REFERAT DE DOCTORAT

CELULE STEM ADULTE SI UTILIZAREA LOR IN MEDICINA REGENERATIVA

2004
Capitolul I: CELULELE STEM
I.1. I t!o"u#$!$ Este uimitor cum un organism ia nastere dintr-o singura celula si cum celulele sanatoase le inlocuiesc pe cele suferinde in organismul adult. Recent s-a descoperit un tip particular de celule care fac posibile toate aceste lucruri ; celulele stem. Acest domeniu promitator al stiintei investigheaza posibilitatea tratarii bolilor prin terapii celulare, astfel luand nastere o noua arie a medicinii, numita medicina regenerativa sau reparatorie. Celulele stem reprezinta una din cele mai fascinante arii ale biologiei in acest moment. Insa, ca multe alte domenii ale cercetarii stiintifice, studiul celulelor stem ridica nenumarate intrebari care genereaza noi controverse. I.2 C$ %u t #$lul$l$ %t$& %i "$ #$ %u t $l$ i&po!ta t$ ' Celulele stem prezinta doua caracteristici principale care le disting de celelate tipuri celulare. Prima, sunt celule nespecializate care se reannoiesc pe lungi perioade de timp prin diviziuni celulare. A doua caracteristica in anumite conditii, sau sub anumite semnale, celulele stem pot da nastere la diferite tipuri celulare care formeza organismul. Astfel, acestea au capacitatea de a deveni celule mature cu forme si functii specializate cum ar fi cardiomiocitele, celulele din piele, neuronii etc. !vulul fertilizat este totipotent ; are potentialul de a genera toate celulele si tesuturile care formeaza un embrion si permit dezvoltarea lui in uter. "upa fertilizare ovulul se divide si se diferentieaza pana produce un organism matur. #amiferele adulte, inclusiv omul, sunt formate din apro$imativ doua sute de tipuri celulare. Acestea includ ,printre altele neuronii, celulele musculare %miocite&, celulele din piele %epiteliale&, celulele din sange %eritrocite, monocite, limfocite, etc&, celulele osoase %osteocite&, si celulele din cartila' %condrocite&. Alte celule, esentiale pentru dezvoltarea embrionului, dar care nu sunt incorporate in corpul embrionului formeaza tesuturile e$traembrionare, placenta si cordonul ombilical. (oate aceste celule sunt generate dintr-o singura celula, totipotenta, numita zigot sau ovul fertilizat.

#a'oritatea cercetatorilor folosesc termenul *pluripotent+ pentru a descrie celulele stem care formeaza toate tipurile celulare derivate din cele trei foite embrionare mesoderm, endoderm, ectoderm. Aceste foite embrionare constituie sursa tuturor celulelor din organism %fig., "iferentierea tesuturilor umane&. (oate tipurile specializate de celule care formeaza organismul deriva din una din cele trei foite %tabelul nr., - .traturile embrionare progenitoare de tesuturi&. Celulele pluripotente au capacitatea de a forma orice tip celular , proprietate observata in dezvolatrea embrionara si in unele conditii de laborator. Celulele din organismul adult sunt in general multipotente, sunt capabile de diferentiere intr-unul sau mai multe tipuri celulare . Acest proces permite formarea sau reannoirea tesuturilor. In cazul in care tesuturile sunt lezate devine necesara inlocuirea acestora, celulele stem se pot atunci activa pentru a repara leziunile. %.lac/ 0.#., 1221&.

%preluat dupa (erese 4insio5, Caitlin "uc/5all 122,& 6ig. , "iferentierea tesuturilor umane C$lul$l$ %t$& $&(!io a!$ deriva din stadiile timpurii ale dezvoltarii embrionare. In urma fertilizarii ovulului de catre un spermatozoid rezulta zigotul, cel mai timpuriu stadiu embrionar % fig., - "iferentierea tesuturilor umane&. 7igotul incepe sa se divida la apro$imativ )2 ore de la fertilizare si in ziua aIIa - aI8a embrionul este format dintr-o masa compacta de celule, numita morula. Cinci - sase zile de la fertilizare si dupa cateva cicluri de diviziuni, celulele morulei incep sa se specializeze formand o sfera , numita blastocist, cu un diametru de apro$imativ ,92 :m. .tratul e$terior al blastocistului poarta numele de trofoblast, iar cel din interiorul clusterului sferei formeaza 9

masa celulara interioara. In acest stadiu, embrionul este format din apro$imativ saptezeci de celule trofoblastice si treizeci de celule ale masei celulare interne. Celulele din masa interna sunt multipotente si formeaza toate tipurile celulare prezente in cele trei starturi embrionare ectoderm, mezoderm, endoderm %tabelul nr. ,&. Recent s-a reusit sa se separe celulele blastocistului si sa se mentina in vitro in stadiu nediferentiat. Aceste celule sunt folosite in terapiile medicale, se pot diferentia in celule specializate si apoi pot fi transplantate la pacienti. In practica s-a reusit e$tragerea celulelor stem embrionare provenite de la embrionii in varsta de 19 zile obtinuti prin fertilizare in vitro. C$lul$l$ %t$& "i %a )$l$ o&(ili#al sunt mai usor de procurat decat cele din maduva osoasa, obtinandu-se printr-o procedura neinvaziva. Prezinta avanta'ul de a fi folosite in vederea transplantarii imediat dupa recoltare, terapia cu astfel de celule dovedindu-se eficace in tratamentul leucemiei si a unor boli imunologice. Recent, s-a descoperit ca sangele ombilical contine pe langa celule stem hematopoietice si celule stem non-hematopoietice capabile de diferentiere in condrocite, osteoblaste, adipocite, hepatocite %;ee !< si colab., 1223&. C$lul$l$ %t$& *$tal$ reprezinta tipuri celulare primitive care e$ista in fetus si pot da nastere la diferite organe, insa cercetarea acestor tesuturi fetale s-a limitat doar la cateva categorii celulare celulele stem neuronale, inclusiv celulele din creasta neurala, celulelele stem hematopoietice si progenitorii insulelor pancreatice. Celulele stem neurale, care sunt numeroase in creierul fetal, pot fi izolate si crescute in forma nediferentiata in cultura si se pot diferentia in cele trei tipuri celulare prezente in creier %=rustle !. si colab., ,>>?; 8illa A. si colab, 1222&. Aceste celule au fost utilizate in terapia bolii Par/inson pe modele de rozatoare %.tuder ;. si colab., ,>>?&. Celulele din creasta neurala rezulta din tubul neural, migreaza si formeaza fetusul fiind capabile de diferentiere in multiple linii celulare. Cele de la soarece au fost cultivate in laborator. .angele fetal si ficatul fetal sunt cele mai bogate surse de celule stem hematopoietice care dau nastere multiplelor tipuri celulare din sange, insa proprietatile lor nu au fost pe deplin investigate. .a consatat ca tesuturile e$trase din pancreasul fetal stimuleaza productia de insulina cand sunt transplantate in soareci diabetici, insa nu se cunoaste e$act daca aceasta este produsa de celulele stem care se diferentieaza, de celule progenitoare sau chiar de celule mature producatoare de insulina din insulele pancreatice %=eattie @. #. si colab.,,>>A&. "e asemenea, celulele primordiale germinale izolate din creasta gonadala, structura ce se formeaza in stadiile timpurii ale fetusului sunt multipotente. Aceste celule prezente in sperma sau ovulul organismului adult pot fi cultivate in vitro si formeaza cele trei foite embrionare %.hamblott #. 0. si colab.,,>>?&.

C$lul$l$ %t$& a"ult$

sunt celule nediferetiate prezente in tesuturi diferentiate, cum sunt

maduva osoasa sau creierul din organismul adult. Au capacitate de autoreannoire de-a lungul intregii vieti a unui organism %pot forma copii identice&, sau pot deveni celule specializate. .ursele de celule stem includ maduva osoasa, sangele, ochii, creirul, muschii scheletici, pulpa dentara, ficatul, pielea, stratul intern al tractului gastrointestinal si pancreas. Cnele dintre acestea sunt multipotente celulele stem din tesutul mezenchimal din maduva osoasa pot forma cele trei tipuri celulare din creier, care deriva in mod normal din ectoderm %#ezeD E. si colab., 1222&, iar cele din creier se pot diferentia in celule din sange si muschi scheletici %='ornson C. R. si colab., ,>>>&. Celulele stem adulte sunt rare, dificil de identificat si purificat, iar cand sunt crescute in cultura sunt dificil de mentinut in stare nediferentiata. "atorita acestor limitari, chiar si celulele stem din maduva osoasa, cel mai studiat tip, nu se gasesc in numar suficient pentru a sustine potentialele aplicatii ale medicinii regenerative. @asirea unor cai de cultivare a celulelor stem adulte in afara organismului constituie principala prioritate a cercetarii din acest domeniu. (abel nr., - .traturile embrionare progenitoare de tesuturi - %Chandross si colab., 122,& St!atu!i $&(!io a!$ (imus @lande paratiroide, tiroida ;aringe, trahee, plamani endoderm 8ezica urinara, vagin, uretre !rgane gastrointestinale ficat, pancreas .traturile interne ale tractului gastrointestinal .traturile interne ale tractului respirator #aduva osoasa % sange& Corte$ adrenal (esut limfatic mezoderm #uschii scheletici , netezi si muschiul cardiac (esutul con'unctiv %inclusiv oase si cartila'e& .istemul urogenital Inima si vasele de sange %sistemul vascular& Piele (esut nervos %neuroectoderm& A T$%utu!i "i*$!$ tiat$

ectoderm

#edulla adrenala @lada pituitara (esutul con'unctiv al inimii si fetei !chi, ureche

Capitolul II + CELULELE STEM ADULTE

In ultimii ani un real interes a fost acordat cercetarii celulelor stem adulte, datorita capacitatii acestora de a forma multiple tipuri celulare si tesuturi, precum si prezentei lor in numeroase tesuturi. (ermenul de Ecelule stem adulteF este oarecum impropriu, deoarece aceste celule sunt specifice organismelor tinere, iar celule similare s-au identificat in placenta si sange ombilical. Au fost propusi astfel numerosi termeni celule stem din tesuturi, celule stem somatice, sau celule stem post-natale, insa in cele din urma a fost unanim acceptat termenul de celule stem adulte. II.1. C$ %u t #$lul$l$ %t$& a"ult$ ' Celulele stem adulte, asemeni tuturor celulelor stem, prezinta cel putin doua caracteristici. Pot forma copii identice pe indelungate perioade de timp; capacitate denumita autoreannoiore si se pot diferentia in tipuri celulare mature cu morfologie %forma& si functii specializate. Celulele stem inainte de a genera celule complet diferentiate, formeaza tipuri celulare intermediare %RobeD P. @. si colab., 1222&. Asemenea celule sunt considerate commited inainte de diferentierea completa %6ig.1 Caracteristicile distincte dintre celulele progenitoareG precursoare si celulele stem&. Celulele stem adulte sunt rare. 6unctia lor principala este de a mentine un stadiu functional al celulelor, numit homeostazie si, cu limitari, de a inlocui celulele afectate, moarte in urma leziunilor sau bolilor %Holtzer H. si colab., ,>A?&. "e e$emplu ; doar una din ,2.222 - ,9.222 de celule din maduva osoasa este o celula stem hematopoietica %4eissman I. ;. si colab., 1222&. In plus, celulele stem adulte se disperseaza in tot organismul matur, iar comportamentul lor este influentat de mediul %tesutul& in care e$ista. .pre e$emplu celulele stem hematopoietice sunt generate continuu in maduva osoasa unde se diferentiaza in toate tipurile celulare sanghine mature. Rolul principal al acestor celule este de a inlocui celulele sangelui. Prin diferenta, celulele stem din intestinul subtire nu sunt mobile si sunt separate fizic de cele mature pe care le genereaza. Celulele stem epiteliale intestinale sau precursorii acestora sunt distribuite la baza criptelor, iar celulele epiteliale diferentiate ?

sunt situate spre lumenul intestinal. Aceste celule epiteliale din cripte se divid adesea, insa raman parte integranta a grupului pe care il genereaza %.lac/ 0. #. si colab., 1222&. .pre deosebire de celulele stem embrionare, care sunt definite prin originea lor %masa celulara interna a blastocistului&, celulele stem adulte par a nu detine mi'loace de caracterizare. Ramane o enigma inca originea celulelor stem adulte din tesuturile mature. E$ista unele supozitii cum ca celulele stem sunt retinute de a se divide in timpul dezvoltarii fetale. #a'oritatea informatiilor despre celulele stem adulte provin din studii facute pe soareci. ;ista tesuturilor care contin celule stem adulte este in crestere si cuprinde maduva osoasa, sangele periferic, vasele sanghine, cordul, pulpa dentara, muschii scheletici, epiteliul din piele si sistemul digestive, cornea, retina, ficatul si pancreasul. Celulele stem adulte prezinta cateva caracteristici sunt capabile de autoreannoire de-a lungul intregii vieti a unui organism. Acest criteriu este fundamental pentru toate celulele stem si dificil de demonstarat in vivo. ! alta caracteristica a acestor celule este aceea de a forma clone. ! singura celula stem poate initia o linie celulara genetic identica din care deriva toate tipurile celulare ce apartin tesutului de origine al celulei mama. .-a demonstrat ca celulele stem adulte au potentialul de a forma clone in vitro precum si ca o populatie de celule stem poate repopula anumite tesuturi. Celulele stem adulte pot da nastere la celule complet diferentiate si integrate in tesuturi, capabile de functii specializate caracteristice respectivului tesut. Pentru a caracteriza capacitatea de regenerare si autoreannoire a celulelor stem adulte, este important sa se demonstreze ca o singura celula stem adulta poate genera o linie celulara genetic identica din care se diferentieaza toate tipurile celulare prezente in tesutul de origine a celulei mama.

>

%preluat dupa4inslo5 (., <ibiu/ ;., 122,& 6ig. 1 - Caracteristicile distincte dintre celulele progenitoareG precursoare si celulele stem II.2. Do,$-i al$ p!$-$ t$i #$lul$lo! %t$& a"ult$ Celulele stem adulte sunt prezente in multe tesuturi animale si umane. In general, sunt folosite trei metode de identificare a acestora. Pot fi marcate in vivo si in acest fel sunt urmarite. Pot fi izolate, etichetate si apoi transplantate in organismul de origine pentru a se determina modul lor de integrare. In final, pot fi izolate, crescute in vitro si manipulate, fie prin adaugare de factori de crestere, sau introducand gene in scopul elucidarii mecanismului de generare a diferitelor tipuri celulare specializate. Este foarte dificil, daca nu imposibil, sa se faca distinctia intre celulele stem specifice unui tesut si celulele progenitoare din tesuturile fetale sau adulte. Aceste celule, prezente in multe organe, sunt in general necesare pentru a inlocui celulele moarte si a mentine integritatea tesulului. Celulele progenitoare formeaza numeroase tipuri celulare ; spre e$emplu celulele sangelui cunoscute ca ,2

limfocite (, limfocite = si natural /iller nu sunt capabile sa se dezvolte in toate tipurile celulare e$istente in tesuturi ; ca urmare nu sunt in totalitate celule stem. Prezenta progenitorilor sau precursorilor celulari este posibila datorita e$istentei celulelor stem in tesuturile adulte. Astfel, e$ista progenitori ai celulelor endoteliale, celule stem ale muschilor scheletici, precursori epiteliali in piele, sistem digestiv, progenitori sau celule stem prezente in pancreas si ficat. II... M$#a i%&ul "i*$!$ ti$!ii #$lul$lo! %t$& a"ult$ Au fost propuse cateva mecanisme de diferentiere a celulelor stem adulte in alte tesuturi. Cnul dintre acestea il reprezinta posibilitatea fuziunii celulare celula stem fuzioneaza cu o celula tisulara si preia astfel caracteristicile acesteia. E$perimentele in vitro au demonstrat insa contrariul celula hibrid rezultata in urma fuziunii unei celule somatice cu o celula stem embrionara, sau cu o celula stem germinala, preia caracteristicile celei mai nediferentiate dintre celule %(ada # si colab., 122,&. .-a a'uns insa la concluzia ca in vivo mecanismul nu este similar cu cel demonstrat in vitro, in vitro neputandu-se realiza interactia celulelor stem adulte cu tesuturile mature. .tudii recente, in vivo au artat ca pentru ficat, hibridul rezultat reprezinta o e$plicatie plauzibila pentru diferentiere, cat si pentru reparatiile organului afectat %4ang I. si colab., 122)&. Coculturile realizate intre celulele stem mezenchimale si celule epiteliale au evidentiat ca unele dintre celulele stem s-au diferentiat in celule epiteliale, in timp ce altele au generat hibrizi pentru a reface monostratul celular %.pees 0; si colab., 122)&. Abilitatea de a forma hibrizi celulari in unele testuturi poate reprezenta un mecanism folositor in repararea anumitor organe afectate, sau pentru furnizarea genelor terapeutice acestora %=lau H#. si colab., 1221&. In contrast cu rezultatele prezentate mai sus, alte e$perimente au evidentiat ca fuziunea celulara nu detine nici un rol in diferentierea celulelor stem adulte spre alte tipuri celulare. .-a constatat ca celulele stem din maduva osoasa se pot diferentia in celule epiteliale bucale in vivo fara fuziune, iar celulele stem din sangele din cordonul ombilical formeaza hepatocite atunci cand sunt in'ectate in ficat fara a necesita fuziunea cu celulele hepatice %(ran .". si colab., 122); Je5some PJ si colab., 122)&. In aceste cazuri celulele stem adulte sufera schimbari in e$presia genica si se diferentieaza direct in tipul celular specific tesutului gazda, integrandu-se in acesta. Este posibil ca mecanismul de diferentiere a celulelor stem adulte sa varieze in functie de tesutul tinta, sau de stadiul celulei stem adulte folosita. Astfel, in cazul anumitor organe, spre e$emplu ficatul, fuziunea celulelor stem adulte cu hepatocitele este necesara pentru functionarea normala a acestui organ, pentru diferentierea celulara si repare tisulara, iar diferentierea directa fiind intalnita in cazul altor tesuturi.

,,

II.4. Ma!/$!ii #$lul$lo! %t$& "eoarece e$aminarile microscopice nu reusesc sa faca distinctia intre celulele stem si alte celule, singura modalitate de identificare a acestora o reprezinta prezenta mar/erilor de suprafata. #ar/erii celulelor stem reprezinta molecule prezente pe suprafata acestora. .unt de fapt proteine specializate, denumite receptori, cu capacitate de legare selectiva sau aderare de alte molecule semnal. .-au descoperit o multitudine de receptori care difera prin structura si afinitatea fata de moleculele semnal. In mod normal celulele folosesc acesti receptori impreuna cu moleculele care se leaga la acestia drept o cale de comunicare cu alte celule, precum si pentru a-si e$ercita functiile proprii in organism. 6iecare tip celular poseda pe suprafata o combinatie unica de receptori care le deosebeste fata de alte tipuri celulare. In multe cazuri o combinatie de mar/eri multiplii este folosita pentru a identifica un tip particular de celula stem. E$ista mai multe modalitati de identificare a celulelor stem. Atasarea la moleculele de semnalizare a unei alte molecula %tinta& cu capacitatea de a emite energie luminoasa cand este activata de o sursa de energie, cum ar fi lumina C8 sau un fascicul laser, reprezinta una din modalitatile de izolare a celulelor stem %fig.) - Identificarea mar/erilor de suprafata cu a'utorul tintelor fluorescente&.

%preluat dupa (erese 4inslo5 ; 122,& 6ig.) - Identificarea mar/erilor de suprafata cu a'utorul tintelor fluorescente In prezent se folosesc multiple tinte fluorescente care emit lumina de diferite culori si intensitati. "e asemenea, s-a observat ca e$ista combinatii unice intre proprietatile de fulorescenta si patternul unic de receptori de pe suprafata celulelor. Cna din tehnicile care utilizeaza mar/erii de fluorescenta ca unelte de cercetare este stem&. fluorescence - activated cell sorting %6AC.& %fig. 3 - Izolarea celulelor

,1

%preluat dupa (erese 4insla5, ;Ddia <ibiu/, Caitlin "uc/5all ; 122,& 6ig. 3 - Izolarea celulelor stem (ehnicile de biologie moleculara si genetica au avut un rol deosebit in intelegerea procesului de diferentiere celulara. .-au identificat gene si factori transcriptionali specifici celulelor stem. Prin inserarea unei K gene reporter L numita green fluorescent protein %@RP& s-a urmarit diferentierea celulara. @ena este activata doar atunci cand celulele sunt nediferentiate, in aceasta stare producand ,)

o proteina fluorescenta si devine inactiva odata cu specializarea celulara. Prin cumularea acestor metode ; reporting method cu 6AC. si cele de microscopie s-a reusit sortarea celulelor, identificarea acestora in tesuturi, diferentierea si specializarea lor.

