Introducere: Genetica Moleculara ca domeniul in biologie.

Etapele principale ce au contribuit la dezvoltarea Geneticii moleculare.

Obiectul si sarcinele.
Dogma centrala: schema clasica si moderna, abateri si situatii speciale.
Metodele geneticii moleculare.
Utilizarea practică a realizărilor Geneticii Moleculare.
Genetica moleculară este o ramură a geneticii și biologiei moleculare care studiază structura și
fiziologia genelor, ereditatea și variabilitatea organismelor la nivel molecular, biochimic. La toate
organismele materialul genetic este reprezentat de acizii nucleici (ADN și ARN). Aceștia au
capacitatea de a inregistra sub o forma codificata biochimic informatia genetică, care determină
toate caracterele și insușirile organismelor vii.
Genetica moleculară lucrează pe metodele geneticii și biologiei moleculare pentru a elucida funcția
moleculară și interacțiile dintre gene. Împreună cu determinarea modelului descendenților, genetica
moleculară ajută la înțelegerea mutațiilor genetice care cauzează diferite tipuri de boli. Astfel utilizând
metodele geneticii și biologiei moleculare, genetica moleculară descoperă motivul pentru care caracterele se
transmit și cum pot apărea mutații.
Cursul include o viziune contemporană asupra geneticii moleculare moderne. O deosebită atenţie la
expunerea materiei se acordă mecanismelor moleculare și a expresiei genelor.
Se consideră că începutul geneticii moleculare datează imediat după descoperirea Legilor eredității de către
Mendel (1865), iar ca o direcție separată a apărut în anii 40 sec. XX datorită introducerii în biologie a noilor
metode fizice și chimice (analiza difracției cu raze X, cromatografie, electroforeză, centrifugare de mare viteză,
microscopie electronică, utilizarea izotopilor radioactivi etc.), ceea ce a permis mult mai profund și mai precis, decât
înainte, studiul structurei și funcțiilor componentelor celulare, celulei ca un sistem întreg.
 Evenimente cheie în evoluția geneticii moleculare
1869; 1889 Extragerea ADN (pentru prima dată din nucleele leucocitelor la peste), localizarea in Johann Friedrich Miescher;
nucleu; constatat proprietati acide R. Altman
1879-1891 Au fost extrase parti component a acidului nucleic: baze purinice, baze pirimidinice, Albrecht Kossel
acidul fosforic, resturi de carbohidrati. A descoperit patru baze azotate care
formează ADN-ul. Premiul Nobel
1924 ADN cromozomal,a utilizat coloratia specifică (fucsin) pentru evidentierea distributiei Robert Feulgen
ADN-ului în celulă, prin acesta demonstrând localizarea ADN-ului în cromozomi, a
dovedit ca AND sa localizeaza in nucleu iar ARN in citoplazma
1928 Principuil transformarii la bacterii Franklin Griffith
1944 Transformarea ADN (la pneumococi). S-a stabilit că dacă în mediu de cultură se Oswald Avery,
adăuga enzima dezoxiribonucleaza, care fragmentează specific moleculele de ADN, Colin MacLeod, Maclyn McCarty
atunci transformarea n-are loc. Dovedit rolul genetic al ADN
1945 a emis ipoteza conform cãreia informatia geneticã pentru sinteza proteinelor se aflã Erwin Schrödinger
localizatã în acizii nucleici
1949 Regulile lui Chargraff Erwin Chargraff
1953. Elaborarea modelului de structură bicatenară James Watson,
a ADN-ului (dublu helixal) Francis Crick, Maurice
Wilkins, Rosalind Franklin
1955 Secventierea proteinelor Fred Sanger
1955, 1956 Rolul ARN în ereditate a fost demonstrat independent de douã colective, care au H. Fraenckel-Conrat si R. Williams
efectuat experimente cu virusul mozaicului tutunului (VMT) (SUA), A. Gierer si G. Schramm.
(Germania)
1961 Descoperirea reglarii genice a sintezei enzimelor Andre Lwoff, Jacques Monod,
Francois Jacob
1962-1968 Codul genetic. Premiul Nobel Marchall Nirenberg,
Robert Holley şi Gobind Khorana
1967 Sinteza in vitro a ADN biologic activ la virus Arthur Kornberg
1970 Sinteza chimica a genei (bacteriene) Gobind Khorana
1970 Descoperirea reverstranscriptazei si fenomenului transcriptiei inverse Howard Temin, David
Baltimore,Renato Dulbecco
1974 Descoperirea restrictazelor Werner Arber, Daniel Nathans,
Hamilton Smith
2 tulpini de pneumococi:
tulpina tip S virulentã, prezintă
capsulãă, formează colonii netede;
tulpina R, avirulentă, nu prezintã
capsula, formeazã colonii rugoase.
Prin mutație, tulpina S poate pierde
capsula și se transformă în tulpină
acapsulată de tip R avirulentă.
Experimentele au fost efectuate la
șoareci, injectați intraperitoneal cu
pneumococi vii sau omorăți prin șoc
termic, singuri sau în amestec din
ambele tulpini. S-a constatat că
șoarecii au murit în urma injecției cu
pneumococi virulenți vii, de tipul S
(situație normală), însă și în cazul
injectării unui amestec constituit din
pneumococi tip R vii și S omorâți prin
șoc termic - Griffith nu a putut
explica fenomenul de transformare
genetică.

