CAP.

1 GENETICA CLASIC
__________________________________________________________ 1.1 Istoricul cercetrilor de genetic
Genetica este tiina care studiaz structura i funciile genelor i transmiterea lor la descendeni. nceputurile geneticii se nscriu cu 4000 de ani n urm, prin studiile realizate n Sumer i Egipt, concretizate printr-o selecie primitiv a caracterelor pe baz de fenotipuri avantajoase pentru amelioratori. Genetica modern a debutat la mijlocul secolului al XIX-lea cu studiile lui Gregor Mendel care a analizat transmiterea caracterelor la Pisum sativum (mazrea) i a stabilit c anumite caractere pot fi transmise la descendeni realiznd o corelaie ntre caractere i factorii ereditari. Astfel a nceput genetica formal genetica transmiterii caracterelor. Cunoscut ca printele geneticii moderne, Gregor Mendel (1822-1884) s-a nscut n 1822 ntr-o familie de rani din Heizendorf (localitatea fcea parte din Austria la vremea respectiv; astzi ns, localitatea se numete Hynice i face parte din Republica Ceh). La vrsta de 21 de ani intr n Mnstirea Augustinian din Brnn (astzi Brno) unde ulterior devine clugr. A urmat cursuri de matematic, iin, filozofie la Universitatea din Viena. n grdina mnstirii din Brno, Mendel a realizat timp de zece ani experimente de incruciri ntre diverse soiuri de mazre, urmrind transmiterea a apte perechi de caractere ereditare la Gregor Johann descendeni. Interpretnd rezultatele, Mendel a elaborat Mendel principiile ereditii cunoscute astzi sub denumirea de Legile lui Mendel. i-a publicat cea mai important lucrare despre ereditate n 1866, dar de-abia n 1900 cunoscutul botanist olandez Hugo de Vries a apreciat munca i activitatea lui Mendel. ntreaga semnificaie a fost realizat de-abia n anii 1920-1930, prin efervescena experimental a altui mare genetician, Thomas Hunt Morgan, care a elaborat teoria cromozomal a ereditii i a denumit acei factori ereditari gene. Morgan este cel care a fundamentat citogenetica, tiin ce studiaz structura i numrul cromozomilor, precum i comportamentul lor n timpul diviziunii celulare (mitoz i meioz). Thomas Hunt Morgan (1866-1945) s-a nscut n Kentucky, SUA i a fost profesor de zoologie experimental la Universitatea Columbia ntre 1904 i 1928. mpreun cu doctoranzii si (A.H.Sturtevant, C.B.Bridges i H.J.Muller), Morgan a realizat experimente i analize citologice pe musculia-de-oet (Drosophila melanogaster) demonstrnd faptul c cromozomii se comport foarte asemnntor cu ceea ce Mendel denumea factori ereditari. Thomas Hunt Morgan Toate rezultatele l-au condus pe Thomas Morgan la elaborarea Teoriei cromozomiale a ereditii i la publicarea lucrrii Mecanismele Ereditii Mendeliene (1915), lucrare ce a avut un rol foarte important n dezvoltarea geneticii moderne. Experimentele ulterioare realizate de Morgan au

demonstrat existena i comportamentul genelor, rezultate publicate sub titlul Teoria Genei (1926). Pentru ntreaga sa activitate tiinific, Thomas Morgan primete n 1933 Premiul Nobel pentru fiziologie i medicin. Genetica molecular debuteaz cu studiile lui Griffith (1928) care a urmrit procesul de virulen la pneumococi (bacterii ce provoac pneumonie la om i mamifere). Griffith a costatat c pneumococi neviruleni devin infecioi n prezena unor penumococi viruleni dar omori anterior prin tratament termic. A concluzionat c modificarea se relizeaz prin aciunea unui agent transformant. Natura acestui agent ns a afost descoperit mai trziu, n 1944, de ctre Avery, Mac Leod i McCarty, fiind vorba de o macromolecul de ADN d.c. Acizii nucleici au fost iniial descoperii n nucleii leucocitelor umane, dar Streptococcus fr s fie identificat funcia lor. Analiza chimic realizat n prima pneumoniae decad a secolului trecut a stabilit existena a 2 clase importante de acizi nucleici, i anume ADN i ARN.

Pn n prezent, cea mai important descoperire din domeniul geneticii a fost elucidarea structurii ADN, macromolecul dublu catenar helical, de ctre James Watson i Francis Crick n 1953. n prezent, ADN este denumit macromolecul informaional, coninnd informaia genetic codificat n structura sa.

Escherichia coli

Etapa urmtoare in dezvoltarea geneticii este rezentat de apariia geneticii moleculare care a beneficiat pe studiile pe microorganisme, iniial pe bacterii, iar cobaiul a fost Escherichia coli. Acest microorganism prezint avantaje majore pentru studiile de genetic: o generaie se obine n cteva minute, toate caracterele se exprim (datorit faptului c este haploid, adic deine un singur set de gene/cromozomi), populaia reprezint o clon (toi indivizii fiind identici din punct de vedere genetic, iar variabilitatea intervine doar n urma unor procese mutagene).

O alt etap care a revoluionat genetica molecular este reprezentat de momentul iniierii tehnologiei ADN recombinant n 1970, tehnologie ce a permis realizarea unor cercetri fundamentale referitoare la. structura i funciile genelor i a unor cercetri aplicative ce au condus la sinteza unor substane biologic active, inclusiv a unor compui de interes biomedical. Tot anul 1970 ste anul n care Temin i Baltimore au descoperit retrovirusurile i reverstranscrierea. Anul 1975 este asociat cu hibridizarea molecular de tip Southern, Northern i Western blotting, fapt ce a permis seturi de analize moleculare a structurii fine a genelor. Anul 1977 este corelat cu secvenierea acizilor nucleici, Maxam, Gilbert i Sanger, precum i cu identificarea genelor mozaicate de la organismele eucariote. Perioda urmtoare a geneticii moleculare este cea a anilor 1980 1985, cnd au fost obinute primele organisme transgenice, organisme obinute prin introducerea

de gene heterologe (gene obinute de la alte organisme) n embrioni timpurii aflai n stare de blastul. Etapa urmtoare corespunde anului 1975, an n care Kary Mullis a pus la punct tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction) de amplificare enzimatic in vitro a unei secvene de ADN, tehnic esenial n studierea i secvenierea genelor pentru c permite obinerea unui numr mare de copii dintr-o anumit secevn de nucleotide ntr-un timp foarte scurt. n anul 1996, cercettorii de la Institutul Roslin din Edinburg, Marea Britanie au reuit clonarea unui organism mamalian pornind de la celule somatice adulte. De atunci i pn n prezent s-a mai reuit clonarea unor diverse specii de mamifere.

1.2 Legile Mendeliene ale ereditii

La mijlocul secolului XIX Gregor Johann Mendel a efectuat o serie de experimente pe plante de mazre, n grdina mnstirii din Brno. El a ales mazrea de grdin (Pisum sativum), n primul rnd pentru c aceast plant se poate i autofertiliza datorit faptului c pe o aceeai tulpin exist i flori femele i flori mascule.

Figura 1.1 Cele apte caractere fenotipice analizate de Gregor Mendel la Pisum sativum (dup Singer, 1978 )

Mendel a ncruciat diverse soiuri de mazre, urmrind n descenden apte caractere (Figura 1), dintre care cele mai cunoscute sunt forma i, respectiv, culoarea bobului. Pentru fiecare din cele dou caractere, Mendel a constatat c pot exista dou variante: Caracter forma bobului culoarea bobului Variante neted zbrcit galben verde

n cursul ncrucirilor pe care le-a realizat, Mendel a notat: P sau F0 generaia parental, pur din punct de vedere genetic F1 prima generaie, obinut din ncruciarea dintre 2 linii parentale pure F2 a doua generaie, obinut prin autofecundarea indivizilor din prima generaie 3

1.2.1 Noiuni de baz n genetica clasic Din experimentele efectuate de Gregor Mendel, au reieit urmtoarele noiuni ce sunt n bun parte valabile i astzi : gene alele (denumite de Mendel factori ereditari) sunt variante ale unei gene, variante ce codific pentru un acelai caracter i care sunt localizate n loci omologi ntr-un organism diploid, un caracter este determinat de o pereche de gene alele; acestea pot s fie identice una cu cealalt, caz n care organismul poart denumirea de homozigot pentru acea gen, sau pot sa fie diferite una de cealalt, caz n care organismul se numete heterozigot ntr-o pereche de gene alele prezente ntr-un organism, de cele mai multe ori, nu se exprim ambele gene, ci doar una dintre ele; gena care se exprim este denumit ca fiind dominant fa de cealalt, care este denumit recesiv ca urmare, organismele heterozigote prezint acelai fenotip cu organismele homozigote dominante perechile de gene alele prezente ntr-un organism se despart in interiorul gameilor, acetia avnd doar cte una din gene din fiecare pereche loci omologi reprezint locaii situate la acelai nivel pe cromozomi omologi, locaii n care se gsesc gene alele linie pur din punct de vedere genetic care este homozigot pentru o serie de caractere genotipul reprezint totalitatea genelor deinute de un organism fenotipul reprezint totalitatea caracterelor artate (prezentate) de un organism
Mendel a mai notat : A - gen dominant a gen recesiv AA organism cu genotip homozigot dominant; un asemenea organism exprim fenotipul genei A aa - organism cu genotip homozigot recesiv; un asemenea organism exprim fenotipul genei a Aa organism cu genotip heterozigot; un asemenea organism exprim fenotipul genei A