Capitolul III 0 1LASTICITATEA CELULELOR STEM ADULTE

Recent s-a descoperit ca celulele stem din tesuturile adulte pot genera tipuri celulare specializate ce apartin altor tesuturi decat tesutului lor de origine - tesuturi derivate din aceeasi foita embrionara sau din foite diferite %tabelul nr.,&. .tudii efectuate pe celule stem sanghine %rezultate din mezoderm& au artat ca acestea se pot diferentia atat in celule musculare scheletice %care se formeaza din mezoderm&, cat si in neuroni %care provin din ectoderm&. Astfel, s-a evidentiat ca celulele stem care apartin unui anumit tesut adult isi pot schimba morfologia si caracteristicile asemanandu-se cu celulele diferentiate prezente in alte tesuturi. Pentru a desemna aceasta capacitate a celulelor stem adulte s-a folosit termenul de plasticitate, sau diferentiere neortodoxa %=razelton (. R. si colab., 1222; <rause ". .. si colab., 122,&, sau transdiferentiere %Anderson ". 0. si colab.,122,; ;agasse E. si colab.,1222&. III.1. A(o!"a!i p$ t!u "$&o %t!a!$a pla%ti#itatii #$lul$lo! %t$& a"ult$ Pentru a demonstra plasticitatea celulelor stem adulte este important sa se arate ca intr-o populatie celulara dintr-un anumit tesut sunt prezente celule stem. Apoi, este nevoie sa se evidentieze ca celulele stem adulte se diferentieaza in tipuri celulare ce apartin altor tesuturi decat tesutului lor de origine. Jici unul din aceste criterii nu este usor de demonstrat. Evidentierea celulelor stem adulte in tesuturile diferentiate este un proces foarte laborios. .e impune astfel necesara demonstratia ca celulele stem candidate au capacitate de autoreannoire si ca pot forma tipuri celulare caracteristice unui anumit organ. .-a incercat urmarirea celulelor stem adulte atat in vivo, cat si in vitro. #a'oritatea studiilor au fost facute pe celule stem din soarece carora li s-a introdus prin inginerie genetica o tinta moleculara. .-a cautat apoi sa se arate ca aceste celule marcate adopta caracteristicile structurale si biochimice ale noului tesut pe care trebuie sa il genereze. In final, s-a demonstrat ca aceste celule se pot integra in noul tesut, supravietuiesc in acesta si functioneaza la fel ca si celulele mature specifice tesutului ,3

respectiv. In urma unor astfel de e$perimente s-a descoperit ca celulele stem adulte pot adopta caracteristicile celulelor ce deriva din aceeasi foita embrionara ca si celula stem sau din foite diferite %fig. 9 - Evidente preliminarii ale plasticitatii celulelor stem adulte&.

%preluat dupa(erese 4inslo5, 122,& 6ig. 9 - Evidente preliminarii ale plasticitatii celulelor stem adulte #a'oritatea e$perimentelor care urmaresc plasticitatea celulelor stem au vizat celulele stem din maduva osoasa, care deriva din mesoderm. Acestea se pot diferentia in alte celule cu origine mezodermala muschi scheletic %6errari @. si colab., ,>>? ; @ussoni E. si colab.,,>>>&, celule ,9

cardiace %<ocher A. A. si colab.,122, ; !rlic ". si colab., 122,&, sau hepatocite %Alison #. R. si colab., 1222 ; ;agasse E. si colab., 1222 ; (heise J. ". si colab., 1222&. Insa, s-a constatat ca aceleasi celule stem din maduva osoasa pot forma si celule cu alta origine decat cea mezodermala neuroni ce deriva din ectoderm %=razelton (. R. si colab., 1222 ; #ezeD E. si colab., 1222&. In mod similar , celulele neuronale din creierul adult se pot diferentia in celule hematopoietice sau alte tipuri celulare %Clar/e ". ;. si colab.,1222&. In ambele cazuri celulele prezinta plasticitate. #a'oritatea e$perimentelor care urmaresc studiul plasticitatii folosesec celule stem adulte recoltate fie din maduva osoasa, fie din creierul adult. Celulele din maduva osoasa sunt sortate folosindu-se mar/eri de suprafata in populatii de celule stem hematopoietice si celule stem stromale medulare %0ac/son <. A. si colab.,122, ; ;agasse E. si colab., 1222 ; !rlic ". si colab., 122,&. Celulele stem hematopoietice pot fi purificate total sau partial in functie de conditiile de utilizare. ! alta cale de separare a celulelor stem din maduva osoasa o constituie distinctia intre celulele care adera la o suprafata de cultivare %celule stromale& si cele care nu adera %celule hematopoietice& %6errari @. si colab., ,>>?&. In studiul palsticitatii celulelor stem derivate din creier, e$ista cateva probleme. Celulele stem din sistemul nervos central, spre deosebire de cele din maduva osoasa nu sunt concentrate intr-un singur loc accesibil. In creierul sobolanilor acestea sunt dispuse in trei zone tesutul din 'urul ventriculilor laterali, bulb olfactiv si hipocampus. .-a constatat ca aceste celule formeaza neurosfere, agregate celulare circulare ce deriva de la o singura celula mama. Este imposibil de identificat celulele din centrul neurosferei, astfel ca pentru studiul plasticitatii in vitro , celulele sunt disociate si cultivate in monostraturi. .tudiile in vivo presupun disocierea celulelor inainte de in'ectarea lor in sistemul circulator %='ornson C. R. si colab., ,>>>&, sau sunt in'ectate ca neurosfere %Clar/e ". ;. si colab., 1222&. III.2. E,i"$ t$l$ pla%ti#itatii (ipurile celulare diferite care deriva prin plasticitatea celulelor stem prezinta de obicei caracteristicile morfologice ale celulelor diferentiate si e$pun mar/eri specifici acestora. .-a demonstrat ca celulele stem adulte transplantate prezinta plasticitate in vivo fiind integrate in tesutul gazda matur si poseda unele dintre caracteristicile acestuia %=razelton si colab.,1222 ; 6errari si colab.,,>>? ; <ocher si colab.,122, ; #ezeD si colab.,1222 ; !rlic si colab., 122,; 0oanna E. si colab., 1223&. #a'oritatea lucrarilor care vizeaza plasticitatea celulelor stem adulte folosesc celule recoltate din maduva osoasa %=razelton (. R. si colab.,1222 ; 6errari @. si colab.,,>>? ; ;agasse E. si ,B

colab.1222 ; #ezeD E. si colab.,1222 ; Petersen =. E. si colab.,,>>>& sau din creier %='ornson C. R. si colab.,,>>> ; Clar/ ". si colab., 1222& datorita faptului ca acestea au fost cel mai bine caracterizate in cele doua tesuturi. In urma studiilor mai sus amintite s-a constatat ca populatiile de celule stem in mamiferele adulte nu sunt entitati fi$e si dupa ce sunt e$puse la un nou mediu, ele pot popula alte tesuturi si se pot diferentia in alte tipuri celulare. Ramane insa o necunoscuta mecanismul plasticitatii in vivo. Cnii cercetatori sunt adepti ai acesteia neavand insa dovezi pentru a demonstra-o. "e asemenea, nu este pe deplin cunoscut modul de desfasurare al plasticitatii in cercetarile e$perimentale si cum acest fenomen poate genera tesuturi care pot fi apoi transplantate. "aca acest fenomen este folosit ca baza in generarea tesuturilor transplantabile, tehnicile care vizeaza plasticitatea celulara trebuie sa fie reproductibile si de incredere. III.2.1. Evidente experimentale ale plasticitatii celulelor stem adulte Celulele stem adulte din sistemul nervos In urma cu treizeci de ani, Altman si "as au aratat ca doua regiuni din creierul posnatal de sobolan ; hipocampusul si bulbul olfactiv, contin celule care se divid si devin neuroni %Altman si colab., ,>B9 ; Altman, ,>B>&. In ciuda acestei descoperiri, opinia predominanta la aceea vreme era ca celulele nervoase din creierul adult nu se pot divide. Cercetari ulterioare au aratat ca celulele stem din creierul adult de la mamifere pot forma trei tipuri celulare ma'ore astrocite, oligodendrocite si neuroni %@age 6. H. si colab., ,>>9 ; 0ohe <. <. si colab., ,>>B ; #c<aD R.., ,>>A ; #omma .. 0. si colab., 1222 ; .hihabuddin ;. .. si colab., ,>>> ; (a/ahashi (. si colab., ,>>> ; 4eiss .. si colab., ,>>?&. Astazi, se stie ca celulele stem din creierul fetal si adult se divid si formeaza alte celule stem sau cateva tipuri de precursori celulari. Precursorii neuronali %denumiti si neuroblasti& se divid si dau nastere tuturor tipurilor de celule nervoase %neuroni&. Precursorii gliali formeaza astrocitele si oligodendrocitele. Astrocilele reprezinta A2 - ?2 M din celulele creierului adult, ele asigurand suportul metabolic si mecanic. !ligodendrocitele formeaza mielina, materialul care incon'ura a$onii si asigura viteza propagarii impulsului nervos. In conditii normale, in vivo, precursorii neuronali nu dau nastere celulelor gliale, iar precursorii gliali nu se diferentieaza in neuroni. Prin contrast, in sistemul nervos central fetal sau adult, celulele stem pot forma neuroni, astrocite si oligodendrocite, aceasta diferentiere depinzand de semnalele pe care celulele le primesc si de mediul din creierul adult. Inca nu este pe deplin acceptata ideea e$istentei celulelor stem in sistemul nervos central, nu ,A

se cunoaste cum functioneaza aceste celule in vivo si nici cum sunt ele inrudite. "eoarece nu e$ista mar/eri pentru identificarea celulelor stem in vivo, singura metoda disponibila pentru a demonstra prezenta acestora in sistemul nervos central este de a le izola si manipula in vitro, proces care insa poate duce la modificarea proprietatilor lor intrinseci %#orrison .. 0. si colab., ,>>>&. In ciuda acestor dificultati, trei tipuri de celule stem din sistemul nervos central au fost descoperite in creierul rozatorelor adulte. "ate preliminare atesta e$istenta lor si in creierul uman adult. Cn grup este situat in tesutul nervos, langa ventriculi, regiune cunoscuta sub denumirea de zona ventriculara si zona subventriculara. 8entriculii sunt distantati in creier, spatiul despartitor fiind umplut cu lichid cerebrospinal. In timpul dezvoltarii fetale, tesutul adiacent ventriculilor este o regiune proieminenta cu celule aflate in diviziune. ;a adult, acest tesut este mult mai mic, insa contine celule stem %#orshead C. #. si colab., 122,&. Al II- lea grup de celule stem din sistemul nervos central, descris la soareci, nu si la oameni se gaseste in linia de tesut care uneste ventriculii laterali cu bulbul olfactiv de la care pornesc semnale olfactive catre nas. ;a soareci, neuronii din bulbul olfactiv sunt constant inlocuiti %;ois C. A. si colab., ,>>3 ; ;us/in #. =. si colab., ,>>)&. A III- a posibila pozitionare a celulelor stem in creierul soarecilor, precum si la omul adult, se gaseste in hippocampus, o parte din creier care 'oaca un rol important in formarea tipurilor particulare de memorie %Eri/sson P. .. si colab., ,>>? ; @age 6. H. si colab., ,>>9&. Celulele stem din zona subventriculara a sistemului nervos central Celulele stem din sistemul nervos central care e$ista in creierul anterior ce incon'ura ventriculii laterali, sunt heterogene si se disting morfologic. Celulele ependimale, care sunt ciliate, contureaza ventriculii. Adiacent stratului celulelor ependimale, in zona subventriculara, e$ista o populatie de celule mi$ta formata din neuroblasti %neuroni imaturi& care migreaza in bulbul olfactiv, celule precursoare si astrocite. Cnele dintre celule se divid rapid, in timp ce altele se divid mult mai incet. Celulele astrocit-li/e pot fi usor identificate datorita continutului lor in proteina gliala fibrilara acida %@6AP&, in timp ce celulele ependimale se coloreaza pozitiv la nestina, care este cunoscuta ca mar/er pentru celulele stem neuronale. Ju este pe deplin cunoscut care din aceste celule poseda cele mai bune caracteristici pentru a fi denumite celule stem neuronale %Panicher #. si colab., 122,&. Cn studiu recent arata ca astrocitele din zona subventriculara a creierului de sobolan functioneaza ca celule stem neuronale. Celulele care prezinta mar/eri de astrocite genereaza neuroni in vivo, fiind identificati dupa mar/erii specifici neuronali. "eoarece aceste astrocite sunt capabile sa formeze ,?

neurosfere in vitro %grupuri de celule nediferentiate care pot fi disociate si diferentiate in neuroni sau celule gliale&, s-a a'uns la concluzia ca ele reprezinta de fapt celule stem %"oetsch 6. si colab., ,>>>&. .tudii similare in vitro bazate pe formarea neurosferelor au fost folosite pentru a identifica zona subependimala ca o sursa de celule stem a creierului adult de sobolan. Celulele stem din zona ventriculara a sistemului nervos central Cn alt grup de celule stem din creierul adult de sobolan il reprezinta celulele ependimale %0ohansson C. =. si colab., ,>>>&. Aceste celule sunt ciliate, captusesc ventriculii laterali si au fost considerate lipsite de capacitatea de a se divide, functionand ca parte componenta a barierei sangecreier %"el =igio #. R. si colab., ,>>9&. Intr-un studiu recent, care se bazeaza pe folosirea a doua tinte moleculare mar/erul fluorescent "iI si vectorul adenovirus lac 7 precum si a celulelor ependimale care captusesc interiorul sistemului nervos central s-a demonstrat ca acestea se comporta asemeni celulelor stem %@age 6. si colab., ,>>9&. Celulele stem din hipocampus Hipocampusul reprezinta una din cele mai vechi zone a corte$ului cerebral si 'oaca un rol important in unele forme de memorie. Regiunea din hipocampus in care e$ista celule stem, atat in creierul sobolanilor, cat si uman, este zona subgranulara. .tudiile facute la soareci, care foloseau bromdeo$iuridina pentru evidentierea celulelor aflate in diviziune in aceasta zona, au aratat ca apro$imativ 92 M din celulele care au incorporat colorantul se diferentieaza in celule care par a fi neuroni si ,9 M devin celule gliale. Restul celulelor care au incorporat bromdeo$iuridina nu prezinta un fenotip recunoscut. In mod interesant, multe, daca nu toate celulele din hipocampusul creierului adult evidentiate cu acest colorant e$ista langa vasele de sange. III... C$lul$l$ %t$& "i &a"u,a o%oa%a %i %a )$ .e cunoaste de multa vreme ca maduva osoasa contine celule stem %=ec/er A. 0. si colab., ,>B) ; (ill 0. E. si colab., ,>B,& o populatie de celule stem hematopoietice responsabila de formarea tuturor tipurilor celulare din sange, precum si o populatie mi$ta de celule stromale ce confera suport celulelor hematopoietice si are capacitatea de a genera oase, cartila'e, grasime, tesut conectiv fibros, neuroni %6riedenstein A. 0. si colab., ,>BB ; 6riedenstein A. 0. si colab., ,>A2 ; !5en #. si colab., ,>?? ; .anchez-Ramos 0. si colab., 1222 ; 4oodburD ". si colab., 1222&. Izolarea acestora se realizeza in functie de prezenta mar/erilor de suprafata, cat si de abilitatea de a forma monostrat in ,>

cultura. Recent a fost izolata din sangele circulant cu originea in maduva osoasa o populatie de celule progenitoare cu capacitatea de a se diferentia in celule endoteliale %.hi N. si colab., ,>>?&. Afirmatia ca acesti progenitori ai celulelor endoteliale, care se aseamana cu angioblastii ce formeaza vasele de sange in timpul dezvoltarii embrionare, reprezinta o populatie de celule stem adulte din maduva osoasa este inca neconfirmata. "in acest motiv se presupune ca in maduva osoasa e$ista trei populatii de celule stem celule stem hematopoietice, celule stromale si posibil progenitori ai celulelor endoteliale %fig.B - "iferentierea celulelor stem stromale si hematopoietice&. In sangele circulant s-au identificat doua tipuri de celule stem, insa nu s-a demonstrat ca au originea in maduva osoasa. ! populatie, numita pericite, pare a fi inrudita cu celulele stromale medulare, insa originea lor ramane inca necunoscuta %=ianco P. si colab., ,>>>&. A II - a populatie de celule stem hematopoietice, evidentiata in patru specii testate porci de guineea, soareci, iepuri si om, asemanatoare cu celulele stromale, poate genera os si cartila' %;ois C. si colab., ,>>3&.

%preluat dupa(erese 4insla5, ;Ddia <ibiu/, 122,& 6ig. B - "iferentierea celulelor stem stromale si hematopoietice

12

III.4. C$lul$l$ %t$& 2$&atopoi$ti#$ "intre toate tipurile celulare din organism, cele care supravietuiesc pentru perioade scurte de timp sunt celulele sangelui si unele tipuri de celule epiteliale. .pre e$emplu eritrocitele, care isi pierd nucleul, traiesc apro$imativ ,12 de zile in circulatie. 8iata unui organism depinde de abilitatea acestor celule precum si a altora din sange de a fi inlocuite continuu. Acest proces de inlocuire se realizeaza in maduva osoasa, unde celulele stem hematopoietice sunt produse, se divid si se diferentieaza in toate tipurile celulare din sange. .-a constatat ca celulele stem hematopoietice si cele din sange au acelasi traseu din maduva osoasa in sange si inapoi, fiind sub influenta unor factori secretori care regleaza proliferarea, diferentierea si migrarea lor. Celulele stem hematopoietice au capacitatea de a reconstitui sistemul hematopoietic al unui soarece supus unor doze letale de radiatii. .-a demonstrat astfel ca aceste celule stem pot reface in intregime sangele %=ec/er A. 0. si colab., ,>B); (ill 0. E. si colab., ,>B,&. Celulele stem hematopoietice sunt definite prin abilitatea lor de autoreannoire si de a forma toate tipurile celulare prezente in sange. ! singura celula stem este capabila sa regenereze un intreg sistem hematopoietic. "e-a lungul anilor, nenumarate combinatii de mar/eri de suprafata au fost folositi pentru a identifica, izola si purifica celulele stem hematopoietice derivate din maduva osoasa sau sange. Celulele stem hematopoietice nediferentiate si progenitorii acestora e$prima c-/it, C" )3, H-1<, neprezentand de obicei mar/erii ;in, sau e$prima intr-un nivel foarte scazut ;in-. Rezultate incura'atoare in cazul transplanturilor celulare l-au avut celulele C")3O, (hD,O, ;in-. Pana in prezent au fost identificate doua tipuri de celule stem hematopoietice cu viata lunga, cu activitate telomerazica crescuta si care prolifereaza pe intreaga viata a unui organism si al II-lea tip, cu viata scurta, ele proliferand pe perioade limitate, probabil cateva luni. Celulele stem hematopoietice cu viata scurta se diferentieaza in precursori limfoizi si mieloizi. Precursorii limfoizi se diferentieaza in celule (, =, J<, aceste mecanisme fiind inca investigate %A/ashi <. si colab., ,>>>&. Precursorii mieliozi se diferentieaza in monocite, macrofage, neutrofile, eozinofile, megacariocite, eritrocite %A/ashi <. si colab., 1222&. In vivo, celulele stem hematopoietice din maduva osoasa se diferentieaza in celule mature, specializate ale sangelui, care circula constant din maduva osoasa in sange si inapoi in maduva osoasa %"omen 0. si colab., ,>>>&. .-a demonstrat recent ca celulele stem hematopoietice cu viata scurta reprezinta o populatie heterogena cu capacitate de autoreannoire si de a repopula sistemul hematopoietic %@uenechea @. si colab., 122,&. Incercarile de a induce proliferarea celulelor stem hematopoietice in vitro pe numeroase substraturi, inclusiv cele care mimeaza conditiile din stroma au fost sortite esecului multi ani. .-a constatat ca aceste celule prolifereaza in vitro, insa de obicei se diferentieaza sau mor %"omen 0. si 1,

colab., ,>>>&. "e aceea ma'oritatea studiilor despre celulele stem hematopoietice vizeaza factorii, interactiile celula-celula si celula-matrice care controleza proliferarea si diferentierea lor in vivo, sperand ca aceste conditii pot fi obtinute si in vitro. #a'oritatea factorilor solubili care regleaza diferentierea celulelor stem hematopoietice in vivo sunt citochine, produse de diferite tipuri celulare si apoi concentrate in maduva osoasa in matri$ul e$tracelular al celulelor stromale - locul formarii sangelui %Hunt P. si colab., ,>?A ; 4hitloc/ C. A. si colab., ,>?A&. Cele mai studiate citochine sunt factorul stimulator de colonii granulocite-macrofage %@#-C.6& si interleuchina ) %I;-)& %@ordon #. P. si colab., ,>?A ; Roberts R.,si colab., ,>??&. "e asemenea importante in proliferarea si diferentierea celulelor stem hematopoietice sunt interactiile acestor celule cu moleculele de adeziune din matri$ul e$tracelular din stroma medulara %RoD 8. si colab., ,>>> ; 8erfaillie C. #. si colab., ,>>? ; 7andstra P. 4. si colab., 1222&. III.3. C$lul$l$ %t!o&al$ "i &a"u,a o%oa%a Celulele stromale din maduva osoasa detin un rol important in diferentierea celulelor mature e$istente in sange din celule stem hematopoietice %fig.3 "iferentierea celulelor stem stromale si hematopoietice&. In afara faptului ca furnizeaza un mediu propice pentru diferentierea celulelor stem hematopoietice, celulele stromale medulare pot genera cartila', os, tesut adipos, precum si celule endoteliale %6riedenstein A. 0. si colab., ,>BB; 6riedenstein A. 0. si colab., ,>B?;!ghushi H. si colab., 1223; !s5ald 0. si colab., 1223; .un .. si colab., 1223&. Ramane inca o problema daca celulele stromale pot fi clasificate drept celule stem sau progenitori celulari prezenti in maduva osoasa. "e asemenea, nu este pe deplin cunoscut daca celulele stromale medulare si celulele stem mezenchimale reprezinta aceeasi populatie celulara %Pittenger #. 6. si colab., 122,&. Celulele stem mezenchimale pot prolifera timp indelungat in cultura si dupa perioade lungi in vitro isi pastreaza capacitatea de diferentiere in adipocite, condroblaste, osteoblaste %@ronthos .. si colab., 122)&. In urma analizelor de biologie moleculara s-a constatat ca acestea e$prima gene specifice celor trei straturi embrionare mezoderm, ectoderm, endoderm, precum si gene specifice celulelor Acesta e$presie genica s-a dovedit caracteristica germinale %4oodburD ". si colab., 1221&.

