrul genei. n continuare
doi tri eri se leag tre ei i for eaz u hexa er i pro esul de legare a
odulelor de tri eri o ti u.
Dup ter i area si tezei odulelor a estea su t u ite tre ele pri
legturi fosfodiesteri e u ajutorul e zi ei ADN ligaza.

Gazdele (3)
Pentru a putea fi utilizate ca i gazde n tehnologia ADN
recombinat anumite specii bacteriene au fost modificate
genetic in vitro pentru a rspunde cerinelor de evitare a
biohazardului.
n acest scop au fost acceptate ca s fie utilizate ca i
gazde
(1) tulpina K12 a bacteriei E.coli care nu poate coloniza
intestinul animalelor cu snge cald (LPZ-)
(2) tulpinii EcoliK12 i s-au indus anumite mutaii care i
permit supravieuirea doar n condiii de laborator (gazde
EK1, EK2). Alte bacterii acceptate a fi gazde in
tehnologia ADN recombinat sunt Bacilus subtillis

 Gazdele EK1- gazdele E. coli A prezi t utaii de tipul:

recA pri are a teria prezi t o se si ilitate ridi at la
lu i a solar i la lu i a UV astfel t supravieuirea
afara la oratorului este di i uat;

- thyA- este o utaie pri are a teria e esit

ediul de ultur ti i sau ti idi e esare biosintezelor
proprii;

- amber utaii e deter i supri area si tezei u ui

a u it produs pri i trodu erea pre atur a u ui odo
STOP;

- -gal-pe tru s ree i gul olo iilor tra sfor ate dup
uloare al /al astru e a ept ve toriii di seria pUC de
exe plu, tulpi a DH5 .

Etapele tehnologiei ADN recombinat

1. Obinerea vectorului
2. Izolarea pasagerului
3. Integrarea pasagerului n vector i formarea
ADN recombinat
4. Introducerea ADN recombinat n celula
gazd
5. Selecia celulelor care poart ADN
recombinat
6. Clonarea propriu-zis a genei
7. Detecia genei clonate sau a produsului de sintez

3. Integrarea pasagerului n vector

i formarea ADN recombinat

Pentru integrarea genei pasager n vector trebuie

respe tate o diiile:
- ri ea ge ei pasager s fie ade vat ve torului
(10 kb ptr plasmide, 23 kb ptr fagi, 45 kb ptr cosmide,
300 kb ptr vectorii BAC)
- s se produ apete adezive o ple e tare la
ve tor i pasager a a estea s poat fi u ite sta il u
enzima ADN ligaza.
ge a pasager s fie plasat ore t ve tor fa de
elementele de reglaj a.. a esta s per it i iierea
tra s ripiei i (eventual) a tra lsiei pentru clonare
n scop de expresie).

Producerea capetelor adezive la

vehi ul i pasager
Prin a io area cu a eeai e zi de restri ie sau cu
enzime diferite dar care produc capete adezive i
complementare
a Capete adezive o ple e tare la vehi ul i la pasager

Capetele oa te i/sau adezive la vehi ul i

pasager sunt transformate n capete adezive
complementare:
1 u ajutorul li kerilor i adaptorilor
2) cu enzima terminal transferaza

2) cu enzima terminal transferaza

Terminal transferazele adaug ozi
ho opoli ere la apetele u ei se ve e ADN.

Plasarea corect a genei n vector

Exprimarea genei pasager e esit pe l g
i trodu erea gazd, ca i seria ve tor s fie
f ut tr-un cadru de citire corect pentru ca
tra s ripia i tra slaia s deter i e u produs
proteic stabil.
Adica fa de ele e tele ge eti e ale u ui opero
(P+SD....T).
Ge a stru tural tre uie s fie plasat su o trolul
tra s ripio al al u ui pro otor procariot unde ARN
poli eraza i epe fu ia i un situs de legare la
ribozom pe tru o tradu ere efi ie t.

4. Introducerea ADN recombinat n

celula gazd
Prin tra sfor are ge eti - proces prin care
bacteriile pri es i a ept ole ule exoge e
de ADN
teh ologia ADN re o i at se tra sfer o
ole ul de ADN re o i at provenit de la
dou spe ii elule a terie e a estea
suferind astfel un proces de transformare
ge eti .

 Fenomenul de transformare in vitro a bacteriilor este

precedat de i du erea artifi ial a strii de o pete .
A east stare depi de de u ii fa tori fiziologi i u su t:
faza i lului de diviziu e elular, spe ia a teria , etapa
fiziologi de retere, ediul de ultur et .
Metodele de i du ere a strii de o pete pe tru
transferul ADN recombinat pot fi: chimice, fizice, mecanice

Prin tratarea celulelor bacteriene cu ioni de calciu

(CaCl2 e ra a elular devi e per ea il pe tru s urt
ti p pe tru ole ule stri e.
De asemenea, o ul ter i (42oC) de s urt durat
deter i reterea su sta ial a u rului de elule
aflate stare de o pete , eea e fa iliteaz
ptru derea ADN re o i at elulele re eptoare.
Electroporarea este o etod e a i de tra sfer a
genelor

 Di ategoria etodelor e a i e fa parte ele troporarea i

metodele balistice sau biolistice
A estea su t la a terii, pla te i la spe ii a va ole.
Electroporarea este u fe o e de i du ere a per ea ilizrii
e ra ei elulare su a iu ea u ui p ele tri de s urt
durat d e ra a elular este str tut de u p
ele tri are du e pe tru s urt durat la reterea
di e siu ii porilor pri are ptru d ole ulele de ADN
exogen.
Pe tru a u leza e ra a elular difere a de pote ial
apli at se deter i fu ie de tipul elulelor, ri ea i
o for aia frag e telor de ADN e ur eaz s fie
transferate.
De exe plu, valoarea axi a eptat pe tru a terii este
de cca. 25V/cm.

Electroporarea
Suspe sia elular este plasat preu u
molecula de ADN recombinat n cuvete de
uar are su t i troduse ele troporator
dup e au fost setai para etrii aparatului.
Ur eaz i du erea o urilor de s urt durat
p la ptru derea ADN elule. Dup
electroporare suspensiile celulare sunt trecute
pe edii de ultur u de ADN re o i at se
va ultipli a preu u gazda.

Echipamente/schema de realizare

 Introducerea ADN recombinat n celula gazd cnd

vectorul este un bacteriofag
Se realizeaz prin infectarea culturilor bacteriene cu fagi
care se ataeaz la suprafaa celular prin intermediul
cozii prin care ADN ul din capul fagic este injectat n
celula gazd
n cazul vectorilor hibrizi tip cosmide introducerea ADN
recombinat n celula gazd se face asemntor cu a
fagilor, deoarece cosmidele sunt molecule hibride care
conin elementele cos de la fagi responsabile cu
mpachetare genomului in capul fagic ns ncapsidarea
lor se face in vitro iar dup patrunderea in celula
cosmidele se replic asemntor plasmidelor deoarece
conin originea replicrii de la plsmide.

5. Selecia celulelor care poart

ADN recombinat
I. Sele ia lo elor re o i ate d ve torul este u plasmid bacterian,
cosmide, vectori de expresie
Sele ia lo elor se fa e pe aza arkerilor de sele ie prevzui la ivelul
ve torului i u eori i a ge ei pasager, pe u
ediu sele tiv.
azul are ve torul poart u
arker de reziste la u ul sau ai
multe antibiotice sele ia tra sfor ailor se fa e pe edii u a ti ioti e
pe are res i se dezvolt doar olo iile tra sfor ate.
n cazul n care markerul utilizat este ge a gala tozidazei LacZ) din
operonul Lac de la E. coli sele ia elulelor tra sfor ate se fa e prin teste
histochimice preze a i di atorului X-gal.
n cazul n care markerul este o gen reporter fuzionat la gena
pasager (gene ce produc fluorescen (GFP, YFP)) selecia se face
prin detecia rapid a produsului (florescena) emis de bacterie n
lumina UV

 Selecia clonelor recombinate cnd

vectorul este un fag se va face la nivelul
plajelor de liz deoarece att vectorii de
nlocuire ct i cei de inserie (derivai din
fagul ) se replic prin intermediul ciclului
litic la nivelul gazdelor bacteriene.