1.2.2 Prima lege a ereditii Legile mendeliene descriu transmiterea caracterelor prin intermediul factorilor ereditari. Prima lege a lui Mendel este intitulat Legea puritii gameilor i statueaz faptul c gameii sunt puri din punct de vedere genetic, adic nu conin dect unul din cei 2 factori ereditari pereche. Aceast lege mai este denumit i monohibridism, ntru-ct descrie ncruciarea ntre organisme ce difer ntre ele doar printr-un singur caracter, situaie n care descendena este uniform fenotipic i se aseamn cu unul din parentali. Pentru evidenierea acestei legi, Mendel a ncruciat 2 linii pure de mazre: una cu bob neted (pe care a notat-o AA) i una cu bob zbrcit (aa). Dac se ncrucieaz 2 organisme homozigote pentru un caracter (AA x aa), organisme ce difer ntre ele printr-un singur caracter, n prima generaie (F1) rezult numai organisme care din punct de vedere gentipic sunt heterozigote, iar din punct 4

de vedere fenotipic prezint fenotipul genei dominante (n cazul de fa A adic bob neted. Prin autofertilizarea organismelor obinute n aceast prim generaie, se obin n generaia a doua (F2) organisme ce difer ntre ele att genotipic ct i fenotipic: - homozigote dominante (AA) - homozigote recesive (aa) - heterozigote (Aa) n urma interprettilor statistice, s-a constatat c genotipurile i fenotipurile segreg dup anumite reguli statistice: - cele 3 genotipuri posibile respec anumite proporii: 1AA : 2Aa : 1aa; - cele 2 fenotipuri posibile respect anumite proporii: 3 fenotipul genei dominante : 1 fenotipul genei recesive (Figurile 1.2 i 1.3).

Figura 1.2 Prezentarea schematizat a monohibridrii prin ncruciarea la Pisum sativum ntre plante cu bob galben (caracter dominant codificat de gena A) i plante cu bob verde (caracter recesiv codificat de gena a).

Figura 1.3 Schema segregrii genotipice i fenotipice, de la generaia parental pn la generaia a treia, n cazul unei singure perechi de caractere.

1.2.3 A doua lege a lui Mendel A doua lege a lui Mendel se mai numete i dihibridism i presupune ncruciarea a 2 organisme ce difer ntre ele doar prin 2 caractere. Aceast lege mai poart numele i de Legea segregrii independente a caracterelor i statueaz faptul c fiecare pereche de caractere se transmite la descendeni n mod independent de alte perechi de caractere. n experimentele sale Mendel a luat n studiu plante de mazre cu bob neted i galben (caractere dominante) i plante cu bob zbrcit i verde (caractere recesive). n prima generaie (F1) s-au obinut plante hibride care fenotipic exprimau caracterele dominante (bob neted i galben). n urma autofertilizrii plantelor din prima generaie, n a doua generaie s-a obinut o segregare fenotipic de 9:3:3:1 (tabelul din figura 1.4).

Figura 1.4 Reprezentarea schematizat a segregrii caracterelor n a doua generaie (F2) prin dihibridism.
gamei femeli gamei masculi

AB AABB AABb AaBB AaBb

Ab AABb AAbb AaBb Aabb

aB AaBB AaBb aaBB aaBb

ab AaBb Aabb aaBb aabb

AB Ab aB ab

1.2.4 A treia lege a lui Mendel Cea de a treia lege a lui Mendel este cunoscut i sub denumirea de Legea reasocierii independente. Aceast lege are, de fapt, ca suport citologic, procesul de recombinare independent a perechilor de cromozomi omologi n timpul meiozei proces cunoscut i sub denumirea de recombinare genetic intercromozomial.

1.2.5 Variaii de la modelul de dominan recesivitate Au fost identificate o serie de abateri de la legile mendeliene, ce prezint un pattern de segregare difeirt de cele amintite mai sus. a) Un exemplu este dominana incomplet, caz n care hibrizii nu prezint fenotipul dominant, ci un fenotip intermediar. Astfel, la planta barba-mpratului (Mirabilis jalapa), hibrizii nu prezint culoarea roie caracaterstic caracterului dominant, ci culoarea roz intermediar. n acest caz, raportul de segregare fenotipic nu este 3:1 ci 1:2:1 (Figura 1.5).

Figura 1.5 Prezentarea schematizat a monohibridrii prin ncruciarea la Mirabilis jalapa ntre plante cu flori roii (caracter dominant codificat de gena A) i plante cu flori albe (caracter recesiv codificat de gena a).

b) O alt abatere este codominana, care este cel mai evident n cazul grupelor de snge de la om din sistemul ABO. Sistemul ABO presupune existena unor anticorpi fa de polizaharidele celulare A sau B. Un anticorp este o protein ce are capacitatea de a lega un antigen (molecul strin de corp) i a o inactiva. Inactivarea este nsoit de formarea unui precipitat. Sngele de tip A conine hematii pe a cror suprafa se gsesc antigene de tip A, iar n plasm conine anticorpi anti-B. Sngele de tip B conine hematii pe a cror suprafa se gsesc antigene B, iar n plasm conine anticorpi anti-A. In cazul grupei sanguine AB, hematiile conin pe suprafaa lor ambele antigene, manifestndu-se astfel fenomenul de codominan. Totodat, n plasm nu exist nici un fel de anticorpi. n cazul grupei 0, nu exist antigene pe suprafaa hematiilor, dar n plasm exist ambii anticorpi. In final, s-a stabilit c sistemul cuprinde 3 gene, LA, LB i l. Genele LA i LB sunt codominante una fa de cealalt i fiecare dintre ele este dominant fa de gena l (tabelul din figura 1.6).
Figura 1.6 Genotipurile posibile la grupele de snge n sistemul AB0.

Fenotip (Grupa de snge) A B AB 0

Genotip posibil LALA sau LAl LBLB sau LBl LALB ll

Antigenele AB0 de pe suprafaa hematiilor sunt glicoproteine ce se formeaz de la un precursor poplipeptidic la care se adaug, n funcie de grupa sanguin, diverse lanuri polizaharidice. Glicozilarea este realizat de o enzim diferit la grupele La i Lb. n cazul grupei 0, alela recesiv l codific pentru o enzim inactiv care determin ca antigenul s fie format din miezul polpipeptidic i fucoz. Pentru 7

grupa A transferaza A catalizeaz legarea la fucoz a N-acetil-glucozaminei, iar pentru grupa galactoza.

1.2.6 Serii polialelice Cercetri ulterioare experimentelor lui Mendel au artat c dei la nivelul unui singur individ exist o singur pereche de loci omologi i, ca atare, o singur pereche de gene alele, la nivelul unei populaii de indivizi pot exista mai multe gene alele, ce constituie o serie polialelic. Simplificat, genele dintr-o serie polialelic pot fi notate astfel: a1, a2, a3, a4, a5, ......, an. Un individ conine doar 2 gene din seria polialelic, de exemplu: a1/a3 sau a1/a5 sau a2/a2 sau a4/a4 etc. Astfel, unii indivizi sunt homozigoi pentru o anumit gen (a1/a1; a2/a2 etc), iar alii sunt heterozigoi (a1/a2 sau a2/a3 etc). Noiunea de dominan/recesivitate a fost redefinit ca relaia dintre 2 gene alele prezente n acelai individ. Astfel, este posibil ca gena a1 s fie dominant fa de gena a2 i, ca urmare, heterozigotul a1/a2 s prezinte fenotip a1. Pe de alt parte ns, este posibil ca aceeai gen a1 s fie recesiv fa de a3 i, deci, heterozigotul a1/a3 s aib fenotip a3. Cu alte cuvinte, n multe serii polialelice nici una dintre gene nu este dominant fa de toate celelalte. 1.2.7 Caractere poligenice Cercetrile au continuat i au evideniat faptul c unele caractere sunt influenate de mai multe gene ne-alele. Cu alte cuvinte, exist caractere ce sunt determinate de combinaii de gene de tipul [a2/a5; b3/b4], fiecare din cele dou perechi de gene alele aparinnd la serii polialelice diferite: a1, ...., an i b1, ...., bn. Fenomenul poart numele de poligenie, iar caracterul respectiv este determinat poligenic.

