Tehnici moleculare n genetic

OBINEREA SONDELOR DE
ACIZI NUCLEICI

Manea Andreea Simona

Niculae Adelina tefania
Facultatea de Biologie
Universitatea Bucureti
Master GAB

Principiile hibridizrii acizilor nucleici

Hibridizarea = procesul prin care 2 monocatene ADN sau ARN din surse
biologice diferite reformeaz configuraia dublu catenar
Procesul de hibridizare se bazeaz pe :
- principiul complementaritii dintre cele 2 catene ale unui duplex ADN sau ARN;
- eventuala omologie de secven dintre cele 2 surse ADN.
Pot exista hibrizi:
ADN : ADN
ARN : ARN
ADN : ARN

SCOP:

Identificarea sau localizarea anumitor fragmente de acizi nucleici

molecula INT = fragmentul de ADN, ARN sau de protein de identificat sau de localizat

molecula SOND = fragmentul de ADN, ARN sau de protein cu ajutorul cruia, prin
hibridizare, este identificat sau localizat INTA

n soluie
2 tipuri de hibridizare
Pe suport solid = BLOTTING

Exist 3 categorii principale de blotting :

SOUTHERN BLOTTING (dup numele autorului Southern, 1975)
- tehnic molecular ce identific fragmente de ADN folosind sonde ADN sau ARN
NORTHERN BLOTTING
- tehnic molecular ce identific fragmente ARN folosind sonde ARN sau ADN
WESTERN BLOTTING
- tehnic molecular ce identific fragmente proteice folosind anticorpi specifici

Principalele etape ale unui

proces de hibridizare molecular
pe suport solid
1. Sinteza sondei marcate
n funcie de molecula de ADN int, de lungimea sondei dorite, precum i de tipul de marcare,
se sintetizeaz o specie molecular de sond ADN sau ARN complementar cu molecula int.
2. Procesarea ADN int
Moleculele de ADN surs n care se gsete i secvena de ADN int, trebuie izolate i
purificate. Ulterior, ADN surs se digera cu o endonucleaz de restricie, astfel nct secvena de ADN
int s fie obinut ca molecul d.c. linear.
Amestecul de digestie se supune unei electroforeze n gel de agaroz, n care se separ diversele
fragmente obinute n reacia de restricie.
3. Denaturarea ADN int
Gelul de agaroz n care se afl i moleculele de ADN se introduce n soluii de NaOH, n care
va avea loc denaturarea acestora, rezultnd molecule monocatenare.

4. Transferul ADN int pe suport solid

Fragmentele de ADN d.c. lineare separate n gelul de electroforez se transfer pe un suport
solid (hrtie de nitroceluloz sau membran de nylon), dup ce n prealabil se realizeaz o denaturare a
moleculelor de ADN prin imersarea gelului n NaOH 0.5N.
Transferul poate fi realizat prin 3 variante tehnice:
- transfer prin capilaritate, n sistem sandwich: fragmentele de ADN sunt transportate din gel de ctre
un lichid (de obicei, tampon SSC) i depozitate pe suportul solid;
- transfer electroforetic: se folosete numai pe membrane de nylon ncrcate electric i reprezint o
metod eficient chiar pentru transferul unor fragmente mici: 56 bp;
- transfer prin vacuum: este mult mai eficient i mai rapid dect celelalte 2 variante tehnice; n acest
caz, gelul de agaroz se gsete n contact direct cu suportul solid (nitroceluloza sau membrana de
nylon), amndou aezate pe un suport poros deasupra unei camere de vacuum; tamponul este aezat n
camera superioar a dispozitivului i este tras prin vacuum, elund acizii nucleici din gel i depozitndui pe suportul solid.
5. Hibridizarea molecular
In aceast etap, suportul solid pe care se afl fixat inta se imerseaz n tampon 5xSSC care
conine i sonda marcat, i se las n agitare uoar 14-16h. Dup hibridizare, sonda nehibridizat se
ndeprteaz prin splri succesive cu tampon SSC.

Caracteristicile generale ale sondelor

Sond = o secven de nucleotide, scurt, monocatenar, alctuit din ADN sau din
ARN, ce se va lega specific de o secven int

s fie marcat pentru a putea permite vizualizarea hibridului molecular

sond:int;
10 10.000 nucleotide ( de regul se folosesc 14 40);
s nu conin complementaritate intracatenar.

Gradul de omologie de secven dintre sond i int va determina stabilitatea hibridului.

Modaliti de sintez a sondelor

moleculare de acizi nucleici
1. Sinteza de sonde prin nick-translation
A D N d .c .