6. Clonarea propriu-zis a genei

Prin transferul coloniilor recombinate pe medii
lichide pentru multiplicarea celulelor care
o i ADN re o i at.
Odat u ultipli area a teriilor se va
ultipli a i ADN-ul recombinat

7. Detecia genei clonate sau a produsului

de sintez
Identificare genei: pri rea ia PCR amplificarea genei cu
pri eri spe ifi i dup extra ia ADN re o i at di elul
Identificarea genei prin tehnici de hibridare (metoda
Southern blotting) ;
A aliza se ve ei u leotidelor pasagerului ex izat di vehi ul
(se ve iere ;
- ex izia ge ei pasager di vehi ul pe ale i vers lo rii,
igrarea gel de agaroz i dete ia ei pe aza greutii
moleculare.
- dete ia rapid a produsului de si tez a genei pasager cu
ajutorul moleculelor reporter (GFP, YFP, gena LacZ din
operonul lac de la E. coli, etc

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINAT

transgeneza la eucariotele vegetale
obinerea plantelor transgenice
CAP.III

Definiie
Transferul de gene n celule gazd eucariote
vegetale duce la obinerea de Organisme
Modificate Genetic (OMG) sau plante
transgenice.
Transferul de gene se poate realiza n
scopul adugrii unei gene, nlocuirii unei
gene sau inactivrii unei gene din genom.
Este un proces integrativ.

Obiectivul i scopul transgenezei la

plante
Obiectiv: regenerarea plantelor transgenice capabile s
exprime gena transferat.
Transgeneza la plante se realizezaz n scopul
- creterii rezistenei plantei la boli (virale,
bacteriene, fungice) i duntori
- creterii toleranei la un anumit erbicid
- creterii rezistenei la insecte i ameliorarea
rezistenei la stresul osmotic
- mbuntirii calitii poduciilor
- producerii de biomolecule active n plante
(vaccinuri)

Gena pasager
este o gen strin genomului celulei
gazd a crei izolare se realizeaz similar
cu cea pentru tranfer n celule bacteriene
(izolare dintr-un alt genom cu enzime de
restricie, producerea genei prin
reverstranscripie, sau sinteza chimic a
genei pasager)

Metode de transfer a genei

pasager
Transferul genei pasager (o gen de interes
economic sau farmaceutic) se poate realiza prin
metode directe i indirecte
Metodele directe presupun transferul genei
direct n celula vegetal care se va integra n
genomul celulei gazd prin recombinare
omoloag.
Metodele indirecte presupun utilizarea unor vectori
care vor transporta gena pasager n celulele
gazd unde se vor multiplica independent sau
se vor integra n genomul celulei gazd

Metode directe de transfer

Celula vegetal este prevzut cu perete celular dur iar
pentru transferul genei strine este necesar obinerea de
protoplaste sau transferul se face direct n explante
vegetale (foliare, radiculare, etc)
Manipularea protoplastelor este o metod mai facil,
n care introducerea ADN strin se realizezaz prin
endocitoz. Gena pasager este de regul introdus n
vector care conine i markeri de selecie pentru izolarea
celulelor recombinate.
Obinerea protoplastelor se face prin - digestia peretelui
celular (cu enzime proteolitice: pectinaza i chitinaza
Uneori facilitatea ptrunderii genei pasager poate fi
nlesnit prin tehnici mai blnde cum sunt: microinjecia,
tratarea celulelor vegetale cu cu polietilenglicol (PEG)
dar i prin electroporare.

Transferul direct n esuturi vegetale

(explante foliare, radiculare, smn etc)
este posibil doar cu ajutorul metodelor
mecanice.
Din aceast categorie fac parte:
electroporarea i porarea laser, micro i
macroinjecia i metodele mecanice
(biolistice)

 Electroporarea este similar cu tehnica utilizat la transformare

bacteriilor iar porarea laser are la baz inducerea permeabilizrii
membranei cu ajutorul unui laser spre deosebire de electroporare
unde permeabilizarea se realizez cu ajutorul unei cmp electric.
Microinjecia i macroinjecia
Microinjecia presupune injectarea ADN recombinat cu ajutorul unei
seringi fine n protoplastele fixate n alginat pe o lam microscopic.
Procedeul are loc la microscop cu ajutorul unui micromaipulator.
Metoda este utilizat mai ales pentru manipularea celulelor
animalelor. La plante trebuie avut grij ca vacuolele s nu fie lezate
deoarece acestea conin enzime litice care pot degrada ADN
recombinat.
Macroinjecia - presupune pulverizarea soluiei n care se gsete
ADN-ul recombinat direct pe inflorescen imediat dup polenizare.
Rezultate cu aceast metod au fost obinute la secar (1987). Se
presupune c se transform direct spermatiile n timpul creterii
tubului polinic n stilul plantelor. Dei metoda pare promitoare
deoarece nu se mai pune problema regenerrii plantelor transgenice,
nu au mai fost raportate rezultate i la alte specii.

 Metoda biolistic:este metoda cel mai mult

utilizat n prezent n care transferul genelor se
face prin mpucare, cu ajutorul unor pistolete
sau a tunului de particule.
ADN-ul recombinat este ncrcat la suprafaa
unor particule de aur sau tunsgen i proiectat n
esut sub aciunea unei fore explozive (praful de
puc i mai nou heliul sub presiune).
Pentru ataarea ADN recombiant la suprafaa
microproiectilelor se utilizeaz spermidina iar
pentru a mpiedica aglomerarea microproiectilelor
acestea sunt nglobate n clorur de calciu i sunt
vortexate puternic nainte.
La transformare se utilizeaz explante uor
plasmolizate prin tratare cu
sorbitol sau
manitol nainte cu 4 ore de transformare i 6 ore
dup transformare. n acest fel se evit ca
celulele s plesneasc n timpul impactului cu
microproiectilele.
Rezultate foarte bune s-au obinut la majoritatea
plantelor inclusiv la porumb i la plantele
furajere, considerate refractare la transformare i
regenerare.

 Tra sfor area ge eti pri

etode i dire te
Tra sfor area ge eti pri
etode i dire te
presupu e utilizarea u or age i aturali de tra sfer
aa u su t a teriile Agrobacterium tumefaciens
preze t
od atural sol are produ e
a erul a teria la di otiledo ate i
Agrobacterium rhizoge es e produ e rd i i
filiforme -hairy roots).
Producerea cancerului bacterian este un proces
natural, indus de plasmidele Ti (tumor inducing)
(sau Ri) ale bacteriei A. tumefaciens are ptru d
pla t pri leziu i.

Plasmidele native Ti de la A.
tumefaciens

Dimenisiune mare 250 kb att a plasmidelor Ti t i Ri de la A. rhizogenes

Originea replicrii
Genele de virulen: regiunea vir for at di 8 -10 operoni operoni care
o i gene pentru asimilarea opinelor su sta e a aloage ale
aminoacizilor ) cum ar fi octopina, nopalina, agrocinopina ce pot fi utilizate
doar de A.tu efa ie s a surs de C i N. i ge e pe tru si teza de
endonucleaze care vor exciza regiunea ADN-T di a terie i o vor tra sfera
genomul plantei.
Regiunea de transfer ADN-T este respo sa il de i du erea tu orii
Co i e la apete se ve e repetitive dire te (25 nt) notate L -Left order i
R- Right border. tre ele se gses gene responsabile cu sinteza
regulatorilor de retere (sinteza auxine, citochinine) care induc efectul
tu orige i ge e respo sa ile de si teza opi elor.
Pe tru i du ia tu oral a teria are u he otropis pozitiv fii d
se si il la fe olii produi de esuturile vegetale r ite u ar fi
acetosiringonul .