celulelor stromale. In urma acestor rezultate s-a constatat ca celulele stem stromale au de'a capacitate de multidiferentiere, iar pentru diferentierea intr-o anumita directie fiind necesara doar reglarea cantitativa a patternului e$presiei genelor e$istente. Celulele stromale din maduva osoasa prezinta numeroase caracteristici care le deosebesc de celulele stem hematopoietice. Astfel, cele doua tipuri celulare sunt usor de separat in vitro. "upa ce maduva osoasa este disociata si celulele medulare sunt insamantate cu densitate scazuta, celulele 11

stromale adera la suprafata vasului de cultura, in timp ce celulele stem hematopoietice cresc in suspensie. In vitro, cultivate in conditii specifice, celulele stromale medulare formeaza colonii provenite dintr-o singura celula numita unitate formatoare de colonii %C6C-6&. Aceste colonii pot fi ulterior diferentiate in adipocite sau pot forma stroma medulara. .pre deosebire de celulele stem hematopoietice, care nu se divid in vitro %sau prolifereaza pe o perioada scurta de timp&, celulele stromale pot realiza )9 dublari de populatii in vitro %=ruder .. P. si colab., ,>>A&. Aceste celule prolifereaza rapid sub influenta unor mitogeni ca factorul de crestere derivat din plachete %P"@6&, factorul de crestere epidermal %E@6&, factorul bazic de crestere din fibroblaste %b6@6& si factorul de crestere insulin - li/e, %I@6,& %=ianco P. si colab., 122,&. Este practic imposibila izolarea unei populatii pure de celule stromale din maduva osoasa. #ultitudinea de mar/eri folositi pentru identificarea acestor celule include receptori pentru citochine %interleuchina-,, ), 3, B si A&, receptori pentru proteinele din matricea e$tracelulara, %ICA#-, si 1, 8CA#-,, integrienle Q ,, 1 si ) si R- ,, 1, ) si 3& % #c<aD R.&. Recent s-a obtinut izolarea celulelor mezenchimale din sangele din cordonul ombilical. Asemeni celulelor din maduva osoasa si acestea formeaza colonii care pot realiza cel putin 12 dublari de populatie, putand fi mentinute in vitro timp de opt pasa'e. Prezinta capacitate de diferentiere osteogenica si condrogenica, insa este redusa diferentierea adipogenica, comparativ cu celulele mezenchimale din maduva osoasa %=iebac/ <. si colab., 1223&. .-a consatat de asemenea ca celulele C")3- izolate din sangele din cordonul ombilical pot forma celule endoteliale %#urga #. si colab., 1223&. Asemeni celulelor stem hematopoietice, celulele stromale din maduva osoasa deriva din mezoderm in timpul dezvoltarii embrionare ; insa cu toate acestea nici un precursor sau celula stem stromala nu au fost izolate si identificate. Cna dintre teoriile care dezbat originea acestora este aceea ca un tip comun de celula progenitoare - probabil o celula primordiala endoteliala care margineste vasele de sange embrionare - da nastere atat celulelor stem hematopoietice, cat si precursorilor mezodermali. #ai tarziu acestia se pot diferentia in precursori miogenici %celule satelit care se presupune ca functioneaza ca celule stem in muschii scheletici & si celule stromale din maduva osoasa %=ianco P. si colab., ,>>>&. In vivo, diferentierea celulelor stromale in tesut adipos si osos nu este deloc simpla. Adipocitele din maduva osoasa si celulele stromale care functioneaza ca mielosuport - ambele derivate din celulele stromale din maduva osoasa - pot fi privite ca fenotipuri alternative %=ianco P. si colab., ,>>> ; =ianco P si Riminucci, ,>>>&. Adipocitele nu se dezvolta decat in timpul vietii postnatale, cand oasele se maresc si cavitatea medulara creste pentru a sustine hematopoieza. Cand cresterea 1)

scheletului inceteaza iar numarul celulelor stem hematopoietice descreste fata de cel normal, fenomen dependent de varsta, celulele stromale din maduva osoasa se diferentieaza in adipocite, care au rolul de a umple spatiile libere. 6ormarea noului os este evident mai accentuata in timpul cresterii scheletului, desi turn-overul tesutului osos dureaza intreaga viata. Ju este pe deplin cunoscuta relatia dintre osteoblaste %celulele formatoare de os& si celulele stromale din maduva osoasa. .e presupune ca osul trabecular nou format, care reprezinta regiunea interioara a osului in apropierea maduvei, se dezvolta prin actiunea celulelor stromale din maduva osoasa. .uprafata e$terioara a osului prezinta de asemenea turn-over, ca si osul din apropierea sistemului Haversian, desi nici una din aceste suprafete nu este in contact cu celulele stromale medulare. III.4. C$lul$l$ %t$& a"ult$ "i alt$ t$%utu!i Este deosebit de greu, daca nu imposibil sa se faca distinctia intre celulele stem adulte specifice unui tesut si progenitorii celulari. III.6.1 Progenitorii endoteliali celulari Celulele endoteliale marginesc suprafata intrena a vaselor de sange. .-a dovedit dificil de identificat celule stem endotelilale atat in embrion, cat si in organismele mamiferelor adulte. In timpul dezvoltarii embrionare, imediat dupa stadiul de gastrula, se formeaza un tip celular numit hemangioblast, derivat din mezoderm, care se presupune ca reprezinta precursorul liniilor hematopoietice si endoteliale. 8asculatura embrionului formata in acest stadiu consta din insule sanghine in sacul vitelin, insa hemangioblastii nu au fost izolati din embrioni, iar e$istenta lor ramane inca sub semnul intrebarii. Evidentele prezentei hemagioblastilor provin din studiile efectuate pe celule stem embrionare de soarece care sunt direct diferentiate in vitro. Aceste studii arata ca un precursor celular derivat din celule endoteliale de soarece care e$prima 6l/-, %receptor pentru factorul de crestere vascular endotelial - 8E@6& poate da nastere atat celulelor sangelui, cat si celulelor vaselor de sange %.halabD =. si colab., ,>>9 ; Pamashita si colab., 1222&. Atat 8E@6 , precum si factorul de crestere pentru fibroblasti 1 - 6@6-1 detin un rol crucial in diferentierea celulelor endoteliale in vivo %Poole (. 0. si colab., 122,&. .tudii recente au demonstrat ca maduva osoasa contine celule care dau nastere vaselor de sange in tesuturile ischemice %leziuni provocate prin deprimare de sange si o$igen& %Ashara (. si colab., ,>B) ; 6ol/man 0. si colab., ,>>? ; <al/a C. si colab., 1222 ; (a/ahashi (. si colab., ,>>>&. Ramane insa o necunoscuta care dintre tipurile celulare din maduva osoasa induce angiogeneza. 13

.-a observat ca celulele umane derivate din maduva osoasa in'ectate in coada sobolanilor cu ischemie cardiaca indusa, migreaza in inima, unde genereaza noi vase de sange in zona infarctata, inducand astfel angiogeneza. .-a reusit izolarea progenitorilor endoteliali din sangele periferic folosindu-se anticorpi specifici pentru C")3 si 6l/-,. Aceste celule erau mononucleate, C")3O si 6l/O. In cultura se ataseaza de substrat, devin fuziforme si formeaza structuri tubuli-li/e asemanatoare vaselor de sange. (ransplantate in soareci apartinanad aceleiasi specii %transplant autolog& cu ischemie indusa e$perimental, celulele din maduva ososasa C")3 O promoveaza formarea noilor vase %Asahara (. si colab., ,>>A&. Astfel celulele adulte C")3O si 6l/Odin maduva osoasa functioneaza in unele cazuri asemeni celulelor stem, de obicei aceste celule fiind privite drept progenitori celulari. III.6.2 Celulele stem din muschii scheletici #uschiul scheletic, ca si muschiul cardiac si muschiul neted din peretii vaselor de sange este derivat din mezoderm. .-a constatat ca e$ista cel putin trei populatii de celule stem in muschiul scheletic celulele satelit, celulele din peretele aortei dorsale si asa numita K side population L , observata si in maduva osoasa si ficat, cu abilitatea de a regenera tesutul muscular %Asa/ura A. si coalb., 1221&. Celulele satelit participa in anumite conditii la innlocuirea mioblastilor si miofibrilelor, mediind si cresterea muschiului %.cultz E. , ,>>B&. .-a constatat de asemenea, ca muschiul adaposteste, alaturi de celulele stem specifice si alte celule stem ; celule stem hematopoietice care migreaza din maduva osoasa si sangele periferic. Celulele stem derivate din muschi au fost izolate si folosite in modele animale in regenerarea osoasa si musculara %;ee 0P., 1222&. In urma studiilor efectuate pe modele animale de distrofie musculara s-a descoperit o populatie de celule stem derivate din muschi cu capacitate de regenerare musculara %(orrente P., 122,&. .-a dovedit ca stimularea regenerarii musculare cu celule stem derivate din muschi este mai crescuta dupa in'uria tesutului %Nu-Petersen 7., 1221 ; Poless/aDa A., 122)&. "atorita asemanarilor dintre muschiul scheletic si miocard, celulele stem derivate din muschi au fost folosite in refacerea cardiaca, observandu-se ca bataile cardiace sunt necesare pentru diferentierea celulelor stem musculare scheletice in cardiomiocite %At/ins, =., ,>>>; Ii'ima P., 122)&. Rezultate pozitive au fost obtinute in clinica prin utilizarea celulelor musculare scheletice in repararea leziunilor cardiace.

19

III.6. . Celulele stem din ficat E$ista similitudini intre ficat si pancreas, ambele derivand din endoderm, similitudini care faciliteaza interconvertirea celulelor din cele doua tesuturi. .tudii recente au demonstrat ca un singur precursor celular derivat din endoderm poate genera atat pancreasul ventral, cat si ficatul %"eutsch @. si colab., 122,&. ;a mamiferele adulte, cele doua organe sunt constituite din multiple tipuri de celule diferentiate care provin din tipuri multiple de celule stem. Prin studii de inginerie genetica; sau adaugat gene provenite de la celulele pancreatice celulelor hepatice si s-a reusit convertirea ficatului in pancreas %Pang ;, si colab., 1221&. Celule stem hepatice de soarece au putut fi convertite in vitro in celule pancreatice secretoare de insulina. (ransplantate in soareci cu diabet indus e$perimental, aceste celule au capacitatea de a restabili concentratia normala de glucoza in sange. "e asemenea, s-a constatat ca celulele stem hepatice in'ectate in inima pot forma miocite % #alouf JJ. si colab.,122,&. III.6.!. Celulele stem pancreatice Interconvertirea intre pancreas si ficat a fost demonstrata folosindu-se celule stem din pancreas. .a observat ca la soareci celulele stem pancreatice pot repopula un ficat afectat si pot corecta bolile hepatice metabolice %4ang, I. si colab., 122,&. Cna din posibilitatile de tratament a diabetului ar consta in identificarea unei celule stem care poate regla nivelul insulinei secretate intr-o maniera dependenta de glucoza. .-a reusit in acest sens prelevarea de insule pancreatice de la cadavre care au fost apoi transplantate la pacienti cu rezultate pozitive, insa devine necesar gasirea de noi surse de celule secretore de insulina. .-a demonstrat ca pancreasul insusi contine celule stemGprogenitori celulari care pot regenera atat in vivo, cat si in vitro celulele secretoare de insulina. Cn rol important in diferentierea celulelor stem pancreatice il detine glucagonul %=onner-4eir .. si colab., 1222&. .-a observat ca acelasi hormon poate induce diferentierea celulelor epiteliale intestinale de soarece in celule secretoare de insulina in vitro, iar aceste celule s-au dovedit folositoare atunci cand sunt tranplantate la soarecii diabetici %.uzu/i A. si colab., 122)&. In afara celulelor stem din pancreas si din intestin, s-au dovedit capabile de a secreta insulina si reface pancreasul lezat si alte tipuri de celule stem adulte celulele stem din maduva osoasa si ficat %<ale .. si colab., 122) ; ;in 6. si colab., 122) ; Pang ;. si colab., 1221&. III.6.". Celulele stem din limbul corneal In prezent, celulele stem din limbul corneal sunt folosite in inlocuirile de cornee. Aceste celule pot fi mentinute si multiplicate in cultura, crescute pe membrane amniotice pentru a forma noi cornee si 1B

apoi pot fi transplantate la pacienti cu rezultate incura'atoare %(sai si colab., 122,& . Cn studiu recent arata ca celulele stem din cornee manifesta proprietati functionale asemanatoare celulelor neuronale in cultura %.eigel @# si colab., 122)&. III.6.6. Celulele stem mamare E$perimente facute pe celule stem mamare din soarece au artat ca acestea pot fi propagate in vitro si se pot diferentia in cele trei linii epiteliale mamare %"ontu @. si colab., 122)&. Profilul transcriptional al acestor celule arata e$presii genice similare cu cele ale celulelor stem din maduva osoasa. .unt studii care atesta ca celulele stem umane si cele provenite de la soareci e$ista ca o populatie *side+, asemanatoare cu cele observate in maduva osoasa, ficat si celulele stem musculare %Alvi A0. si colab., 122)&. In cultura, populatia K side L de celule stem mamare poate forma structuri ductale epitelilale. III.6.#. Celulele stem din glandele salivare .tudii recente au aratat ca celulele stem pot fi izolate si din glandele salivare si propagate in vitro %!/umura <. si colab., 122)&. In functie de conditiile de cultivare celulele pot e$prima gene specifice ficatului sau pancreasului ; in'ectate in sobolani s-a observat ca acestea se integreaza in tesutul hepatic. III.6.$. Celulele stem din piele Celulele stem adulte multipotente au fost izolate din derm si foliculii firului de par de la sobolani %(oma 0@. si colab., 1221&. .-a observat ca acestea 'oaca un rol important in mentinerea structurii foliculilor firelor de par si a epidermei, pot fi propagate in vitro, iar celulele stem izolate clonal se pot diferentia in cultura in neuroni, celule gliale, celule musculare netede si adipocite. III.6.%.Celulele stem din tendoane Cn studiu recent atesta izolarea unei linii de celule stem din tendonul de soarece. Celulele prezinta o morfologie similara cu a celulelor mezenchimale, gene cu potential de e$primare osteogenic, condrogenic si adipogenic, similare cu cele din celulele stem mezenchimale din maduva osoasa %.alingcarnboriboon R. si colab., 122)&.

1A

III.6.1&.Celulele stem din membranele sinoviale .-a reusit izolarea celulelor stem din membrane sinoviale umane, care s-au dovedit a fi multipotente, avand inclusiv potential miogenic %"e =ari C. si colab., 122,&. Celulele stem in'ectate in circulatia sanghina se pot incorpora in muschi, capata fenotip muscular si au capacitatea de a repara leziunile musculare %"e =ari C. si colab., 122)&. III.6.11.Celulele stem din cartila' =iopsiile provenite din cartila'e umane plasate in cultura sufera un proces de dediferentiere in condrocite primitive cu fenotip de celule stem mezenchimale %Robinson ". si colab., 122,&. Aceste condrocite au fost folosite in transplanturi in repararile cartila'elor articulare colab., 1221&. III.6.12.Celulele progenitoare din timus Recent s-a obtinut izolarea progenitorilor epiteliali din timus %=ennett AR. si colab., 1221&. @refarea acestor celule in soreci determina producerea tuturor tipurilor de celule epiteliale din timus, precum si homingul limfocitelor (. III.6.1 . Celulele stem din pulpa dentara .-a constatat ca celulele stem izolate din pulpa dentara adulta pot fi propagate in vitro si au capacitate de proliferare rapida %@ronthos .. si colab., 1222&. "e asemenea, prezinta similaritati cu celulele stem mezenchimale din maduva osoasa, ; cand sunt in'ectate in soareci imunodeficienti celulele stem adulte din pulpa dentara formeaza initial structuri dentin-li/e incon'urate de tesut interstitial pulpar. ! alta sursa de celule stem o reprezinta dintii prelevati de la copii in primele luni de viata %#iura #. si colab., 122)&. In vitro aceste celule pot genera ; neuroni, adipocite, odontoblasti, iar dupa in'ectarea in soareci imunodeficienti, acestea participa la formarea osului, dentinei si celulelor neuronale. III.6.1!.Celulele stem derivate din tesutul adipos Cna dintre cele mai interesante surse de celule stem umane o reprezinta tesutul adipos, in particular grasimea liopsuctionata. Aceste celule pot fi mentinute in cultura perioade indelungate, au o morfologie mazenchimal-li/e si se pot diferentia in vitro in tesut adipos, cartila', muschi si tesut afectate si in tratamentul copiilor cu osteogenesis imperfecta %Hor5itz E#. si colab., ,>>> ; Hor5itz E#. si

1?

osos %7u/ PA. si colab., 1221; @uila/ 6. si colab., 1223&. "e asemenea, s-a s-a demonstrat ca aceste celule se pot diferentia si in neuroni %7u/ PA. si colab., 1221&. III.6.1".Celulele stem din sangele cordonului ombilical 6olosirea celulelor stem din cordonul ombilical a cunoscut un real interes in ultimul timp. Acestea reprezinta surse pentru transplanturile sanghine similare cu transplanturile de celule stem medulare, fiind folosite cu succes in tratamentul anemiei %<urtzberg 0. si colab., ,>>B&. .angele din cordonul ombilical prezinta o imunogenicitate mai scazuta comparativ cu cel din maduva osoasa, datorita probabil nivelului crescut de interleu/ina,2 %Rainsford E. si colab., 1221&. ! alta posibilitate de a determina scaderea re'ectiei se poate obtine in cazul in care transplanturile de celule stem din sange de cordon ombilical prezinta o e$presie scazuta de beta-1-microglobulina %=eerheide 4. si colab., 1221&. .-a constatat ca aceste celule pot fi crioprezervate timp indelungat %,9 ani& pastrandu-si aceleasi proprietatile functionale %=ro$meDer HE. si colab., 122)&. .imilitudini cu celulele stem medulare prezinta si in ceea ce priveste potentialul de diferentiere in alte tipuri celulare. Celulele stem umane din sange din cordon ombilical poseda mar/eri neuronali, iar administrarea lor intravenoasa in modele animale ischemice a determinat recuperarea functionala a acestor animale %Chen 0 si colab., 122,&. Cn studiu recent a artat ca o linie progenitoare de celule stem neuronale derivata din celule din sange de cordon ombilical poate fi mentinuta in cultura timp de doi ani fara pierderea capacitatii de diferentiere %=uzans/a ;. si colab., 122)&. Alte studii atesta diferentierea celulelor hepatice functionale din celule stem din sangele cordonului ombilical %<a/inuma .. si colab., 122)&. Celulele stem mezenchimale din cordonul ombilical .-a constatat ca si celulele din matri$ul cordonului ombilical prezinta capacitate de autoreannoire. Aceste celule prezinta mar/eri tipici celulelor stem %c-/it& si activitate telomerazica crescuta, pot realiza in vitro ?2 de dublari de populatie si pot fi induse sa formeze neuroni %#itchell < si colab., 122)&. (ransplantate in sobolani, celulele e$prima mar/eri neuronali si se integreaza in creier %4eiss #; si colab., 122)&. Celulele stem amniotice 6luidul amniotic contine celule stem care pot prelua proprietati neuronale atunci cand sunt in'ectate in creier %#itchell <. si colab., 122)&. Recent s-a reusit izolarea acestor celule din fluidul

1>

amniotic si s-a constatat ca ele e$prima !ct-3, gena tipica celulelor stem pluripotente %Prusa A-R . si colab., 122)&.