Experienta de transformare genetica a
lui O.T.Avery si a colaboratorii sai. Deci
rolul ADN în ereditate a fost stabilit la
Streptococcus pneumoniae (pe mediul de cultură
al bacteriilor de tip R au introdus ADN extras de la bacterii de tip S,
după 24 de ore au constatat prezența coloniilor de tip S. Deci, ADN
bacterian posedă capacitate infecțioasă, el fiind purtătorul
informației genetice).
Structura VMT. Experienta rolului ARN în
ereditate la VMT ale H. Fraenckel-Conrat si
R. Williams, A. Gierer si G. Schramm (VMT
este constituit dintr-o moleculă lineară de ARN viral, protejată de o
capsidă virală, de natură proteică. Ei au separat virusul în cele două
componente și au făcut infecții separate cu acestea. S-a constatat
prezența unei infecții virale numai în regiunea unde a fost injectat ARN
viral, din regiunea respectivă fiind izolat virusul întreg. Deci ARN viral
poartă informația genetică pentru sinteza întregului virus. ).
J.D. Watson si F.H.C. Crick in
fata modelului moleculei de
ADN, propus in anul 1953
 Dezvoltarea furtunoasa a biologiei moleculare si anume metodele de determinarea
rapida a succesiunelor nucleotidice de ADN create de Sanger F, Coulson A., Maxam A., Gilbert Y.
in 1975-1976 a adus la aparitia stiintei noi bioinformaticei care a fost creata in baza geneticii
moleculare si informaticii. In 1982 au fost fondate bancile de succesiuni nucleotidice: Gen
Bank in SUA si EMBL in Europa, aici sa concentreaza informatia despre succesiunile nucleotide
descifrate la diferite organizme.
Cercetãrile din genetica molecularã au condus la clonarea primei gene si implicit la
dezvoltarea unei noi ramuri a geneticii moleculare, denumitã ingineria geneticã (tehnologia
ADN recombinant) din care s-a dezvoltat industria biotehnologiilor. Progresul in secventierea
ADN la diferite organisme la sfarsitul secolui XX (in 1995- sa secventiat genomul bacterian, in
1997-genomul la drojdie, 1998- la nematode, in 2000- la drozofila si la om) a adus la aparitia asa
stiintei ca genomica (ce studiaza toate genele a organizmului ca o intregime). Totodata a aparut si
proteomica- stiinta ce studiaza seturile complete a proteinelor, care functioneaza la diferite etape
de dizvoltare oare caruia organism.

Dezvoltarea geneticii moleculare a fost influentatã de:

(1) utilizarea unor instrumente si tehnici adecvate de investigatie (ultracentrifuga analiticã,
microscopul electronic);
(2) utilizarea substantelor fluorescente si radioactive (electroforeza, difractia cu raze X, diferite
tipuri de cromatografe);
(3) tehnici de enzimologie în analiza acizilor nucleici.
 Dogma centrală a biologiei moleculare (Crick, 1953):
Circulatia a informației genetice merge în direcția unica
ADN → ARN → proteine
Informatia nu poate fi transmisa de la proteina inapoi la ARN/ADN sau de la o proteina
la alta proteina

Deci dogma centrală în forma sa generala acceptată descrie procesele de replicarea

ADN, transcriptia ADN şi translatia ARNm.
S-au descoperit insa abateri de aceasta teorie:
– Revers-transcriptia = transcrierea informatiei din ARN in ADN;
prezenta la retrovirusuri (ex: HIV), unele bacterii
– Replicarea ARN = copierea ARN in alt ARN (virusuri, bacterii).