 Mecanismul inducerii tumorale

ur a a tivrii ge elor vir de tre
a etosiri go doar se ve a ADN T este
tra sferat u leul elulelor gazd are
sufer u pro es de tra sfor are ge eti e
se a ifest pri supraprodu ia de hor o i
i for area tu orilor.
pro esul de tra sfor are ge eti se
e ploateaz a est fe o e u e iu ea n
interiorul regiunii ADN-T se introduc genele
utile n locul genelor responsabile cu inducerea
tu orilor i ge e arker.

Producerea plasmidelor Ti
recombinate- vectorii binari

Pe tru tra sfor are se utilizeaz vectori binari de tip avet are ge ele vir sunt
situate pe o plas id A.tumefaciens) iar constructul genic cu gena pasager purtat de
gena ADN-T pe alt plas id E.coli).
Procesul presupune o hi ridare tripare tal: tre E. oli are o i e ge a pasager
interiorul regiunii ADN-T, o bacterie A.tumefaciens (gazda final, are o i e pe o
plas id dezar at ge ele vir i o a terie helper E. oli are i iiaz o jugarea
tre pri ele dou.
Etape:
A) Producerea plas idei re o i ate are poart ge a pasager: gena pasager se
i trodu e i teriorul se ve ei ADN-T de la are se pstreaz doar apetele att L i R
order i se adaug arkerii de sele ie. A easta este i trodus tr-un plasmid al
bacteriei E.coli i lo at n bacteria E.coli (I).
O alt plas id este e hipat u regiunea vir s este dezar at. A easta este
tra sferat A. tumefaciens. Astfel ele dou regiu i vir i ADN-T sunt pe plasmide
diferite i gazde diferite. Tra sferul plas idului re o i at di E.coli gazda fi al
Agrobacterium tumefaciens se realizeaz adrul u ui pro es de o jugare
a teria .
Pe tru i iierea pro esului de o jugare se utilizeaz al treilea pri te o bacterie
E.coli helper are poart se ve a operon tra respo sa il u o jugarea di tre E. oli i
A.tumefaciens.
Introducerea plasmidului recombinat n A.tumefaciens poate avea loc i dire t pri
electroporare.

 Ba teria re o i at A.tumefaciens este apoi

utilizat pe tru tra sfor area pla telor
superioare astfel:
- pe tru tra sfor are se utilizeaz de o i ei
e pla te repreze tate de poriu i de fru ze,
a hipo otil, se i e la pla te u se i e
foarte mici: Arabidopsis, Nicotiana tabacum,
Lactuca sativa i ai rar protoplaste.

Proto olul de tra sfor are se i e

Se i ele su t ger i ate o diii sterile
Fru zele otiledo are se detaeaz preu u peiolul. Se taie ape ul i
se r es u isturiul partea i ferioar
Se face i fe ia pri i o ularea e pla tului ntr-o suspensie de
A.tumefaciens purttoare a ve torului i ar
Cultivarea a teriei preu u e pla tul pe u
ediu aloge pe tru
formarea calusului) , 2-3 zile, ti p are se realizeaz tra sfor area
Transferul e pla telor pe edii u ka a i i da arkerul este ge a
kanR i ar e i ili pe tru o orrea a teriilor purttoare a ge ei
pasager care au realizat transferul plasmidelor.
Pasarea e pla tului pe u
ediu de sele ie auloge (pentru inducerea
lstririi , operaie e se poate repeta la dou spt i p la for area
lstarilor.
Pasarea pe un ediu de ele ie pe tru rd i are

 Sele ia elulelor re o i ate u ali arkeri pe tru

tra ge eza i dire t:
- ge ele pe tru fluores e GFP, )FP, RFP n care
preze a ADN re o i at se fa e preze a u ui
substrat fluorogenic H (MuGluc- Metil Umbeliferon
Glucuronidaza d esutul devi e fluores e t.
Evide ierea preze ei tra sge ei i tegrate
genom se poate realiza prin metode moleculare:
- azate pe rea ia PCR n care primerii sunt
stru turai di ve i tatea ge ei pasager sau hiar a
unuia dintre markeri
-teh i i de hi ridare i tra sfer pe e ra e
(Southern blotting)

 Tra sfor area ge eti pri

etode i dire te, ediat de
Agrobacterium este i efi ie t azul o o otiledo atelor
deoarece:
Acestea nu sunt gazde naturale pentru Agrobacterium
Lipsesc inductorii de tip acetosiringon
Rspu sul la r irea esutului este diferit- u se for az alus
i se lig ifi , elulele fii d i apte ptr tra sfor are.
Sunt foarte active n eliminarea ADN-ului stri pri pro ese
reparatorii
Pro esul a dat teva rezultate la o o otiledo ate o diii
spe iale:
ediul de ultur a fost i lus age t i du tor, s-au
utilizat tulpini hipervirulente de Agrobacterium iar explantele
au fost pre ultivate pe u
ediu olage ai tea tra sfor rii
Astfel de rezultate s-au o i ut la Asparagus officinalis,
Narcissus, Chlorophytum, Dioscorea bulbifera
Totui etodele de tra sfor are efi ie t la
o o otiledo ate r
etodele dire te

Realizri ale transgenezei la

plante
I- Ameliorarea rezistenei la virusuri

 Majoritatea virusurilor vegetale sunt virusuri ARN

s e ist i virusuri ADN
Metodele lasi e de o trol a i fe ilor virale la pla te
vizeaz:
eli i area i se telor sugtoare : afidele, care
rsp des i fe ia viral
O i erea de aterial sditor li er de virusuri prin
ultur de eriste e i ter oterapie
Prote ia ru iat pri i fe ie u virusuri ai
pui virule te
A eliorarea ge eti pri hi ridare se uat

Metodele IGV pe tru reterea

reziste ei la virusuri

1. Sunt transferate ge e pasager are odifi a ti orpi

a tivirali sau protei e u proprieti a tivirale
poteinele antivirale: ubiquitinul
- ge a e odifi protei a viral de la Phytolacca
americana pla t to i ptr o i a i ale la
Nicotiana benthamina (pl din fam tutunuluiorganism model)reziste total la virusuri
Gena ptr oligo-adenil-sintetaza de la oare la artofreziste a la virusul X al artofului are produ e
ozai ul rezultate si ilare u ge ele e odifi
interferonul)

2. Strategii ale transgenezei cu gene sau

se ve e de ge e de tip viral
A) transgeneaza genelor ptr sinteza capsidei
virale virsurile ARN de regul ptru d elul
preu u apsida, se de apsideaz i se
repli . Da ge o ul gazdei su t tra sferate
ge e e produ apsida viral elul vor fi
prezente mai multe capside, virusurile nu se mai
de apsideaz, u se repli i pla tele devi
reziste te la i fe ia viral .

 B. Transgeneza prin strategia antisens presupune

introducerea n celule de secvene scurte de ARN
antisens 3 -5 (miARN, siARN) complementare unei
molecule sens 5 -3 de ARNm.
Acestea pot fi complementare fie captului 3 al ARNm
(blocheaz replicarea ARN) fie captului 5 (blocheaz
translaia) i au ca efect inactivarea sau scoaterea din
funcie a ARNm- adic produc interferena ARN

C. Transgeneza prin strategia sens

Presupune introducerea n genomul gazdei de
secvene genice virale (ADN) care se transcriu n ARN
viral i care sunt complementare aptului 3 al ARN
viral, ce marcheaz nceputul tra s ripiei a..
enzima replicaza viral e esar repli rii virusului va
fi o su at iar plantele devin rezistente.