Capitolul IV 0 CELULELE STEM 5EMATO1OIETICE

IV.1. I t!o"u#$!$ Celulele sangelui sunt responsabile pentru mentinerea constanta si protectia imuna a tuturor tipurilor celulare din organism. Aceste celule, alaturi de cele din piele prezinta o mare capacitate de autoreannoire comparativ cu oricare alt tesut adult. Celulele stem care formeaza sangele si celulele sistemului imunitar sunt cunoscute drept celule stem hematopoietice. Acestea sunt responsabile de innoirea constanta a sangelui - productia bilioanelor de noi celule sanghine din fiecare zi. .peranta ca numeroase boli pot fi candva tratate cu a'utorul terapiei cu celule stem este inspirata de succesul transplanturilor cu celule provenite din maduva osoasa in cresterea ratei de supravietuire a pacietilor cu leucemie si alte forme de cancer, incluzand boli ale sistemului imun si ale sangelui %(homas si =lume, ,>>>&. IV.2.C$ %u t #$lul$l$ %t$& 2$&atopoi$ti#$ ' Celulele stem hematopoietice reprezinta celule izolate din maduva osoasa cu capacitate de autoreannoire, se pot diferentia intr-o varietate de tipuri celulare specializate, pot fi mobilizate in sangele circulant si isi pot incheia viata prin apoptoza - moarte celulara programata. Celulele stem hematopoietice au fost descoperite si caracterizate inca din anul ,>B2. "eoarece in cultura acestea arata si se comporta asemeni celulelor albe ale sangelui, s-au dovedit foarte greu de identificat dupa morfologie %dimensiuni si forma&. .tudiile pe soareci au avut un rol deosebit in elucidarea proprietatilor celulelor stem hematopoietice. Astfel, s-a observat ca numai una din ,2.222 - ,9.222 de celule din maduva osoasa este o celula stem, in sangele circulant, proportia fiind mult mai mica o celula stem la ,22.222 celule ale sangelui. Astazi se incearca gasirea unor teste prin care sa se evidentieze capacitatea de autoreannoire si plasticitatea celulelor stem hematopoietice. Jumeroase studii au evidentiat prezenta a doua tipuri de celule stem hematopoietice cu viata lunga, capabile de autoreannoire si cele cu viata scurta. Celulele stem cu viata lunga introduse in animale al caror sistem hematopoietic a fost iradiat, au capacitatea de a reface acest sistem in cateva luni. Celulele stem hematopoietice cu viata scurta pot regenera imediat toate tipurile celulare prezente in )2

sange, insa in conditii normale nu se pot autoreannoi, fapt pentru care li s-a acordat denumirea de progenitori G precursori cu viata scurta. Progenitorii G precursorii sunt in general celule imature care pot forma anumite tipuri celulare complet diferentiate. .unt capabili de proliferare, insa au capacitate limitata de diferentiere in mai mult de un singur tip celular. .pre e$emplu ; un progenitor celular poate forma o celula rosie din sange %fig.A - "iferentierea celulelor stem hematopoietice &.

% preluat din *.tem cells and the future of regenerative medicine+, 122,& 6ig. A - "iferentierea celulelor stem hematopoietice IV...C$lul$l$ %t$& 2$&atopoi$ti#$ pot *i i"$ ti*i#at$ #u a6uto!ul &a!/$!ilo! #$lula!i' E$ista o mare dificultate in identificarea celulelor stem hematopoietice. 6ie datorita e$istentei tipurilor multiple de celule stem, fie aspectului asemanator al acestora cu al altor specii celulare prezente in sange sau in maduva osoasa. Cel mai folosit criteriu in identificarea celulelor stem hematopoietice s-a dovedit a fi evidentierea mar/erilor de suprafata specifici.

),

Inca din anul ,>?? a fost identificat un set de mar/eri proteici prezenti pe suprafata celulelor stem sanghine de la soareci cu viata lunga %long-term& %.pangrude @.R. si colab., ,>??&. Clterior s-a descoperit un set de mar/eri specifici celulelor stem umane %=aum C. #. si colab., ,>>1&. 4eissman introduce pentru identificarea celulelor stem hematopoietice un set de mar/eri apropiati atat celulelor de soarece, cat si celulelor umane % tabelul nr. 1& %4eissman I. ;., comunicare personala&. (abelule nr. 1 - #ar/erii celulari de suprafata propusi pentru identificarea celulelor stem hematopoietice nediferentiate Soa!$#$ C")3 C")3 .CA- ,O C"9>O (hD, OGlo5 (hD,O O C")? C")?lo5GC-/itO C-/it-Glo5 linlin- numai o familie de mar/eri C"9> a fost evaluata
lo5GO

O&

;in - mar/erii celulelor lipsesc din ,), ,3 linii mature sanghine

(abelul cuprinde mar/erii de suprafata ai celulelor stem hematopoietice uname si de soarece aflate in stadiu nediferentiat, mar/eri prezenti atat in vivo, cat si in vitro. Cand celulele incep sa se diferntieze ca linii celulare distincte, mar/erii de suprafata nu mai sunt prezenti. @rupul celulelor sortate dupa mar/erii de suprafata este heterogen si cuprinde celule stem cu viata lunga capabile de autoreannoire, unii progenitori cu viata scurta si cateva celule non-stem. IV.4. Su!%$ "$ #$lul$ %t$& 2$&atopoi$ti#$ I(.!.1. )aduva osoasa .ursa clasica de celule stem hematopoietice o reprezinta maduva osoasa. (ransplanturile de maduva osoasa se practicau inca in urma cu patruzeci de ani. Celulele erau recoltate prin punctie osoasa, cu precadere in creasta iliaca. .-a dovedit ca una din ,22.222 celule din maduva osoasa este o celula capabila de multiplicare pe termen lung, celula formatoare de sange. Alte celule fiind reprezentate de celule stromale, celule progenitoare ale sangelui, precum si celule mature sau in curs de maturare albe si rosii.

I(.!.2. *angele periferic )1

! alta sursa de celule stem sanghine, folosita in clinica o consituie sangele periferic, circulant. Este cunoscut de multa vreme ca un numar scazut de celule stem si progenitori celulari circula in sangele periferic, insa in urma cu zece ani s-a descoperit ca se poate determina migrarea celulelor stem din maduva osoasa in sange prin administrarea unei citochine, cum ar fi factorul stimulator de colonii granulocitare %@C.6&. .-a observat ca 9 pana la 12M din celulele recoltate sunt reprezentate de celule stem hematopoietice. In ultimii ani se pune un accent tot mai mare pe transplanturile autologe sau alogene cu celule nucleate sanghine recoltate din sangele periferic. .-a observat %constatat& ca sangele periferic contine de doua ori mai multe celule stem hematopoietice decat maduva osoasa. Astfel, in cazul acestor transplante recuperarea se realizeaza mai repede. .-a constatat, de asemenea, ca celulele C")3O si (hD-,O purificate din sangele periferic se grefeaza rapid si fara complicatii in cazul pacientilor cu cancer mamar carora li s-a realizat un transplant autolog dupa chemoterapie %Jegrin R. .., si colab., 1222&. I(.!. . *angele din cordonul ombilical ;a sfarsitul anilor ,>?2, inceputul anilor ,>>2, s-a observat ca sangele din cordonul ombilical si placenta este bogat in celule stem hematopoietice. Acest tesut realizeaza dezvoltarea fetusului in timpul vietii intrauterine. Celulele stem recoltate din sangele placentar ombilical au fost folosite cu succes in realizarea transplanturilor %;aughlin #. 0. si colab., 122,&. "e asemenea, s-a demonstrat ca aceste celule stem, comparativ cu celulele stem din maduva osoasa sunt multipotente, avand capacitatea de a dezvolta celule din cele trei straturi embrionare, sau chiar din toate cele trei straturi embrionare endoderm, ectoderm, mezoderm %pluripotente&. Ju s-au descoperit pana in prezent diferente calitative intre celulele diferentiate provenite din celule stem hematopoietice recoltate din sangele din cordonul ombilical, sangele periferic si maduva osoasa. I(.!.!. *istemul hematopoietic fetal ! sursa de celule stem sanghine folosita in cercetare, insa nu si in clinica o reprezinta sangele fetal. Celulele hematopoietice apar timpuriu in dezvoltarea tuturor vertebratelor. #a'oritatea celulelor stem care e$ista in maduva osoasa adulta si in circulatie sunt derivate din celule care apar tarziu in cursul vietii intrauterine si localizate altundeva decat in sacul vitelin. Cele mai multe studii care vizeaza celulele stem fetale folosesc celule recoltate de la soareci sau alte animale, insa e$ista putine informatii despre celulele stem hematopoietice fetale si embrionare umane. In urma cu cativa ani s-au descris precursori hematopoietici in embrionii umani si mult mai recent celule stem ))

sanghine circulante in fetusii umani avortati in varsta de ,1 pana la ,? saptamani %HuDhn A. si colab., ,>>9 ; (avian #. si colab., ,>>B ; @allacher ; si colab., 1222 ; ;abastie #. C. si colab., ,>>? ; (avian #. si colab., ,>>B&. .-a constatat ca aceste celule prezinta mar/eri diferiti de cei ai celulelor fetale hepatice, din maduva osoasa sau cele din sangele din cordonul ombilical. I(.!.". Celulele stem embrionare si celulele stem germinale In anul ,>?9 s-a aratat ca este posibil sa se obtina precursori pentru multe tipuri celulare sanghine din celule stem embrionare de soarece %"oetschman (. si colab., ,>?9&. .-a reusit obtinerea in vitro a tuturor liniilor ma'ore de progenitori celulari din corpii embrioizi proveniti de la soareci, chiar si fara adaugarea factorilor de crestere hematopoietici %Per/ins A. C. si colab., ,>>?&. Cu toate acestea se cunosc putine date despre celulele stem embrionare umane si germinale. E$ista studii care atesta obtinerea progenitorilor sanghini din celule stem embrionare umane care insa nu pot fi cultivate in laborator %<aufman ". .. si colab., ,>>>&. .-a reusit diferentierea celulelor stem embrionare in celule sanghine, acestea avand capacitatea de a produce gamaglobulina %Its/ovitz-Eldor 0. si colab., 1222&. Celulele stem germinale pot genera in anumite conditii celule C")3O %.hamblott #. 0. si colab., 122,&. Celulele hematopoietice derivate din celule stem embrionare si germinale umane nu au fost riguros testate in privinta capacitatii lor proliferative pe termen lung si in ceea ce priveste abilitatea de a forma toate tipurile celulare sanghine. IV.3. Cu& "i*$!a #$lul$l$ %t$& 2$&atopoi$ti#$ #a!$ p!o,i "i %u!%$ "i*$!it$ ' .-a observat ca celulele stem hematopoietice recoltate din tesuturi aflate in stadii timpurii de dezvoltare prezinta o mare capacitate de autoreplicare, precum si o scazuta imunogenicitate. Populatiile de celule stem din maduva osoasa Ramane inca o necunoscuta fenomenul prin care celulele stem sanghine migreaza din locatiile timpurii in care se afla in timpul dezvoltarii fetale spre maduva osoasa adulta. .-a constatat ca numarul relativ de celule C")3O izolate din sangele cordului descreste cu varsta de gestatie, iar e$presia moleculelor de adeziune prezente la aceste celule este crescuta. .e presupune ca aceste schimbari ar determina pregatirea celulelor pentru homingul spre ficatul fetal si catre maduva osoasa %.urbe/ ". 8. si colab., 1222&. Aceste date sunt destul de controversate, insa e$ista studii pe soareci care arata ca celulele stem hematopoietice provenite de la animale batrane populeaza intr-un procent scazut maduva osoasa comparativ cu celulele stem recoltate de la animale adulte tinere %Chen 0. si colab., ,>>>&. "e asemenea, s-a demonstrat ca celulele fetale prezinta un procent de repopulare de 92 pana la ,22 mai )3

bun comparativ cu celulele recoltate de la animale tinere. Potentialul de repopulare a maduvei osoase s-a dovedit specific fiecarei varste, insa in ambele cazuri acesta descreste odata cu varsta %.udo <. si colab., 1222&. Rolul #$lul$lo! %t$& 2$&atopoi$ti#$ %i *a#to!ii i&pli#ati i a#ti,itat$a a#$%to!a ! celula stem hematopoietica prezinta patru caracteristici ,& se poate autoreannoi ; 1& se poate diferentia in alte tipuri celulare )& se poate mobiliza din maduva osoasa in circulatie %si inapoi& ; 3& poate sa-si incheie viata prin apoptoza. +utoreannoirea celulelor stem hematopoietice .-a dovedit dificil de multiplicat si mentinut in vitro celule stem capabile sa-si pastreze aceeasi capacitatea de autoreanniore si diferentiere cu cea e$istenta la celulele din organism. .-a observat ca in cultura apare diferentierea acestor celule catre progenitori ce formeaza diferite linii sanghine, care insa isi pierd capacitatea de autoreannoire. .e cunoaste ca celulele stem K adevarate L se divid si se innlocuiesc cu o rata scazuta in maduva osoasa adulta. .tudiul celulelor stem sanghine este foarte laborios tocmai datorita problemelor amintite mai sus. .-a observat ca pentru mentinerea in vitro a acestor celule este necesara folosirea factorilor de crestere. Astfel, s-a artatat ca doua citochine factorul celulelor stem si trombopoietina, determina diviziunea inegala, in urma careia una din celulele fiice rezultate da nastere unui descendent cu potential de autoreannoire. .-a observat, de asemenea ca activarea moleculei de semnalizare gp,)2 este critica pentru supravietuirea si proliferarea celulelor stem hematopoietice de soarece in cultura. 6olosirea in vitro a cito/inelor si moleculelor de adeziune specifice a determinat o usoara crestere a numarului celulelor stem . ,iferentierea celulelor stem hematopoietice in celule sanghine si celule specifice sistemului imun 6unctia principala a celulelor stem sanghine o constituie formarea celulelor albe si rosii prezente in sange. .-a constatat %calculat& ca in timpul producerii unei celule mature, circulanta, prezenta in sange, celula stem hematopoietica originala realizeaza intre ,A - ,>,9 diviziuni %#ac<eD #. C. , 122,&. Cn rol decisiv in diferentierea progenitorilor catre diferite tipuri celulare il detin factorii de crestre si citochinele. Acesti factori controleaza producerea celulelor sanghine prin cai comple$e ce vizeaza controlul e$presiei genice.

)igrarea celulelor stem hematopoietice in interiorul si in afara maduvei osoase si a tesuturilor

)9

.e cunoaste de multa vreme ca celulele stem hematopoietice se gasesc in cone$iune intima cu stroma medulara. Insa astfel de celule sunt prezente si in splina, circulatia periferica si alte tesuturi. Cone$iunile cu interstitiul maduvei osoase sunt importante in sustinerea transplanturilor cu celule stem, precum si pentru mentinerea acestora ca o populatie capabila de autoreannoire. Cone$iunile cu stroma sunt de asemenea, importante in proliferarea, diferentierea si maturarea celulelor sanghine %4hettton A. ". si colab., ,>>>&. .-a observat ca celulele stem care sunt mobilizate din maduva osoasa catre circulatia periferica sunt cu precadere celule care nu se divid %4right ". E. si colab., 122,&. #oleculele de adeziune din stroma 'oaca un rol important in mobilizare, in atasarea celulelor la stroma precum si in transmiterea semnalelor ce regleaza autoreannoirea celulelor stem hematopoietice si diferentierea progenitorilor %4ang #. 4. si colab., ,>>?&. Plasticiatea celulelor stem hematopoietice .-a reusit inducerea diferentierii celulelor stem hematopoietice din maduva osoasa in alte tipuri celulare creier, muschi si ficat %6ang (C. si colab., 1223&. .tudiile pe soareci au aratat ca grefele de maduva osoasa sau de celule stem sanghine s-au dovedit eficiente in regenerarea muschilor scheletici si cardiaci, precum si a ficatului lezat %=ittner R. E. si colab., ,>>>; ;agasse E. si colab., 1222&. Astfel, s-a reusit tratarea distrofiei musculare cu a'utorul transplantului de maduva osoasa provenita de la animale sanatoase. .-a demonstrat, de asemenea integrarea celulelor stem hematopoietice in alte tesuturi decat cel de origine. .-a dovedit ca o singura celula stem sanghina selectata poate determina mai mult decat repopularea maduvei osoase %<rause ". .. si colab., 122,&. Celulele stem hematopoietice pot creste si in alte tesuturi ca raspuns la infectii sau ca urmare a lezarilor produse in urma iradierilor.

CA1. V CELULELE STEM IN MEDICINA REGENERATIVA )B

V.1. T$!apia #u #$lul$ %t$& i (olil$ autoi&u $ ! atentie deosebita in cercetarea biomedicala este acordata bolilor autoimune. Ramane inca o enigma mecanismul care determina sistemul imun sa-si atace propriile celule, tesuturi, organe. Elucidarea acestei probleme este necesara in intelegerea bolilor autoimune ca artrita reumatoida, diabetul de tip I, lupusul eritematos sistemic si sindromul .'ogren. Cand unele dintre proteinele celulare din organism sunt recunoscute ca non-self de catre limfocitele ( %celule care apartin sistemului imun& este declansata o cascada distructiva inflamatorie %fig. ? - Raspunsul imun catre self si nonself&.

)A

%preluat dupa(erese 4inslo5, 122,& 6ig. ? - Raspunsul imun catre self si non self

)?

(erapiile curente folosite in combaterea acestor maladii se bazeaza pe deprimarea raspunsului imun facand astfel pacientii susceptibili pe parcursul intregii vieti la infectii. Astfel, se incearca abordarea unor noi tratamente care se bazeaza pe utilizarea celulelor stem urmarindu-se inlocuirea celulelor anormale cu astfel de celule care au capacitatea de a se diferentia in celule imunitare specifice. Cauza care determina aparitia acestor boli o constituie un dezechilibru intre inducerea si mentinerea unei tolerante imune scazute. Apare astfel o distrugere a celulelor si tesuturilor de catre limfocitele ( citoto$ice C"? sau de autoanticorpi, fenomen insotit si de un proces inflamator. Acest mecanism poate duce la distrugerea articulatiilor in artritele reumatoide, a celulelor beta pancreatice producatoare de insulina in diabetul de tip I, sau la afectarea rinichilor in lupusul eritematos sistemic. #ecanismul defectiv al inducerii si mentinerii tolerantei ramane inca neelucidat. .e stie ca printre cauzele aparitiei acestor boli le constituie factorii genetici, hormonali, precum si unele infectii %Cooper, @... si colab.,,>>?; @rossman, 0.#. si colab., 1222&. In prezent, tratamentul bolilor autoimune consta in administrarea medicamentelor antiinflamatoare, imunosupresive si agentilor imunomodulatori. In ciuda efectului asupra raspunsului imun, aceste terapii s-au dovedit in unele cazuri ineficiente, neobtinandu-se intotdeauna remisia bolii. ;eziunile mediate imun pot fi organ specifice, cum sunt cele din diabetul de tip I, caracterizat prin distrugerea celulelor beta pancreatice sau scleroza multipla datorata distrugerii tecii de mielina. (erapia acestora presupune repararea sau inlocuirea celulelor si tesuturilor lezate. .pre deosebire, bolile autoimune non-organ specifice, spre e$emplu, lupusul sunt caracterizate prin leziuni larg raspandite datorate reactiilor imune care au loc in multe organe si tesuturi. !bsatcolul ma'or in tratamentul acestora constituindu-l lipsa unei tinte specifice. In terapia lupusului sistemic eritematos se incearca distrugerea celulelor imune mature si autoreactive, urmand apoi innlocuirea acestora cu celule stem hematopoietice. Pentru a nu aparea probleme de histocompatibilitate sunt folosite transplanturile autologe. .-a constatat ca aceasta modalitate de reannlocuire poate insa altera sistemul imun al pacientului supus acesteia. Posibilitatea de a genera si propaga in numar mare celule stem sanghine in afara organismului, fie ca acestea provin din sange din cordon ombilical, surse adulte, fetale sau embrion furnizeaza siguranta, costuri mici precum si celule viabile. Cu toate ca celulele stem embrionare ofera avanta'e comparativ cu cele provenite din cordonul ombilical sau din maduva ososasa, celulele stem hematopoietice raman insa cele mai utilizate in astfel de terapii %Its/ovitz-Eldor si colab., 1222; .hamblott, #.0. si colab., 1222&. .e cunoaste ca )>

celulele stem hematopoietice, fie ca provin din sangele din cordonul ombilical, fie din maduva osoasa hematogena prezinta un potential de autoreannoire limitat comparativ cu cele embrionare , insa ofera avanta'ul ca pot fi prelevate de la indivizi sanatosi, cu factori de predispozitie genetica bine definiti. -erapia genica si celulele stem in bolile autoimune (erapia genica consta in modificarea genetica a celulelor cu scopul de a obtine un efect terapeutic. "JA-ul care contine genele terapeutice este introdus in vitro in celule, iar acestea sunt apoi administrate la animale sau la pacienti. Celulele preiau "JA-ul si vor incepe sa produca proteina terapeutica codificata de gena specifica. In acest fel se incearca modificarea raspunsului imun aberant caracteristic bolilor autoimune %PrudFhomme, @.0. ,1222 ; (so/os, @.C., 1222&. .unt folosite cel mai adesea doua strategii pentru modularea sistemului imun. Prima consta in blocarea citochinelor inflamatorii %secretate de celulele imune activate si de tesuturile inflamate& prin transferul unei gene intr-o celula care astfel *capteaza+receptorul specific citochinei respective. .au, o alta metoda consta in transferarea unei gene ce codifica o citochina antiinflamatoare, redirectionand astfel raspunsul imun autoinflamator catre o stare mult mai *toleranta+. In numeraose modele animale aceste abordari au evidentiat rezultate incura'atoare, avand de asemenea o contributie esentiala in intelegerea mecanismului care declanseaza aceste boli, precum si in identificarea citochinelor inflamatorii implicate in progresia bolilor %PrudFhomme, @.0. ,1222 ; (so/os, @.C., 1222&. E$ista insa unele probleme in terapia genica umana. .-a dovedit dificil de transferat materialul genetic in celule adulte, precum si producerea proteinei codificata de gena specifica la un nivel care sa poata anihila efectele bolii. .e incearca dezvoltarea unor noi metode pentru modularea imuna. In tratamentul lupusului eritematos sistemic s-a realizat modificarea celulelor stem hematopoietice sau tesuturilor cu un receptor specific citochinei inflamatorii interferon gama. .-a obtinut in acest fel regresia bolii pe modele animale %;a5son, =.R., 1222&. Abordari similare se incearca pentru prevenirea distrugerii progresive a articulatiilor si pierderea cartila'ului, precum si pentru repararea articulatiilor in modele animale de artrita reumatoida. Artrita reumatoida este o boala autoimuna caracterizata prin inflamarea acuta si cronica produsa de sistemul imunitar care ataca cu precadere articulatiile. .-a reusit transfectia celulelor dendritice cu gena care codifica citochina antiinflamatoare I; - 3 si apoi in'ectarea acestor celule secretoare de I; 3 in soareci care dezvolta artrita reumatoida. .e presupune ca celulele dendritice secretoare de I; 3 actioneaza pe limfocitele C"3 ( helper pentru a 32

reintroduce toleranta fata de proteinele proprii. .-a obtinut supresia completa a bolii, observandu-se ca I; 3 determina si blocarea resorbtiei osoase %o complicatie serioasa aparuta in artrita reumatoida& %<im, ..H. si colab., 122,&. Condrocitele, celulele formatoare de cartila', pot reprezenta o alta alternativa in terapia artritelor reumatoide cu celule stem. Aceste celule deriva din celule stem stromale medulare %Pittenger, #.6. si colab., ,>>>&. .unt putine date despre celulele intermediare care se diferentieaza apoi in condrocite. .e presupune ca o celula ideala capabila de refacerea cartila'ului ar fi o celula mai primitiva decat condrocitele, poate o celula stromala sau un intermediar aparut in cursul diferentierii celulare. "ate care sustin aceasta ipoteza au fost furnizate de studiile pe celule stem embrionare. Acestea se diferentieaza intr-un precursor care apoi formeaza celula stem stromala %.chuldiner, #. si colab., 1222&. .tudii efectuate pe modele animale de iepuri au demonstrat ca celulele stem stromale pot genera noi condrocite facilitand repararea cartila'ului afectat %Caplan, A.I. si colab., ,>>A&. E$ista insa doua obstacole ma'ore in folosirea celulelor stem stromale si condrocitelor in terapia artritei reumatoide numarul limitat al acestora, precum si dificultatile care apar la propagarea lor in vitro. V.2. C$lul$l$ %t$& i "ia($t "iabetul reprezinta un grup de simptome caracterizat prin nivele anormal de mari ale glucozei in sange. Acest e$ces de glucoza constituie cauza multor complicatii orbire, insuficienta renala, boli cardiace, infarct, neuropatie, amputatii. "iabetul de tip I, cunoscut si sub denumirea de diabet 'uvenil, este intalnit cu precadere la copii si tineri. Apare atunci cand sistemul imunitar ataca propriile celule distrugandu-le. Ca rezultat, celulele insulare ale pancreasului, care in mod normal produc insulina, sunt distruse. In absenta insulinei, glucoza nu mai poate patrunde in celule si se acumuleaza in sange. "iabetul de tip II, apare la adulti, la persoanele in varsta, sedentare, avand insa si o componenta ereditara. In acest caz organismul nu poate utiliza in mod eficient insulina. Apare astfel rezistenta la insulina, iar rezultatul este ca si in cazul diabetului de tip I - cresterea glucozei in sange. Pana in prezent nu e$ista nici un remediu pentru aceasta boala. Pacientii cu diabet tip I trebuie sasi administreze insulina de cateva ori pe zi si sa-si controleze concentratia glucozei de ) - 3 ori in cursul aceleiasi zile. "evine astfel foarte importanta monitorizarea frecventa, deoarece prin mentinerea unui nivel de glucoza in sange cat mai apropiat de cel normal se reduce semnificativ

