REFERAT DE DOCTORAT

CELULE STEM ADULTE SI UTILIZAREA LOR IN MEDICINA

REGENERATIVA

2004
Capitolul I: CELULELE STEM

I.1. Introducere
Este uimitor cum un organism ia nastere dintr-o singura celula si cum celulele sanatoase le
inlocuiesc pe cele suferinde in organismul adult. Recent s-a descoperit un tip particular de celule
care fac posibile toate aceste lucruri ; celulele stem. Acest domeniu promitator al stiintei
investigheaza posibilitatea tratarii bolilor prin terapii celulare, astfel luand nastere o noua arie a
medicinii, numita medicina regenerativa sau reparatorie.
Celulele stem reprezinta una din cele mai fascinante arii ale biologiei in acest moment. Insa, ca
multe alte domenii ale cercetarii stiintifice, studiul celulelor stem ridica nenumarate intrebari care
genereaza noi controverse.

I.2 Ce sunt celulele stem si de ce sunt ele importante ?

Celulele stem prezinta doua caracteristici principale care le disting de celelate tipuri celulare.
Prima, sunt celule nespecializate care se reannoiesc pe lungi perioade de timp prin diviziuni
celulare. A doua caracteristica : in anumite conditii, sau sub anumite semnale, celulele stem pot da
nastere la diferite tipuri celulare care formeza organismul. Astfel, acestea au capacitatea de a
deveni celule mature cu forme si functii specializate  cum ar fi : cardiomiocitele, celulele din piele,
neuronii etc.
Ovulul fertilizat este totipotent ; are potentialul de a genera toate celulele si tesuturile care
formeaza un embrion si permit dezvoltarea lui in uter. Dupa fertilizare ovulul se divide si se
diferentieaza pana produce un organism matur. Mamiferele adulte, inclusiv omul, sunt formate din
aproximativ doua sute de tipuri celulare. Acestea includ ,printre altele : neuronii, celulele musculare
(miocite), celulele din piele (epiteliale), celulele din sange (eritrocite, monocite, limfocite, etc),
celulele osoase (osteocite), si celulele din cartilaj (condrocite). Alte celule, esentiale pentru
dezvoltarea embrionului, dar care nu sunt incorporate in corpul embrionului formeaza tesuturile
extraembrionare, placenta si cordonul ombilical. Toate aceste celule sunt generate dintr-o singura
celula, totipotenta, numita zigot sau ovul fertilizat.
Majoritatea cercetatorilor folosesc termenul “pluripotent” pentru a descrie celulele stem care
formeaza toate tipurile celulare derivate din cele trei foite embrionare: mesoderm, endoderm,

3
ectoderm. Aceste foite embrionare constituie sursa tuturor celulelor din organism (fig.1 -
Diferentierea tesuturilor umane). Toate tipurile specializate de celule care formeaza organismul
deriva din una din cele trei foite (tabelul nr.1 – Straturile embrionare progenitoare de tesuturi).
Celulele pluripotente au capacitatea de a forma orice tip celular , proprietate observata in
dezvolatrea embrionara si in unele conditii de laborator. Celulele din organismul adult sunt in
general multipotente, sunt capabile de diferentiere intr-unul sau mai multe tipuri celulare . Acest
proces permite formarea sau reannoirea tesuturilor. In cazul in care tesuturile sunt lezate devine
necesara inlocuirea acestora, celulele stem se pot atunci activa pentru a repara leziunile. (Slack
J.M., 2002).

(preluat dupa Terese Winsiow, Caitlin Duckwall 2001)