 D. Tra sge eza ge elor e odifi protei ele de

transport rsp direa virusului pla t este asigurat
de protei e de tra sport. tra sge ez se utilizeaz
ge e uta te are odifi protei e de tra sport e pot
lega virusul dar nu l pot transporta sau proteine ce nu
pot lega i tra sporta virusul. A estea i tr o petiie
u protei ele lo ale de tra sport a virusului i eti es
rsp direa lui pla t.
E. Tra sge eza ge elor e odifi ri ozi ul Ri ozi ul este o e zi ARN u rol ataliti
asamblarea aminoacizilor n timpul sintezei proteinelor
la ivelul ri ozo ilor. a elai ti p i tervi e i
degradarea moleculelor de ARN viral. Pri tra sge ez
se tra sfer ge ele respo sa ile de si teza ri ozi ului
ge o ul pla telor are devi reziste te la a iu ea
virusului degradndu-l.

II. A eliorarea reziste ei la a terii i

ciuperci
II. 1 Reziste a la a terii
Se azeaz pe tra sferul u or ge e are odifi
anumite proteine cum ar fi:
A. Gene preluate de la insecte ptr sinteza de anticorpi
produi ur a i fe iilor u diferii age ti
fitopatogeni
Exemple:
apidecine specifice albinelor
Cecropine, atacine i lisosi e de la Hyalophora
e ropi a olie u proprieti a ti a terie e

B. Tra sge eza ge elor e odifi

proteinele implicate n procesul de
patoge ez

Este vorba de proteine produse de plante n procesul

de ol vire, a o rea ie de rspu s la i fe ie
Ptr reziste a la a terii i iuper i su t utilizate gene
implicate n sinteza fitoalexinelor
Fitoalexinele sunt su sta e a aloage a ti orpilor din
elula a i al dar de atur eprotei i fr
specificitate.
Exemple: terpenele - specifice solanaceelor
- isoflavonoidele leguminoaselor (pisantin- azre,
kevinton fasole etc)
Reverastrol via de vie, pi

 Ge e e odifi protei e u proprieti

a ti a terie e i a tifu gi e
Thioninele (drosomicinul) antifungic
Proteina VVTL-1 de la soiul de vi Chardo a
izolat i lo at la alte soiuri ptr reziste a la
fungul Elsione amplelina (produce antracnoza
sau r u ele la via de vie
Lactoferina de la ovi e la pr ptr reziste a la
i fe ia u a teria Erwinia amylovora
(produce boala focul bacterian)

 Ptr reziste a la fu gi- ge e e odifi

hiti aza i pe ti aza are o oar iuper a
prin degradarea peretelui celular) au fost
preluate de la bacteria Serratia marcescens
ptr reziste a la ata ul Ascomycetelor i
Basidiomycetelor
Gena glu odifi glu a aza preluat de la
fasole i tra sferat la pla te ptr reziste la
atacul Oomycetelor (Phytophtora- mana
artofului, roiilor, Perenospora- mana cepei)

C. Tra sge eza ge elor e odifi enzime

capabile s deto ifi e to i ele a terie e
Pseudomonas syringae produ e o to i f
puter i tabtoxina) s o i e i ge a ptr
si teza e zi ei apa ile s o deto ifieze ge a
ttR) .
Situaie si ilar i la iuper a parazit la
porumb Helmintosporium carbonum care
produ e o to i dar i e zi a ptr deto ifiere
(hmR)

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINAT

transgeneza la eucariotele vegetale
Realizri ale transgenezei la
plante
III Ameliorarea rezistenei la
atacul duntorilor

Ameliorarea rezistenei la atacul

duntorilor
Se poate realiza prin transgeneza unor gene preluate
i lo ate de la a terii Bacillus thuringiensis care
produ e faza de presporulare o to i are se
tra sfor aparatul digestiv al i se telor tr-o
to i foarte puter i . o aterea iologi a
culturilor efectul este uneori slab deoarece toxina se
i a ti eaz la radiaia UV.
n IGV au fost preluate genele (cry) de la bacterie
respo sa ile de si teza preto i ei i tra sferate la
plante.
To i a produs de ge ele r IA i r III sunt active
mpotriva lepidopterelor olii i fluturi i
coleopterelor (gndaci) iar cry IV mpotriva dipterelor
ute, ari

Realizri ale transgenezei prin

transferul genelor cry
Cea mai cunoscut realizare este porumbul transgenic rezistent la
atacul sfredelitorului porumbului (Ostrinia nubilalis) soiul
MONSATO 810 (poart gena cryIA) i porumbul Bt 176 rezistent la
erbicidul BASTA.
- Tutun transgenic rezistent la atacul lepidopterului Manduca sexta care
produce defolierea.
- Cartof transgenic rezistent la atacul gndacului de ColoradoLeptinotarsa decemliniata (coleopter)
- Cartof transgenic rezistent la atacul duntorului Phtorimea
operculella (molia tuberculilor de cartof)
- Varz transgenic rezistent la atacul lepidopterului - Plutella xylostera
- Bumbac transgenic rezistent la atacul viermelui capsulelor de bumbac
Heliothis virescens.

Alte realizri
De la ghiocel (Galantus nivalis) a fost transferat gena
gna ce codific lectinele glicoproteine cu rol nociv
asupra insectelor la orez i la porumb (la noi n ar la
salat) dar care nu sunt duntoare ptr om i animale
Genele ce codific proteinele PIP (Protease inhibiting
polipeptides) i AIP (amilase Inhibiting proteins) de la
Vigna unguiculata care inhib proteazele i amilazele
insectelor duntoare care nu mai pot asimila
proteine/amidon i mor prin inaniie. Acestea sunt ns
toxice ptr om i animale iar ptr obinerea de plante
furajere netoxice gena a fost transferat sub controlul
promotorului tob care se exprim numai n rdcin
(lucern transgenic rezistent la nematoul Globera
pallida)

IV Ameliorarea rezistenei la
erbicide neselective
Erbicidele neselective (totale) distrug att
buruienile ct i plantele de cultur.
Spre deosebire de cele selective au
avantajul c sunt biodegradabile.
Prin transferul unor gene de la unele bacterii
(care asigur rezistena la aceste erbicide) la
plante au fost obinute plante rezistente la
erbicide selective dar biodegradabile

Mecanismul de aciune:
a) Supraproducia enzimei int afectat
de erbicid
b) Supraproducia enzimei ce degradeaz
produii secundari toxici
c) Detoxifierea organismului plantei

Realizri.
Rezistena la Glyphosate (erbicidul
Roundup) prin transferul unei gene de la
bacteria Salmonella typhimurium
responsabil de supraproducia enzimei
int.
La soia s-au obinut plante transgenice
rezistente la erbicidul Roundup Ready, prin
supraproducia enzimei, gena find preluat
de la Agrobacterium tumefaciens.

 Rezistena la erbicidul Paraquat - transferul

genelor ptr sinteza enzimelor: super oxid
dismutaza (SOD), catalaza, sau peroxidaza de
la Nicotiana plumbaginifolia, enzime capabile s
detoxifice oxidenul activ reducnd stresul
oxidativ al plantei.
Rezistena la erbicidul BASTA prin transferul
unei gene de la Streptomyces hygroscopicus ce
produce o enzim (PAT- phosphinotricin acetil
transferaza) capabil s detoxifice planta
Exemplu / porumbul Bt 176 rezistent la erbicidul
BASTA.