3,

riscul aparitiei complicatiilor. "e asemenea, este necesar ca persoanele cu diabet de tip II sa urmeze o dieta adecvata, e$ercitii fizice, precum si o medicatie corespunzatoare. In cazul diabetului de tip I , singura modalitate de tratament o constituie transplantul de pancreas. Insa pentru a se reduce riscul re'ectiilor este necesara administrarea medicamentelor imunosupresive care determina riscul aparitiei altor boli, cu precadere boli renale. "e aceea cele mai multe transplanturi de pancreas sunt insotite de transplanturi renale. "e-a lungul anilor s-au incercat numeroase modalitati de tratament a diabetului. Cna din aceste tehnici consta in in'ectarea la pacienti a celulelor insulare pancreatice, insa in acest fel nu s-a reusit depasirea tratamentului imunosupresor. .-a observat ca steroizii deterioreaza mult mai mult celulele administrate, comparativ cu transplantul de pancreas. Cn alt dezavanta' este acela ca celulele transplantate sunt recoltate de la cadrave si procedura necesita cel putin doua cadravre pentru un transplant. Intervine si problema imunocompatibilitatii, iar tesutul trebuie obtinut in primele ore de la deces. (.2.1. .tilizarea terapiilor celulare in diabet .e cunoaste ca pancreasul este un organ comple$ alcatuit din celule multiple. ;a mamifere pancreasul contine trei tipuri celulare celulele ductale %canaliculare&, celulele acinare si celulele endocrine. Celulele endocrine produc glucagonul, somatostatina, polipeptidul pancreatic %PP& si insulina. Celulele acinare fac parte din sistemul e$ocrin care secreta enzime digestive. Celulele ductale din ductul pancreatic conecteaza celulele acinare la organele digestive. Pancreasul se dezvolta ca o e$crescenta a duodenului. Atata celulele sistemului e$ocrin, cat si cele ale sistemului endocrin se considera ca deriva din celulele canaliculare in timpul dezvoltarii embrionare. Apoi aceste celule endocrine formeaza agregate denumite insule ;angerhans. ;a om e$ista patru tipuri de celule insulare celulele beta producatoare de insulina, celulele alfa care secreta glucagonul, celulele delta ce secreta somatostatina si celulele PP care produc polipeptidul pancreatic. B9 - >2M din celulele insulare sunt reprezentate de celule beta, ,9 - 12M sunt celule alfa, ) - ,2M celule delta si ,M celule PP %fig.> - Producerea insulinei in pancreasul uman&. Ju se cunoaste cu precizie sursa celulelor din insulele ;angerhans e$istand anumite controverse ce vizeaza prezenta celulelor stem adulte in pancreas. Cnii cercetatori considera ca celulele stem insulare sunt asemeni celulelor care pot fi gasite in ductul pancreatic sau chiar in insule. Altii afirma ca celulele ductale se pot diferentia in precursori insulari, in timp ce altii sustin ca aceste celule insulare deriva din celulele stem din sange. .-au dezvoltat cateva tehnici de izolare si cultivare a

31

celulelor stem sau a precursorilor insulari din tesut pancreatic adult si fetal, precum si din celule stem embrionare %Roche R. si .oria =.; 1223&.

%preluat dupa(erese 4inslo5, ;Ddia <ibiu/, 122,& 6ig. > - Producerea insulinei in pancreasul uman

3)

(.2.2. -esuturile adulte / surse de celule insulare #ulta vreme principala sursa de celule insulare au constituit-o cadravele. .-a constatat insa ca celulele beta pancreatice prelevate din asemenea surse sunt dificil de cultivat si prolifereaza foarte lent in vitro. Prin studii de inginerie genetica s-a reusit adaugarea genelor implicate in stimularea proliferarii. !data cu stabilirea unei astfel de linii celulare, celulele isi pierd capacitatea de a secreta insulina. Prin introducerea in aceste celule a genei specifice celulelor beta pancreatice - P"I-,, s-au obtinut celule capabile de o buna multiplicare in cultura si cu capacitate secretorie. (ransplantate in soareci imunodeficienti s-a constatat ca celulele secreta insulina ca raspuns la glucoza. In prezent se urmareste daca aceste celule pot determina reversia diabetului in modele animale de soareci. %"ufaDet de la (our si colab., 122,; It/in-Ansari si colab., 122,; It/in-Asari P. si ;evine 6.; 1223&. .-a observat ca celulele transfectate nu produc insulina asemeni celulelor normale din insule, ci intr-o cantitate mai scazuta. Problema ma'ora in aceste studii o constituie imposibilitatea de a mentine o balanta adecvata intre crestere si diferentiere. Celulele care prolifereaza bine nu produc insulina in mod eficient, iar cele care produc insulina nu prolifereaza bine. Potrivit acestor date, scopul principal consta in dezvoltarea unor tehnologii capabile sa genereze un numar suficient de celule secretoare de insulina in cantitati suficiente. ! alta sursa promitatoare de celule insulare o reprezinta celulele din ductul pancreatic. .unt studii care sustin ca celulele stem multipotente sunt amestecate cu celule canaliculare mature, diferentiate, in timp ce alte studii atesta ca celulele ductale sufera diferentiere, sau reversul acesteia, catre tipuri celulare mai putin mature care apoi se pot diferentia in celule insulare producatoare de insulina. .-a demonstrat ca celulele ductale izolate din pancreas uman adult in cultura se diferentiaza in clusteri ce contin atat celule ductale, cat si endocrine. "upa trei sau patru saptamani in cultura celulele secreta cantitati scazute de insulina atunci cand sunt e$puse la concentratii mici de glucoza si cantitati mari de insulina cand li se administreaza glucoza in concentratie mare. Prin studii de imunohistochimie si analize ultrastructurale s-a demonstart ca aceste clustere contin toate celulele endocrine prezente in insulele ;angerhans %=onner-4eir, .. si colab., 1222&. In prezent se incearca prelevarea celulelor ductale din biopsii si cultivarea acestora in vitro si apoi administrarea lor inapoi la pacient. Aceasta posibilitate se poate aplica persoanelor cu diabet de tip I a caror celule beta sunt afectate dar care prezinta celule ductale intacte. !ricum in acest fel nu este inlaturata distrugerea autoimuna care ar putea determina distrugerea celulelor transplantate %=onner4eir, ..&. (ehnica se pote aplica cu succes la pacientii cu diabet de tip II care nu au probleme autoimune.

33

Ju se cunoaste cu precizie daca celulele ductale sunt celule dediferentiate sau reprezinta un subset de celule stem sau progenitori insulari care populeaza ductul pancreatic si pot fi co-cultivate impreuna cu celulele ductale. "aca celulele ductale mor, progenitorii insulari prolifereaza si este posibil ca acestia sa preia locul celulelor ductale in cultura si poate parea in acest fel ca celulele ductale se dediferentieaza in celule stem. Potrivit lui =onner-4eir, atat celulele dediferentiate, cat si progenitorii insulari sunt prezenti in ductul pancreatic. In spri'inul celor afirmate de =onner-4eir s-a demonstrat ca celulele epiteliale din ductul pancreatic recoltate de la soarecii adulti pot forma structuri insulare similare clusterilor observati de =onner-4eir. .-a constatat de asemenea ca aceste celule au capacitatea de a secreta glucagon, insulina, somatostatina si polipeptidul pancreatic. (ransplantate soarecilor diabetici s-a obtinut regresia bolii. (erapiile bazate pe transplant celular necesita o atenta manipulare a materialului biologic. Ju se cunoaste comportarea acestor celule in vivo. E$ista pericolul ca orice precursor sau celula stem odata introdusa in organism sa revina la un stadiu pluripotent determinand in acest fel aparitia tumorilor. Acest risc poate fi evitat prin folosirea celulelor complet diferentiate. V... C$lul$l$ %t$& i t!ata&$ tul i *a!#tului "$ &io#a!" In prezent atacurile de cord si bolile congestive ale inimii constituie principala cauza de deces. In pofida modalitatilor de prevenire a bolilor cardiovasculare, restaurarea functiilor unei inimi lezate ramane in continuare o problema. .tudii recente au evidentiat ca celulele stem adulte si embrionare pot inlocui celulele miocardului lezat si pot genera noi vase de sange. .e cunoaste ca distrugerea celulelor miocardice, cunoscute drept cardiomiocite se poate datora hipertensiunii, insuficientei cronice aparute in vascularizatia inimii cauzata de boli arteriale coronariene, atacurile de cord, obstructia vaselor sanghine ale cordului. Cn rol decisiv in functionarea inimii il detin cardiomiocitele a caror contractie determina e$pulzarea sangelui din ventriculi catre artere. Alte doua tipuri celulare care intra in alcatuirea cordului sunt celulele endoteliale vasculare care formeaza stratul intern al vaselor sanghine si celulele musculare netede care formeaza peretele vaselor de sange. Inima prezinta o vascularizatie bogata, iar aceste celule specializate sunt importante pentru dezvoltarea unei noi retele de arteriole care asigura hranirea si o$igenarea cardiomiocitelor. Potentialul celulelor stem embrionare si adulte de a se diferentia in aceste tipuri celulare a fost e$ploatat ca o strategie pentru restaurarea functiilor cardiace la persoanele cu infarct miocardic sau boli congestive. In conditii specifice de laborator s-a reusit diferentierea celulelor stem in cardiomiocite si celule endoteliale vasculare %Pu ;iu si colab., 122); 39

.hahin Rafii si "avid ;Dden, 122)&. .tudiile care urmaresc utilizarea unor noi terapii in tratamentul atacurilor de cord au fost efectuate pe modele animale; sobolan la care s-a indus un atac cardiac %6ig.,2- #odel de infarct miocardic la sobolan&

%preluat dupa(erese 4inslo5, ;Ddia <ibiu/, 122,& 6ig. ,2 - #odel de infarct miocardic la sobolan Pentru a determina un atac cardiac la soarece sau sobolan se realizeaza o ligatura in 'urul vasului sanghin ma'or al inimii, deprimand in acest fel cardiomiocitele de o$igen si nutrienti. Aceste modele animale au fost folosite cu succes in aplicatiile e$perimentale cu celule stem. Astfel, la soarece s-a realizat un atac cardiac prin ligaturarea arterei coronare stangi si apoi au fost utilizate celule stem pentru refacerea zonei afectate. "in maduva osoasa au fost izolate celule stem cu capacitate de a se diferentia in multiple tipuri celulare. In'ectate in peretele ventriculului afectat, s-a constatat ca aceste celule pot genera cardiomiocite, endoteliu vascular, precum si celule musculare netede, avand capacitatea de a forma de novo miocardul, inclusiv artere coronare, arteriole si 3B

capilare %!rlic, ".&. "e asemenea, s-a demonstrat ca tesutul cardiac poate fi refacut si de celule stem hematopoietice. .-a reusit izolarea unei populatii *side+ de celule stem hematopoietice care apoi au fost in'ectate in maduva osoasa a soarecilor iradiati care dezvoltau si infarct miocardic %la nivelul arterei coronare descendente anterioare&. .-a dovedit ca aceste celule prezinta potentialul de a reface miocardul, migrand in zona afectata. Astfel, celulele stem hematopoietice transplantate in maduva osoasa sau in'ectate direct in zona lezata pot regenera tesutul cardiac. Alte date care sustin terapia cu celule stem provin dintr-un studiu ce atesta ca celulele stem adulte umane prelevate din maduva osoasa sunt capabile sa formeze celule endoteliale atunci cand sunt transplantate in sobolani %<ocher, A.A. si colab., 122,&. Asemeni celulelor stem de la soareci, celulele stem hematopoietice umane pot forma in vitro numeroase tipuri celulare, inclusiv muschi cardiac %Pittenger, #.6. si colab., ,>>>& %6ig. ,, Repararea miocardului cu a'utorul celulelor stem adulte&. In'ectate in circulatia soarecilor cu infract de miocard, aceste celule previn moartea prin hipertrofie a celulelor cardiace viabile si reduc formarea progresiva a fibrelor de colagen.

%preluat dupa(erese 4inslo5, ;Ddia <ibiu/, 122,& 6ig. ,, - Repararea miocardului cu a'utorul celulelor stem adulte 3A

.tudiile realizate pe modele animale au evidentiat faptul ca celulele stem adulte se pot diferentia in multiple tipuri celulare. Aceasta capacitate, denumita plasticitate, face din aceste celule candidati viabili in repararea tisulara. E$ista ca si in cazul celorlaltor boli prezentate unele aspecte practice care pana in prezent nu au fost depasite. Asfel, pentru repararea cordului uman sunt necesare milioane de celule. Capacitatea unica a celulelor stem embrionare de a se replica in cultura le confera acestora un avanta' fata de celulele stem adulte. "e asemena, e$ista inca multe intrebari care nu si-au gasit raspuns *Cat timp dupa transplant celulele continua sa functionezeS #odelele animale de sobolani redau cu acuratete conditiile din cordul uman si raspund asemeni acestuia la transplantS Cardiomiocitele obtinute prin diferentierea celulelor stem au aceeasi conductibilitate electrica ca si celulele cardiace native si se integreaza functional in mecanismul de contractie al inimiiS+ V.4. C$lul$l$ %t$& i t$!apia (olilo! %i%t$&ului $!,o% Astazi abordarile terapeutice in bolile neuronale constau in identificarea simptomelor si limitarea leziunilor. !data cu descoperirea celulelor stem neuronale s-au conturat noi posibilitati de tratament. .-a constatat ca celulele stem neuronale pot forma toate tipurile celulare prezente in creier; neuroni functionali %care se integreaza in tesut realizand sinapse&, celule gliale si oligodendrocite %fig. ,1 Jeuronul&. "escoperirea capacitatii regenerative a sistemului nervos central adult ofera sperante in tratamentul bolilor degenerative precum Par/inson. .-au evidentiat doua strategii in incercarile de restabilire a functiilor nervoase. Prima consta in multiplicarea si diferentierea celulelor in vitro si apoi transplantarea lor la pacienti. .e urmareste administrarea celulelor diferentiate in neuroni din celule stem, sau direct implantarea celulelor nediferentiate, integrarea si maturarea acestora in zona afectata. Pot fi utilizate in acest scop o varietate de celule precursorii neuronali de'a *committed+ catre un anumit tip celular, fie celule embrionare pluripotente. ! alta strategie reparatorie o constituie utilizarea *factorilor trofici+ ca factori de crestere, hormoni si alte molecule de semnalizare care a'uta la supravietuirea si cresterea celulelor, putand determina stimularea celulelor stem si mecanismele reparatorii endogene. In acest fel se pot reface zonele afectate si restaura functiile tesutului lezat. .tudiile pe modele animale de boli degenerative %scleroza laterala amfitrofica, sau boala ;ou @ehrig& au relevat rezultate incura'atoare prin folosirea celulelor stem embrionare germinale %<err

3?

". A. si colab., 122,&. .-a constatat ca dupa in'ectarea aceste celule se diferentieaza in neuroni motori iar mobilitatea animalelor se imbunatateste semnificativ.

(preluat dupa (erese 4inslo5, 122,& 6ig. ,1 - Jeuronul V.4.1. C$lul$l$ %t$& i t!ata&$ tul (olii 1a!/i %o =oala Par/inson apare dupa varsta de 92 ani si consta in degenerarea progresiva a neuronilor prezenti in creier. .imptomele se manifesta de cele mai multe ori printr-un tremur necontrolat al mainilor, urmat apoi de o rigiditate crescuta, dificultati in mers precum si dificultati in intierea miscarilor voluntare. Acestea se datoreaza mortii unui tip particular de neuroni prezenti in creier. 3>

Acesti neuroni conecteaza o structura din creier numita substanta neagra cu o alta formatiune anatomica - striatum, parte componenta a nucleului caudat si a putamenului %6ig.,) - Calea neuronala care degenereaza in boala Par/inson&. Acesti neuroni *nigro-striati+ elibereaza dopamina spre neuronii tinta din striatum. Cna din functiile ma'ore ale dopaminei o reprezinta reglarea nervilor care controleaza miscarile organismului. !data cu moartea acestor celule, este produsa mai putina dopamina ceea ce duce la aparitia dificultatilor in miscare caracteristice bolii Par/inson. Ju

92

se

cunoaste

pana

astazi

cauza

mortii

acestor

neuroni.