4
 Fig. 1 Diferentierea tesuturilor umane

Celulele stem embrionare deriva din stadiile timpurii ale dezvoltarii embrionare. In urma
fertilizarii ovulului de catre un spermatozoid rezulta zigotul, cel mai timpuriu stadiu embrionar
( fig.1 - Diferentierea tesuturilor umane). Zigotul incepe sa se divida la aproximativ 30 ore de la
fertilizare si in ziua aIIa – aIVa embrionul este format dintr-o masa compacta de celule, numita
morula. Cinci – sase zile de la fertilizare si dupa cateva cicluri de diviziuni, celulele morulei incep sa
se specializeze formand o sfera , numita blastocist, cu un diametru de aproximativ 150 µm. Stratul
exterior al blastocistului poarta numele de trofoblast, iar cel din interiorul clusterului sferei formeaza
masa celulara interioara. In acest stadiu, embrionul este format din aproximativ saptezeci de celule
trofoblastice si treizeci de celule ale masei celulare interne. Celulele din masa interna sunt
multipotente si formeaza toate tipurile celulare prezente in cele trei starturi embrionare : ectoderm,
mezoderm, endoderm (tabelul nr. 1). Recent s-a reusit sa se separe celulele blastocistului si sa se
mentina in vitro in stadiu nediferentiat. Aceste celule sunt folosite in terapiile medicale, se pot
diferentia in celule specializate si apoi pot fi transplantate la pacienti.
In practica s-a reusit extragerea celulelor stem embrionare provenite de la embrionii in varsta de 2-
5 zile obtinuti prin fertilizare in vitro.
Celulele stem din sangele ombilical sunt mai usor de procurat decat cele din maduva osoasa,
obtinandu-se printr-o procedura neinvaziva. Prezinta avantajul de a fi folosite in vederea
transplantarii imediat dupa recoltare, terapia cu astfel de celule dovedindu-se eficace in tratamentul
leucemiei si a unor boli imunologice. Recent, s-a descoperit ca sangele ombilical contine pe langa
celule stem hematopoietice si celule stem non-hematopoietice capabile de diferentiere in :
condrocite, osteoblaste, adipocite, hepatocite (Lee OK si colab., 2004).
Celulele stem fetale reprezinta tipuri celulare primitive care exista in fetus si pot da nastere la
diferite organe, insa cercetarea acestor tesuturi fetale s-a limitat doar la cateva categorii celulare :
celulele stem neuronale, inclusiv celulele din creasta neurala, celulelele stem hematopoietice si
progenitorii insulelor pancreatice. Celulele stem neurale, care sunt numeroase in creierul fetal, pot fi
izolate si crescute in forma nediferentiata in cultura si se pot diferentia in cele trei tipuri celulare
prezente in creier (Brustle O. si colab., 1998; Villa A. si colab, 2000). Aceste celule au fost utilizate
in terapia bolii Parkinson pe modele de rozatoare (Studer L. si colab., 1998). Celulele din creasta
neurala rezulta din tubul neural, migreaza si formeaza fetusul fiind capabile de diferentiere in
multiple linii celulare. Cele de la soarece au fost cultivate in laborator.

5
 Sangele fetal si ficatul fetal sunt cele mai bogate surse de celule stem hematopoietice care dau
nastere multiplelor tipuri celulare din sange, insa proprietatile lor nu au fost pe deplin investigate. S-
a consatat ca tesuturile extrase din pancreasul fetal stimuleaza productia de insulina cand sunt
transplantate in soareci diabetici, insa nu se cunoaste exact daca aceasta este produsa de celulele
stem care se diferentieaza, de celule progenitoare sau chiar de celule mature producatoare de
insulina din insulele pancreatice (Beattie G. M. si colab.,1997). De asemenea, celulele primordiale
germinale izolate din creasta gonadala, structura ce se formeaza in stadiile timpurii ale fetusului sunt
multipotente. Aceste celule prezente in sperma sau ovulul organismului adult pot fi cultivate in vitro
si formeaza cele trei foite embrionare (Shamblott M. J. si colab.,1998).
Celulele stem adulte sunt celule nediferetiate prezente in tesuturi diferentiate, cum sunt:
maduva osoasa sau creierul din organismul adult. Au capacitate de autoreannoire de-a lungul intregii
vieti a unui organism (pot forma copii identice), sau pot deveni celule specializate. Sursele de celule
stem includ : maduva osoasa, sangele, ochii, creirul, muschii scheletici, pulpa dentara, ficatul,
pielea, stratul intern al tractului gastrointestinal si pancreas. Unele dintre acestea sunt multipotente :
celulele stem din tesutul mezenchimal din maduva osoasa pot forma cele trei tipuri celulare din
creier, care deriva in mod normal din ectoderm (Mezey E. si colab., 2000), iar cele din creier se pot
diferentia in celule din sange si muschi scheletici (Bjornson C. R. si colab., 1999).
Celulele stem adulte sunt rare, dificil de identificat si purificat, iar cand sunt crescute in cultura sunt
dificil de mentinut in stare nediferentiata. Datorita acestor limitari, chiar si celulele stem din maduva
osoasa, cel mai studiat tip, nu se gasesc in numar suficient pentru a sustine potentialele aplicatii ale
medicinii regenerative. Gasirea unor cai de cultivare a celulelor stem adulte in afara organismului
constituie principala prioritate a cercetarii din acest domeniu.