V. Ameliorarea calitii
Ameliorarea compoziiei n compui
vizeaz (1) mbogirea compoziiei n
aminoacizi eseniali (lizin, triptofan etc,) i
aminoacizi cu sulf (cistein, cistamin) n care
unele plante utilizate ca furaje sunt srace
Realizri exemple: transferul unei gene de la
nuca brazilian (Bertholletia excelsa) care
produce o protein foarte bogat n AA cu S la
plante de cultur

 la rapi- proteina conine 2 subuniti:

- napina (20%) bogat n AA cu S
- cruciferin (80%) srac n AA cu S
Prin strategia antisens s-a blocat producerea
cruciferinei
Una din cele mai mari realizri:
Orezul galben (golden rice) bogat n vitamina
A (1999) i apoi a orezului high iron rice
bogat n fier asimilabil

2) ntrzierea senescenei florii i manipularea

coacerii fructelor-strategia antisens
Prin blocarea enzimelor responsabile de
producerea etilenei (strategia antisens) s-au
produs tomatele Flavr Stavr rezistente
nmuiere i la transport
Tot pe aceast cale s-a blocat la tomate
enzima responsabil de degradarea pectinei
(poligalacturonidaza) astfel c fructele la
coacere rmn ferme (nu putrezesc)
3) Reducerea coninutului de lignin tot prin
strategia antisens

VI Producerea de noi compui

Strategii: exprimarea tranzitorie a unor gene incluse
n vectori la nivelul plantei pentru
producerea de biomolecule active
Exprimarea stabil a unor gene incluse n
genomul plantei care se vor exprima i n
descenden.
n ambele cazuri produsul genei se
extrage din plante

Realizri

Plante transgenice anti-HIV

Plante care produc proteine animale
Plante care produc vaccinuri
Prim strategie producerea trichosantinului cu proprieti
anti HIV prin clonarea genei preluat de la bacteria
Trichosantes kirilovi i introdus n vectorul VMT (Virusul
Mozaicului Tutunului) cu care s-au obinut plante de tutun
transgenice (Nicotiana benthamiana).
Strategia a 2-a a fost utilizat la obinerea albuminei serice
umane n plante de tutun i cartof transgenic iar la soia pentru
obinerea cazeinei bovine
Alte realizri:
- obinerea de vaccinuri orale n plante- prin transferul genelor
ce codific proteinele de nveli ale unor virusuri umane n
genomul plantelor. Astfel s-au realizat vaccinuri mpotriva
holerei, a hepatitei B, a enteritei toxice- utile ptr tratarea
populaiei srace de pe glob care este imunizat prin consumul
fructelor plantelor transgenice

 Alte strategii ptr obinerea de vaccinuri orale - deoarece anticorpii sunt structuri proteice care conin 4
lanuri (2 grele i 2 usoare) asamblarea lor are loc natural n
reticolul endoplasmatic al celulei animale dar i vegetale. Unii
cercettori propun ca strategii:
- dubla transformare a plantelor cu genele ce codific cele
dou lanuri urmnd apoi hibridarea plantelor ptr ca cele dou
secvene s ajung mpreun. Astfel s-au obinut plante de
tutun care produc anticorpi mpotriva bacteriei Streptococcus
mutans
Alte realizri - n seminele de la mazrea furajer s-a reuit
exprimarea genelor ptr producia de anticorpi BA11 - anti
tuplina enterotoxic a E.coli care este folosit n alimentaia
porcinelor pentru protecia tubului digestiv mpotriva infeciei
iar anticorpul nu a fost detectat n snge sau n organele
animalului

Produse fitofarmaceutice produse pe

calea transgenezei vegetale
Produsul

Clasa

I ducia

CaroRx

Anticorp

Carii dentare,Diaree Tutu , Poru

transgenic

Lipaza gastri

E zi terapeuti

Fi roza isti ,
Pa reatit

porumb transgenic

Antigenul virusului
hepatitei B

Vaccin

Hepatita B

Cartof, salat tra sge i

Lactoferina

alimentar

I fe ii
gastrintestinale

porumb transgenic

Capsida virusului
Norwalk ()

Vaccin

gastroenterite virale Cartof transgenic

produse de virusul
Norwalk

Glicoproteina de la
virusul rabiei

Vaccin

turbare

Cultura
i artof

Spanac transgenic

 Producerea de mase plastice

biodegradabile prin transformarea genetic
a plantelor de Arabidopsis thaliana cu
genele (PHB) (poli- hydroxy-butyrat])preluate
de la bacteria Alcaligenes eutrophus

VII A eliorarea reziste ei la stresul

abiotic
Stresul abiotic osmotic - cauzat de pierderea
apei datorit: se etei, gheului sau e esului
de sruri poate fi contracaarat prin mecanisme
adaptative naturale (transformarea frunzelor n
epi , odifi area perioadei de florire i alte
e a is e fiziologi e de eli i area srii sau
producerea de osmoprotectori.

 Metodele IGV ptr reducerea stresului osmotic:

tra sferul ge elor e odifi os oprote tori
i osmoregulatori prin transferul genelor de
tolera la sruri de la spe ii halofile la pla te
de ultur
Exemple: Genele ce intervin n metabolismul
prolinei produc enzimele: prolin carboxilat
si tetaza i redu taza. Pri lo area e zi ei
reductaza (strategia antisens) aminoacidul
proli a se a u uleaz elule produ d
efect osmoregulator.

 Glicin betaina os oprote tor este produs

de bacteria Artrobacter de la care a fost
preluat ge a odA e odifi oli oxidaza i
tra sferat la pla tele superioare
De la E.coli gena betA e odifi oli
dehidroge aza i tra sferat la pla tele de
tutun.
Ambele gene intervin in sinteza glicin betainei

 Ge ele e odifi protei ele LEA (Late

E rioge essis A u de t su t preze te se i e i
asigur supravieuirea o diile u ui ediu sra
ap.
S-au o i ut pla te de orez i orz reziste te la
srturare pri tra sferul a estor ge e
Gene pentru sinteza enzimelor de detoxifiere a
oxigenului activ- SOD (super oxid dismutaza) de la
Nicotiana plumbaginifolia tra sferat la lu er

Alte ge e tra sferate ptr reziste a la

stresul osmotic
Ge e i plicate ho eostazia proteic a siste ului
vacuolar Na/H i protei al i eriu asigur
reziste a pla telor la srturare. Au fost prelevate
ge e de la drojdii i tra sferate la Ara idopsis
thaliana
Gene implicate n sinteza membranelor celulare(gene implicate n sinteza unor enzime desaturaze)
are pot deter i a o poziia ridi at a
e ra elor elulare a izi grai esaturai i
prote ia elulelor la ghe- Astfel de gene au fost
prelevate de la cianobacteria Anacystis nidulans i
tra sferat la tutu .

Gene transferate implicate n

reziste a la etale grele
(bioremediere )
Arseniul, Cadmiul, Cuprul, plumbul zincul, mercurul sau
seleniul sunt metale grele pentru mediu .
Bioremedierea presupune utilizarea unor plante care pot
eta oliza a eti o pui
Specia Thlaspi coerulescens a u uleaz ad iu i zi
mod natural
IGV au fost tra sferate ge e ptr reterea apa itii de
bioacumulare
Ge e e per it o ai are a u ulare a arse iului i
mercurului au fost introduse n Arabidopsis
A elai pro es i la plop are are o asa vegetala ult ai
mare

VIII Ma ipularea sterilitii

as ule

Androsterilitatea reprezint incapacitatea plantelor de a produce

gamei masculi funcionali.
Poate fi exploatat ptr producerea de semine hibride F1, care
exprim efectul heterozis.
n practica agricol obinerea seminelor hibride F1 se
realizeaz:
A) castrarea plantelor de pe rndurile mam (la porumb, plant
unisexuat monoic)
B) utilizarea autoincompatibilitii incapacitatea plantelor de a
realiza autofecundarea dei gameii sunt funcionali (la sfecla
de zahr)
C) Utilizarea ginoiciei plantele produc numai flori femele, se
manifest la unele plante unisexuat monoice (castravetele)
D) utilizarea androsterilitii

D) utilizarea androsterilitii
Androsterilitatea poate fi:
Nuclear deter i at de ge e u leare re esive. Pla tele
fertile tre uie ar ate ge eti do i a t ptr a fi eli i ate di ir.
U astfel de arker exist la floarea soarelui are deter i
apariia ulorii roii a pla telor si teza de a to ia i li kat u
ge a de fertilitate . Astfel de pe r durile a se eli i toate
pla tele roii fertile.
Citoplas atic- deter i at de ge e ito o driale are se
tra s it do i a t, pe li ie ater . Pri pole izarea u or pla te
a a drosterile u pole de la pla te tat a drofertile F
ge eraia F1 rezult u ai pla te a drosterile S , suire
tra s is pri itoplas a ga etului fe el.Se utilizeaz la pla te
la are i tereseaz asa vegetativ i u produ ia de se i e
aa u este eapa.