In c u b a re in p re z e n ta D n a z e i I
(e n d o n u c le a z a c a re , in
p r e z e n ta d e M g 2+ in d u c e f o r m a r e a
d e r u p e r i m o n o - c a te n a r e - n ic k u r i)
3

3
3

A D N pol I
( fu n c tie e x o n u c le a z ic a
5 -3 )
3

A D N pol I
( fu n c tie p o lim e r a z ic a 5 -3 )
p o z itia fin a la
d N T P m a rc a ti
3

3
c a te n a m a rc a ta

D e n a tu r a r e - o b tin e r e d e s o n d e m a r c a te

a n ic k -u lu i

2. Sinteza de sonde marcate uniform folosind primeri randomizai

M a trita

d e n a tu ra re

a ta s a re d e p rim e ri
ra n d o m iz a ti

a d a u g a re - A D N p o lI (fra g m e n t K le n o w )
- d N T P (u n u l m a rc a t)
a m p lific a re

D e n a tu r a r e - o b tin e r e d e s o n d e m a r c a te

T7
A D N h e te r o lo g c lo n a t in M C S
v e c to r p la s m id ia l
s a u p h a g e m id
lin e a riz a r e c u e n z im e
d e re s tr ic tie c a r e p r o d u c
c a p e te d r e p te

T3

T7

T3

5
a d a u g a re :
- rN T P ( u n u l m a r c a t)
- s p e r m id in a s a u B S A *
( a m p lif ic a tra n s c r ie re a d e 2 -2 ,5 o ri)
- A R N p o lim e ra z a fa g ic a ( T 3 s a u T 7 )

3. Sinteza de sonde ARN prin

transcriere in vitro

tra n s c r ip t A R N
3

5
3

T3

T7

m o le c u le A R N
3
5

T ra ta re c u D N a z a I

Marcarea capetelor ADN

1. Marcarea capetelor 3 ale ADN d.c.
Pentru a realiza marcarea radioactiv a unor molecule de ADN d.c., ntr-o prim
etap se folosesc endonucleaze de restricie, fie ce produc capete coezive, fie ce produc capete
netede.
Capete coezive:

E coR I
C TTA A P

32

PdATP

C T T A A P 5

+ K le n o w A D N
p o lim e ra z a

n cazul digestiei ADN cu enzime de restricie ce produc capete netede, acestea pot fi
marcate prin nlocuirea nucleotidei de la capul 3OH n amestecul de reacie se introduce
nucleotida de nlocuit ca 32P-dNTP.

2. Marcarea capetelor 3 ale ADN m.c.

dG TP
+M g

CG C O H

CG C G O H

CG CA O H

++

dATP

T e rm in a l
tra n s fe ra z a

+C o

++

CG C T O H

CG C C O H

dTTP
dC TP

Sisteme de marcare a sondelor moleculare

1. Marcare radioactiv: 32P sau 35S
2. Marcare neradioactiv:

metode directe de marcare neradioactiv: molecula reporter este detectabil

direct i se leag direct de sond, astfel c hibrizii pot fi vizualizai direct; n
asemenea situaii, moleculele reporter sunt de obicei reprezentate de fluorocromi
(ex: analogi ai nucleotidelor cuplai cu fluorescein).

metode indirecte de marcare neradioactiv: sonda conine o molecul reporter

introdus chimic sau enzimatic, care va deveni detectabil prin citochimie de
afinitate (n aceste situaii, se folosete, fie biotina cuplat cu avidin sau cu
streptavidin, fie digoxigenina cuplat cu anticorpi-antidigoxigenin).

Microarray
ADN microarray reprezint o tehnologie complex utilizat n biologia
molecular i medicin pentru a monitoriza simultan nivelul de expresie a mai multor
gene. n prezent, ADN microarray are multiple aplicaii:
s identifice gene a cror expresie se schimb ca rspuns la patogeni sau alte organisme
prin compararea expresiei genei din celulele/esuturile infectate cu cele din celule/ esuturi
neinfectate;
s compare expresia genelor din profilele tumorale de la pacien ii bolnavi de cancer.
Un microarray reprezint o colecie de spoturi microscopice situate pe o
suprafa solid. Fiecare spot conine picomoli de secven e ADN specifice, cunoscute sub
numele de sonde (reporteri/oligomeri). Acestea pot fi secven e genice sau alte elemente
ADN care sunt utilizate pentru a hibridiza cu probe (numite int).

Etape:

https://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM

APLICAII
PRACTICE
Microarray utilizat in studii privind transformarile maligne; testarea
incidenei unor markeri particulari n tumori.
INCD Victor Babe
Investigarea anomaliilor structurale genomice i implicit identificarea unor gene
amplificate sau deletate, cu aplicaii n:
- Patologia neuropsihiatric ce asociaz tulburri cognitive i de comportament:
o Autism.
o Sindroame de microdeleie/microduplicaie.
o Dizabiliti intelectuale nencadrabile n sindroame genetice bine definite.
- Neoplazii hematologice.
Platform utilizat: Agilent - un ansamblu de echipamente (Agilent Bioanalyzer
i vortex destinat pregtirii cipurilor, microcentrifugi, cuptor de hibridizare, Agilent
Microarray C Scanner with Surescan, computere i programe specializate destinate
desfurarii experimentelor, extraciei i analizei datelor) pentru aplicaii de tipul:
hibridizarea genomic comparativ bazata pe microarray (aCGH), analiz de expresie
genic i studiul modificarilor epigenetice la nivel genomic.
Metode de validare a rezultatelor: FISH i real-time PCR cantitativ

BIBLIOGRAFIE
http://www.ivb.ro/genetica/Directii%20de%20cercetare_v1.pdf
https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_microarray
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:DNA_microarray.svg
http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html
https://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM
Vassu T., Stoica I., Csutak O., Muat F., 2001, Genetica microorganismelor
i inginerie genetic microbian. Note de curs i laborator, Editura Petrion,
Bucureti.