Tabel nr.1 – Straturile embrionare progenitoare de tesuturi – (Chandross si colab., 2001)

Straturi embrionare Tesuturi diferentiate

Timus
Glande paratiroide, tiroida
Laringe, trahee, plamani
endoderm Vezica urinara, vagin, uretre
Organe gastrointestinale : ficat, pancreas
Straturile interne ale tractului gastrointestinal
Straturile interne ale tractului respirator

6
 Maduva osoasa ( sange)
Cortex adrenal
Tesut limfatic
mezoderm Muschii scheletici , netezi si muschiul cardiac
Tesutul conjunctiv (inclusiv oase si cartilaje)
Sistemul urogenital
Inima si vasele de sange (sistemul vascular)
Piele
Tesut nervos (neuroectoderm)
ectoderm Medulla adrenala
Glada pituitara
Tesutul conjunctiv al inimii si fetei
Ochi, ureche

Capitolul II – CELULELE STEM ADULTE

In ultimii ani un real interes a fost acordat cercetarii celulelor stem adulte, datorita capacitatii
acestora de a forma multiple tipuri celulare si tesuturi, precum si prezentei lor in numeroase tesuturi.
Termenul de ‘celule stem adulte’ este oarecum impropriu, deoarece aceste celule sunt specifice
organismelor tinere, iar celule similare s-au identificat in placenta si sange ombilical. Au fost
propusi astfel numerosi termeni : celule stem din tesuturi, celule stem somatice, sau celule stem
post-natale, insa in cele din urma a fost unanim acceptat termenul de celule stem adulte.
II.1. Ce sunt celulele stem adulte ?
Celulele stem adulte, asemeni tuturor celulelor stem, prezinta cel putin doua caracteristici. Pot
forma copii identice pe indelungate perioade de timp; capacitate denumita autoreannoiore si se pot
diferentia in tipuri celulare mature cu morfologie (forma) si functii specializate. Celulele stem
inainte de a genera celule complet diferentiate, formeaza tipuri celulare intermediare (Robey P. G. si
colab., 2000). Asemenea celule sunt considerate commited inainte de diferentierea completa (Fig.2 –
Caracteristicile distincte dintre celulele progenitoare/ precursoare si celulele stem).
Celulele stem adulte sunt rare. Functia lor principala este de a mentine un stadiu functional al
celulelor, numit homeostazie si, cu limitari, de a inlocui celulele afectate, moarte in urma leziunilor

7
sau bolilor (Holtzer H. si colab., 1978). De exemplu ; doar una din 10.000 – 15.000 de celule din
maduva osoasa este o celula stem hematopoietica (Weissman I. L. si colab., 2000). In plus, celulele
stem adulte se disperseaza in tot organismul matur, iar comportamentul lor este influentat de mediul
(tesutul) in care exista. Spre exemplu : celulele stem hematopoietice sunt generate continuu in
maduva osoasa unde se diferentiaza in toate tipurile celulare sanghine mature. Rolul principal al
acestor celule este de a inlocui celulele sangelui. Prin diferenta, celulele stem din intestinul subtire
nu sunt mobile si sunt separate fizic de cele mature pe care le genereaza. Celulele stem epiteliale
intestinale sau precursorii acestora sunt distribuite la baza criptelor, iar celulele epiteliale diferentiate
sunt situate spre lumenul intestinal. Aceste celule epiteliale din cripte se divid adesea, insa raman
parte integranta a grupului pe care il genereaza (Slack J. M. si colab., 2000).
Spre deosebire de celulele stem embrionare, care sunt definite prin originea lor (masa celulara
interna a blastocistului), celulele stem adulte par a nu detine mijloace de caracterizare. Ramane o
enigma inca originea celulelor stem adulte din tesuturile mature. Exista unele supozitii cum ca
celulele stem sunt retinute de a se divide in timpul dezvoltarii fetale.
Majoritatea informatiilor despre celulele stem adulte provin din studii facute pe soareci. Lista
tesuturilor care contin celule stem adulte este in crestere si cuprinde : maduva osoasa, sangele
periferic, vasele sanghine, cordul, pulpa dentara, muschii scheletici, epiteliul din piele si sistemul
digestive, cornea, retina, ficatul si pancreasul. Celulele stem adulte prezinta cateva caracteristici :
sunt capabile de autoreannoire de-a lungul intregii vieti a unui organism. Acest criteriu este
fundamental pentru toate celulele stem si dificil de demonstarat in vivo. O alta caracteristica a
acestor celule este aceea de a forma clone. O singura celula stem poate initia o linie celulara genetic
identica din care deriva toate tipurile celulare ce apartin tesutului de origine al celulei mama. S-a
demonstrat ca celulele stem adulte au potentialul de a forma clone in vitro precum si ca o populatie
de celule stem poate repopula anumite tesuturi. Celulele stem adulte pot da nastere la celule complet
diferentiate si integrate in tesuturi, capabile de functii specializate caracteristice respectivului tesut.
Pentru a caracteriza capacitatea de regenerare si autoreannoire a celulelor stem adulte, este
important sa se demonstreze ca o singura celula stem adulta poate genera o linie celulara genetic
identica din care se diferentieaza toate tipurile celulare prezente in tesutul de origine a celulei mama.

