Southern blotting

Cuprins:
I.
II.
III.
IV.

Ce este Southern blotting

Care sunt etapele metodei Southern blotting
Aplicatii ale metodei Southern blotting
Bibliografie

I.

Ce este Southern blotting?

Aceasta tehnica a fost descoperita in anul 1975 de catre E.M. Southern. Southern blotting
reprezinta procesul de transfer a fragmentelor de ADN care au fost in prealabil separate prin
electroforeza, pe o membrana de nitroceluloza/nylon si detectarea fragementelor de ADN de
interes.
Multe analize ale genomului uman utilizeaza procedura de marcare dezvoltata de E.M.
Southern, care implica hibridizarea ADN-ului in solutie cu ADN-ul fixat pe un suport
membranar. Metoda de marcare Southern (Southern blotting) (ura 65-6) pentru analiza clinica
incepe cu izolarea ADN-ului genomic din surse ca leucocite periferice sau celule fetale.
Sensibilitatea metodei Southern este obtinuta prin clivarea ADN-ului in fragmente mici,
fragmentele fiind fractionate prin electroforeza pe gel de agaroz si aplicand o metoda sensibila de
identificare a fragmentelor specifice (hibridizarea acidului nucleic).
Aceasta metoda poate detecta fragmente unice ale ADN-ului genomic, fragmente ce
reprezinta tipic aproximati1 parte din 1 milion a genomului. Performanta clinica a metodei de
marcare Southern consta in capacitatea de a analiza o portiune mica specifica a structurii primare
a ADN-ului genomic uman de la un individ. Procedura este utila pentru detectarea
rearanjamentelor mari din ADN si a catorva mutatii punctiforme, dar majoritatea mutatiilor
punctiforme nu sunt detectate prin aceasta metoda.

II.

Etapele metodei Southern blotting

Southern blotting implica 5 etape principale:

1.
2.
3.
4.
5.
6.

digestia enzimatica a ADN

migrarea fragmentelor ADN intr-un gel de agaroza
denaturarea ADN
transferul ADN-ului denaturat pe o membrana
hibridizarea
spalarea si autoradiografierea

1. Digestia enzimatica a ADN

Se realizeaza cu ajutorul enzimelor de restrictie folosind endonucleaze (RE) asemeni Eco
RI.

http://www.discoveryandinnovation.com/BIOL202/notes/lecture23.html

Endonucleazele de restricie sunt enzime care recunosc secvene de ADN specifice,

scurte, legarea fiind urmat de clivare, fie la situsul de recunoastere, fie la o distan oarecare de
acesta, n funcie de tipul de enzim. Sistemele enzimatice de restricie/modificare (sau
restricie/metilare) au fost mparite n 3 categorii: Tipul I, Tipul II i Tipul III.
Tipurile I i III constau n enzime care au att funcii de restricie ct i funcii de
modificare; ambele tipuri recunosc secvene specifice, nemetilate, de ADN dublucatenar;
enzimele de tip I cliveaz ADN-ul ntr-o manier randomizat (situs-nespecific), pe cnd cele de
tip III taie la situsuri specifice, dar nu n cadrul secvenei de recunoatere, ci la o distana de 2527 nucleotide de acesta (ex: Eco P1 codificat de fagul P1). Sistemele de tip II constau n
enzime separate care ndeplinesc funciile de metilare, respectiv, restricie.
Enzimele de restricie de tip II au o secvena de recunoatere scurt, de 4-6 nucleotide, n
cele mai multe cazuri palindromic.

De exemplu, enzima Eco RI recunoate o secvena hexanucleotidic:

5-G-A-A-T-T-C-3
3-C-T-T-A-A-G-5
Similar altor endonucleaze de restricie, Eco RI nu taie la nivelul axei de simetrie a
secvenei de recunoatere, ci spre captul 5, ntre G i A, ducnd la formarea de capete 5
coezive:
5-G-3

5-A-A-T-T-C-3

3-C-T-T-A-A-5

3-G-5

n mod similar, multe alte enzime de restricie genereazfragmente cu capete 5 coezive;

altele (ex: Pst I) genereazfragmente cu capete 3 coezive, n timp ce alte enzime taie la nivelul
axei de simetrie a secvenei de recunoatere, ducnd la formarea de fragmente cu capete drepte.
Spre exemplu, enzima Bal I recunoate secvena
5-T-G-G-C-C-A-3
3-A-C-C-G-G-T-5
i taie la nivelul axei de simetrie ducnd la obtinerea de capete drepte :
5-T-G-G-3

5-C-C-A-3

3-A-C-C-5

3-G-G-T 5

2. Migrarea fragmentelor obtinute prin electroforeza

intr-un gel de agaroza

Electroforeza n geluri de agaroz reprezint metoda standard de analiz a acizilor

nucleici. Deplasarea moleculelor se face n prezenta unui curent electric (acizii nucleici sunt
ncrcai negativ datorit prezenei gruprilor fosfat i migreaz spre electrodul ncrcat pozitiv).
Mobilitatea electroforeticeste influenat de urmtorii factori: concentraia de agaroz,
conformaia moleculei de ADN (monocatenar,bicatenar sau superrsucit), prezena compusului
fluorescent n gel, tamponul utilizat, tipul de agarozi voltajul aplicat.
Concentraia agarozei se apreciaz n funcie de dimensiunile presupuse ale fragmentelor
de digestive, spre exemplu, n cazul fragmentelor obinute la digestia ADN sau a vectorilor se
utilizeaz agaroza 0,8- 0,9 %. Tamponul de electroforez folosit: TBE 0.5X.