Situatii speciale:
– Transcrierea directa a ADN-ului in proteine (in vitro)
– Transmiterea informatiei prionice – o proteina se autoreplica inducand
modificari conformationale unei proteine cu aceeasi secventa de aminoacizi
–Activitatea ribozimelor
–Redactarea ARN proces biologic molecular, pe parcursul caruia informatia continuta in molecula
ARN se modifică prin scimbarae chimică a bazelor. În prezent, este cunoscuta editarea ARN-ului de
transport, a ARN-ului ribozomal și a ARN-ului matricei eucariote(вставки, делеции и замены
оснований после транскрипции).
–Splaising este procesul de maturare a ARN-ului premesager realizat intranuclear prin
care intronii transcriși în moleculele de pre-ARNm sunt excizați și eliminați, în timp ce exonii sunt
reuniți, rezultând moleculele de ARNm matur.(удаление интронов).
–Amprentarea genomică (sau imprinting-ul parental) e un process epigenetic
(variația trăsăturilor fenotipice care sunt cauzate de aspecte ale mediului înconjurător, acestea
schimbând comportarea genelor și afectând modul în care celulele le decodifică), expresia unor gene se
realizeaza in dependenta de originea parentala, ereditatea caracterelor determinate de acest fel de gene
nu sa efectuiaza dupa reguli lui Mendel, imprintingul sa petrece prin calea de metilare ADN in
promotori, ca rezultat blocarea transcriptiei genei.
–Interferența ARN un fenomen natural, cand fragmente scurte de ARN pot intercepta şi distruge ARN-
ul mesager înainte ca acesta să transporte instrucţiunile.
Sarcinele geneticii moleculare la sfarsitul sec. XX devin tot
mai largi si orientate spre directia stiintifico-practica:
decodarea structurii genomului;
crearea bancilor de gene;
dactiloscopia genomica;
studierea bazelor molecular ale evolutiei, diferentiere, biodiversitate, dezvoltarea si
îmbătrânire, cancerogeneza, imunitetea si altele;
crearea medodelor de diagnosticare si tratamentul bolilor genetice, boli virale;
crearea biotehnologiilor noi productie de alimente si diferitor compusi activi biologice
(hormoni, anti-hormoni, factori de eliberare, purtători de energie si altele).

Astfel, sec XXI se considera a fi secolul biologiei, geneticii moleculare si

biotehnologiilor noi, proiectat spre eliberarea omenirii de povara bolilor, vicii și deprivare
pentru a pune bazele de prosperitate in viitor.
Metodele geneticii
moleculare

10
Clasice:
• microscopie;
• analiza difracției cu raze X;
• izotopi radioactivi.
Moderne:
• izolarea ADN-ului, amplificarea, reacția de
polimerizare în lanț (PCR);
• electroforeza;
• restricția,metoda de polimorfizm a lungimei
fragmentelor de restrictie (RFLP);
• secvențierea: abordări de bază, tehnologii moderne;
• cartografierea și screening-ul genomilor etc.
 Genele reprezintă substratul molecular al
eredităţii. Structura şi localizarea genelor în
genom controlează proprietăţile organismului.

Studiul molecular al genelor poate fi realizat pe mai

multe căi în dependenţă de scopul propus:
1. secvenţierea ADN pentru determinarea structurii
primare a genei;
2. tehnica Southern-blot pentru identificarea poziţiei
genei în genom.
3. tehnica Northen-blot pentru determinarea expresiei
genelor (analiza ARNm);
4. tehnica Western-blot pentru determinarea produsului
proteic al genei;
5. tehnica PCR pentru identificarea genei normale sau
mutante.
 Clasificare Sunt alele mutante care marchează
prezența unei gene la nivel individual și
controlează caractere ușor
Markeri genetici evidențiabile, marcante