8
 (preluat dupaWinslow T., Kibiuk L., 2001)
Fig. 2 - Caracteristicile distincte dintre celulele progenitoare/ precursoare si celulele stem

II.2. Dovezi ale prezentei celulelor stem adulte

Celulele stem adulte sunt prezente in multe tesuturi animale si umane. In general, sunt folosite trei
metode de identificare a acestora. Pot fi marcate in vivo si in acest fel sunt urmarite. Pot fi izolate,
etichetate si apoi transplantate in organismul de origine pentru a se determina modul lor de
integrare. In final, pot fi izolate, crescute in vitro si manipulate, fie prin adaugare de factori de
crestere, sau introducand gene in scopul elucidarii mecanismului de generare a diferitelor tipuri
celulare specializate.
Este foarte dificil, daca nu imposibil, sa se faca distinctia intre celulele stem specifice unui tesut si
celulele progenitoare din tesuturile fetale sau adulte. Aceste celule, prezente in multe organe, sunt in
general necesare pentru a inlocui celulele moarte si a mentine integritatea tesulului. Celulele
progenitoare formeaza numeroase tipuri celulare ; spre exemplu : celulele sangelui cunoscute ca :

9
limfocite T, limfocite B si natural killer nu sunt capabile sa se dezvolte in toate tipurile celulare
existente in tesuturi ; ca urmare nu sunt in totalitate celule stem. Prezenta progenitorilor sau
precursorilor celulari este posibila datorita existentei celulelor stem in tesuturile adulte. Astfel,
exista progenitori ai celulelor endoteliale, celule stem ale muschilor scheletici, precursori epiteliali
in piele, sistem digestiv, progenitori sau celule stem prezente in pancreas si ficat.