 Nucleo- itoplas ati - este repreze tat att

de ge e itoplas ati e t i de ge e u leare
dominante restauratoare de fertilitate (Rf) n
timp ce genele nucleare recesive (rf) sunt
e i toare de sterilitate.
Ca ur are hi ridul o i ut di ru iarea
for ei a a drosterile S u for a tat
restauratoare (Rf), este fertil.

Ma ipularea sterilitii

as ule IGV

Dou strategii:
I. Se poate realiza pri tra sferul ge ei e odifi
enzima Barnase de la Bacillus ampholiquefaciens la
li ia ater apa il s distrug ARN-ul elular i s
o oare elula. Ge a se expri doar esutul
ge erator de pole i astfel se o i pla te a e
nu pot produce polen androsterile
For a tat este de ase e ea tra sfor at u o ge
Barstar are i hi e zi a Bar ase o i du-se
pla te tat fertile

 II. Se izoleaz ge a argE de la E.coli care se

expri u ai esutul ge erator de pole
i este apa il s deza etileze fosfotri i ul i
s-l lase activ. Prin pulverizarea plantelor cu
er i id pla tele a devi a drosterile i se
vor pole iza u pole de la for a tat
a drofertil.

CAP.IV
HIBRIDAREA ICIBRIDAREA
CELULAR

HIBRIDAREA CELULAR
HIBRIDAREA elular so ati sau parasexuat
o st fuziu ea a dou elule so ati e, diferite
geneti , ur a reia rezult u hi rid so ati e
u uleaz aterialul ge eti de la ele dou for e
parentale
Etape:
1. o i erea protoplastelor
2. fuziunea protoplastelor
3. izolarea celulelor hibride
4. regenerarea plantelor hibride
5. confirmarea naturii hibride

1. IZOLAREA PROTOPLASTELOR
Se realizeaz prin digestia peretelui celular cu celulaz i pectinaz
n condiii de plasmoliz uoar -cu manitol sau sorbitol
Cultivarea protoplastelor pe mediu MS (Murashige-Skoog), la care se
adaug diferii compui ca surse de carbon (glucoz, zaharoz,
maltoz), auxine, citochinine, etc., antibiotice etc.
2. FUZIUNEA PROTOPLASTELOR- se poate realiza natural sau indus
pe cale fizic sau chimic
n mod natural in timpul izolrii protoplastelor acestea pot s fuzioneze
spontan rezultnd homocarioni (celule hibride care nglobeaz
materialul genetic de la dou sau mai multe celule de acelai fel)
Pentru obinerea de heterocarioni se utilizeaz metode de inducere:
a) Inducerea fuziunii chimic
cu PEG (polietilenglicol)
- Concentraii ridicate de ioni de calciu la 37oC, 30-40 minute
b) inducerea fuziunii celulelor somatice fizic prin electrofuziune sub
aciunea unui curent continuu, pulsatoriu de mare intensitate (100kVm1). Aceasta este i cea mai eficient metod de obinere a
heterocarionilor

n urma fuziunii protoplastelor pot rezulta- Homocarioni poliploizi

- Heterocarioni
Heterocarionii pot segrega somatic eliminnd cromozomii unei specii
totalns p streaz ereditateacitoplasmatic delaambelespecii
supuse fuziunii rezultnd un cibrid celular.
ntrecromozomiiheterocarionilorpotavealocrecombin rigenetice
prin care sunt transferate gene de interes de la o specie la alta
n procesul de regenerare a plantelor hibride o parte din cromozomii
uneispeciisunteliminairezultnd hibriziasimetricicuimportan n
eliminarea unor gene nefavorabile

3. IZOLAREA CELULELOR HIBRIDE din amestec se poate

realiza:
a) Mecanic cu ajutorul unei micropipete la micromanipulator,
dac celulelesepotdifereniafenotipic:
- pebazadeficienelornpigmeniasimilatori(ex.celule verzi
sau albinotice- antociani)
- sau prin marcarea cu florocromi a formelor parentale
(rhodamina,fluoresceina)iidentificarecuajutorul
citometriei n flux continuu (flow cytometry).

b)pebazacomplementarit iimetabolicesau
genetice
Complementaritateametabolic - presupune

inactivareaunorenzimelafiecareform parental astfelnct

nmediudecultur sepotmultiplicanumaihibriziicareau
echipament enzimatic complet
Ex.Unadinformeleparentalepoart markeriihis+imetIarcealalt markeriihis- imet+astfelnctpeunmediulipsit
demetionin ihistidin supravieuiescnumaihibrizii(+/-)

ncazulcomplementarit iigenetice- se

utilizeaz markerigeneticicomplementariiunanumit
mediudeselecie.
Unastfeldeexempluestecumarkeriiderezisten la
antimetaboliii- 5MT(metiltriptofan)iAEC(amino-etilcisteina).Unadinformeleparentaleeste5MT(R)iAEC(S)iar
cealalt 5MT(S)iAEC(R)iarnmediulcuceidoi
antimetaboliisupravieuiescnumaicelulelehibride.

4. Regenerarea plantelor hibridenprocesulderegenerareopartedincromozomipotfieliminai

rezultnd hibrizi asimetrici
ncazulhibrizilorndep rtaiaceastaesteometod deeliminare
a unor gene nefavorabile

5. Confirmarea naturii hibride

Se poate realiza:
a) Citologic prin cariotipare sau bandarea cromozomilor
b)Analizamolecular - cu ajutorul unor markeri RAPD, AFLP sau
SSRdac formeleparentalesuntsuficientdendep rtate
genetic(hibridulpoart sumabenzilorformelorparentale)
sau cu tehnica PCR sau prin tehnici de hibridare.

Importanahibrid riicelulare
Esteimportant pentruobinereadehibrizi
ntrespeciindep rtatesauchiargenuri
ndep rtate,nenrudite,carenupotfi
obinuipecalesexuat .
Exemple- hibrizi ntre Nicotiana tabacum i
N. rustica. Acetia se pot nmuli doar
vegetativ, sunt sterili
Hibrizii asimetrici importani deoarece n
genomul lor se pot introduce gene de
rezisten de la specii slbatice

 Hibridul Lycopersicon esculentum i sp

sl ati e L. (Solanum) pimpinelifolium sau
ntre L. hirsutum prezi t reziste la
septorioz i hiar la ata ul u or i se te.
Hibridul L. hirsutum x L. parviflorum
reziste la fuzarioz.
CIRIDAREA CELULAR
Co st n unirea a dou celule somatice din care una
este e u leat rezultnd un cibrid (hibrid
citoplamsatic)
Cibridarea prezi t i porta pentru manipularea
unor gene citoplasmatice cu i porta n
ameliorarea plantelor reziste a la erbicide,
androsterilitatea)

Cap. V
HAPLOIDIA PRIN ANDROGENE) I
GINOGENE)

Hapolidia pri a droge ez i gi oge ez

o st rege erarea u ei pla te por i d de
la gametofitul mascul, respectiv femel.
Haploizii a droge eti i se o i pri ultur
de antere sau microspori pe un mediu artificial
Succesul depinde de genotip, starea
fiziologi , pretratarea uto ilor florali u
te peraturi s zute, ediul de ultur,
ala a hor o al et

 Mi rosporii utiliza i de regul su t u i u lea i

La unele specii (Lycopersicon esculentum)
stadiul optim este meioza I iar la Brassica
oleracea rezultate bune s-au o i ut u
gru iori aturi.
Haploidia prin ginogenez
- Co st rege erarea u or pla te haploide in
vitro din gametofitul femel.
- Haploizii se pot o i e di ultur de ovare sau
ovule nefecundate.