9,

%preluat dupa (erese 4inslo5, ;Ddia <ibiu/, 122,& 6ig.,) - Calea neuronala care degenereaza in boala Par/inson Ideea cultivarii celulelor dopaminergice in laborator si apoi transplantarea lor bolnavilor afectati de Par/inson in vederea inlocuirii neuronilor distrusi reprezinta una din cele mai recente modalitati terapeutice. .-a constatat insa ca neuronii producatori de dopamina nu supravietuiesc transplantului, astfel ca transplantul tesutului nervos provenit de la cadavre nu s-a dovedit o modalitate de tratament. Rezultate modeste si de scurta durata %dispar dupa un an de la interventie& s-au obtinut in cazul administrarii celulelor cromafine producatoare de dopamina din glandele adrenale %Nuinn J. P., ,>>2&. ! alta strategie bazata pe transplantul neuronilor dopaminergici proveniti din tesutul neuronal fetal a condus la rezultate incura'atoare %"unnett .. =. si colab., 122,&. .tudiile pe modele animale au aratat ca acesti neuroni se dezvolta in continuare si realizeaza cone$iuni cu tesutul incon'urator in vivo. "e asemenea s-a observat ca precursorii dopaminergici derivati din celule stem embrionare au capacitatea de a elimina simptomele bolii pe modele animale de Par/inson. In prezent se urmareste identificarea unei combinatii optime intre factorii de crestere si conditiile de cultivare in vederea mentinerii celulelor in vitro din stadiu de nediferentiate pana la punctul in care ele devin committed catre neuroni dopaminergici. Crmeza apoi implantarea lor in creierul afectat unde isi incheie cresterea si diferentierea. ! alta posibilitate o reprezinta transplantarea celulelor nediferentiate in creierul lezat si diferentierea lor sub influenta semnalelor din micromediul e$istent in tipul celular adecvat necesar inlocuirii celulelor afectate. "e asemenea se incearca utilizarea transplanturilor de celule stem din surse embrionare sau adulte in scopul inducerii organismului sa-si decalnseze propriile mecanisme reparatorii %='or/lund A. si colab., 1222&. ! alta strategie consta in combinarea terapiilor medicamentoase cu cele care vizeaza utilizarea celulelor stem. (erapia regenerativa in boala Par/inson consta in inlocuirea unui singur tip celular aflat intr-o singura regiune din creier, ceea ce reprezinta o tinta relativ usoara comparativ cu celelalte boli neuronale degenerative. V.4.2. Rolul #$lul$lo! %t$& i !$)$ $!a!$a l$-iu ilo! &a"u,$i %pi a!ii "atorita potentialului de diferentiere catre multiple tipuri celulare, celulele stem au fost utilizate si in scopul restabilirii functiilor maduvei spinarii dupa in'uria acesteia. .i astazi constituie o mare 91

problema restaurarea completa dupa lezarea ma'ora a maduvei spinarii. #ulte tipuri celulare sunt distruse in aceasta in'urie, inclusiv neuronii care realizeaza cone$iunile intre creier si restul organismului. In multe astfel de cazuri nu toti neuronii purtatori de semnale au a$onii lezati, insa a$onii acestora nu mai pot transmite impulsul nervos deoarece oligodendrocitele care izoleaza a$onii cu mielina sunt distruse. Recent s-a realizat un prim pas in inceracarea de inlocuire a oligodendrocitelor %Raisman @., 122,&. .-a demonstrat ca celulele stem pot induce remielinizarea la sobolani %;iu .. si colab., 1222; #c"onald 0.4. si colab., ,>>>&. "e asemenea, oligodendrocitele diferentiate din celule stem embrionare pot restabili remielinizarea a$onilor in modelele animale de paralizii ale maduvei spinarii. In ciuda faptului ca sunt inca multe necunoscute, multe intrebari care inca nu si-au gasit raspunsul, rezultatele obtinute prin utilizarea celulelor stem in terapia bolilor neuronale sunt incura'atoare. 6ie prin inlocuirea celulelor lezate, sau prin activarea propriilor celule stem in vivo, s-a demonstrat ca aceste celule reprezinta un potential tratament al bolilor neuronale, fiind un camp de cercetare cu avansare rapida. V.3. R$*a#$!$a %i%t$&ului o%o% p!i t$!apia #u #$lul$ %t$& .e cunoste de multa vreme ca principala sursa de celulele stem mezenchimale o reprezinta maduva osoasa hematogena care contine si progenitorii tesutului osos. .tudii recente au evidentiat insa ca celule stem mezenchimale asemanatoare cu cele medulare sunt prezente si in osul trabecular, cu acelas potential de diferentiere catre osteoblaste, condrocite, adipocite %.a/aguchi P. si colab., 1223&. "e asemeni, potential osteogenic s-a constatat ca prezinta si celulele stem din partea fetala a placentei umane %(a/ahashi <. si colab., 1223; 7hang P. si colab., 1223&. In clinica umana a implantologiei si transplantului sunt puse multe sperante in utilizarea acestor celule cu multiple posibilitati de diferentiere. .e stie ca osteoblastele au un rol decisiv in procesul de formare si refacere osoasa. Acestea sunt celule de forma cuboidala sau cilindrica ce se dispun la periferia suprafetei care urmeaza a fi transformata in tesut osos %fig.,3 - !steoblastul si osteocitul&. Au capacitati secretorii, sintetizand colagen de tip I %Christenson R. H., ,>>A&, osteocalcina, cea mai abundenta proteina necolagenica a matricei osoase si fosfataza alcalina, enzima mar/er a osteoblastului %8oegele (. 0. si colab., 1222; 0il/a 8. 8. si colab., ,>>?; =alint si colab., 122,; "i @regorio E. si colab., 122,&. E$ista numeroase afectiuni ale sistemului osos in care este afectata capacitatea secretorie a osteoblastelor, implicit refacerea tesutului osos. Intr-un studiu Ir5in si colaboratorii %122,& evidentiaeaza o parte a cazuisticii care vizeaza defectele osoase, in special tumorale 9)

endocondroame, chisturi anevrismale osoase, chisturi benigne, defecte fibroase metafizare, lipoame intraosoase, condroblastoame, ganglioni intraososi, infarcte osoase, leziuni fibro-osoase, osteoame osteoide, condrosarcoame, necroze osoase; acestea reprezentand peste 99M din cazuistica unei clinici de chirurgie ortopedica. Astfel s-a impus necesara gasirea unor modalitati terapeutice in vederea eradicarii bolilor care afecteaza tesutul osos.

%preluat din 2ttp:77888.&$"$%.*!7E!i%to7O%t$opo!o%i%7O%t$o#9t$%I&a)$.2t&l& 6ig. ,3 - !steoblastul si osteocitul Incercarile de cultivare a osteoblastelor in vitro sunt de data recenta. Au fost utilizate surse de celule stem localizate in epifizele femurului de sobolan %!hgushi H. si colab., ,>>B; Jordstrom E. si colab., ,>>>; Roth A. 0. si colab., ,>>>&, calvaria fetala umana %#ale/zadeh R. si colab., ,>>?&, maduva osoasa a tibiei de sobolan %Palmieri ". si colab., 1222&, maduva osoasa umana obtinuta prin punctie in creasta iliaca postero-superioara %<assem #. si colab., ,>>,; 0orgensen R. si colab., 1222;&. "iferentierea catre osteoblast a fost realizata prin suplimentarea mediului de cultivare cu acid ascorbic, de$ametazona si R glicerofosfat de sodiu %Cheng .. ;. si colab., ,>>3; .unDer (. si colab., ,>>>, =utterD ;. ". si colab., 122,, (a/amiza5a .. si colab., 1221&. ! mai buna diferentiere s-a obtinut prin adaugarea in mediu de cultivare a ,, 19 dihidro$icolecalciferolului, forma activa a vitaminei "). .tudiile pe modele animale au demonstrat potentialul osteogenic al acestor osteoblaste in vivo %@urevich !. si colab., 1221&, precum si rolul ma'or al vitaminei " in 93

osteogeneza, aceasta inducand osteoblastogeneza si inhiband adipogeneza in maduva osoasa %"uTue @. si colab., 1223&. .-a constatat ca diferentierea celulelor stem mezenchimale in osteoblaste este influentata si de suporturile de cultivare, biomateriale utilizate tot mai mult in medicina reparatorie. In prezent numeroase studii urmaresc diferentierea si gradul de populare a biomaterialelor cu osteoblaste precum si utilizarea lor ca substituienti ososi. .-a constatat ca suporturi materiale precum hidro$iapatita, matricile de colagen compozit, ceramicile de aluminiu, determina o mai buna diferentiere catre osteoblaste %Iida 0. si colab., 1223; Itho .. si colab., 1223; ;iao 6. 7. si colab., 1223, <itamura .., 1223&. Au fost de asemenea testate asocierile intre biomateriale si astfel de celule in vivo, constatandu-se ca un potential osteogenic mai ridicat il detin suporturile biologice populate cu osteoblaste comparativ cu cele populate cu celulele stem mezenchimale %Iida 0. si colab., 1223&. .e contureaza astfel aparitia ingineriei tisulare care ofera noi perspective chirurgiei reconstructive %4iedmann si colab., 1221&.

99

V.3. R$*a#$!$a %i%t$&ului o%o% p!i t$!apia #u #$lul$ %t$& .e cunoste de multa vreme ca principala sursa de celulele stem mezenchimale o reprezinta maduva osoasa hematogena care contine si progenitorii tesutului osos. .tudii recente au evidentiat insa ca celule stem mezenchimale asemanatoare cu cele medulare sunt prezente si in osul trabecular, cu acelas potential de diferentiere catre osteoblaste, condrocite, adipocite %.a/aguchi P. si colab., 1223&. "e asemeni, potential osteogenic s-a constatat ca prezinta si celulele stem din partea fetala a placentei umane %(a/ahashi <. si colab., 1223; 7hang P. si colab., 1223&. In clinica umana a implantologiei si transplantului sunt puse multe sperante in utilizarea acestor celule cu multiple posibilitati de diferentiere. .e stie ca osteoblastele au un rol decisiv in procesul de formare si refacere osoasa. Acestea sunt celule de forma cuboidala sau cilindrica ce se dispun la periferia suprafetei care urmeaza a fi transformata in tesut osos %fig.,3 - !steoblastul si osteocitul&. Au capacitati secretorii, sintetizand colagen de tip I %Christenson R. H., ,>>A&, osteocalcina, cea mai abundenta proteina necolagenica a matricei osoase si fosfataza alcalina, enzima mar/er a osteoblastului %8oegele (. 0. si colab., 1222; 0il/a 8. 8. si colab., ,>>?; =alint si colab., 122,; "i @regorio E. si colab., 122,&.

%preluat din 2ttp:77888.&$"$%.*!7E!i%to7O%t$opo!o%i%7O%t$o#9t$%I&a)$.2t&l& 9B

6ig. ,3 - !steoblastul si osteocitul E$ista numeroase afectiuni ale sistemului osos in care este afectata capacitatea secretorie a osteoblastelor, implicit refacerea tesutului osos. Intr-un studiu Ir5in si colaboratorii %122,& evidentiaeaza o parte a cazuisticii care vizeaza defectele osoase, in special tumorale endocondroame, chisturi anevrismale osoase, chisturi benigne, defecte fibroase metafizare, lipoame intraosoase, condroblastoame, ganglioni intraososi, infarcte osoase, leziuni fibro-osoase, osteoame osteoide, condrosarcoame, necroze osoase; acestea reprezentand peste 99M din cazuistica unei clinici de chirurgie ortopedica. Astfel s-a impus necesara gasirea unor modalitati terapeutice in vederea eradicarii bolilor care afecteaza tesutul osos. Incercarile de cultivare a osteoblastelor in vitro sunt de data recenta. Au fost utilizate surse de celule stem localizate in epifizele femurului de sobolan %!hgushi H. si colab., ,>>B; Jordstrom E. si colab., ,>>>; Roth A. 0. si colab., ,>>>&, calvaria fetala umana %#ale/zadeh R. si colab., ,>>?&, maduva osoasa a tibiei de sobolan %Palmieri ". si colab., 1222&, maduva osoasa umana obtinuta prin punctie in creasta iliaca postero-superioara %<assem #. si colab., ,>>,; 0orgensen R. si colab., 1222;&. "iferentierea catre osteoblast a fost realizata prin suplimentarea mediului de cultivare cu acid ascorbic, de$ametazona si R glicerofosfat de sodiu %Cheng .. ;. si colab., ,>>3; .unDer (. si colab., ,>>>, =utterD ;. ". si colab., 122,, (a/amiza5a .. si colab., 1221&. ! mai buna diferentiere s-a obtinut prin adaugarea in mediu de cultivare a ,, 19 dihidro$icolecalciferolului, forma activa a vitaminei "). .tudiile pe modele animale au demonstrat potentialul osteogenic al acestor osteoblaste in vivo, precum si rolul ma'or al vitaminei " in osteogeneza, aceasta inducand osteoblastogeneza si inhiband adipogeneza in maduva osoasa %"uTue @. si colab., 1223&. .-a constatat ca diferentierea celulelor stem mezenchimale in osteoblaste este influentata si de suporturile de cultivare, biomateriale utilizate tot mai mult in medicina reparatorie. In prezent numeroase studii urmaresc diferentierea si gradul de populare a biomaterialelor cu osteoblaste precum si utilizarea lor ca substituienti ososi. .-a constatat ca suporturi materiale precum hidro$iapatita, matricile de colagen compozit, ceramicile de aluminiu, determina o mai buna diferentiere catre osteoblaste %Iida 0. si colab., 1223; Itoh .. si colab., 1223; ;iao .. .. si colab., 1223, <itamura .., 1223&. Au fost de asemenea testate asocierile intre biomateriale si astfel de celule in vivo, constatandu-se ca un potential osteogenic mai ridicat il detin suporturile biologice populate cu osteoblaste comparativ cu cele populate cu celulele stem mezenchimale %Iida 0. si colab., 1223&. .e contureaza astfel aparitia ingineriei tisulare care ofera noi perspective chirurgiei reconstructive %4iedmann si colab., 1221&.

9A

CU1RINS Capitolul I + C$lul$l$ %t$& ,. Introducere 1. Ce sunt celulele stem si de ce sunt ele importanteS Capitolul II + C$lul$l$ %t$& a"ult$ ,.Ce sunt celulele stem adulteS 1. "ovezi ale prezentei celulelor stem adulte ). #ecanismul diferentierii celulelor stem adulte 3. #ar/erii celulelor stem Capitolul III + 1la%ti#itat$a #$lul$lo! %t$& a"ult$ ,.Abordari pentru demonstarea plasticitatii celuleor stem adulte 1. Evidentele plasticitatii 1.,. Evidente e$perimentale ale plasticitatii celulelor stem adulte ). Celulele stem din maduva osoasa si sange 3. Celulele stem hematopoietice 9. Celulele stromale din maduva osoasa B. Celulele stem adulte din alte tesuturi B.,. Progenitorii endoteliali celulari B.1. Celulele stem din muschii scheletici B.). Celulele stem din ficat B.3. Celulele stem pancreatice B.9. Celulele stem din limbul corneal B.B. Celulele stem mamare B.A. Celulele stem din glandele salivare B.?. Celulele stem din piele B.>. Celulele stem din tendoane B.,2. Celulele stem din membranele sinoviale B.,,. Celulele stem din cartila' B.,1. Celulele progenitoare din timus B.,). Celulele stem din pulpa dentara B.,3. Celulele stem din tesutul adipos B.,9. Celulele stem din cordonul ombilical B.,B. Celulele stem mezenchimale din cordonul ombilical B.,A. Celulele stem amniotice Capitolul IV + C$lul$l$ %t$& 2$&atopoi$ti#$ ,. Introducere 1. Ce sunt celulele stem hematopoieticeS ). Celulele stem hematopoietice pot fi identificate cu a'utorul mar/erilor celulariS 3. .urse de celule stem hematopoietice 3.,. #aduva osoasa 3.1. .angele periferic 3.). .angele din cordonul ombilical 3.3. .istemul hematopoietic fetal 3.9. Celulele stem embrionare si celulele stem germinale 9. Cum difera celulele stem hematopoietice care provin din surse diferiteS B. Rolul celulelor stem hematopoietice si factorii implicati in activitatea acestora Capitolul V + C$lul$l$ %t$& i &$"i#i a !$)$ $!ati,a ,.(erapia cu celule stem in bolile autoimune 1. Celulele stem in diabet 1.,. Ctilizarea terapiilor celulare in diabet .... ...:

. . . 1.

. . . 2;

. . . .4

9?

1.1. (esuturile adulte - surse de celula insulare ). Celulele stem in tratamentul infarctului de miocard 3. Celulele stem in terapia bolilor sistemului nervos 3.,. Celulele stem in tratamentul bolii Par/inson 9. Refacerea sistemului osos prin terapia cu celule stem Capitolul VI + <i(lio)!a*i$

. . . 3.

Capitolul VI 0 <i(lio)!a*i$
,. A/ashi <., <ondo #., Cheshier .., .hizuru 0., @andD <., "omen 0., #ebius R., (raver ". si
4eissman I.;. *;Dmphoid development from stem cells and the common lDmphocDte progenitors+, 0iol. B3, ,-,1, 2000 ; 1. A/ashi <., (raver "., <ondo #. si 4eissman I.;. *;Dmphoid development from hematopoietic stem cells+, Int. 1. 2ematol. B>,1,A-11B, 1;;; ; ). Alison #. R., Poulsom R., 0efferD R., "hilion A. P.,Nuaglia A., 0acob 0., Jovelli #., Prentice @., 4illiamson 0. si 4right J. A., *HepatocDtes from non-hepatic adult stem cells+, 3ature. 32B, 19A, 2000 ; 3. Altman 0. si "as @. "., *Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats+, 1. Comp. 3eurol.,13, ),>-))9, 1;43 ; 9. Altman 0., *Autoradiographic and histological studies of postnatal neurogenesis. I8. Cell proliferation and migration in the anterior forebrain, 5ith special reference to persisting neurogenesis in the olfactorD bulb+ , 1. Comp. 3eurol. ,)A, 3))-39A, 1;4; ; B. Alvi A0 et al., *6unctional and molecular characterisation of mammarD side population cells+, 0reast Cancer 4esearch 9, R,-R?; 200. ; A. Anderson ". 0., @age 6. H. si 4eissman I. ;., *Can stem cells cross lineage boundariesS+, 3at. )ed. A, )>)-)>9, 2001; ?. Asahara (., #urohara (., .ullivan A., .ilver #., van der 7ee R., ;i (., 4itzenbichler =., .chatteman @. si Isner 0. #., *Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis +, *cience. 1A9, >B3->BA,1;;: ; >. Asa/ura A et al., *#Dogenic specification of side population cells in s/eletal muscle+, 1ournal of Cell 0iolog5 ,9>, ,1)-,)3; ,3, 2002; ,2. At/ins = et al., *Intracardiac (ransplantation of ./eletal #Doblasts Pields (5o Populations of .triated Cells In .itu+; +nnals of -horacic *urger5 BA, ,13-,1>; 1;;; ; ,,. =alint E., .zaho P., #arshall C.6., .prague .. #.,+@lucose induced inhibition of in vitro bone mineralization+, 0one, 1? %,& 1,-1?, 2001 = ,1. =aum C.#., 4eissman I.;., (su/amoto A..., =uc/le A.#. si Peault =., *Isolation of a candidate human hematopoietic stem-cell population+, Proc. 3atl. +cad. *ci. .. *. +. $%, 1?231?2?., 1;;2 ; ,). =eattie @.#., !ton/os/i (., ;opez A.". si HaDe/ A., *6unctional beta-cell mass aftertransplantation ofhuman fetal pancreatic cells differentiation or proliferationS+, ,iabetes. !66 133-13?., 1;;: ; ,3. =ec/er A. 0., #cCullough E. A. si (ill 0. E., *CDtological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marro5 cells+, 3ature.1%#, 391-393, 1;4. ; ,9. =eerheide 4 et al., *"o5nregulation of U1-microglobulin in human cord blood somatic stem cells after transplantation into livers of .CI"-mice an escape mechanism of stem cellsS+, 0iochemical and 0ioph5sical 4esearch Communications 1>3, ,291-,2B), 2002 ; ,B. =ennett AR et al., *Identification and characterization of thDmic epithelial progenitor cells+, Immunit5 ?2)-?,3, 2002 ; 9>

,A. =ianco P. si Cossu @., *Cno nessuno e centomila searching for the identitD of mesodermal
progenitors+, 7xp. Cell 4es. 19,, 19A-1B), 1;;; ; ,?. =ianco P., Riminucci #., @ronthos .. si RobeD P. @., *=one marro5 stromal cells ; nature, biologD and potential applications +, *tem Cells. ,>, ,?2-,>1, 2001; ,>. =ianco P., Riminucci #., <uznetsov .. si RobeD P. @, *#ultipotential cells in the bone marro5 stroma regulation in the conte$t of organ phDsiologD+ , Crit. 4ev. 7u8ar5otic.9ene 7xpr. >, ,9>-,A), 1;;; ; 12. =iebac/ <., <ern .., <luter H. si Eichler H., *Critical parameters for the izolation of mesencDmal stem cells from umbilical cord blood + , *tem cells 11 B19-B)3, 2004 ; 1,. =ittner R.E., .chofer C., 4eipoltshammer <., Ivanova .., .treubel =., Hauser E., 6reilinger #., Hoger H., Elbe-=urger A. si 4achtler 6., *Recruitment of bone-marro5derived cells bD s/eletal and cardiac muscle in adult dDstrophic md$ mice+, +nat. 7mbr5ol. %=erl& 1%%, )>,-)>B., 1;;; ; 11. ='ornson C. R., Rietze R. ;., ReDnolds =.A., #agli #. C. si 8escovi A. ;., *(urning brain into blood a hematopoietic fate adopted bD adult neural stem cells in vivo+, *cience. 1?), 9)3-9)A, 1;;; ; 1). =lau H#, *.tem-cell fusion A t5ist of fate+, 3ature 3,>, 3)A; ), 2002 ; 13. =onner-4eir .., (ane'a #., 4eir @.C., (atar/ie5icz <., .ong <.H., .harma A. si !FJeil 0.0., *In vitro cultivation of human islets from e$panded ductal tissue+, Proc. 3atl.+cad. *ci. .. *. +. %#6 A>>>-?223., 2000 ; 19. =razelton (. R., Rossi 6. #., <eshet @. I. si =lau H. #., *6rom marro5 to brain e$pressionof neuronal phenotDpes in adult mice+, *cience. 1>2, ,AA9-,AA>, 2000 ; 1B. =ro$meDer HE et al., *High-efficiencD recoverD of functional hematopoietic progenitor and stem cells from human cord blood crDopreserved for ,9 Dears+, Proceedings of the 3ational +cadem5 of *ciences .*+ ,22, B39-B92, 200. ; 1A. =ruder .. P. 0ais5al J. si HaDnes5orth .. E., *@ro5th /inetics, self-rene5al, and the osteogenic potential of purified human mesenchDmal stem cells during e$tensive subcultivation and follo5ing crDopreservation+, 1. Cell 0iochem. B3, 1A?-1>3, 1;;:; 1?. =rustle !.,ChoudharD <., <arram <., Huttner A., #urraD <., "ubois ". #., #c<aD R. "., *Chimeric brains generated bD intraventricular transplantation of human brain cells into embrDonic rats+, 3at. 0iotechnol. ,B %,,& ,232-,233, 1;;> ; 1>. =utterD ;. "., =ourne .., IDnos 0. "., 4ood H., Hughes 6., Hughes .. P., Epis/opou 8., Pola/ 0. #., *"ifferentiation of osteoblast and in vitro bone formation from murine embrDonic stem cells+, -issue 7ng.6A%,& ?>->>, 2000 ; )2. =uzans/a ; et al., *Jeural stem cell line derived from human umbilical cord blood morphological and functional properties+, 1ournal of 3eurochemistr5 ?9, .uppl 1, )); 200. ; ),. Caplan A.I., ElDaderani #., #ochizu/i P., 4a/itani .. si @oldberg 8.#., *Principles of cartilage repair andregeneration+, Clin. :rthop. !2, 193-1B>, 1;;: ; )1. Chandross <.0. si #ezeD E.,+ PlasticitD of adultbone marro5 stem cells+, #attson #.P. si 8an 7ant @.eds. ;9reen<ich6 C-= 1+I Press>., 2001 ; )). Chen, 0. Astle C.#. si Harrison ".E., *"evelopment and aging of primitive hematopoietic stem cells in =A;=Gc=D mice6 7xp. 2ematol. 2#, >1?->)9., 1;;; ; )3. Cheng .. ;., Pang 0., Rifas ;., 7hang .. 6., Arioli ;., *"ifferentiation of human bone marro5 osteogenic stromal cells in vitro induction of the osteobalst phenotDphe bD de$amethasone+, 7ndocrinolog5 ,)3 1AA-1?B, 1;;4 ; )9. Christenson R. H., V=iochemical mar/ers of bone metabolism an overvie5+, Clin. 0iochem., )2: 9A)-9>), 1;;: ; B2