Markerii Markeri Markerii moleculari

morfologici
Markerii morfologici
controlează caractere
morfologice uşor de evidenţiat,
controlate genetic de către o
singură genă
biochimici Markerii moleculari
Controlează însuşiri biochimice evidenţiază polimorfismul la
care sunt controlate de mai multe nivelul ADN-ului nuclear şi
gene şi se bazează pe proprietatea citoplasmatic.
proteinelor de a fi separate prin
electroforeză
Markeri ADN

Bazate pe blot- Bazate pe Bazate pe cipuri-

hibridare reactia PCR ADN(analiza automată a
genomurilor complexe)
Markerii moleculari pun în evidenţă diferenţele dintre secvenţele nucleotidice, marcând totodată prezenţa
unei anumite gene în ADN-ul extras de la diferiţi indivizi. Formarea sau dispariţia unui marker molecular
este determinată de modificarea unei singure nucleotide dintr-o genă sau chiar de la nivelul ADN-ului
repetitiv.
Markerii genetici evidențiază orice diferenţă genotipică sau fenotipică specifică unui individ, care se
transmite în descendenţă, sunt de fapt alele mutante care pot fii urmărite de-a lungul generaţiilor.

CARACTERISTICILE MARKERILOR MOLECULARI

1. pot fi obtinuţi în număr nelimitat, din orice ţesut, în orice etapă de dezvoltare;
2. sunt independenţi de expresia genică şi nu sunt influenţaţi de condiţile de mediu;
3. nu sunt supuşi presiunii de selecţie;
4.de regulă, nu prezintă interacţiuni nealelice (epistatice) şi nu manifestă pleiotropie;
5. se transmit mendelian, simplu;
6. pot fi dominanţi, când nu se deosebesc heterozigoţii de homozigoţi sau codominanţi, când se pot deosebi heterozigoţii de
ambii părinţi homozigoţi.

IMPORTANŢA MARKERILOR MOLECULARI

• identificare,
• selecţie şi clonare a genelor de interes,
• precum şi observarea naturii informaţionale a materialului analizat.

UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI

• Stabilirea variabilităţii genetice şi caracterizarea colecţiilor de germoplasmă;
• Amprentarea genetică a varietăţilor, identificarea şi accelerarea dezvoltării indivizilor care combină alelele favorabile, contribuind la
performanţele presupuse ale hibrizilor;
• Estimarea distanţelor genetice între populaţii, şi producerea de seminţe;
•Detecţia QTL(Quantitative Trait Loci) şi monogene;
• Puritatea şi stabilitatea seminţelor şi a materialului vegetal;
•cartarea genelor și clonarea genelor
• Identificarea de secvenţe utile, gene candidat etc.
Clasificarea markerilor moleculari
I.Markeri care permit evidenţierea polimorfismului monolocus
1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism),
2. PCR (Polymerase Chain Reaction), cu următoarele tipuri:
CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences);
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism);
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
SSR (Simple Sequences Repeats) sau markeri ADN microsatelit.

II.Markeri care permit evidenţierea polimorfismului polilocus (la gene diferite sau
cromozomi diferiţi)
1. RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) cu următoarele tipuri:
DAF (DNA Amplified Fingerprinting)
AP – PCR (Arbitrary Primed PCR)

2. ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)

3.AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism).
 Markeri moleculari bazate pe PCR

• RAPD – Random Amplification of Polymorphic DNA, ADN

Polimorfic Amplificat Randomizat (Williams et al, 1990).
• ISSR – Inter Simple Sequence Repeats, Amplificarea Regiunilor
dintre Secvenţele Simple Repetate (Zietkiewicz et al, 1994).
• AFLP – Amplified Fragment Length Polymorphisms,
Polimorfismul Lungimilor de Fragmente Amplificate (Vos et al.,
1995).
• SSAP – Sequence-specific Amplification Polymorphism,
Polimorfism al Secvențelor Amplificate în mod Specific (Waugh et
al., 1997).
 RAPD – Random Amplified Polymorphic DNA
PCR utilizeaza un singur primer decamer, care se gaseste la nivelul genomului, randomizat, la un situs de fixare care sa-i
permita realizarea amplificarii. Produsii de amplificare urmeaza a fi separati in gel de agaroza si se evidentiaza in UV dupa
colorarea cu bromură de etidium. Produşii de amplificare apar sub forma unor benzi fluorescente în lumină UV. Pentru
obţinerea produşilor de amplificare, condiţia esenţială este ca primerii arbitrari să aibă un conţinut de guanină şi citozină de
cel puţin 50%.