 Un procedeu aparte este metoda bulbosum

- Utilizat pri a dat 97 la orz ur a
hi ridrii se uate di tre Hordeum vulgare i H.
bulbosum , embrionul hibrid este salvat pe un
mediu artificial n diferite stadii de diviziune
itoti d e rio ul pierde ro ozo ii de
la H. bulbosum rezultnd o pla t haploid

I porta a teoreti i pra ti a

haploidiei

La ivelul halpoizilor pot fi evide iate dupli a iile

ge o ului sau origi ea poliploid a spe iilor. De
e e plu atura tetrapolid a lu er ei i artofului
a putut fi o fir at
eioz
Di pu t de vedere pra ti haploizii su t utiliza i
la (1) accelerarea procesului de ameliorarea a
pla telor pri o i erea de for e pare tale
ho ozigote dihaploide i e ploatarea efectului
heterozis n F1. (hibrizii de porumb)

 . a eliorarea a aliti a poliploizilor la cartof,

gru i la o i erea hi rizilor de spara ghel
% as uli la are se o su ai ales
lstarii as uli .
azul grului se prefer utilizarea de li ii
dihaploide o i ute di
aterial hi rid are
fi eaz pri re o i ri ge e valoroase
stare ho ozigot ge e de reziste la
septorioz, lur .
La cartof s-a o i ut u soi de artof reziste t
la 4 rase diferite de Phytophtora infestans
(mana cartofului).

 Schema producerii cartofului rezistent la 4

rase de a
I s he se produ li ii ater ale haploide
prin hibridare ntre Solanum tuberosum i S. phureja
t i utilizarea haploidiei a doge eti e in vitro
pe tru o i erea o oplizilor ur at de hi ridare
atural i o i erea de protoplaste
se utilizeaz li ii de artof tertraploid
, are
fie are o i e o ge de reziste la o ras de
Phytophtora infestans
1) De la acestea s-au o i ut pla te ater e
haploide (2n)

Haploizii su t supui i fe iei u te o ras de

Phytophtora infestans

3) De la haploizii 2n s-au o i ut o oploizi

androgenetici (n) de la care ulterior s-au o i ut
plante diploide homozigote (2n) rezistente la
te o ras de Phythoptora infestans.
pri hi ridarea se uat a te dou for e
diploide s-au o i ut hi rizi tetraploizi
reziste i la te dou rase de Ph tophora iar
prin fuziune de protoplaste s-a o i ut o for
reziste t la toate ele patru rase.
La sparanghel s-au o i ut hi rizi
% as uli
de la are se o su lstarii

 De la pla tele as ule a li iei tat XY se o i

haploizi androgenetici (cu cromozomi X sau cu
Y . La i divizii u ro ozo ul Y se du leaz
u rul de ro ozo i o i d i divizi
ho ozigo i super as uli YY .
Li ia ater XX se hi rideaz se uat u li ia
tat YY rezult d hi rizi as uli
% u
pote ial produ tiv ridi at heterozis

Cal VI Varia ilitatea so a lo al

Varia ilitatea so a lo al reprezi t
varia ilitatea evide iat pri pla tele
regenerate in vitro din celule somatice
Cauzele varia ilit ii so a lo ale:
A epige eti e datorate a iu ii ediului
asupra e pri rii ge elor
ge eti e: uta ia so ati , uta ia de
tipul poliploidiei sau a euplidiei, tra spozi ia
elementelor genetice mobile, crossing-overul

Fa torii de are depi de a ifestarea varia ilit ii

Genotipul
esutul are se produ e: Da la rege erarea
pla tei se tre e pri faza de esut edifere iat
alus fe o e ul varia ilit ii este a plifi at
Co pozi ia ediului de ultur: fenomenul
poate fi a plifi at de e esul de itoki i e i
CaCl2 poliploidia i EDTA restru turri
cromozomiale)

Izolarea varia iilor utile

In vitro nainte de regenerarea plantei

In vivo dup rege erare
Izolarea in vitro este ea ai efi ie t i se
realizeaz pe edii sele tive.
Exemple.

- pri adugarea srii e es

ediu % s-au o i ut pla te de orez
i i reziste te la e esul de sruri
- - pri adugarea hidro iproli ei plante de cartof reziste te la ghe
- - pri adugarea alu i iului plante de Nicotiana plumbaginifolia
reziste te la a eti io i
- - pri adugarea er i idului . D plante rezistente la erbicid

 Pri adugarea de a i oa izi ese iali- plante

ogate o i ut de a i oa izi
Pri adugarea de to i e spe ifi e diferi ilor
age ilor patoge i se o i plante rezistente la
fitopatogeni

MUTA IILE I MUTAGENEZA

Dintre aplica iile tehnologiei ADN recombinat face parte i

mutageneza in vitro.

Muta iile

Pentru a cunoate n profunzime structura i

func iile genelor este necesar s dispunem de
tehnici i mijloace de a modifica secven a
ADN i de a examina efectul modificrii
asupra func iei genei.
Prin tehnologia ADN recombinant se pot izola
genele sub form de clone moleculare,
acestea pot fi ulterior modificate in vitro i
napoiate n organism n vederea testrii
func iei lor (genetic invers).

Mutageneza in vitro

Metoda const n crearea in vitro a unor muta ii specifice ntr-un

segment de ADN, urmat de analiza efectelor acestor schimbri in
vivo, dup reintroducerea n gazd a genei mutante.
Etape:
ADN-ul plasmidial care con ine gena de interes este supus in vitro
unei proceduri de mutagenez chimic sau enzimatic care modific
ADN.
ADN-ul plasmidial care a suferit muta ia este introdus n E.coli prin
transformare i coloniile care con in moleculele plasmidiale sunt
selectate pe baza rezisten ei la antibiotice.
Plasmidele mutante pot fi izolate dintr-o singur colonie i testate
individual sau se poate ob ine o librrie de plasmide care sunt testate
din punct de vedere func ional (genetic screen)

Mutageneza in vitro poate fi de dou feluri:

A. - mutageneza ntmpltoare (necontrolat) ;
B. - mutageneza dirijat.

A. Metodele mutagenezei ntmpltoare pot

produce modificri n secven a nucleotidelor
(muta ii) n oricare parte a plasmidei.
Aceste metode se utilizeaz mai ales pentru
identificarea unei func ii.

A. Metodele mutagenezei
ntmpltoare

A.I. Modificarea secven elor din situsurile

enzimelor de restric ie ;
A.II. Inser ia unui linker oligonucleotidic, la
ntmplare ntr-o plasmid ;
A.III. Modificarea ADN-ului plasmidic in
vitro (realizarea de substitu ii

ntmpltoare) cu ajutorul substan elor

chimice sau prin ncorporarea greit a unor
nucleotide pe parcursul sintezei in vitro a
ADN.

A. 1. Mutageneza ntmpltoare realizat prin

modificarea secvenelor din situsurile endonucleazelor
de restricie.

ADN-ul plasmidial este clivat cu endonucleaz

Eco RI, care recunoate un situs cu secven a GAATTC
producnd fragmente cu capetele 5 adezive
Tratamentul cu nucleaza S1, care diger specific
ADN-ul monocatenar determin ndeprtarea celor
patru nucleotide de la capetele 5, rezultnd capete
boante
Fragmentul liniar de ADN este tratat cu ADN-ligaza
care leag capetele boante ale fragmentului
reconstituit. Molecula circular de ADN plasmidic
care rezult, con ine o deleie a patru perechi de
baze

In mod alternativ, adugarea de ADNpolimeraz i de deoxiribonucleotid

trifosfa i (dNTPs) la plasmida clivat de
endonucleaza de restric ie Eco RI extinde
capetele 3 prin sinteza ADN-ului.
Dup ligarea capetelor, molecula de ADN
plasmidic rezultat con ine o inser ie
(adiie) de patru perechi de baze
Aceste tipuri de manipulri dac sunt
realizate la o secven ce codific o
protein, vor schimba cadrul de citire
transla ional, avnd ca rezultat
producerea unei proteine alterate.