)B. Clar/e ".;., 0ohansson C.=., 4ilbertz 0., 8eress =., Jilsson E., <arlstrWm H., ;endahl C. si
6risen 0., *@eneralized potential of adult neural stem cells+, *cience. 2$$, ,BB2-,BB)., 2000 ; )A. Cooper @..., "ooleD #.A., (read5ell E.;., .t Clair E.4., Par/s C.@. si @il/eson @..., *Hormonal, environmental, and infectious ris/ factors for developing sDstemic lupus erDthematosus,+ +rthritis 4heum. !1, ,A,3-,A13, 1;;> ; )?. "e =ari C et al., *#ultipotent mesenchDmal stem cells from adult human sDnovial membrane+, +rthritis 4heumatism 33, ,>1?-,>31, 2001; )>. "e =ari C et al.; V./eletal muscle repair bD adult human mesenchDmal stem cells from sDnovial membraneV; 1ournal of Cell 0iolog5 ,B2, >2>->,?, 200. ; 32. "el =igio #.R., *(he ependDma a protective barrier bet5een brain and cerebrospinal fluid+, 9lia. 1!, ,-,)., 1;;3 ; 3,. "eutsch @., 0ung 0., 7heng #., ;ora 0.si 7aret <..., *A bipotential precursor population for pancreas and liver 5ithin the embrDonic endoderm+, ,evelopment. 12$,?A,-??,., 2001 ; 31. "i @regorio @. =., Pamamoto #., Afshan A., Abe E., Roberson P., #anolagas C. .., 0il/a R. ;. VAttenuation of the self-rene5al of transit-amplifDing osteoblasts progenitors in the murine bone marro5 bD ,A R-estradiol+, 1. Clin. Invest., ,2A: ?2)-?,1, 2001; 3). "oetsch 6., @arcia-8erdugo 0.#. si Alvarez-=uDlla A., *Cellular composition and threedimensional organization of the subventricular germinal zone in the adul tmammalian brain+, 1. 3eurosci. 1#, 923B-92B,., 1;;: ; 33. "oetschman (., Eistetter H., <atz #., .chmit 4. si <emler R., *(he in vitro development of blastocDstderived embrDonic stem cell lines formation of visceral Dol/ sac, blood islands and mDocardium+, 1. 7mbr5ol. 7xp. )orph. $#, 1A-39., 1;>3 ; 39. "omen 0. si 4eissman I.;., *.elf-rene5al, differentiation or death regulation and manipulation of hematopoietic stem cell fate+, )ol. )ed. -oda5. ", 12,-12?., 1;;; ; 3B. "ontu @ et al., *In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammarD stemGprogenitor cells+, 9enes and ,evelopment ,A, ,19)-,1A2, 200. ; 3A. "ufaDet de la (our "., Halvorsen (., "emeterco C., (Drberg =., It/in-Ansari P., ;oD #., Poo ..0., Hao .., =ossie ..si ;evine 6., *b-cell differentiation from a humanpancreatic cell line in vitro and in vivo.+, )ol.7ndocrinol. 1"6 3AB-3?)., 2001 ; 3?. "uTue @., #acoritto #., <remer R., ?,,19%!H&1") inhibits bone marro5 adipogenesis in senescence accelerated mice %.A#-PGB& bD decreasing the e$pression of pero$isome proliferator activated receptor gamma 1 %PPARgamma1&+, 7xp 9erontol.6 )>%)& )))-?, 2004 ; 3>. Eri/sson P..., Perfilieva E., ='or/-Eri/sson (., Alborn A.#., Jordborg C., Peterson ".A. si @age 6.H., * Jeurogenesis in the adult human hippocampus+, 3at. )ed. !, ,),)-,),A., 1;;>; 92. 6ang (C, Alison #R, 4right JA, Poulsom R., *Adult stem cell plasticitD 5ill engineered tissues be re'ectedS+, Int 1 7xp Pathol., ?9%)& ,,9-13, 2004 ; 9,. 6errari @., Cusella-"e Angelis @., Coletta #., Paolucci E., .tornaiuolo A., Cossu @. si #avilio 6., *#uscle regeneration bD bone marro5-derived mDogenic progenitors+, *cience. 2#%, ,91?,9)2., 1;;> ; 91. 6ol/man, 0., *(herapeutic angiogenesis in ischemic limbs+, Circulation. %#, ,,2?-,,,2. ,1;;> ; 9). 6riedenstein A.0., Chaila/h'an R.<. si ;alD/ina <..., *(he development of fibroblast colonies in monolaDer cultures of guinea-pig bone marro5 and spleen cells+, Cell -issue ?inet. , )>)-32)., 1;:0 ; 93. 6riedenstein A.0., Petra/ova <.8., <urolesova A.I. si 6rolova @.P., *Heterotopic of bone marro5. AnalDsis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues+, -ransplantation. 6, 1)2-13A., 1;4> ; B,

99. 6riedenstein A.0., Piatetz/D-.hapiro I.I. si Petra/ova <.8., *!steogenesis in transplants of bone
marro5 cells+, 1. 7mbr5ol. 7xp. )orphol. 16, )?,-)>2., 1;44 ; 9B. @age 6.H., Coates P.4., Palmer (."., <uhn H.@., 6isher ;.0., .uhonen 0.!., Peterson ".A., .uhr ..(. si RaD 0., *.urvival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain+, Proc. 3atl. +cad. *ci. .. *. +. %2, ,,?A>-,,??)., 1;;3 ; 9A. @age 6.H., RaD 0. si 6isher ;.0.,+Isolation, characterization, and use of stem cells from the CJ.+, +nnu. 4ev. 3eurosci. 1$, ,9>-,>1., 1;;3 ; 9?. @allacher ;., #urdoch =., 4u "., <aranu 6., 6ello5s 6. si =hatia #., *Identification of novel circulating human embrDonic blood stem cells+, 0lood. %6, ,A32-,A3A., 2000 ; 9>. @ordon #.P., RileD @.P., 4att ..#. si @reaves #.6., *Compartmentalization of a haematopoietic gro5th factor %@#-C.6& bD glDcosaminoglDcans in the bone marro5 microenvironment+, 3ature. 26, 32)-329., 1;>: ; B2. @ronthos . et al., *#olecular and cellular characterisation of highlD purified stromal stem cells derived from human bone marro5+, 1ournal of Cell *cience ,,B, ,?1A-,?)9; 200. ; B,. @ronthos .. et al., *Postnatal human dental pulp stem cells %"P.Cs& in vitro and in vivo+, Proceedings of the 3ational +cadem5 of *ciences .*+ >A, ,)B19-,)B)2, 2000 ; B1. @rossman, 0.#. si (sao, =.P., *@enetics and sDstemic lupus erDthematosus+, Curr. 4heumatol. 4ep. 2, ,)-,?.@ 2000 ; B). @rove 0oanna E., =ruscia E., <rause ". .., *PlasaticitD of bone marro5-derived stem cells+, *tem Cells, 2004 ; B3. @uenechea @., @an !.I., "orrell C. si "ic/ 0.E., *"istinct classes of human stem cells that differ in proliferative and self-rene5al potential+, 3at. Immunol. 26 A9-?1., 2001 ; B9. @uila/ 6arshid, Hani A. A5ad , =everleD 6ermor , HollD A. ;eddD , 0effreD #. @imble *Adipose-derived adult stem cells for cartilage tissue engineering+, 0iorheolog5, 3,,)-3 , 2004 ; BB. @ussoni E., .oneo/a P., .tric/land C."., =uzneD E.A., <han #.<., 6lint A.6., <un/el ;.#. si #ulligan R.C., *"Dstrophin e$pression in the md$ mouse restored bD stem cell transplantation+, 3ature. !&1, )>2-)>3., 1;;; ; BA. Holtzer H., *Cell lineages, stem cells and theETuantalF cell cDcle concept. In .tem cells and tissue homeostasis+, Eds =.I. ;ord, C... Potten, and R.0. Cole. %Cambridge, Je5 Por/ Cambridge CniversitD Press&. ,-1?., 1;:> ; B?. Hor5itz E# et al., *Isolated allogeneic bone marro5-derived mesenchDmal cells engraft and stimulate gro5th in children 5ith osteogenesis imperfecta Implications for cell therapD of bone+, Proceedings of the 3ational +cadem5 of *ciences .*+ >>, ?>)1-?>)A; 2002 ; B>. Hor5itz E# et al., *(ransplantabilitD and therapeutic effects of bone marro5-derived mesenchDmal cells in children 5ith osteogenesis imperfecta+, 3ature )edicine 9, )2>-),); 1;;;; A2. Hunt P., Robertson "., 4eiss "., Rennic/ "., ;ee 6. si 4itte !.J., *A single bone marro5derived stromal cell tDpe supports the in vitro gro5th of earlD lDmphoid and mDeloid cells+ Cell. !$, >>A-,22A., 1;>: ; A,. HuDhn A., "ommergues #., Izac =., Croisille ;., <atz A., 8ainchen/er 4. si Coulombel ;. *Characterization of hematopoietic progenitors from human Dol/ sacs and embrDos+, 0lood. $66 33A3-33?9., 1;;3 ; A1. Iida 0., (a/afumi Poshi/a5a,, #anabu A/ahane, Ha'ime !hgushi, Poshi/o "ohi, Poshinori (a/a/ura si A/ita/a Jonomura, *!steogenic Potential of Cultured =oneGCeramic Construct Comparison 4ith #arro5 #esenchDmal CellGCeramic Composite+, Cell -ransplantation, ,) )9A,-)B9, 2004 ;

B1

A). Ii'ima P et al., *=eating is necessarD for transdifferentiation of s/eletal muscle-derived cells into
cardiomDocDtes+, @+*70 1ournal ,A, ,)B,-,)B), 200. ; A3. It/in-Ansari P., "emeterco C., =ossie .., "ufaDet de la (our "., =eattie @.#., #ovassat 0., #allD #.I., HaDe/ A. si ;evine 6., *P"I-, and cell-cell contact act in sDnergDto promote d-cell development in a human pancreatic endocrine precursor cell line+, )ol. 7ndocrinol. 1!6 ?,3?11., 2001 ; A9. It/in-Asari P. si ;evine 6.; ?.ources of beta-Cells for Human Cell-=ased (herapies for "iabetes+, Cell 0iochem 0ioph5s, 32%) .uppl& ,2)-,1, 2004 ; AB. Itoh ..6 #asanori <i/uchi, Poshihisa <oDama, <azuo (a/a/uda, <enichi .hinomiDa, 0unzo (ana/a, *"evelopment of a HDdro$DapatiteGCollagen Janocomposite as a #edical "evice+, Cell -ransplantation, ,) 39,-3B,, 2004 ; AA. Its/ovitz-Eldor 0., .chuldiner #., <arsenti "., Eden A., Panu/a !., Amit #., .oreT H., si =envenistD J., *"ifferentiation of human embrDonic stem cells into embrDoid bodies comprising the three embrDonic germ laDers+ , )ol. )ed. 6, ??->9., 2000 ; A?. 0ac/son <.A., #a'/a ..#., 4ang H., Pocius 0., HartleD C.0., #a'es/D #.4., Entman #.;., #ichael ;.H., Hirschi <.<. si @oodell #.A., *Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium bD adult stem cells+, 1. Clin. Invest. 1&#6 ,-?., 2001 ; A>. 0il/a ;.R., (a/ahashi <., #unsci #., 4illiams "., Robertson <. P., #onolagas .. C., X;oss of estrogens upregulates osteoblastogenesis in murine bone marro5*, 1. Clin. Invest., ,2,: ,>31,>92, 1;;> ; ?2. 0ohansson C.=., #omma .., Clar/e ".;., Risling #., ;endahl C. si 6risen, 0., *Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous sDstem+, Cell. %6, 19-)3., 1;;; ; ?,. 0ohe <.<., Hazel (.@., #uller (., "ugich-"'ord'evic #.#. si #c<aD, R."., *.ingle factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous sDstem+, 9enes ,ev. 1&, ),1>-),32., 1;;4 ; ?1. 0orgensen R.,Henri/sen7., =rott C., Eri/sen E. 6., .orensen !. H., Civittelli R., .teinberg (. (. H., *Human osteoblastic cells propagate intercellular calcium signals bD t5o different mechanisms+, 1. 0one )iner. 4es., ,9 ,213-,2)1, 2000 ; ?). <a/inuma . et al; *Human Cmbilical Cord =lood as a .ource of (ransplantable Hepatic Progenitor Cells+; *tem Cells 1,, 1,A-11A, 200. ; ?3. <ale . et al., *=one marro5 stem cells contribute to repair of the ischemicallD in'ured renal tubule+, 1ournal of Clinical Investigation ,,1, 31-3>, 200. ; ?9. <al/a C., #asuda H., (a/ahashi (., <al/a-#oll 4.#., .ilver #., <earneD #., ;i (., Isner 0.#, si Asahara (., *(ransplantation of e$ vivo e$panded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization+, Proc. 3atl. +cad. *ci. .. *. +. %#, )311-)31A., 2000 ; ?B. <assem #., Risteli ;., #ose/ilde ;., #elsen 6., Eri/sebn E. 6., *6ormation of osteoblasts-li/e cells from human mononuclear bone marro5 cultures+, +P)I* >> 1B>-1A3, 1;;1 ; ?A. <aufman ". .., ;e5is R. ;., Auerbach R. si altii, *"irected differentiation of human embrDonic stem cells into hematopoietic colonD forming cells+, 0lood >3, )3a, 1;;; ; ??. <im ..H., <im .. Evans C.H., @hivizzani ..C., !ligino (., si Robbins P."., *Effective treatment of established murine collagen-induced arthritis bD sDstemic administration of dendritic cells geneticallD modified to e$press I;-3.+, 1. Immunol. 166, )3>>-)929., 2001 ?>. <itamura .., *!steogenic "ifferentiation of Human =one #arro5-derived #esenchDmal Cells Cultured on Alumina Ceramics+, +rtificial :rgans, 1? %,& A1, 2004 ; >2. <ocher A.A., .chuster #."., .zabolcs #.0., (a/uma .., =ur/hoff "., 4ang 0., Homma .., Ed5ards J.#., si Itescu .., *Jeovascularization of ischemic mDocardium bD human bone-

B)

marro5-derived angioblasts prevents cardiomDocDte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function+, 3at. )ed. #6 3)2-3)B., 2001 ; >,. <rause "..., (heise J."., Collector #.I., Henegariu !., H5ang .., @ardner R., Jeutzel .. si .har/is ..0., *#ulti-organ, multi-lineage engraftment bD a single bone marro5-derived stem cell+, Cell. 1&"6 )B>-)AA., 2001 ; >1. <rause "..., (heise J."., Collector #.I., Henegariu !., H5ang .., @ardner R., Jeutzel .. si .har/is ..0., *#ulti-organ, multi-lineage engraftment bD a single bone marro5-derived stem cell+, Cell. 1&", )B>-)AA., 2001 ; >). <urtzberg 0 et al., *Placental blood as a source of hematopoietic stem cells for transplantation into unrelated recipients+, 3e< 7ngland 1ournal of )edicine ))9, ,9A-,BB; 1;;4 ; >3. ;abastie #.C., Cortes 6., Romeo P.H., "ulac C. si Peault =., *#olecular identitD of ematopoietic precursor cells emerging in the human embrDo+, 0lood. %26 )B13-)B)9., 1;;> >9. ;abastie, #.C., Cortes, 6., Romeo, P.H., "ulac, C. si Peault, =. *#olecular identitD of hematopoietic precursor cells emerging in the human embrDo+, 0lood. %26 )B13-)B)9, 1;;> ; >B. ;agasse E., Connors H., Al "halimD #., Reitsma #., "ohse #., !sborne ;., 4ang I., 6inegold #., 4eissman I.;. si @rompe #., *Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocDtes in vivo+, 3at. )ed. 6, ,11>-,1)3., 2000 ; >A. ;agasse E., Connors H., Al "halimD #., Reitsma #., "ohse #., !sborne ;., 4ang I., 6inegold #., 4eissman I.;. si @rompe #., *Purified hematopoietic stemcells can differentiate into hepatocDtes in vivo+, 3at. )ed. 66 ,11>-,1)3., 2000 ; >?. ;aughlin #.0., *Cmbilical cord blood for allogeneic transplantation in children and adults+, 0one )arro< -ransplant. 2#6 ,-B., 2001 ; >>. ;a5son =.R., PrudFhomme @.0., Chang P., @ardner H.A., <uan 0., <ono, ".H. si (heofilopoulos A.J., *(reatment of murine lupus 5ith c"JA encoding I6J gamma RG6c.+, 1. Clin. Invest. 1&6, 12A-1,9., 2000 ; ,22. ;ee 0P et al., *Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing+, 1ournal of Cell 0iolog5 ,92, ,2?9-,2>>; 2000 ; ,2,. ;ee !<, <uo (<, Chen 4#, ;ee <", Hsieh .;, Chen (H *Isolation of multipotent mesenchDmal stem cells from umbilical cord blood+, 0lood. ,2)%9& ,BB>-A9, 2004 ;

,21.

;iao .. .., Cui F. Z.@ Z2u A.@ ?O%t$o(la%t% Adherence and #igration through (hreedimensional Porous #ineralized Collagen =ased Composite nHACGP;A+, 1ournal of 0ioactive and Compatible Pol5mers, ,>, ,,A-,)2, 2004 ;

,2).

;in 6 et al; *Hematopoietic stem cells contribute to the regeneration of renal tubules after renal ischemia-reperfusion in'urD in mice+; 1ournal of the +merican *ociet5 of 3ephrolog5 ,3, ,,??-,,>>, 200. ; ,23. ;ois C. si Alvarez-=uDlla A., *;ong-distance neuronal migration in the adult mammalian brain+, *cience. 26!, ,,39-,,3?., 1;;4 ; ,29. ;ois C. si Alvarez-=uDlla A., *;ong-distance neuronal migration in the adult mammalian brain+, *cience. 26!, ,,39-,,3?, 1;;4 ; ,2B. ;us/in #.=., *Restricted proliferation and migration of postnatallD generated neurons derived from the forebrain subventricular zone+, 3euron. 11, ,A)-,?>, 1;;. ; ,2A. #ac<eD #.C., *Cell /inetic status of haematopoietic stem cells+, Cell. Prolif. !6 A,-?). , 2001 ; ,2?. #ale/zadeh R., Hollinger 0. !., =uc/ "., Adams 6. "., #c Allister .. =., *Isolation of human osteoblast-li/e cells and in vitro amplification for tissue engineering+, 1. Periodontol., B> ,19B-,1B1, 1;;> ; B3

,2>.