RAPD analysis of somatic hybrid plants (sf1-sf3)

M.sativa + M.falcata with the random primer RP7.
(S. Arcioni et al.)
Avantajele tehnicii RAPD
-nu pezintă riscuri deoarece nu implică radioactivitatea;
-cantitatea de ADN necesară pentru caracterizare este relativ redusă;
- permit e diferenţierea speciilor, a subspeciilor şi a cultivarelor.

Dezavantaje
- produşii de amplificare sunt în număr relativ redus;
- markerii RAPD sunt dominanţi;
- repetabilitatea metodei este relativ redusă, fiind influenţată de
condiţiile de lucru şi aparatura utilizată.
Схема RAPD анализа (Williams et al., 1990)
 ISSR – Inter Simple Sequence
Repeat
- ПЦР с использованием одного или нескольких праймеров длиной 15-24 н.

Микросателлитная ДНК – ДНК из коротких тандемных

повторов длиной от 1 до 6 пар оснований. Используются как
молекулярные маркеры в определении родства,
принадлежности к конкретной популяции, для исследования
гибридизации. Микросателлиты характеризуются высокой
скоростью изменения последовательностей, обусловленной
«проскальзыванием» при репликации ДНК и точечными
мутациями.

Праймер:
5’ – CA CA CA CA CA CA CA CA CA G
 ISSR – Inter Simple Sequence
Repeat
- ПЦР с использованием одного или нескольких праймеров длиной 15-24 н.

Схема ISSR анализа (Zietkiewicz et al., 1994; Gupta et al., 1994; Bornet, Branchard, 2001)
 AFLP – Amplified Fragment Length
Polymorphism
Сложный метод анализа, состоящий из нескольких этапов:

Схема одного из вариантов AFLP анализа (Zabeau, Vos, 1993)

• Principiul metodei de PCR a fost formulat de
Gobind Khorana in 1971
• In 1983 Karry Mullis a efectuat reactia de PCR
• In 1993 Karry Mullis a fost decernat cu premiul
Nobel in chimie pentru inventia reactiei PCR
 (PCR) reacția de polimerizare în lanț
este o reactie enzimatica de amplificare mediata de
primeri (secvente scurte de ADN) specifici secventelor
de ADN genomic sau clonat.