1.3 Teoria cromozomial a ereditii

Geneticianul american Thomas Hunt Morgan i echipa sa au elaborat ntre 1911 i 1919 Teoria cromozomial a ereditii, teorie ce se bazeaz pe comportamentul cromozomilor n mitoz i meioz. Pentru toate contribuiile sale n domeniul geneticii, Morgan a primit n 1933 Premiul Nobel.
Figura 1.7 Musculi-de-oet depunnd un ou (dup Encarta Encyclopedia, 2004).

Thomas Hunt Morgan Biologul i geneticianul american Thomas Hunt Morgan s-a nscut n 1866 n Lexington, Kentucky, USA. Morgan a studiat embriologia la Universitatea Johns Hopkins unde i -a luat i doctoratul n 1891. ntre 1904 i 1928 a fost profesor de zoologie experimental la Universitatea Columbia. La nceput a criticat teoriile lui Mendel, dup care a realizat serii ntregi de experimente i analize citologice pe musculia-de-oet. Astfel, Morgan i studenii si A.H. Sturtevant, C. Blackman Bridges i H.J. Muller au artat faptul c cromozomii se comport foarte asemntor cu factorii ereditari ai lui Mendel. Morgan i colaboratorii si au publicat dou lucrri importante - The Mechanism of Mendelian Heredity (Mecanismul Ereditii Mendeliene, 1915) i Theory of the Gene (Teoria Genei , 1926) care au influenat major etapele urmtoare n dezvoltarea geneticii moderne. n 1933 Thomas Morgan a primit Premiul Nobel pentru fiziologie i medicin.

1.3.1 Musculia-de-oet Musculia-de-oet (Figura 1.7), cu denumirea tiinific de Drosophila melanogaster, din punct de vedere tiinific face parte din Ordinul Diptera, Familia Drosophilidae. Este cunoscut oamenilor pentru c apare la oet (de unde i denumirea) sau la fructe fermentate. Adulii au dimensiuni mici (3-4 mm), cu corp maron sau negru, cu ochi de obicei de culoare roie. Grupuri ntregi de cercettori (dintre care cel mai cunoscut a fost grupul condus de Thomas Morgan) au ales musculia-de-oet pentru cercetri citologice i genetice din urmtoarele motive: se cresc foarte uor i ieftin, pe medii de cultur cu compoziie simpl (ap, zahr, agar-agar, drojdie-de-bere) au un ciclu de via foarte scurt, de numai 10 12 zile la temperatura de 24oC; ca urmare, o nou generaie poate fi obinut n aproximativ o stmn; Drosophila este un dipter cu morfogenez complet, adic traverseaz toate cele 3 stadii larvare:

adult

ou

larv I

larv II

larv III

pup

adult

sunt foarte prolifice: un cuplu poate produce pnp la 500 de descendeni aceast specie prezint o variabilitate genetic foarte mare, chiar n populaii naturale fiind prezente un numr mare de mutaii are o garnitur cromozomial simpl, format doar din 8 cromozomi, grupai n 4 perechi (Figura 1.8):

perechea I sunt heterozomi, XX la femel i XY la mascul perechea II sunt autozomi, metacentrici perechea III sunt autozomi, submetacentrici perechea IV sunt autozomi, subtelocentrici

Figura 1.8 Cromozomii la muscula-de-oet.

1.3.2 Tezele teoriei cromozomiale a ereditii Prima tez a teoriei cromozomiale a ereditii statueaz faptul c genele sunt plasate linear n cromozomi, fiecare gen ocupnd o anumit poziie denumit locus (cu pluralul loci). A doua tez a teoriei cromozomiale statueaz faptul c genele plasate pe acelai cromozom se transmit nlnuit (mpreun, n bloc) la descendeni. Morgan a denumit acest fenomen linkage i, deci, genele de pe acelai cromzom se transmit linkat. La baza fenomenului de linkage st faptul c n timpul diviziunii celulare (fie mitoz, fie meioz) cromozomii se comport ca entiti de sine stttoare; n transmiterea lor de la celula parental la celulele fiice, cromzomii i pstreaz individualitatea i integritatea structural. Astfel, genele plasate pe acelai cromozom se transmit n bloc la celulele fiice, n contrast cu genele plasate pe cromozomi diferii. A treia tez a teoriei cromozomiale s-a bazat pe observaia comportamentului cromozomilor n timpul meiozei. Astfel, n decursul profazei I a meiozei cromozomii omologi se apropie foarte mult unul de altul realiznd aa-numita sinaps cromozomial. Mai mult chiar, ntr-o asemenea structur (denumit bivalent), cromozomii omologi schimb ntre ei fragmente cromatidice echivalente. Fenomenul a fost denumit crossing-over (mai este numit i recombinare genetic intracromozomial) i are efect invers fa de linkage producnd netransmiterea nlnuit a anumitor gene plasate pe acelai cromozom. Cercetri ulterioare au concluzionat c fenomenul de crossing-over reprezint unul dintre cele mai importante mecanisme de variabilitate genetic la organisme eucariote, deci la organisme ce prezint sexualitate. Pe de alt parte, frecvena evenimentelor de crossing-over este direct proporional cu lungimea cromozomului; cu alte cuvinte, probabilitatea ca 2 gene plasate pe acelai cromozom s nu se transmit nlnuit crete cu distana dintre ele. Faptul c genele sunt plasate pe cromozom a fost de Morgan nc din 1910 prin studii pe Drosophila melanogaster, care a constatat c n populaiile de tip slbatic (cu ochi roii) apreau frecvent masculi cu ochi albi. Gena pentru culoarea ochilor (w+) este plasat pe cromozomul X, iar gena pentru ochi albi este recesiv (w). La musculia de oet, sexele sunt determinate cromozomial, pe un model cu femele XX i masculi XY. Ca urmare, o mutaie la nivelul acestor gene localizate pe cromozomul X se exprim ca i cum organismul ar fi haploid. Genele plasate pe cromozomul X i care, deci, se transmit o dat cu acesta, sunt X-linkate (fenomenul de X-linkage). 1.3.3 Determinismul cromozomial al sexelor La organismele eucariote dezvoltate grupurile de gene de control al dezvoltrii sexuale se gsesc grupate pe anumii cromozomi ce au fost denumii cromozomi de sex sau heterozomi. n marea majoritate a cazurilor, aceti cromozomi au fost notai cu literele X i, respectiv, Y. Ceilali cromozomi din garnitur au fost denumii autozomi (notai cu litera A). La Drosophila, dar i la mamifere (inclusiv la om), femela reprezint sexul homogametic avnd, pe lng autozomi, doi heterozomi e acelai fel, notai XX. Garnitura cromozomial a unei femele poate fi scris astfel: 2A + XX. Denumirea de 10

sex homogametic se datoreaz faptului c, prin meioz, femela formeaz gamei ce pot conine doar un singur tip de heterozomi, respectiv tipul X. Masculul este sexul heterogametic i conine ca heterozomi cte un cromozom din fiecare tip. Garnitura sa este: 2A + XY. Din punct de vedere al heterozomilor, masculul formeaz dou tipuri de gamei: unii conin cromozomul X, alii Y. Datorit faptului c acest tip de determinism cromozomial al sexelor a fost descris prima oar la musculia-de-oet, a fost denumit determinism tip Drosophila (Figura 1.9).

Figura 1.9 Reprezentarea schematizat al tipului Drosophila de determinism cromozomial al sexelor.

n afar de diptere i de mamifere, acest tip de determinism a mai fost identificat i la o serie de specii de plante. Alte cercetri au evideniat, n cadrul dipterelor, existena unui subtip, denumit subtipul Protenor (greier-de-cmp) de la numele speciei la care a fost descris prima oar. n acest caz, femela are tot 2 cromozomi de sex similari (notai tot XX) i este sexul homogametic. Masculul ns nu are 2 heterozomi (XY), ci doar unul singur (X) i este sexul heterogametic. Pe de alt parte ns, n ansambu, masculul are un cromozom mai puin dect femela. Exist i specii la care masculul este sexul homogametic (2A + XX), iar femela este sexul heterogametic (2A + XY - tipul Abraxas sau pasre sau 2A + X0 - subtipul fluture).