#alouf, JJ et al.; *Adult-derived stem cells from the liver become mDocDtes in the heart in vivo+; +merican 1ournal of Patholog5 ,9?, ,>1>-,>)9, 2001 ; ,,2. #c<aD R., *.tem cells in the central nervous sDstem+ *cience. 2#6, BB-A,., 1;;: ; ,,,. #ezeD E., Chandross <.0., Harta @., #a/i R.A. si #c<ercher ..R., *(urning blood into brain cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marro5+, *cience. 2%&, ,AA>,A?1., 2000 ; ,,1. #itchell < et al; *#atri$ Cells from 4hartonFs 0ellD 6orm Jeurons and @lia+; *tem Cells 1,, 9,-B2, 200. ; ,,). #iura # et al; *.HE" .tem cells from human e$foliated deciduous teeth+; Proceedings of the 3ational +cadem5 of *ciences .*+ ,22, 9?2A-9?,1; 200. ; ,,3. #omma, .., 0ohansson, C.= si 6risen, 0., *@et to /no5 Dour stem cells+, Curr. :pin. 3eurobiol. 1&, 39-3>, 2000 ; ,,9. #orrison ..0., 4hite P.#., 7oc/ C. si Anderson ".0., *Prospective identification, isolation bD flo5 cDtometrD, and in vivo self-rene5al of multipotent mammalia nneural crest stem cells+, Cell. %6, A)A-A3>., 1;;; ; ,,B. #orshead C.#. si van der <ooD <."., *A ne5 EspinF on neural stem cellsS+, Curr. :pin. 3eurobiol. 11, 9>-B9, 2001 ; ,,A. #urga #., Pao ;ei si (osato @., *"erivation of endothelilal cells from C")3 - umbilical cord blood+, *tem Cells 11 )?9-)>9, 2004 ; ,,?. Jegrin R..., At/inson <., ;eemhuis (., Hanania E., 0uttner C., (ierneD <., Hu 4.4., 0ohnston ;.0., .hizurn 0.A., .toc/erl-@oldstein <.E., =lume <.@., 4eissman I.;., =o5er .., =aDnes R., "anseD R., <aranes C., Peters 4. si <lein, 0., *(ransplantation of highlD purified C")3O (hD-,O hematopoietic stem cells in patients 5ith metastatic breast cancer+, 0iol. 0lood )arro< -ransplant. 66 1B1-1A,., 2000 ; ,,>. Je5some PJ et al., *Human cord blood-derived cells can differentiate into hepatocDtes in the mouse liver 5ith no evidence of cellular fusion+, 9astroenterolog5 ,13, ,?>,-,>22; 200. ; ,12. Jordstrom E., !hgushi H., Poshi/a5a (., Po/obori A. (., Po/obori (., *!steogenic differentiation of cultured marro5 stromal stem cells on surface of microporous h5drox5apatite based mica composite and macroporous sDnthetic hDdro$Dapatite+, 0ioA)edical )aterials 7ngineering 6 > 1,-1B, 1;;; ; ,1,. !hgushi H, <itamura ., <otobu/i J, Hirose #, #achida H, #ura/i <, (a/a/ura P., *Clinical application of marro5 mesenchDmal stem cells for hard tissue repair+, Bonsei )ed 1.;39 .uppl B,-A, 2004 ; ,11. !hgushi H., "ohiP., Poshi/a5a, (amai .., (abata .., !/unga <., .hibuga (., *!steogenic differentiation of cultured marro5 stromal stem cells on the surface of bioactive glass ceramics6 1. 0iomed. )ater. 4es., )1, 1;;4 ; ,1). !/umura < et al., *.alivarD gland progenitor cells induced bD duct ligation differentiate into hepatic and pancreatic lineages+, 2epatolog5 )?, ,23-,,), 200. ; ,13. !rlic "., <a'stura 0., Chimenti .., 0a/oniu/ I., Anderson ..#., ;i =., Pic/el 0., #c<aD R., Jadal-@inard =., =odine ".#., ;eri A. si Anversa P., *=one marro5 cellsregenerate infarcted mDocardium+, 3ature. !1&, A2,-A29, 2001 ; ,19. !rlic "., <a'stura 0., Chimenti .., 0a/oniu/ I., Anderson ..#., ;i =., Pic/el 0., #c<aD R., Jadal-@inard =., =odine ".#., ;eri A. si Anversa P., *=one marro5 cells regenerate infarcted mDocardium+, 3ature. !1&6 A2,-A29., 2001 ; ,1B. !s5ald 0., =o$berger .., 0orgensen =., 6eldmann .., Ehninger @., =ornhauser # si 4erner C., *#esencDmal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro+, *tem Cells 11 )AA-)?3, 2004 ; B9

,1A. ,1?.

!5en #., *#arro5 derived stromal stem cells+, 1. Cell *cience *upp. 1&, B)-AB., 1;>> = Palmieri "., Camardella ;., Clivi 8., @uasco @., #anduca P., *(rimer carbo$Dl propeptide of collagen I produced bD mature osteobalsts is chemotactic for endothelial cells+, 1. 0iol. Chem., 1A9 )1B9?-)1BB), 2000 ; ,1>. Panic/er #. si Rao #., *.tem cells and neurogenesis+ , #arsha/, ".R., @ardner, ".<., and @ottlieb, ". eds. Cold .pring Harbor, Je5 Por/ Cold .pring Harbor ;aboratorD Press&. )>>3)?., 2001 ; ,)2. Per/ins A.C., *Enrichment of blood from embrDonic stem cells in vitro6 4eprod. @ertil. ,ev. 1&6 9B)-9A1., 1;;> ; ,),. Petersen =.E., =o5en 4.C., Patrene <."., #ars 4.#., .ullivan A.<., #urase J., =oggs ...., @reenberger 0... si @off 0.P., *=one marro5 as a potential source of hepatic oval cells+, *cience. 2$!, ,,B?-,,A2., 1;;; ; ,)1. Pittenger #.6. si #arsha/ ".R., *#esenchDmal stem cells of human adult bone marro5+ #arsha/ ".R., Je5 Por/ Cold .pring Harbor ;aboratorD Press&. )3>-)A3., 2001 = ,)). Pittenger #.6., #ac/aD A.#., =ec/ ..C., 0ais5al R.<., "ouglas R., #osca 0."., #oorman #.A., .imonetti ".4., Craig .. si #arsha/ ".R., *#ultilineage potential of adult human mesenchDmal stem cells+, *cience. 2$!6 ,3)-,3A., 1;;; ; ,)3. Poless/aDa A et al., *4nt signaling induces the mDogenic specification of resident C"39O adult stem cells during muscle regeneration+, Cell ,,), ?3,-?91; 200.; ,)9. Poole (.0., 6in/elstein E.=. si Co$ C.#., *(he role of 6@6 and 8E@6 in angioblast induction and migration during vascular development+, ,ev. ,5n. 22&, ,-,A., 2001 ; ,)B. PrudFhomme @.0., *@ene therapD of autoimmunediseases 5ith vectors encoding regulatorD cDto/ines or inflammatorD cDto/ine inhibitors+ 1. 9ene. )ed. 2, 111-1)1, 2000 ; ,)A. Prusa A-R et al., *!ct-3-e$pressing cells in human amniotic fluid a ne5 source for stem cell researchS+, 2uman 4eproduction ,?, ,3?>-,3>); 200. ; ,)?. Nu-Petersen 7 et al.; *Identification of a novel population of muscle stem cells in mice potential for muscle regeneration+; 1ournal of Cell 0iolog5 ,9A, ?9,-?B3; 2002 ; ,)>. Rainsford E, Reen "0, *Interleu/in ,2, produced in abundance bD human ne5born ( cells, maD be the regulator of increased tolerance associated 5ith cord blood stem cell transplantation+, 0ritish 1ournal of 2aematolog5 ,,B, A21-A2>; 2002 ; ,32. Roberts R., @allagher 0., .pooncer E., Allen (."., =loomfield 6. si "e$ter (.#., *Heparan sulphate bound gro5th factors a mechanism for stromal cell mediated haemopoiesis+, 3ature. 2, )AB-)A?., 1;>> ; ,3,. RobeD P.@., *.tem cells near the centurD mar/+, 1. Clin. Invest. 1&", ,3?>-,3>,., 2000 ,31. Robinson " et al., *Characteristics of cartilage biopsies used for autologous chondrocDtes transplantation+, Cell -ransplant ,2, 12)-12?; 2001 ; ,3). Roche R. si .oria = @eneration of ne5 islets from stem cells; Cell 0iochem 0ioph5s.32%).uppl& ,,)-13,2004; RoD 8. si 8erfaillie C.#., *E$pression and functionof cell adhesion molecules on fetal liver, cord blood and bone marro5 hematopoietic progenitors implications for anatomical localization and developmental stage specificregulation of hematopoiesis+, 7xp. 2ematol. 2#, )21-),1, 1;;; ; ,33. Roth A. 0., <im =. @., ;in 4en-;ang, Cho #oon-II, *#elatonin promotes osteoblasts differentiation and bone formation+, 1. 0iol. Chem.6 13A 1123,-1123A, 1;;; ; ,39. .a/aguchi P., Ichiro .e/iDa, <azuDoshi Pagishita, .hizu/o Ichinose, <enichi .hinomiDa, (a/eshi #uneta, *.uspended cells from trabecular bone bD collagenase digestion become virtuallD identical to mesenchDmal stem cells obtained from marro5 aspirates+, 0lood6 2004 ; BB

,3B.

.alingcarnboriboon R et al., *Establishment of tendon-derived cell lines e$hibiting pluripotent mesenchDmal stem cell-li/e propertD+, 7xperimental Cell 4esearch 1?A, 1?>-)22; 200. ; ,3A. .anchez-Ramos 0 et al., *Adult bone marro5 stromal cells differentiate into neural cells in vitro+, 7xperimental 3eurolog5 ,B3, 13A-19B; 2000 ; ,3?. .chuldiner #., Panu/a !., Its/ovitz-Eldor 0., #elton ". si =envenistD J., *Effects of eight gro5th factors on the differentiation of cells derived from human embrDonic stem cells+, Proc. 3atl. +cad. *ci. .. *. +. %#, ,,)2A-,,),1, 2000 ; ,3>. .chultz E., *.atellite cell proliferative compartments in gro5ing s/eletal muscles+, ,ev. 0iol. 1#", ?3->3., 1;;4 ; ,92. .eigel @# et al., *Human corneal stem cells displaD functional neuronal properties+, )olecular (ision >, ,9>-,B), 200. ; ,9,. .hahin Rafii si "avid ;Dden, *(erapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vasculariDation and regeneration+, 3ature )edicine, 200. ; ,91. .halabD 6., Rossant 0., Pamaguchi (.P., @ertsenstein #.,4u I.6., =reitman #.;. si .chuh A.C., *6ailure of blood-island formation and vasculogenesis in6l/-,-deficient mice+, 3ature. #6, B1-BB., 1;;3 ; ,9). .hamblott #. 0., A$elman 0., 4ang .., =ugg E. #., ;ittlefield 0. 4., "onovan P. 0., =lumenthal P. "., Huggins @. R., @earhart 0. "., *"erivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells+, Pro. 3at. +cad. *ci ..*.+. >9;,)A1B-),; 1;;> ; ,93. .hamblott #.0., A$elman 0., ;ittlefield 0.4., =lumenthal P."., Huggins @.R., Cui P., Cheng ;. si @earhart 0."., *Human embrDonic germ cell derivatives e$press a broad range of developmentallD distinct mar/ers and proliferate e$tensivelD in vitro Proc. 3atl. Acad. .ci. C. *. +. %$6 ,,)-,,?., 2001 ; ,99. .hi N., Rafii .., 4u #.H., 4i'elath E..., Pu C., Ishida A., 6u'ita P., <othari .., #ohle R., .auvage ;.R., #oore #.A., .torb R.6. si Hammond 4.P., *Evidence for circulating bone marro5-derived endothelial cells+, 0lood. %2,)B1-)BA, 1;;> ; ,9B. .hihabuddin ;..., Palmer (.". si @age 6.H., *(he search for neural progenitor cells prospects for the therapD of neurodegenerative disease+, )ol. )ed. -oda5. ", 3A3-3?2., 1;;; ; ,9A. .lac/ 0.#., *.tem Cells in Epithelial (issues+, *cience. 2$#, ,3),-,3))., 2000 ; ,9?. .lac/ 0.#., *.tem cells in epithelial tissues+, *cience.2$#6 ,3),-,3))., 2000 ; ,9>. .pangrude @.0., Heimfeld .., 4eissman, I.;., *Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells+, *cience. 2!16 9?-B1, 1;>> ; ,B2. .pees 0; et al., *"ifferentiation, cell fusion, and nuclear fusion during ex vivo repair of epithelium bD human adult stem cells from bone marro5 stroma+, Proceedings of the 3ational +cadem5 of *ciences .*+ ,22, 1)>A-1321; 200. ; ,B,. .tuder ;., (abar 8. si #c/aD R.".@., *(ransplantation of e$panded mesencephalic precursors leads to recoverD in Par/insonian rats+, 3at. 3eurosci. , 1>2-9, 1;;> ; ,B1. .udo <., Ema H., #orita P. si Ja/auchi H., *Ageassociated characteristics of murine hematopoietic stem cells+, 1. 7xp. )ed. 1%26 ,1A)-,1?2, 2000 ; ,B). .un .., @uo 7., Iiao I., ;iu =., ;iu I., (ang Pei-Hsien si#ao J., *Isolation of mouse marro5 mesencDmal progenitors bD a novel and reliable method+, *tem Cells 1, 91A-9)9, 2004; ,B3. .unDer (.,;e5is 0., CollinY !sdobD P., *Estrogen s bone-protective effects maD involve differential I;-, regulation in human osteoblast-li/e cells+, 1. Clin. Invest.6 ,2) ,32>-,3,?, 1;;; ;

BA

,B9.

.urbe/ ".8., .teinmann C., =ur/ #., Hahn .., (ichelli A. si Holzgreve 4., *"evelopmental changes in adhesion molecule e$pressions in umbilical cord blood C")3O hematopoietic progenitor and stem cells+, +m. 1. :bstet. 95necol. 1$ 6 ,,91-,,9A, 2000 ; ,BB. .uzu/i A et al.; *@lucagon-li/e peptide , %,-)A& converts intestinal epithelial cells into insulin-producing cells+; Proceedings of the 3ational +cadem5 of *ciences .*+ ,22, 92)392)>; 200. ; ,BA. (ada # et al., *Juclear reprogramming of somatic cells bD in vitro hDbridization 5ith E. cells+, Current 0iolog5 ,,, ,99)-,99?; 2001 ; ,B?. (a/ahashi <., Igura <.,.7hang I, #itsuru A., (a/ahashi (. A., *Effects of !steogenic Induction on #esenchDmal Cells 6rom 6etal and #aternal Parts of Human Placenta+, Cell -ransplantation, ,) ))A-)3,, 2004 ; ,B>. (a/ahashi (., <al/a C., #asuda H., Chen "., .ilver #., <earneD #., #agner #., Isner 0.#. si Asahara (., *Ischemia- and cDto/ine-induced mobilization of bone marro5-derived endothelial progenitor cells for neovascularization+, 3at. )ed. ", 3)3-3)?., 1;;;= ,A2. (a/amiza5a .., #aehata P., !za5a .., !/ada .., <ato P., <ubota E., .ato .., *Ascorbic acid 1-phosphate stimulates proliferation and differentiation of human osteoblasts+, 7ndocrinolog5, ,3)%9& ,>31-,>3>, 2002 ; ,A,. (avian #., Coulombel ;., ;uton "., Clemente H..., ieterlen-;ievre 6. si Peault =. *Aortaassociated C")3O hematopoietic cells in the earlD human embrDo+, 0lood. $#6 BA-A1. 1;;4 ; ,A1. (erese 4insio5, Caitlin "uc/5all, *.tem cells - JIH+, 2001 ; ,A). (erese 4insla5, ;Ddia <ibiu/, *.tem cells - JIH+, 2001; ,A3. (heise J. "., Jimma/aDalu #., @ardner R., Illei P. =., #organ @., (eperman ;., Henegariu !. si <rausse ". .., *;iver from bone marro5 in humans+, 2epatolog5 )1 ,,-,B, 2000 ; ,A9. (homas E. ". si =lume <. @., *Historical mar/ers in the develpoment of allogeneic hematopoietic cell tranplantation+ , 0iol. 0lood )arro< -ranspl. 9 )3,-B, 1;;; ; ,AB. (ill 0.E. si #cCullough, E.A., *A direct measurement of the radiation sensitivitD of normal mouse bone marro5 cells+ 4adiat. 4es. 1!, 1,)-111., 1;41 ; ,AA. (oma 0@ et al; *Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian s/in+; 3ature Cell 0iolog5 ), AA?-A?3; 2002 ; ,A?. (orrente P., (remblaD 0. P., Pisati 6., =elicchi #., Rossi =., .ironi #., 6ortunato 6., El 6ahime #., "ZAngelo #. @., Caron J. 0., Constantin @., Paulin "., .carlato @. si =resolin J., * Intraarterial in'ection of muscle-derived C")3O.ca-, stem cells restores dDstrophin in md$ mice+, 1. Cell 0iol. ,91 ))9-3?, 2001 ;

,A>. ,?2.

(ran ." et al.; *"ifferentiation of human bone marro5-derived cells into buccal epithelial cells in vivo a molecular analDtical studD+; Cancet )B,, ,2?3-,2??; 200. ;

(sai et al.; *(he long term outcome of limbal allografts the search for surviving cells+, 0ritish 1ournal of :phthalmolog5 ?9, B23-B2>; 2001 ; ,?,. (so/os @.C. si Jepom @.(., *@ene therapD in the treatment of autoimmune diseases+, 1. Clin. Invest. 1&6, ,?,-,?), 2000 ; ,?1. 8erfaillie C.#., *Adhesion receptors as regulators of the hematopoietic process+, 0lood. >1, 1B2>-1B,1., 1;;> ; ,?). 8illa A., .nDder E. P., 8escoviA., #artinez-.errano A., *Establishment and propertes of a gro5th factor-dependent perpetual neural stem cell line from the human CJ. +, 7xp. 3eurol ,B, %,& BA-?3, 2000 ;

B?

,?3.

8ogele (. 0., 8oegele - <adietz #., Esposito 8., #acfelda <., !berndorfer C., 8ecsei 8., .chahus R., ,V(he effect of different isolation techniTues on human osteoblast-li/e cell gro5th+, +nticancer 4es., 12: )9A9-)9?,, 2000 ; ,?9. 4ang #.4., Consoli C., ;ane C.#., "urett A., ;auppe #.0., Champlin R., Andreeff #. si "eisseroth A.=., *Rescue from apoptosis in earlD %C")3-selected&versus late %non-C")3selected& human hematopoietic cells bD verD late antigen 3- and vascular cell adhesion molecule %8CA#& ,-dependent adhesion to bone marro5 stromal cells+, Cell 9ro<th ,iffer. %6 ,29-,,1., 1;;> ; ,?B. 4ang I et al.; *Cell fusion is the principal source of bone-marro5-derived hepatocDtes+; 3ature 311, ?>A->2,; 13 April 122); 8assilopoulos @ et al.;*(ransplanted bone marro5 regenerates liver bD cell fusion+; 3ature 311, >2,->23; 200. ; ,?A. 4ang, I et al; *;iver repopulation and correction of metabolic liver disease bD transplanted adult mouse pancreatic cells+ +merican 1ournal of Patholog5 ,9?, 9A,-9A>; 2001 ; ,??. 4eiss #; si colab., *(ransplantation of porcine umbilical cord matri$ cells into the rat brain+, 7xperimental 3eurolog5 , 200. ; ,?>. 4eiss, .. si van der <ooD "., *CJ. stem cells 5hereFs the biologDS+, 1. 3eurobiol. 6, )2A-),3., 1;;> ; ,>2. 4eissman I.;., *.tem cells units of development, units of regeneration, and units in evolution+, Cell. 1&&,,9A-,B?., 2000 ; ,>,. 4hetton A.". si @raham @.0., *Homing and mobilization in the stem cell niche+, -rends Cell. 0iol. %6 1))-1)?, 1;;; ; ,>1. 4hitloc/ C.A., (idmarsh @.6., #uller-.ieburg C. si 4eissman I.;., *=one marro5 stromal cell lines 5ith lDmphopoietic activitD e$press high levels of a pre-= neoplasia-associated molecule+, Cell. !$, ,22>-,21,, 1;>: ; ,>). 4iedmann A., @ut5ald R., ;auer @., Hubner C., .chmelzeisen R., VHo5 to optimize seeding and culturing of human osteoblast-li/e cells on various biomaterials+, 0iomaterials 1)%,B& = )),>-))1?, 2002 ; ,>3. 4oodburD " et al., *Adult bone marro5 stromal stem cells e$press germline, ectodermal, endodermal, and mesodermal genes prior to neurogenesis+, 1ournal of 3euroscience 4esearch >B, >2?->,A; 2002 ; ,>9. 4oodburD " et al; *Adult rat and human bone marro5 stromal cells differentiate intoneurons+ 1ournal of 3euroscience 4esearch B,, )B3-)A2; 2000 ; ,>B. 4right ".E., Cheshier ..H., 4agers A.0., Randall (."., Christensen 0.;. si 4eissman I.;., *CDclophosphamideGgranulocDte colonD-stimulating factor causes selective mobilization of bone marro5 hematopoietic stem cells into the blood after #-phase of the cell cDcle+ , 2001 ; ,>A. Pamashita 0., Itoh H., Hirashima #., !ga5a #., Jishi/a5a .., Purugi (., Jaito #., Ja/ao <.si Jishi/a5a .., *6l/,-positive cells derived from embrDonic stem cells serve as vascular progenitors+, 3ature. !&$, >1->B., 2000 ; ,>?. Pang ; et al.; *In vitro trans-differentiation of adult hepatic stem cells into pancreatic endocrine hormone-producing cells+; Proceedings of the 3ational +cadem5 of *ciences .*+6 >>, ?2A?-?2?); 2002 ; ,>>. 7andstra P.4., ;auffenburger ".A. si Eaves C.0., *A ligand-receptor signaling threshold model of stem cell differentiation control a biologicallD conserved mechanism applicable to hematopoiesis+, 0lood. %6, ,1,9-,111, 2000 ; 122. 7hang P., ;i C", 0iang II, ;i H;, (ang PH, #ao J., *Comparison of mesenchDmal stem cells from human placenta and bone marro5+, Chin )ed 1 %Engl&., ,,A%B& ??1-A, 2004 ;

B>

12,.

7u/ PA et al., *Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells+, )olecular 0iolog5 of the Cell ,), 31A>-31>9; "ec 1221; .afford <# et al., *Jeurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells+, 0iochemical and 0ioph5sical 4esearch Communications 1>3, )A,-)A>; 2002 ;

A2