Праймеры

Полимераза
ПЦР – полимеразная цепная реакция
 Componentele reacţiei PCR
1. Matriţa ADN poate fi: ADN genomic, mitocondrial, viral, ADNc (caz particular ARN total – RTPCR).
2. Tamponul de reacţie: furnizează pH optim al polimerazei utilizate şi concentraţia optimă a ionilor Mg2+,
acivatorii ADN polimerazei (cantităţile insuficiente de Mg2+ duc la amplificări slabe, iar cantităţile crescute
conduc la cumularea de produşi de amplificare nespecifici). Cel mai comun tampon (pH 8,3) folosit conţine:
Tris-HCl KCl şi gelatină.
3. dNTP: sunt livrate fie sub forma a patru soluţii stoc individuale, fie sub forma unui amestec al celor patru
nucleotide. Soluţiile sunt ajustate la o valoare optimă de pH. Concentraţia optimă de dNTP depinde de:
concentraţia de MgCl2 , conc. primerilor, lungimea fragmentului ce urmează să fie amplificat şi numărul de
cicluri de reacţie.
4. ADN polimeraza: iniţial s-a folosit fragmentul Klenow al ADN polimerazei din E. Coli. Ulterior au fost
descoperite şi utilizate ADN polimeraze termostabile ca: -Taq/Amplitaq ADN polimeraza – izolată din
Thermus aquaticus. Viteza optimă de polimerizare este de 35-100 nucleotide/s la 70-80°C. Enzimele au o
activitate 5’-3’ exonucleazică care permite înlăturarea nucleotidelor situate în faţa lanţului de creştere. -
AmpliTaq polimeraza are aceleaşi proprietăţi cu Taq polimeraza dar este produsă în E. Coli prin recombinare
genetică. Reproductibilitatea şi puritatea acesteia este mult mai mare decât a Taq polimerazei simple.
5. Apa ultrapură: se utilizează exclusiv apă ultrapurificată, nuclease-free, livrată de firme specializate.
6. Primerii: în desemnarea primerilor trebuie respectate câteva reguli generale: Ø- lungimea primerilor
trebuie să fie cuprinsă între 20 şi 35 de nucleotide, acest lucru permiţând selectarea unei temperaturi de
hibridizare ridicate. Ø- primerii trebuie să conţină un număr aproximativ egal din cele patru baze azotate,
evitându-se pe cât posibil regiunile cu repetiţii de nucleotide (evitare structuri hairpin). Ø- perechile de
primeri trebuie alese astfel încât să nu prezinte complementaritate la nivel intra- şi interindividual (evitarea
dimerlor de primeri). Ø- distanţa dintre doi primeri la nivelul matriţei trebuie să fie mai mică de 5-10 kpb,
dar s-a observat o eficienţă foarte scăzută a reacţiei în cazul în care lungimea produsului de amplificare
depăşeşte 3 kpb. Ø- determinarea cu exactitate a temperaturii optime de hibridizare (annelare) prin realizarea
unei reacţii PCR în gradient de temperatură.
 Avantajele tehnicii PCR sunt
următoarele:
• suficienţa cantităţilor mici de ADN,
• rapiditatea ei (în câteva ore se obţin milioane
copii de ADN),
• specificitatea primerului permite amplificarea
selectivă a ADN,
• produsele de amplificare pot fi utilizate în
calitate de sonde pentru hibridări în alte
tehnici.
 Electroforeza acizilor nucleici
Pentru separarea fragmentelor de acizi nucleici se utilizează electroforeza
macromoleculelor în gel de agaroză sau de poliacrilamidă. Purtând sarcină negativă,
moleculele acizilor nucleici migrează în câmpul electric cu viteze diferite, în dependenţă de
greutatea moleculară. Fragmentele mai scurte migrează mai rapid, în timp ce fragmentele
lungi migrează mai lent. Pentru determinarea dimensiunilor fragmentelor din gel,
concomitent cu fragmentele de interes sunt supuse electroforezei în trecuri vecine şi
fragmente-marker ai lungimii. Moleculele acizilor nucleici pot fi vizualizate în gel prin
colorare cu agenţi fluorescenţi chimici, sau sunt marcate radioactiv. În cazul marcării
radioactive fragmentele se identifică cu ajutorul autoradiografiei care constă în suprapunerea
gelului cu un film fotosensibil. Prelucrarea statistică a datelor experimentale (TotalLab
Quant, Gelanalyzer).
 Tehnica Southern-blot
Pentru analiza unor gene e necesar să se determine localizarea specifică a situsurilor de
restricţie. Succesiunea situsurilor de restricţie într-o gena poate fi determinată fără a fi
necesară clonarea genei, folosind sonde moleculare (secvenţe scurte de ADN monocatenar,
marcate radioactiv sau cu agenţi fluorescenţi şi care sunt complementare secvenţei de
interes). Transferul pe filtru de nitroceluloză se realizează prin tehnica Southern-blot (de la
numele inventatorului Edward Southern) .
Analiza constă din următoarele etape:
(1) extragerea ADN genomic cu greutate moleculară mare din celule;
(2) digestia enzimatică a ADN-ului cu diferite ER, fiecare producând fragmente de lungime
diferită;
(3) separarea fragmentelor de restricţie prin electroforeză în gel de agaroză;
(4) denaturarea fragmentelor bicatenare cu o soluţie alcalină;
(5) neutralizarea gelului cu o soluţie tampon;
(6) transferul capilar al fragmentelor de ADN pe filtre de nailon sau nitroceluloză;
(7) hibridarea cu sondele monocatenare radioactive;
(8) autoradiografia pentru vizualizarea hibrizilor ADN cercetat / ADN sondă.
Principiile transferului acizilor nucleici pe filtru şi hibridarea cu
sonde radioactive