1.4 Definirea genei

Gena este unitatea fundamental a ereditii reprezentnd un segment de ADN. Funcia genelor a fost stabilit dup 1945, cnd a fost iniiat ipoteza c o gen codific pentru o anumit enzim, fiecare etap catabolic fiind catalizat de o anumit enzim codificat de o anumit gen. n consecin, o mutaie la nivelul unei gene blocheaz activitatea enzimei i, implicit, calea metabolic corespunztoare. Ulterior s-a stabilit c, de fapt, o protein poate fi format din mai multe polipeptide ptide i, deci, o gena codific pentru un lan polipeptidic. Faptul c o gen codific o anumit polipeptid a fost demonstrat de diverse date experimentale, dintre care

11

amintim cele ale lui Beadle i Efphrussi 1950, care au demonstrat c producerea pigmentaiei de tip slbatic (crmiziu) la drosofile se realizeaz n mai multe etape. Blocajul ]n diverse etape apariia unor mutante cu culori diferite ale ochilor. Pentru formarea pigmentului de tip slbatic, triptofanul este convertit n pigmentul xantomatin (pigment maro) ntr-o serie de reacii : Concepia clasic despre gen considera c gena este indivizibil i c determin un anumit fenotip, fiind cea mai mic unitaie de mutaie i recombinare. n concepia modern, gena este divizibil, cea mai mic unitate de mutaie i recombinare fiind perechea de nucleotide, denumit muton i, respectiv, recon. Pentru stabilirea structurii fine a genei s-au realizat iniial experimente pe bacteriofagul T4 de ctre Seymour Benzer (1955-1962). Bentzer a adaptat la fagul T4 testul de complementaie, utilizat anterior la organismele superioare. Complementaia genetic reprezint interaciunea dintre 2 seturi de gene care permite celulei sau virusului s manifeste o anumit funcie dei foecare set de gene poart o mutaie la nivelul unei gene eseniale. Testul de complementaie (testul cis-trans, test de alelism) stabilete dac 2 mutaii aparin la 2 gene diferite sau sunt intragenice. Gena n testul cis-trans poart numele de cistron, acesta fiind o unitate de funcie, o regiune cromozomal ce codific un produs celular specific i este format dintr-o multitudine de locusuri potenial mutabile, ntre care se poate realiza recombinare genetic.

Triptofan Blocaj vermillon (rou foarte aprins) Formilkinurenin Blocaj cinnabar (rou aprins)

Hidroxinurenin

Xantomatin (maro)

12

CAP. 2 STRUCTURA ACIZILOR NUCLEICI

__________________________________________________________ 2.1 Introducere
Trsturile (caracterele) ereditare se caracterizeaz prin capacitatea de a se transmite de la o generaie la cealalt. Caracterele ereditare sunt determinate de factorii genetici, iar totalitatea acestora alctuiesc genotipul unui organism. n timpul vieii oricrui organism genotipul acestuia funcioneaz (adic se exprim), iar din interaciunea genotipului cu mediul rezult manifestarea vizibil, denumit fenotip. Toate funciile unui organism, fie el unicelular, fie pluricelular, sunt ndeplinite cu ajutorul materialului genetic. Genetica este tiina care studiaz caracterele ereditare ale organismelor, structura i funcionarea acestora, modul n care se transmit la descendeni. Datorit dezvoltrii tehnicilor de studiu n ultimii douzeci de ani, n prezent genetica este reprezentat de un complex ntreg de tiine, de la citogenetic clasic, pn la inginerie genetic. Setul complet de informaie genetic dintr-un organism poart numele de genom. Cercetrile desfurate pe ntindere de aproape un secol au demonstrat c toate organismele descrise pe Terra pn n prezent au genom format din acizi nucleici. Mai mult dect att, la toate organismele, att cele procariote, ct i cele eucariote, au genomul format din ADN. Se poate deci spune c molecula ADN reprezint materialul genetic aproape universal pe Pmnt. O excepie notabil o reprezint anumite virusuri, la care materialul genetic este reprezentat de molecule ARN. Viaa - flux continuu de informaie Dintr-un anumit punct de vedere, viaa ar putea fi definit i ca un flux continuu de informaie. Astfel, materialul genetic conine informaie pentru : formarea tuturor structurilor unei celule pentru diferenierea unor diverse tipuri de celule i esuturi pentru desfurarea tuturor reaciilor biochimice i, n final, fiziologice multiplicarea celulelor i pentru nmulirea organismelor pentru moartea celular i chiar i pentru moartea unui organism ntreg

2.2 Structura primar a acizilor nucleici

Acizii nucleici reprezint molecule foarte complexe, produse att de organisme vii (celule), ct i de virusuri. Denumirea de acizi nucleici se datoreaz faptului c prima oar au fost izolate din nuclei de celule. Cercetri ulterioare au dovedit ns faptul c anumite tipuri de acizi nucleici nu se gsesc n nucleu, ci n citoplasm. n ansamblu, acizii nucleici ndeplinesc dou funcii biologice majore: - transmit informaia ereditar de la o generaie la alta - conin informaie pentru producerea de proteine specifice Exist dou categorii majore de acizi nucleici : acid deoxiribonucleic (pe scurt, ADN) i acid ribonucleic (pe scurt, ARN).

13

O molecula de acid nucleic este format din uniti de baz, numite nucleotide, legate ntre ele prin legturi chimice de tip covalent (legturi fosfodiesterice). Fiecare nucleotid este alctuit din 3 categorii de molecule, i ele legate ntre ele (Figurile 2.2 i 2.3) : baz azotat pentoz (un zahar format din 5 atomi de carbon) un rest de radical fosforic Att n structura ADN, ct i n ARN, exist 4 tipuri majore de baze azotate : adenin, timin, citozin, guanin - n ADN adenin, uracil, citozin, guanin - n ARN Adenina i guanina sunt baze azotate derivate din structura purinei i, ca atare, mai sunt numite i baze purinice (sau, simplu purine). Timina, citozina i uracilul sunt derivate din structura pirimidinei baze pirimidinice/pirimidine (Figura 2.2). n mod curent, cele 5 baze azotate se prescurteaz A, T, C, G i, respectiv, U. Pentoza este, fie riboz n ARN, fie deoxiriboz n ADN (Figura 2.4) Formarea nucleotidelor Baz azotat + pentoz = nucleosid de ex. A + pentoz = adenosina nucleosid + radical fosforic = nucleotid de ex. adenosin + radical fosforic = acid adenilic

Figura 2.1 Clasificarea nucleosidelor i a nucleotidelor.

Denumirea nucleosidelor i a nucleotidelor

Baze azotate Purine Adenin (A) Nucleoside n ARN n ADN Nucleosid mono-, di-, trifosfai (n ARN) Deoxinucleosid mono-, di-, trifosfai (n ADN) n ARN Nucleotide n ADN adenosina deoxiadenosin AMP, ADP, ATP Guanin (G) guanosin deoxiguanosin GMP, GDP, GTP Pirimidine Citozin (C) citidin deoxicitidina CMP, CDP, CTP Uracil (U) Timin (U) uridin deoxitimidin UMP, UDP, UTP

dAMP dADP dATP acid adenilic acid deoxiadenilic

dGMP dGDP dGTP acid guanosilic acid deoxiguanosilic

dCMP dCDP dCTP acid citidilic acid deoxicitidilic

dTMP dTDP dTTP acid uridilic acid deoxitimidilic

14

Figura 2.2 Toate nucleotidele au acelai plan general de structur. (a) Structura chimic a riboadenozin 5-monofosfatului (AMP), nucleotid prezent n moleculele ARN. (b) Structura chimic a celor 2 zaharuri prezente n moleculele de acizi nucleici: riboza n ARN i 2deoxiriboza n ADN.

Figura 2.3 Structura chimic a principalelor baze azotate din acizii nucleici. Azotul din poziia 9 (N9) al purinelor i azotul 1 (N1) al pirimidinelor se leag la carbonul din poziia 1 (C1) al unei molecule de riboz sau deoxiriboz.

15

2.3 Structura secundar a acizilor nucleici

Nucleotidele se leag ntre ele prin legturi fosfodiesterice ce se formeaz ntre o pentoz a unui nucleotid i radicalul fosforic al nucleotidului urmtor. Asemenea lanuri de nucleotide poart numele de catene polinucleotidice i reprezint structura primar a unui acid nucleic. Astfel de molecule sunt, deci, monocatenare (prescurtat m.c.) Mai toate tipurile de acizi ribonucleici (ARN) sunt formate dintr-o singur caten polinucleotidic, n timp ce majoritateta moleculelor de ADN sunt alctuite din dou catene polinucleotidice, avnd astfel i o structur secundar. Asemenea molecule sunt dublucatenare (prescurtat d.c.). Formarea unor molecule de acizi nucleici dublucatenare respect o serie de legi chimice, ce poart numele cercettorului care le-a descris prima oar Chargaff (vezi caseta cu Legile lui Chargaff). Legile lui Chargaff 1. cele 2 catene polinucleotidice sunt complementare una fa de cealalt
Aceasta nseamn c unei adenine de pe una din catene i corespunde o timin pe cealalt caten, de care se leag prin 2 legturi de hidrogen (A = T); se spune, deci, c adenina este complementar cu timina. n mod similar, guanina este complementar cu citozina, de care se leag prin 3 legturi de hidrogen (G C). Se deduce c legturile de hidrogen permise sunt: A = T i G C n moleculele de acizi nucleici dublucatenare dar formate dintr-o caten ADN i o caten ARN (asemenea molecule hibrid se formeaz de obicei n procesul de transcriere genetic), adeninelor din catena ADN le corespund n catena ARN molecule de uracil. i n acest caz se fromeaz tot 2 legturi de hidrogen: A = U.