II.3. Mecanismul diferentierii celulelor stem adulte

Au fost propuse cateva mecanisme de diferentiere a celulelor stem adulte in alte tesuturi. Unul
dintre acestea il reprezinta posibilitatea fuziunii celulare : celula stem fuzioneaza cu o celula
tisulara si preia astfel caracteristicile acesteia. Experimentele in vitro au demonstrat insa contrariul :
celula hibrid rezultata in urma fuziunii unei celule somatice cu o celula stem embrionara, sau cu o
celula stem germinala, preia caracteristicile celei mai nediferentiate dintre celule (Tada M si colab.,
2001). S-a ajuns insa la concluzia ca in vivo mecanismul nu este similar cu cel demonstrat in vitro,
in vitro neputandu-se realiza interactia celulelor stem adulte cu tesuturile mature. Studii recente, in
vivo au artat ca pentru ficat, hibridul rezultat reprezinta o explicatie plauzibila pentru diferentiere,
cat si pentru reparatiile organului afectat (Wang X. si colab., 2003). Coculturile realizate intre
celulele stem mezenchimale si celule epiteliale au evidentiat ca unele dintre celulele stem s-au
diferentiat in celule epiteliale, in timp ce altele au generat hibrizi pentru a reface monostratul celular
(Spees JL si colab., 2003). Abilitatea de a forma hibrizi celulari in unele testuturi poate reprezenta
un mecanism folositor in repararea anumitor organe afectate, sau pentru furnizarea genelor
terapeutice acestora (Blau HM. si colab., 2002).
In contrast cu rezultatele prezentate mai sus, alte experimente au evidentiat ca fuziunea celulara nu
detine nici un rol in diferentierea celulelor stem adulte spre alte tipuri celulare. S-a constatat ca
celulele stem din maduva osoasa se pot diferentia in celule epiteliale bucale in vivo fara fuziune, iar
celulele stem din sangele din cordonul ombilical formeaza hepatocite atunci cand sunt injectate in
ficat fara a necesita fuziunea cu celulele hepatice (Tran SD. si colab., 2003; Newsome PN si colab.,
2003). In aceste cazuri celulele stem adulte sufera schimbari in expresia genica si se diferentieaza
direct in tipul celular specific tesutului gazda, integrandu-se in acesta. Este posibil ca mecanismul de
diferentiere a celulelor stem adulte sa varieze in functie de tesutul tinta, sau de stadiul celulei stem
adulte folosita. Astfel, in cazul anumitor organe, spre exemplu ficatul, fuziunea celulelor stem adulte
cu hepatocitele este necesara pentru functionarea normala a acestui organ, pentru diferentierea
celulara si repare tisulara, iar diferentierea directa fiind intalnita in cazul altor tesuturi.

10
 II.4. Markerii celulelor stem
Deoarece examinarile microscopice nu reusesc sa faca distinctia intre celulele stem si alte celule,
singura modalitate de identificare a acestora o reprezinta prezenta markerilor de suprafata.
Markerii celulelor stem reprezinta molecule prezente pe suprafata acestora. Sunt de fapt proteine
specializate, denumite receptori, cu capacitate de legare selectiva sau aderare de alte molecule
semnal. S-au descoperit o multitudine de receptori care difera prin structura si afinitatea fata de
moleculele semnal. In mod normal celulele folosesc acesti receptori impreuna cu moleculele care se
leaga la acestia drept o cale de comunicare cu alte celule, precum si pentru a-si exercita functiile
proprii in organism. Fiecare tip celular poseda pe suprafata o combinatie unica de receptori care le
deosebeste fata de alte tipuri celulare. In multe cazuri o combinatie de markeri multiplii este folosita
pentru a identifica un tip particular de celula stem.
Exista mai multe modalitati de identificare a celulelor stem. Atasarea la moleculele de semnalizare
a unei alte molecula (tinta) cu capacitatea de a emite energie luminoasa cand este activata de o sursa
de energie, cum ar fi lumina UV sau un fascicul laser, reprezinta una din modalitatile de izolare a
celulelor stem (fig.3 – Identificarea markerilor de suprafata cu ajutorul tintelor fluorescente).

(preluat dupa Terese Winslow ; 2001)

Fig.3 – Identificarea markerilor de suprafata cu ajutorul tintelor fluorescente
In prezent se folosesc multiple tinte fluorescente care emit lumina de diferite culori si intensitati. De
asemenea, s-a observat ca exista combinatii unice intre proprietatile de fulorescenta si patternul unic
de receptori de pe suprafata celulelor. Una din tehnicile care utilizeaza markerii de fluorescenta ca
unelte de cercetare este : fluorescence – activated cell sorting (FACS) (fig. 4 – Izolarea celulelor
stem).

11
 (preluat dupa Terese Winslaw, Lydia Kibiuk, Caitlin Duckwall ; 2001)
Fig. 4 - Izolarea celulelor stem
Tehnicile de biologie moleculara si genetica au avut un rol deosebit in intelegerea procesului de
diferentiere celulara. S-au identificat gene si factori transcriptionali specifici celulelor stem. Prin
inserarea unei « gene reporter » numita green fluorescent protein (GRP) s-a urmarit diferentierea
celulara. Gena este activata doar atunci cand celulele sunt nediferentiate, in aceasta stare producand

12
o proteina fluorescenta si devine inactiva odata cu specializarea celulara. Prin cumularea acestor
metode ; reporting method cu FACS si cele de microscopie s-a reusit sortarea celulelor,
identificarea acestora in tesuturi, diferentierea si specializarea lor.