Analiza poate determina

prezenţa sau lipsa unor
situsuri de restricţie
caracteristice genei
analizate care se asociază
cu anumite mutaţii.
Diferenţele dintre hărţile de
restricţie obţinute de la doi
indivizi este numită
Polimorfismul Lungimii
Fragmentelor de Restricţie
(RFLP – Restriction
Fragment Lenght
Polimorphism). Acest
polimorfism poate fi folosit
ca marker genetic în
evaluarea genotipului.
 Tehnica Northern-blot
Technica Northern-blot se utilizeaza pentru cercetarile expresiei
genelor prin testarea moleculelor de ARN (ARNm) si fragmentelot acestora
in probe. Metoda a fost propusa in 1977 de colaboratorii universitatii din
Stanford Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR. Metoda Northern-blot constă în
transferul moleculelor denaturate de ARN pe filtre de nailon sau
nitroceluloză, urmat de hibridarea cu sonde marcate. Această metodă este
similară tehnicii Southern-blot cu deosebirea că ARNm extras şi purificat nu
este supus scindării cu enzime, iar electroforeza decurge în condiţii de
denaturare. Tehnica Northern-blot permite identificarea transcripţilor genelor
analizate, stabilirea lungimii lor.
 Tehnica Western-blot
Metoda a fost elaborata in laboratorul lui George Stark universitatii din Stanford. Denumirea
tehnicii “Western-blot” a fost data de W. Neal Burnette, analogic cu Southern-blot. Această
metodă constă în identificarea unei proteine specifice din amestecul de proteine
celulare. Pentru aceasta, proteinele sunt separate prin electroforeză în condiţii de
denaturare în prezenţa SDS (Dodecil Sulfat de Sodiu). Proteinele fracţionate după
greutatea moleculară sunt transferate pe filtre de nailon sau nitroceluloză şi supuse
tratării cu anticorpi specifici marcaţi radioactiv sau fluorescent. Prin această metodă se
poate identifica prezenţa/lipsa proteinei, dimensiunile ei, rata de expresie a genei.
 Hibridarea in situ
Hibridarea in situ reprezintă o tehnică moleculară , în care o sondă specifică
marcată poate identifica direct pe preparatele celulare:
(1) un ARNm într-o celulă particulară sau ţesut;
(2) o genă pe un anumit cromozom sau fragment de cromozom;
(3) numărul moleculelor de ARNm în dependenţă de perioada ontogenetică sau tip tisular;
(4) ADN viral;
(5) deleţiile cromozomiale submicroscopice;
(6) genele responsabile de producerea cancerului, localizarea şi nivelul lor de expresie.

Din motiv că sondele marcate radioactiv au unele dezavantaje (tehnică laborioasă, pericol
pentru sănătate) în ultimii ani se utilizează metoda FISH (Fluorescence In Situ Hibridization)
care utilizează sonde fluorescent marcate. Metoda FISH este simplă, poate fi aplicată pe
preparate celulare arhivate, este rapidă, nu modifică morfologia celulelor.
Technica FISH (fluorescent
in situ hybridization)
 Secventierea ADN
Analiza secvenţei bazelor azotate din structura primară a ADN poate fi realizată prin două căi:
1) calea chimică (Maxam-Gilbert), în care se folosesc reacţiile chimice de clivare a
ADN-ului în baze individuale, dar fiind o metodă complicată şi laborioasă, în
ultimii ani nu se mai utilizează;
2) calea enzimatică (Sanger) în care ADN-ul este sintetizat in vitro pe baza matriţei
ADN studiat, în aşa fel încât reacţia se termină specific în poziţia care corespunde unei
baze anumite. Pentru a determina o secvenţă de nucleotide pe una din căile menţionate, ADN-
ul este supus seriei de patru reacţii separate, fiecare reacţie fiind specifică pentru una din
baze. Prin electroforeză produşii de reacţie vor migra în patru curse paralele, pe acelaşi gel.
Urmărind bandă cu bandă, poate fi identificată ordinea nucleotidelor în ADN

Secvenţierea ADN prin clivarea

chimică (Maxam-Gilbert)