A.II. Inseria unui linker

oligonucleotidic la ntmplare ntr-o
plasmid

este o variant a tehnicii descrise mai sus i const n:

Adugarea unor oligonucleotide sintetice linker, care
adesea codific situsul unei enzime de restric ie.
Pozi ia linkerului inserat poate fi cartat cu uurin prin
clivarea plasmidei cu enzima de restric ie care taie linkerul
formndu-i acestuia capete adezive.
O metod asemntoare a fost folosit pentru a carta
regiunile func ionale ale unui element transpozabil
bacterian (o gen sritoare - jumping gene) prin
inser ia linkerului n mai multe pozi ii alternative peste tot
n element.

A.III. Inducerea substituiilor intmpltoare

de nucleotide cu ajutorul substanelor chimice
sau prin ncorporarea greit a unor
nucleotide

Se pot realiza prin :

A.III.1 ) dezaminarea citozinei ;

A.III.2) ncorporarea unor analogi ai
bazelor azotate ;
A.III.3) ncorporarea greit a
nucleotidelor.

A.III.1. Dezaminarea citozinei

Cele mai multe metode pentru plasarea
substitu iilor n pozi ii ntmpltoare utilizeaz
substan e chimice care modific sau
deterioreaz ADN-ul, cum sunt: bisulfitul de
sodiu (NaHSO3) care dezamineaz citozina
transformnd-o n uracil i unii reactivi
(hidrazina, acidul formic etc.) care degradeaz
sau ndeprteaz bazele azotate, n acest fel
prevenind mperecherea normal a bazelor
azotate prin legturi de tip Watson-Crik.

Substituen ii bazelor azotate pot fi

introdui n ADN dup ce au fost generate
zone scurte monocatenare.
1. gena care se dorete a fi modificat se
cloneaz ntr-un vector ADN bicatenar;
se cliveaz gena (pasagerul) cu ajutorul
unor enzime de restric ie care taie ambele
catene la acelai nivel;
tratarea situsului de restric ie (Sma I) cu
enzima Klenow (o form modificat a ADNpolimerazei I de la E.coli) care ac ioneaz
ca o exonucleaz producnd digestia
monocatenelor n direc ia 3 - 5 pn cnd
ntlnete reziduul T, deoarece n mediu de
reac ie este prezent un singur dNTP-dTTP.
Digestia se va opri cnd baza azotat
situat pe catena n curs de digerare este
disponibil n mediul de reac ie.
Procednd n acest fel se ob in por iuni
monocatenare la nivelul pasagerului;

dezaminarea citozinei de pe monocatene i

transformarea ei n uracil se face prin
adugarea bisulfitului de sodiu ca agent
mutagen;

- molecula de ADN este refcut n urma unui

proces de biosintez reparatorie n prezen a
celor patru deoxinucleotid trifosfa i (dATP,
dGTP, dCTP i dTTP), a enzimei Klenow i a
ligazei.

A.III.2 Muta iile de substitu ie prin tranzi ie pot fi induse i

prin ncorporarea unor analogi ai bazelor azotate
(N-4-hidroxicitozina), n cadrul procesului de biosintez
reparatorie a ADN.
Metoda presupune crearea de intervale scurte monocatenare
n interiorul unui duplex de ADN, fr clivarea ambelor
catene.
Intervalul este apoi reparat utiliznd o form modificat a
ADN-polimerazei I (enzima Klenow), mpreun cu N-4hidroxicitozina i cu ceilal i trei dNTP(dATP, dGTP i
dCTP).
Ambele forme tautomere ale N-4-hidroxicitozinei (cetonic
i enolic) permit mperecherea att cu A (forma
cetonic) ct i cu G (forma enolic), spre deosebire de T
care se mperecheaz numai cu A.
Dac N-4-hidroxicitozina s-a mperecheat cu G, n
urmtorul ciclu de replicare G se mperecheaz cu C. In
acest fel se induce tranzi ia perechii de baze azotate T-A
n C-G. In concluzie, aceast metod de mutagenez in
vitro are ca rezultat tranzi ia T C.

A.III.3/ ncorporarea enzimatic

greit a nucleotidelor

Muta iile de substitu ie pot fi generate i prin ncorporarea enzimatic

greit a nucleotidelor pe parcursul proceselor de biosintez ADN
reparatorie.
Pentru a realiza o astfel de substitu ie este necesar ca sinteza in vitro
a ADN-ului s se realizeze n condiii neideale (condi ii ionice
suboptime, cantit i inegale ale precursorilor nucleotidici). Aceste
condi ii ncurajeaz ADN-polimeraza, ca ocazional s ncorporeze greit
o nucleotid pe parcursul sintezei.
De exemplu, biosinteza ADN-ului este realizat n prezen a unor
concentra ii ridicate a trei dintre precursori (deoxinucleotid trifosfa i) i
a unei concentra ii foarte sczute a celui de-al patrulea. Pozi iile din
catena de ADN care n mod normal trebuie s fie ocupate de cea de-a
patra nucleotid (aflat n concentra ie sczut) sunt ocupate, uneori,
de ctre una dintre celelalte trei nucleotide, rezultnd n acest fel o
muta ie prin substitu ie.
Aceast metod se bazeaz i pe faptul c enzimei Taq polimeraza i
lipsete activitatea de corectare - un mecanism specific exonucleazelor
care verific fiecare pereche de baze dup ncorporare i ndeprteaz
nucleotidele care sunt mperecheate greit.

B. Mutageneza dirijat
Mutageneza dirijat permite introducerea unei muta ii ntr-o
pozi ie dorit, la nivelul unei gene. Aceasta se poate realiza
prin dou metode:

B.1 - prin extensia enzimatic cu ajutorul oligonucleotidelor

mutagenice
B.2 - prin sinteza genelor
B.1. Mutageneza dirijat pe situsuri prin extensia enzimatic a
oligonucleotidelor mutagenice :

Aceast metod presupune ca gena de interes (pasager) de tip

slbatic s fie integrat ntr-un vector ADN monocatenar, cum
este fagul M13

O oligonucleotida sintetica (cu rol de primer) este sintetizat

deliberat cu o anumit modificare n raport cu gena pasager
slbatic i ca atare oligonucleotida este numai par ial
complementar cu gena pasager de tip slbatic.

In condi ii de temperatur sczut i concentra ie ridicat

de sare, oligonucleotida se poate hibrida molecular cu gena
pasager.

In continuare, n prezen a ADN-polimerazei I, a

celor patru molecule de deoxinucleotid trifosfa i
(dNTP) i a ADN-ligazei se realizeaz, n
procesul de replicare, sinteza celei de-a doua
catene complementare, oligonucleotida sintetic
jucnd rolul de primer.
In cadrul procesului de replicare se completeaz
att gena pasager care integreaz
oligonucleotida sintetizat artificial, ct i cea
de-a doua caten a vectorului.
Cnd molecula bicatenar a fagului M13, astfel
rezultat, este introdus n E.coli, aceasta se
replic i d natere la bacterii ce poart gena
pasager slbatic i la bacterii ce poart gena
pasager mutant.

Muta ia dirijat
prin utilizarea
oligonucleotidelor

B.2 Mutageneza prin sinteza

genelor

Odat ce au devenit disponibile oligonucleotidele mai lungi, este

posibil ca o gen ntreag s fie asamblat din unit i sintetice.
Aceasta se realizeaz prin sintetizarea prealabila a unui set de
oligonucleotide complementare, cu o lungime tipic de 40 pn la
80 nucleotide, care pot fi ligate in vitro pentru a asambla ntregul
ADN bicatenar (gena). In sinteza genelor, experimentatorul are
controlul total asupra secven ei genice, care poate fi de tip slbatic
sau mutant.
Genele sintetice sunt de obicei purificate pe un gel nainte de a
fi ligate de un vector. Plasmida recombinat rezultat este ob inut
dup o transformare n E.coli i este secven iat pentru a putea
vedea dac a fost sintetizat secven a dorit. Secven a genei
sintetice poate fi realizat n aa fel nct s plaseze situsurile de
restric ie n locuri convenabile pentru mutageneza realizat cu
ajutorul casetelor de oligonucleotide.