2. ntr-o molecul de acid nucleic d.c. purinele sunt n raport echimolar cu pirimidinele
Aceast regul este, de fapt, o consecin a primei legi. Astfel, dac oricrei A de pe una din catene i corespunde o T pe cealalt caten i oricrei G i corespunde o C, atunci numrul moleculelor de adenin este egal cu numrul celor de timin, adic A = T i, respectiv, G = C De aici, prin adunarea celor dou ecuaii, se deduce: A + G = T + C Deci, numrul purinelor dintr-o molecul de acid nucleic d.c. este egal cu numrul pirimidinelor. Altfel spus, cele dou tipuri de molecule se afl n raport echimolar.

3. cele dou catene polinucleotidice dintr-o molecul de acid nucleic d.c. sunt antiparalele
O caten polinucleotidic are dou capete: la un capt se afl carbonul din poziia 5 (C5) al unei pentoze, iar la cellalt capt se afl carbonul din poziia 3 (C3) al unei alte pentoze. n interiorul unei celule o asemenea caten polinucleotidic este sintetizat chiar n aceast direcie: 5 3. Cele 2 catene polinucleotidice ale unei molecule d.c. sunt n orientri inverse una fa de cealalt: capul 5 al fiecreia corespunde cu capul 3 al celeilalte. Cele 2 catene sunt antiparalele.

16

Figura 2.4 Reprezentare schematic a unei poriuni dintr-o molecul de ADN

Figura 2.5 Dou reprezentri ale dublului helix ADN. (a) Dublu-helix ADN de form B. Scheletul glucido-fosforic (n gri i marcat cu linii roii) se afl la exteriorul helixului. Bazele azotate se afl la interior. Sunt marcate curbura major i cea minor a helixului. (b) Structura schematizat a unui ADN dublu-helix. Cele dou schelete glucido-fosforice (n verde nchis i deschis) sunt n orientare invers: 5 3, fa de 3 - 5. Bazele azotate de pe cele dou catene sunt prezentate n albastru i rou.

17

2.4 ADN - elicea vieii

Datorit formei spaiale a nucleotidelor cele 2 catene polinucleotidice dintr-o molecul d.c. se dispun spaial una fa de cealalt ntr-o form de elice (dublu helix), nvrtindu-se una n jurul celeilalte i amndou n jurul unui ax central. Aceast dispunere formeaz structura teriar a unei molecule de acid nucleic d.c. n arhitectura unei asemenea molecule, la exterior se gsec cele 2 schelete glucidofosforice ale catenelor, iar spre interior sunt bazele azotate. Perioada modern a biologiei moleculare a nceput n 1953, cnd James Watson, Francis Crick i Maurice Wilkins au propus modelul de structur dubluhelical a ADN. Toate cercetrile ulterioare au demonstrat corectitudinea acestui model (Figurile 2.4 i 2.5). Un dublu-helix de acid nucleic prezint o serie de parametri fizici, denumii parametri helicali (vezi caseta cu parametri helicali).

Parametri helicali n = numrul de nucleotide per tur de spir (de elice) h = distana dintre perechile de nucleotide adiacente P = pasul elicei i este dis tana traversat de-a lungul axei helixului de un tur complet de spir (adic de o rotaie de 360o). P poate fi exprimat n raport cu numrul de nucleotide dintr-un tur (n) i cu distana dintre 2 nucleotide n procesul de rotaie (h) t = unghiul de rsucire sau de rotaie a perechile de baze azotate; acestea nu sunt perfect perpendiculare pe axa helixului (sau, altfel spus, dou perechi de baze adiacente nu sunt coplanare), ci sunt nclinate cu un unghi de rsucire t care, de obicei, este 34,6o. Aceaste este de fapt cauza pentru care cele dou catene se rsucesc una n jurul celeilalte, formnd o structur de dublu-helix. Valorile acestori parametri pot varia ntre anumite limite i determin mai multe forme topologice ale moleculei de ADN d.c. Forma B reprezint conformaia cel mai des ntlnit n celule. Are un diametru de aproximativ 20 Angstrom (), iar distanele dintre perechile de baze este de aproximativ 3,4 . n aceast conformaie exist o medie de 10,4 baze azotate per tur de spir, iar unghiul de rotaie dintre 2 baze adiacente este de +34,6. Forma A se ntlnete n celule n regiunile dublucatenare ale moleculelor de ARN i n dublu-helixurile hibride ADN ARN ce se formeaz n procesele de transcriere genetic. Are un diametru de aproximativ 23 A, 11 baze per tur de spir i un unghi de +34,7. Forma Z este mai subire (un diametru de 18A), 12 baze per tur i un unghi de 30 ntre ele. Datorit acestui lucru, formele A i B sunt denumite de dreapta, iar forma Z este de stnga.

18

Figura 2.6 Reprezentarea schematic a celor 2 forme principale de ADN d.c.

Figura 2.7 Denaturarea i renaturarea moleculelor de ADN dublu-catenare.

Figura 2.8 Variaia absorbanei n denaturarea termic a ADN. (a) Denaturarea (topirea) moleculelor de ADN d.c. poate fi monitorizat prin variaia absorbanei n lumin ultraviolet 260 nm: pe msur ce ADN denatureaz, absorbana crete pn aproape de dublu. Temperatura la care jumtate din molecule sunt denaturate poart numele de temperatur de topire (Tm). (b) Valoarea Tm depinde de coninutul n guanin i citozin a moleculelor de ADN d.c.: cu ct procentul molar de guanin citozin (%molGC) este mai mare, cu att este mai mare i valoarea Tm.

Moleculele de ADN d.c. pot fi lineare sau circulare (Figurile 2.9 i 2.10). Astfel, cromozomii la organismele eucariote, dar i o serie de plasmide, sunt alctuite din molecule de ADN d.c. linear. Cromozomul bacterian, precum i o serie de plasmide bacteriene, sunt alctuite din molecule de ADN d.c. circular.

19

Figura 2.9 Molecul de ADN d.c. linear.

Figura 2.10 Molecul de ADN d.c. circular.

2.5 Acizii ribonucleici

Pe de o parte, acizii ribonucleici reprezint materialul genetic al anumitor tipuri de virusuri (numite virusuri ARN). Pe de alt parte, n celule, moleculele de ARN ndeplinesc diverse funcii metabolice, dintre care cele mai importante sunt legate de traducerea informaiei genetice din secven de nucleotide n secven de aminoacizi, adic n sinteza de proteine. Din punct de vedere chimic, exist trei diferene majore ntre acizii ribonucleici i ADN: - zaharul din ARN (riboza) conine o grupare hidroxil n plus fa de deoxiriboz (prezent n ADN); - n majoritatea moleculelor de ARN timina din ADN este nlocuit cu uracil; - n cele mai multe cazuri, moleculele de ARN sunt formate dintr-o singur caten polinucleotidic, spre deosebire de majoritatea moleculelor de ADN, care sunt dublu-catenare; chiar i moleculele de ARN monocatenare pot forma structuri secundare i teriare (Figura 2.11); - unele molecule de ARN (n mod special, ARNt) mai conin i o serie de baze azotate modificate, de exemplu pseudouridina, dihidrouridina, riboziltimina, inozina. Cele mai importante tipuri de acizi ribonucleici dintr-o celul sunt ARN mesager, ARN de transfer i ARN ribozomal.

ARN mesager (ARNm)

este o molecul intermediar ce reprezint o copie a uneia din cele 2 catene ale unei gene ce codifica pentru o protein

ARN de transfer (ARNt)

este un intermediar n sinteza proteic; fiecare molecul de ARNt are o zon de 3 nucleotide numit anticodon, iar pe de alt parte, la unul din capete se leag de un anumit aminoacid

ARN ribozomal (ARNr)

este un component major al ribozomilor, intervenind tot n sinteza de proteine

Toate moleculele de ARN dintr-o celul iau natere printr-un proces numit transcriere genetic.