Capitolul III - PLASTICITATEA CELULELOR STEM ADULTE

Recent s-a descoperit ca celulele stem din tesuturile adulte pot genera tipuri celulare specializate
ce apartin altor tesuturi decat tesutului lor de origine – tesuturi derivate din aceeasi foita embrionara
sau din foite diferite (tabelul nr.1). Studii efectuate pe celule stem sanghine (rezultate din
mezoderm) au artat ca acestea se pot diferentia atat in celule musculare scheletice (care se
formeaza din mezoderm), cat si in neuroni (care provin din ectoderm). Astfel, s-a evidentiat ca
celulele stem care apartin unui anumit tesut adult isi pot schimba morfologia si caracteristicile
asemanandu-se cu celulele diferentiate prezente in alte tesuturi. Pentru a desemna aceasta capacitate
a celulelor stem adulte s-a folosit termenul de “plasticitate”, sau “diferentiere neortodoxa”
(Brazelton T. R. si colab., 2000; Krause D. S. si colab., 2001), sau “transdiferentiere” (Anderson D.
J. si colab.,2001; Lagasse E. si colab.,2000).

III.1. Abordari pentru demonstrarea plasticitatii celulelor stem adulte

Pentru a demonstra plasticitatea celulelor stem adulte este important sa se arate ca intr-o populatie
celulara dintr-un anumit tesut sunt prezente celule stem. Apoi, este nevoie sa se evidentieze ca
celulele stem adulte se diferentieaza in tipuri celulare ce apartin altor tesuturi decat tesutului lor de
origine. Nici unul din aceste criterii nu este usor de demonstrat. Evidentierea celulelor stem adulte in
tesuturile diferentiate este un proces foarte laborios. Se impune astfel necesara demonstratia ca
celulele stem candidate au capacitate de autoreannoire si ca pot forma tipuri celulare caracteristice
unui anumit organ.
S-a incercat urmarirea celulelor stem adulte atat in vivo, cat si in vitro. Majoritatea studiilor au fost
facute pe celule stem din soarece carora li s-a introdus prin inginerie genetica o tinta moleculara. S-a
cautat apoi sa se arate ca aceste celule marcate adopta caracteristicile structurale si biochimice ale
noului tesut pe care trebuie sa il genereze. In final, s-a demonstrat ca aceste celule se pot integra in
noul tesut, supravietuiesc in acesta si functioneaza la fel ca si celulele mature specifice tesutului

13
respectiv. In urma unor astfel de experimente s-a descoperit ca celulele stem adulte pot adopta
caracteristicile celulelor ce deriva din aceeasi foita embrionara ca si celula stem sau din foite diferite
(fig. 5 – Evidente preliminarii ale plasticitatii celulelor stem adulte).

(preluat dupaTerese Winslow, 2001)

Fig. 5 – Evidente preliminarii ale plasticitatii celulelor stem adulte
Majoritatea experimentelor care urmaresc plasticitatea celulelor stem au vizat celulele stem din
maduva osoasa, care deriva din mesoderm. Acestea se pot diferentia in alte celule cu origine
mezodermala: muschi scheletic (Ferrari G. si colab., 1998 ; Gussoni E. si colab.,1999), celule