http://www.multilab.ro/med_lab/electroforeza.html

http://wp.ufpel.edu.br/genomicanutricional/files/2013/04/Aula-05-T%C3%A9cnicas-em-Gen%C3%B4mica-Nutricional.pdf

3. Denaturarea ADN-ului
Conversia ADN-ului dublucatenar la ADN monocatenar. Transferul poate fi facut numai
cu forma monocatenara a ADN-ului. Se foloseste o solutie 0.5M NaOH, 0.2M HCL.

http://bacbioro.weebly.com/acizii-nucleici.html

4. Transferul ADN denaturat pe o membran

Se utilizeaza membrane de nitroceluloza sau de nylon, deoarece au mici pori care
faciliteaza deplasarea lichidului prin fenomenul de capilaritate. In general, transferul este realizat
de forta de capilaritate. Se pot utiliza si aparate cu vaccum care scurteaza semnificativ durata
transferului.
Dupa realizarea trasferului, membrana este expusa la radiatii UV, sau introdusa intr-un
cuptor, la 800C. Aceste tratamente asigura formarea de legaturi non-covalente, semipermanente,
intre ADN si membrane. In acest moment ADN-ul este imobilizat pe membrane.

http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/southern-and-northernblotting.html

5. Hibridizarea
Membrana de nitroceluloza cu fragmentele de ADN atasate este introdusa intr-un punga
cu buffer in care s-au introdus probele de interes (ADN monocatenar) marcate radioactiv pentru
a se atasa prin complementaritate de fragementele de ADN de pe membrane. Se lasa cateva ore
la incubat pentru a permite atasarea acestora.

http://edusanjalbiochemist.blogspot.ro/2013/06/blotting-techniques.html

http://sites.sinauer.com/cooper6e/animation0411.html

6. Spalarea si autoradiografierea
Spalarea se face cu ajutorul unei solutii de NaCl si detergent si se lasa la incubat pentru a
inlatura fragmentele atasate non-specific de membrane.
Autoradiografierea se face cu ajutorul unui film radiografic atasat peste membrana de
nitroceluloza/nylon. Dupa developare se pot observa benzi intunecate unde s-au atasat probele.
Vizualizarea rezultatelor depinde de metoda de marcaj (radioactiv sau cu fluorocromi) a
secventelor proba care au hibridizat eventual, cu secventele tinta din ADN-ul transferat pe
membrane.

http://sites.sinauer.com/cooper6e/animation0411.html

III.

Aplicatii ale metodei Southern blotting

Identificarea specifica a ADN-ului intr-o proba

Izolarea ADN-ului

In prognosticul cancerului si diagnosticul bolilor genetice prenatal

In RFLP (Restriction fragment length polymorphism).

In analiza filogenetica

Diagnosticul HIV-1 si bolilor infectioase

Aplicatii ale fingerprinting-ul ADN-ului : - Testul de paternitate

- Identificarea criminalistica

IV.

Bibliografie:

1. Primros, S.B. & Twyman, R.M., 2006, Principles of Gene Manipulation and Genomics,
7th Edition, Blackwell Publishing.
2. Kessler, C. & Manta, V., 1990, Specificity of restriction endonucleases and DNA
modification methyltransferases. Gene, 92, 1248.
3. Stekel, D., 2003, Microarray Bioinformatics. Cambridge University Press.
4. Wilson, G. G. & Murray, N. E., 1991, Restriction and modification systems. Annual
Reviews of Genetics, 25, 585627.
5. http://www.biologyexams4u.com/2013/12/southern-blotting-principleprocedure.html#.VltayeJLHnY
6. http://sites.sinauer.com/cooper6e/animation0411.html
7. http://edusanjalbiochemist.blogspot.ro/2013/06/blotting-techniques.html
8. http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/southern-andnorthern-blotting.html
9. http://bacbioro.weebly.com/acizii-nucleici.html
10. http://wp.ufpel.edu.br/genomicanutricional/files/2013/04/Aula-05-T%C3%A9cnicas-emGen%C3%B4mica-Nutricional.pdf
11. http://www.multilab.ro/med_lab/electroforeza.html
12. http://www.discoveryandinnovation.com/BIOL202/notes/lecture23.html
13. http://sanatate.flu.ro/boli-si-afectiuni/metode-de-analiza-a-adnului-uman-metoda-demarcare-southern/
14. http://anatop.usmf.md/wp-content/blogs.dir/164/files/sites/164/2014/ 08/ /LP12-Analizagenelor.pdf
15. http://www.bio.unibuc.ro/pdf/micro/documente_de_studiat/Cap32_Enzime_de_restrictie.pdf
16. https://robi74ro.files.wordpress.com/2011/02/electroforeza-adn-ului.pdf