20

Molecula rezultat poart numele de transcript primar i este ulterior procesat, n funcie de gena care a fost transcris, pentru a deveni ARNm, ARNt sau ARNr.

Moleculele de ARN au un rol central n exprimarea genelor. Iniial, aceste molecule au fost descrise ca intermediar n sinteza proteic; ulterior ns, s-a constatat c exist multe clase de ARN ce ndeplinesc roluri complexe n diverse etape ale exprimrii genelor. Implicarea moleculelor de ARN n foarte multe funcii celulare i, n mod special n expresia genic, reprezint unul din argumentele majore n sprijinul teoriei conform creia, n fazele iniiale ale apariiei i evoluiei sistemelor biologice, ARN ar fi reprezentat componenta activ n meninerea i expresia informaiei genetice, i nu moleculele de ADN, care probabil au aprut mult mai trziu; se vorbete deci, de o aa-zis lume ARN.

21

CAP. 3 CROMOZOMUL LA ORGANISME PRO- SI EUCARIOTE

__________________________________________________________ 3.1 Cromozomul bacterian
3.1.1 Dimensiune Imensa majoritate a bacteriilor dein ca material genetic esenial o molecul ADN dublu catenar circular covalent nchis, suprarsucit negativ i mpachetat. Dei complexarea cu proteine i mpachetarea nu este identic cu cea din cromozomii de tip eucariot, totui aceast molecul este denumit tot cromozom sau nucleoid. Cromozomul bacterian este ataat la membrana plasmatic a celulei bacteriene n aproximativ 20 de puncte, dar o funcie deosebit o are punctul de ataare de lng regiunea de origine a replicrii acestei molecule de ADN (ori C). Cei mai mici cromozomi de tip procariot msoar mai puin de 1 Mpb i se ntlnesc mai ales la bacteriile fr perete celular (bacteriile din genurile Mycoplasma, Ureaplasma au cromosomi cu dimensiuni cuprinse ntre 600 i 800 kpb). La cealalt extrem se afl bacteriile din genurile Myxococcus i Calothrix, care au cromozomi foarte mari (aproximativ 12-13000 kpb). Escherichia coli are un cromozom de dimensiune intermediar: 4700 kpb.

Figura 3.1 Modelul Pettijohn de structur a nucleoidului din bacteria Escherichia coli. ntre 40 i 50 de bucle suprarsucite radiaz dintr-un miez proteic (dup Brown, 2002).

3.1.2 Modelul Pettijohn n general, molecula ADN ce formeaz cromozomul bacterian este de aproximativ 1000 de ori mai lung dect celula bacterian. Aceast molecul este complexat cu proteine, suprarasucit i mpachetat formnd o structur conform cu modelul elaborat de Pettijohn n 1974 (Figura 3.1). Conform acestui model, prin asocierea ADN cu proteine i cu ARN (de regul, ARN nascent) se formeaz aproximativ 50 de domenii topologice, semi-independente (denumite i bucle), per 22

genom de E.coli. Fiecare domeniu (bucl) este suprarsucit separat de celelalte domenii i poate fi relaxat independent de celelalte prin introducerea unei rupturi monocatenare. Gradul de suprarsucire negativ este dat de balana dintre activitatea a doua enzime - ADN giraza i ADN topoizomeraza I amndou reglnd densitatea helical a moleculelor de ADN. ADN giraza crete numrul de spire per kilopereche de baze azotate (suprarsucete molecula de ADN), iar ADN topoizomeraza I scade numrul de spire. 3.1.3 Configuraii ADN n cromozomul bacterian Principalul tip de structur secundar a ADN ce formeaz cromozomul bacterian este forma B de dreapta, dar aceast configuraie nu se gsete uniform de-a lungul ntregului cromosom bacterian. Alte configuraii, prezente pe distane scurte, sunt ADN-Z (n dublu helix de stnga), structuri cruciforme (n regiunile cu secvene invers repetate) i regiuni triplu-catenare (n zone extrem de bogate n purine sau pirimidine). Este de reamintit faptul c, n general, expresia genic este afectat nu numai de secvena primar a ADN (succesiunea de nucleotide), ci i de structura secundar i teriar a acestuia. 3.1.4 Compoziia n nucleotide n majoritatea cazurilor, compoziia global n nucleotide a unei molecule de ADN se exprim prin procentul molar de guanin + citozin (%mol GC), restul pn la 100% fiind, evident, reprezentat de adenin + timin (datorit criteriului de complementaritate ntre cele dou catene ADN, respectiv ntre bazele purinice i cele pirimidinice). Compoziia n nucleotide a cromozomului bacterian variaz n limite foarte largi: 25 %mol GC la Mycoplasma capricolum i 75 %mol GC la Micrococcus luteus. Procentul molar de guanin citozin n cromozomul bacterian
Procentul molar de guanin + citozin este corelat i cu compoziia n codoni a genomului. Aceasta variaz n sensul preferinei pentru 1-2 codoni dintrun grup de codoni sinonimi. Se constat astfel c la Mycoplasma capricolum este favorizat prezenta A/T n poziia 3-a a codonilor sinonimi. S-a mai constatat c n cromosomul bacterian exist i o serie de gene a cror activitate poate afecta compoziia total n nucleotide a unei molecule de ADN. Astfel, la E.coli au fost descrise dou gene (mut T i mut Y) care afecteaz frecvena transversiilor A-T / C-G i, respectiv, C-G / A-T. Echilibrul ntre exprimarea acestor dou gene afecteaz compoziia global n nucleotide a moleculei de ADN ce reprezint cromosomul de E.coli. O alt problem o reprezint contextul de citire a unui anumit codon, n spe, configuraia codonilor adiaceni. Numrul teoretic posibil de codoni (sens) adiaceni este foarte mare (612 = 3721), dar, examinnd 237 de gene de la E.coli s-a constatat c perechile de codoni adiaceni nu sunt distribuite randomizat, ci anumite perechi de codoni sunt mai abundente dect altele. S-a dedus astfel c, compoziia n nucleotide a unui codon este corelat i cu compoziia codonilor adiaceni, corelat probabil cu procesele de ataare la situsurile A (Aminoacil) i P (Peptidil) ale ribozomilor. Se pare deci, c aparatul de traducere a informaiei genetice ar fi putut s determine evoluia unor anumite trsturi ale matriei genetice.

23

Figura 3.2 Organizarea genomului la cteva specii de procariote. Denumirea speciei Escherichia coli K-12 Vibrio cholerae El Molecule ADN 1 molecul circular 2 molecule circulare 1 cromozom 1 megaplasmid 4 molecule circulare Cromozom 1 Cromozom 2 Megaplasmid Plasmid 7 8 molecule circulare 11 molecule lineare Cromozom linear Plasmid circular cp9 Plasmid circular cp26 Plasmid circular cp32 Plasmid linear lp17 Plasmid linear lp25 Plasmid linear lp28-1 Plasmid linear lp28-2 Plasmid linear lp28-3 Plasmid linear lp28-4 Plasmid linear lp36 Plasmid linear lp38 Plasmid linear lp54 Plasmid linear lp56 0.911 0.009 0.026 0.032 0.017 0.024 0.027 0.030 0.029 0.027 0.037 0.039 0.054 0.056 853 12 29 necunoscut 25 32 32 34 41 43 54 52 76 necunoscut Dimensiune (Mb) Numrul de gene 4.639 4397 2.961 1.073 2.649 0.412 0.177 0.046 2770 1115 2633 369 145 40

Deinococcus radiodurans R1

Borrelia burgdorferi B31

3.2 Structura cromozomului la eucariote

Materialul genetic este reprezentat dintr-un genom nuclear i un genom extranuclear (reprezentat din genomul mitocondrial i, n cazul celulelor vegetale, i din genom cloroplastic). Genomul nuclear cuprinde un set de molecule lineare de ADN, fiecare reprezentnd un cromozom. Fr excepie, toate eucariotele au cel puin 2 cromozomi care ntotdeauna sunt lineari. Singura variaie care se nregistreaz este cea referitoare la numrul de cromozomi, care ns nu este corelat cu caracteristicile biologice sau cu poziia evolutiv a organismului respectiv. Astfel, la Saccharomyces cerevisiae (drojdia de bere - un eucariot unicelular, inferior) numrul haploid de cromozomi este 16, de 4 ori mai mare dect la musc (Musca domestica). De asemenea, numrul de cromozomi nu este corelat nici cu dimensiunea

24

genomului; de exemplu, la salamandr genomul este de 30 ori mai mare dect la om, dar are jumtate din numrul haploid de cromozomi de la om. Cromozomii eucarioi sunt separai de citoplasm prin membrana nuclear i, ca urmare, transcrierea i traducerea sunt separate n timp i spaiu una de cealalt; n contrast, la procariote, cele dou procese se de sfoar aproximativ simultan. Nucleul este format din 4 componente: nucleolem, carioplasm, cromonemata (singular, cromonema) i nucleol. Cromonemata este o substan cromatic despiralizat n interfaz i condensat n mitoz. Din aceast substan se difereniaz cromozomii. Nucleolul este o substructur nuclear cu rol n biogeneza ribozomilor. n aceast zon a nucleului are loc sinteza de ARN ribozomal prin transcrierea genelor corespunztoare. La eucariote ADN este complexat cu o clas de proteine specializate, cu caracter bazic, denumite histone. Acest complexpoart numele de cromatin (denumirea are la baz tinctorialitatea fa decolorani bazici).