Marcarea:
1.izotopi 32P sau 35S
2.neradioactiva cu biotina sau sonde fluorescente.
 Tehnica SANGER (dideoxi)
Tehnica Sanger (dideoxi) utilizează sinteza enzimatică a unei catene, complementară cu o matriţă
clonată. În cadrul acestei proceduri sinteza este stopată prin încorporarea unui di- deoxinucleozid
trifosfat - un analog al dezoxiribonucleotidelor. Dideoxinucleozidtrifosfaţii conţin în poziţia 3'
grupa –H, dar nu grupa –OH care împiedică polimerizarea nucleotidelor. Folosind patru analogi
dedeoxi diferiţi în timpul sintezei catenei noi de ADN, se poate de identificat fiecare nucleotid
normal din catena matriţă. Electroforeza fragmentelor obţinute permite stabilirea ordinii
nucleotidelor în molecula de ADN.
În ultimii ani se utilizează o metodă automată de secvenţiere, bazată pe metoda dideoxi. În scopuri de
diagnostic al purtătorilor de gene normale sau mutante se compară rezultatele secvenţierii cu datele structurii
primare normale a genei din bibliotecile de ADN. Spre regret, nu se cunoaşte încă secvenţa tuturor genelor
umane, de aceea în diagnostic se utilizează metode indirecte: înlănţuirea cu markeri genetici apropiaţi
(repetiţii hipervariabile de ADN mini- şi microsatelitic), determinarea situsurilor de restricţie caracteristice
genei date, hibridarea cu sonde specifice etc.
Utilizarea practică a realizărilor geneticii moleculare:
•Biomedicina (noi antibiotici, vaccine,identificarea genelor asociate cu
boli ereditare și predispunere,terapia cancerului, terapia genică,
materiale biocompatibile, metabolismul și rezistență diferită a indivizilor
față de medicamente – farmacocinetică și
farmacodinamica,diagnosticarea moleculară).

•Medicina legală („amprentarea” genetică sau dactiloscopia,

paternitatea)

•Agricultura (medicina veterinară, furaje noi, rase și soiuri noi, plante și

animale transgenice).

•Tehnologii alimentare (tehnologii enzimatice (aprofundarea procesării

materiilor prime, noi metode de conservare), produse cu compuși cu
un conținut scăzut de molecule, culturi de plamadeala și probiotice).
 Lista surselor bibliografice :
 Larry Snyder & Wendy Champness. Molecular genetics of bacteria, Washington, D.C.:ASM Press, ed. 3, 2007;
 Jeremy W. Dale, Simon Park Molecular Genetics of Bacteria, Chichester; Hoboken, N.J. John Wiley & Sons, ed. 5, 2010;
 Уотсон Молекулярная биология гена, 1982, Из-во “Мир”, Москва;
 M.Singer and P.Berg, Genes and genomes, 1991, University Science Books;
 L.Baltimore, B. Zipunnsky and M. Darnell. Molecular cell Biology III edition 1995, New York and Oxford;
 B. Lewin, Genes, 2003, Oxford University Press;
 L. Gavrila. Genomica. Editura Enciclopedica, Bucuresti, 2003, I-II volum;
 Antohi Şt., Gavrilă L. Progrese în genetica moleculară. Ed.Ştiinţifică şi enciclopedică, Bucureşti, 1981;
 John Wily. Genomics, 1999;
 Atchinson. Molecular and Celular biology, 2003, New York;
 Vasu. Bazele ingeneriei genice, 2007, Bucuresti;
 Gavrila. Principii de Genetica Moleculara, 2004, Bucuresti;
 Berg P. Genes and genomes.1992, Oxford University Press;
 Стент Молекулярная генетика, 1984, Из-во «Мир» Москва;
 Люин Б. Гены. М.:Изд. Бином. 2012, 896 с.;
 Зенбуш. Молекулярная и клеточная биология, 1982, 3х Томах;
 Айала Ф Кайгер Д. Современная генетика – в 3х Томах, 1987, Из-во «Мир», Москва;
 Коничев А.С., Севастьянова Г.А. Молекулярная биология. М., 2005, 397 с.
 Г.Ф. Жегунов, Б.И. Кулаченко. Молекулярные основы генетики.-Харьков, 2001. -74с.
 Горбунова В.Н., Баранов В.С..Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний.-
СПБ.: Специальная литература, 1997.-285с.
Bibliografia suplimentară:
 J.Sambrook, E.F. Fritsch, T.Maniatis Molecular Cloning, 1989, ed. II Cold Spring Harbor Laboratory Press;
 Гловер. Клонирование ДНК1988 Из-во «Мир»;
 Хеймс Б., Хиггинс С. - 1987 год - 400 с. Транскрипция и трансляция. Методы 1990 Из-во «Мир».