Cromatina se prezint sub 2 stri: eucromatina cromatin decondensat n interfaz i condesat n timpul diviziunii celulare se replic la nceputul fazei S a interfazei heterocromatina condensat permanent i se replic la sfritul fazei S.

Heterocromatina se clasific n: - heterocromatin constitutiv este caracteristic zonelor centromerice i telomerice - heterocromatin facultativ - este caracteristic unuia din cromozomii X la femelele de mamifer i constituie cromatina sexual; apare datorit necesitii compensaiei de doz a genelor eseniale prezente pe cromozomul X - heterocromatin de citodifereniere apare prin inactivarea selectiv a unor gene n timpul proceselor de citodifereniere Eucromatina este caracteristic genelor active transcripional, n timp ce heterocromatina are rol preponderent reglator i structural. 3.2.1 Clase de secvene ADN la eucariote 1. secvene unice, o copie per genom haploid, corespunztoare genelor codificatoare pentru lanuri polipeptidice, excepie fcnd genele ce codific histone, care se gsesc n ctevasute de copii per genom haploid (este necesar o sintez rapid ntr-un timp scurt corespunzzoare perioadei S de replicare a ADN). 2. secvene moderat repetitive: sunt intr-un numr de 102 103 copii per genom haploid i codific pentru ARN ribozomal, ARN de transfer i pentru histone. 3. secvene nalt repetitive: ajung pn la 106 copii per genom haploid n general, eucariotele conin mult mai mult ADN dect procariotele. O celul de om conine de peste 1000 de ori mai mult ADN dect o celul de Escherichia coli. Astfel, ADN-ul dintr-o celul de om, aflat n stare decondensat atinge o lungime de 25

4 cm i nu poate ncpea ntr-un nucleu (de diametru 5 m) dect n form condensat. Forma cromozomilor dintr-o celul eucariot se modific n timpul ciclului celular.

3.2.2 Proteinele cromozomale Principalele proteine ce complexeaz ADN-ul au greutate molecular mic, o cantitate mare de aminoacizi cu caracter bazic i se numesc histone. Au fost descrise 5 clase de histone: H1 H2A, H2B, H3 i H4. Histona H1 este alctuit din 3 domenii structurale distincte: - un capt amino-terminal cu 39 aminoacizi bazici - o regiune globular central cu un diametru de 2,8 nm, cu aminoacizi cu caracter acid; interacioneaz cu alte proteinexi-terminal ce conine 40% lizin (cu puternic caracter bazic) i are afinitate de interaciune cu molecula de ADN. Histonele H2A i H2B au cantitate mai redus de lizin. H2A are leucin, iar H2B are serin i prolin. Au doar 2 domenii, dintre care unul interacioneaz cu ADN. Histonele H3 i H4 sunt bogate n arginin i, n mod similar cu H2A i H2B, au tot doar 2 domenii funcionale. n general, histonele prezint o structur nalt conservat n lumea vie. Cea mai heterogen este histona H1, acest parametru scznd de la H1 ctre H4. Genele pentru histone sunt organizate n uniti repetitive dispuse n tandem. De exemplu, la D.melanogaster unitatea repetitiv este format din genele pentru: H1 H3 H4 H2A H2B

Figura 3.5 Organizarea genelor pentru histone la D.melanogaster. regiuni reglatoare ale genelor (situsuri hipersensibile la nucleaz)

3.2.3 Nivelele de organizare ale cromatinei Elementul structural de baz al cromatinei este nucleozomul care este format dintr-un octamer histonic central i o histon de legtur (linker). Nucleozomul are 145 perechi de baze corespunztoare la aproximativ 2 ture de spir suprarsucite negativ n jurul miezului histonic. Miezul histonic prezint domeniul hidrofob carboxiterminal de interaciune cu celelalte proteine spre partea central, iar domeniul amino-terminal se gsete la suprafaa de interaciune cu ADN. ntre 2 nucleozomi adiaceni se interpune ADN linker de 60 perechi de baze i este complexat cu histona H1. Cromatina extins apare ca un irag de mrgele cu un diametru de 11 nm. Prin intermediul histonei H1 implicat n superspiralizare interacioneaz 6 10

26

nucleozomi pentru a forma solenoidul de 30 nm. Acesta este unitate de baz a condensrii materialului genetic in interfaz. Forma superioar de condensare este reoprezentat de cromozomii metafazici, perioada n care materialul genetic atinge un nivel maxim de condensare de 1400 nm. Procesul de condensare a cromatinei este realizat prin ataarea ei la o clas de proteine denumite proteine scaffold (proteine de eafodaj). Ataarea se realizear cu formarea unor bucle (domenii) care au fiecare 100 kpb, comparabile cu cele de la cromozomul bacterian.

Figura 3.6 Reprezentarea schematizat a structurii nucleosomilor (dup Strachan, 1999).

n organizarea materialului genetic nuclear la organisme eucariote intervin i proteine non-histonice. Acestea se submpart n mai multe clase: enzime ale metabolismului ADN: ADN polimeraze, ADN ligaze, ADN topoizomeraze, terminal-ADN-nucleotidil-transferaze enzime ale metabolismului ARN: ARN polimeraze, poliA polimeraze, enzime de splicing, RNaze enzime ce modific histonele: protein-kinaze, metilaze, acetilaze, esteraze, proteaze proteine structurale: proteinele fusului de diviziune, proteinele matricei nucleare, proteinele scaffold, proteinele particulelor RNP (RiboNucleoProtein) proteinele HMG (High Mobility Group) ce intervin n modificarea structurii cromatinei n vederea funcionrii genelor n replicare i transcriere: o HMG 1 i HMG 2 proteine omoloage cu g.m. 29 kd; o HMG 14 i HMG 17 - proteine omoloage cu g.m. 10-12 kd Proteinele HMG nlocuiesc histona H1 determinnd, alturi de topoizomeraze, relaxarea helixului ADN n iniierea transcrierii genelor.

27

CAP. 4 FUNCIILE

MATERIALULUI GENETIC

__________________________________________________________

4.1 Replicarea ADN

Replicarea ADN reprezint transmiterea fidel a informaiei genetice la celulele fiice, n urma diviziunii celulare. Replicarea este una dintre cele dou funcii eseniale ale materialului genetic. Mai mult dect att, replicarea ADN este procesul de baz al continuitii vieii pe Pmnt. 4.1.1 Principalele etape ale replicrii ADN Ca i alte procese din biologia molecular, i procesul de replicare se desfoar n 3 etape iniierea, elongarea i terminarea : Iniierea implic recunoaterea regiunii de pe o molecul ADN unde va ncepe procesul de replicare Elongarea cuprinde evenimetele ce se desfoar la o bifurcaie de replicare, unde catenele parentale sunt copiate n catene fiice Terminarea este o etap destul de puin cunoscut i se desfoar atunci cnd molecula parenatl a fost complet replicat Etapele chimice ale replicrii ADN Din punct de vedere chimic, replicarea ADN presupune urmtoarele etape principale: desfacerea iniial a dublului helix ntr-o zon denumit regiune de origine a replicrii sinteza unor fragmente de ARN m.c. scurt ce ofer captul 3-OH liber pentru sinteza primelor legturi fosfo-diesterice; aceste fragmente poart numele de primeri i sunt sintetizate de ARN polimeraze speciale denumite primaze n bucla de ADN desfcut procesul de replicare se va desfura n ambele direcii, formndu-se deci 2 bifurcaii de replicare n faa fiecrei bifurcaii de replicare dublul helix va fi desfcut prin intervenia topoizomerazelor (care dersucesc dublul helix) i a helicazelor (care desfac legturile de hidrogen dintre cele 2 catene); astfel, bucla de replicare se va lrgi n fiecare din cele 2 capete fiecare din cele 2 catene ale helixului parental va servi drept matri pentru sinteza unei catene noi sinteza catenelor noi se realizeaz de ctre enzime numite ADN polimeraze, pe baz de complementaritate cu catena veche folosit ca matri; nucleotidele

28

sunt legate ntre ele prin formarea de legturi fosfo-diesterice; alungirea catenei noi se realizeaz n direcie 5 3 datorit faptul c ADN polimerazele nu pot sintetiza o caten nou dect n direcie 5 3, la fiecare bifurcaie de replicare, sinteza celor 2 catene noi are loc oarecum diferit : una din catenele noi este sintetizat continuu, pornind de la un singur primer: aceast caten este denumit catena conductoare (leading) (Figura 4.1) cealalt caten este sintetizat discontinuu, pe msur ce dublul helix parental este desfcut n continuare; aceast caten este denumit caten ntrziat (lagging) i este format din multe fragmente distincte, denumite fragmente Okazaki (de la numele celul care le-a descris prima oar) de aproximativ 100 nucleotide; fiecare asemenea fragment este iniiat de la un primer ntr-o faz mai avansat a replicrii primerii sunt ndeprtai att din structura catenei conductoare, ct i din cea ntrziat, dup care golurile sunt umplute tot de o ADN polimeraz aceste fragmente sunt apoi unite ntre ele prin refacerea legturilor fosfodiesterice de ctre o ADN ligaz n timpul procesului de replicare monocatenele ADN (att cele vechi, ct i cele nou sintetizate) sunt stabilizate i protejate de aciunea nucleazelor, de ctre o clas special de proteine numite proteine Ssb (Single Stranded Binding) terminarea replicrii unei molecule de ADN difer ntre moleculele circulare i cele lineare la moleculele circulare, ntlnite n majoritatea cazurilor la cromozomul bacterian i la plasmide, cele 2 bifurcaii de replicare se ntlnesc ntr-o regiune denumit ter. la moleculele ADN lineare din cromozomii de la eucariote, capetele acestora (telomerele) sunt replicate printr-un mecanism diferit, iar fragmentele sunt apoi unite de ADN ligaze

Figura 4.1 Reprezentarea schematizat a unei bifurcaii de replicare.

29

Complementaritatea dintre bazele azotate de pe cele 2 catene ale moleculei de ADN determin o structur perfect adaptat funciei de replicare, fiecare dintre cele 2 catene servind drept matri pentru sinteza unei catene complementare. In majoritatea cazurilor, replicarea se realizeaz pe model semiconservativ, macromoleculele de ADN fiice fiind formate dintr-o caten veche i una nou (Figura 4.2).

Figura 4.2 Principalele trei modele de replicare a moleculelor ADN.

La majoritatea organismelor (chiar i la genomuri virale) replicarea ADN se desfoar bidirecional, ceea ce presupune formarea a dou bifurcaii de replicare ce avanseaz de la secvena de origine a replicrii (denumit secven oriC pentru cromozomul bacterian) ctre regiunea de terminare a replicrii (denumit secvna ter n cromozomul bacterian). Dei procesul de replicare a moleculelor de ADN se desfoar enzimatic n mod similar la toate organismele, att la cele procariote, ct i la cele eucariote, totui exist suficiente diferene ntre cele 2 tipuri principale de organisme. Astfel, cromozomul bacterian este un replicon unic, adic are o singur secven de origine a replicrii. n contrast, cromozomii de la eucariote sunt fiecare dintre ei structuri multirepliconice (au mai multe regiuni de origine a replicrii ADN) (Figurile 4.3 i 4.4).

30

Figura 4.3 Replicarea bidirecional a unui cromozom bacterian (A) i a unui cromozom de tip eucariot (B)

Figura 4.4 Reprezentarea schematic a replicrii cromozomului bacterian.

Mai mult chiar, apar diferene i datorate structurii teriare. Cromozomul bacterian are o structur circular i, ca urmare, cele 2 bifurcaii de replicare se ntlnesc la nivelul secvenei ter (Figura 4.5). Cromozomul de tip eucariot are o structur linear, iar capetele lui (denumite telomere) se replic diferit de restul cromozomului.

Figura 4.5. Imaginea de microscopie electronic i reprezentarea schematizat a unei molecule circulare de ADN n timpul replicrii.

4.2 Transcrierea genetic

Principii i definiii Transcrierea genetic reprezint procesul de sintez, catalizat enzimatic, a moleculelor de ARN, ca urmare a citirii informaiei codificate n molecule ADN. Procesul se desfoar pe baza legilor de complementaritate chimic dintre cele 2 catene ale unei molecule de acid nucleic dublu catenar i conduce la formarea de legturi fosfo-diesterice ntre ribonucleotide.

31

Prin transcriere genetic se sintetizeaz toate tipurile de molecule ARN proprii celulelor, att la organisme procariote, ct i la eucariote, i anume: ARN mesager (ARNm), ARN ribozomal (ARNr), ARN de transfer (ARNt), ARN heterogen nuclear (ARNhn). Molecula ARN rezultat prin transcriere, nainte de orice alt procesare, poart numele de transcript primar. Procesul de transcriere a unei poriuni din ADN (denumit gen) presupune deci sinteza unei copii a informaiei genetice, copie care din punct de vedere chimic este o molecula de acid nucleic monocatenar, i anume ARN. Transcrierea ncepe n anumite zone din molecula ADN, zone numite promotori. Acetia au anumite secvene de nucleotide care i fac uor de recunoscut de ctre ARN polimeraze (enzimele ce sintetizeaz molecule de ARN). n zona promotorilor dublul helix ADN este desfcut de ctre ARN polimeraze, formndu-se o aa-numit bucl de transcriere. n interiorul acesteia, ARN polimeraza sintetizeaz o molecul de ARN, copiind informaia genetic de pe una din catenele ADN pe care o folosete ca matri. Primul nucleotid de pe catena ADN matri care este citit i cruia i corespunde un prim nucleotid n catena ARN, este numerotat convenional cu +1 i denumit startpoint (punct de pornire a transcrierii). Urmtoarele nucleotide din matria ADN sunt numerotate +2, +3, +4 etc. Fa de poziia nucleotidului +1, se definesc 2 zone n matria ADN : - zona amonte (upstream), n care nucleotidele sunt numerotate cu semnul minus (-1, -2, -3 etc) - zona aval (downstream), n care nucleotidele sunt numeortate cu semnul plus (+2, +3, +4 etc) Procesul de transcriere pornit de la promotori continu pn n anumite zone din ADN, cu anumite secvene, zone denumite terminatori. n aceste zone, ADN polimeraza se desprinde de pe molecula de ADN, bucla de transcriere format n dublul helix ADN se nchide, iar transcriptul ARN este eliberat. O zon din ADN cuprins ntre un promotor i un terminator poart numele de unitate de transcriere. Din cele 2 catene ale moleculei de ADN, catena care este folosit ca matri pentru sinteza unui transcript ARN este complementar cu aceasta i este numit caten antisens. Catena ne-matri este denumit caten codificatoare sau caten sens. Admind c o gen reprezint o zon din ADN (sau mai exact, secvena de nucleotide de pe una din catenele ADN dintr-o anumit zon) ce codific un polipeptid (sau o molecul de ARNr, ARNt ARNhn), o unitate de transcriere poate include : - o singur gen, caz n care se numete transcriere monocistronic - sau mai multe gene, caz n care se numete transcriere policistronic Dei exist i destule excepii, n general, transcrierea monocistronic este caracteristic organismelor eucariote, iar cea policistronic procariotelor (Figura 4.16)

32

Figura 4.17 Reprezentarea schematizat a unui proces de transcriere monocistronic i, respectiv, policistronic.

4.2.1 Transcrierea la eucariote

4.2.1.1 ARN polimerazele la eucariote n sine, procesul de transcriere la organismele eucariote se desfoar n mod similar cu cel de la procariote. Exist totui o serie de diferene. Astfel, n timp ce la procariote exist o singur specie molecular de ARN polimeraz per celul, la eucariote exist, n majoritatea cazurilor 3 specii moleculare de asemenea enzime. Cele 3 ARN polimeraze de la eucariote sunt nrudite i structural i funcional. Cu toate acestea, cele 3 enzime iniiaz transcrierea de la promotori diferii i transcriu gene diferite : - ARN polimeraza I transcrie n mod special gene ce codific pentru ARN ribozomal - ARN polimeraza II transcrie mai ales gene ce codific ARN mesager - ARN polimeraza III transcrie mai ales ARN de transfer i o serie de molecule mici de ARN, de exemplu ARN nuclear mic i nucleolar mic Alte diferene importante apar i n ceea ce privete factorii de transcriere. Astfel, dac la procariote iniierea transcrierii necesit doar facotrul , la eucariote debutul acestui proces necesit mai multe proteine, denumite generic factori de transcriere generali. n general, structura promotorilor pentru ARN pol I i III este mai simpla dect a promotorilor pentru ARN pol II, dei i aceste 2 enzime necesit factori de transcriere.

33

34