14
cardiace (Kocher A. A. si colab.,2001 ; Orlic D. si colab., 2001), sau hepatocite (Alison M. R. si
colab., 2000 ; Lagasse E. si colab., 2000 ; Theise N. D. si colab., 2000). Insa, s-a constatat ca
aceleasi celule stem din maduva osoasa pot forma si celule cu alta origine decat cea mezodermala :
neuroni ce deriva din ectoderm (Brazelton T. R. si colab., 2000 ; Mezey E. si colab., 2000). In mod
similar , celulele neuronale din creierul adult se pot diferentia in celule hematopoietice sau alte tipuri
celulare (Clarke D. L. si colab.,2000). In ambele cazuri celulele prezinta plasticitate.
Majoritatea experimentelor care urmaresc studiul plasticitatii folosesec celule stem adulte
recoltate fie din maduva osoasa, fie din creierul adult. Celulele din maduva osoasa sunt sortate
folosindu-se markeri de suprafata in populatii de celule stem hematopoietice si celule stem stromale
medulare (Jackson K. A. si colab.,2001 ; Lagasse E. si colab., 2000 ; Orlic D. si colab., 2001).
Celulele stem hematopoietice pot fi purificate total sau partial in functie de conditiile de utilizare. O
alta cale de separare a celulelor stem din maduva osoasa o constituie distinctia intre celulele care
adera la o suprafata de cultivare (celule stromale) si cele care nu adera (celule hematopoietice)
(Ferrari G. si colab., 1998).
In studiul palsticitatii celulelor stem derivate din creier, exista cateva probleme. Celulele stem din
sistemul nervos central, spre deosebire de cele din maduva osoasa nu sunt concentrate intr-un
singur loc accesibil. In creierul sobolanilor acestea sunt dispuse in trei zone: tesutul din jurul
ventriculilor laterali, bulb olfactiv si hipocampus. S-a constatat ca aceste celule formeaza neurosfere,
agregate celulare circulare ce deriva de la o singura celula mama. Este imposibil de identificat
celulele din centrul neurosferei, astfel ca pentru studiul plasticitatii in vitro , celulele sunt disociate si
cultivate in monostraturi. Studiile in vivo presupun disocierea celulelor inainte de injectarea lor in
sistemul circulator (Bjornson C. R. si colab., 1999), sau sunt injectate ca neurosfere (Clarke D. L.
si colab., 2000).

III.2. Evidentele plasticitatii

Tipurile celulare diferite care deriva prin plasticitatea celulelor stem prezinta de obicei
caracteristicile morfologice ale celulelor diferentiate si expun markeri specifici acestora. S-a
demonstrat ca celulele stem adulte transplantate prezinta plasticitate in vivo fiind integrate in tesutul
gazda matur si poseda unele dintre caracteristicile acestuia (Brazelton si colab.,2000 ; Ferrari si
colab.,1998 ; Kocher si colab.,2001 ; Mezey si colab.,2000 ; Orlic si colab., 2001; Joanna E. si
colab., 2004).
Majoritatea lucrarilor care vizeaza plasticitatea celulelor stem adulte folosesc celule recoltate din
maduva osoasa (Brazelton T. R. si colab.,2000 ; Ferrari G. si colab.,1998 ; Lagasse E. si
15
colab.2000 ; Mezey E. si colab.,2000 ; Petersen B. E. si colab.,1999) sau din creier (Bjornson C. R.
si colab.,1999 ; Clark D. si colab., 2000) datorita faptului ca acestea au fost cel mai bine
caracterizate in cele doua tesuturi. In urma studiilor mai sus amintite s-a constatat ca populatiile de
celule stem in mamiferele adulte nu sunt entitati fixe si dupa ce sunt expuse la un nou mediu, ele pot
popula alte tesuturi si se pot diferentia in alte tipuri celulare. Ramane insa o necunoscuta
mecanismul plasticitatii in vivo. Unii cercetatori sunt adepti ai acesteia neavand insa dovezi pentru a
demonstra-o. De asemenea, nu este pe deplin cunoscut modul de desfasurare al plasticitatii in
cercetarile experimentale si cum acest fenomen poate genera tesuturi care pot fi apoi transplantate.
Daca acest fenomen este folosit ca baza in generarea tesuturilor transplantabile, tehnicile care
vizeaza plasticitatea celulara trebuie sa fie reproductibile si de incredere.

III.2.1. Evidente experimentale ale plasticitatii celulelor stem adulte

Celulele stem adulte din sistemul nervos

In urma cu treizeci de ani, Altman si Das au aratat ca doua regiuni din creierul posnatal de
sobolan ; hipocampusul si bulbul olfactiv, contin celule care se divid si devin neuroni (Altman si
colab., 1965 ; Altman, 1969). In ciuda acestei descoperiri, opinia predominanta la aceea vreme era
ca celulele nervoase din creierul adult nu se pot divide. Cercetari ulterioare au aratat ca celulele stem
din creierul adult de la mamifere pot forma trei tipuri celulare majore: astrocite, oligodendrocite si
neuroni (Gage F. H. si colab., 1995 ; Johe K. K. si colab., 1996 ; McKay R.., 1997 ; Momma S. J.
si colab., 2000 ; Shihabuddin L. S. si colab., 1999 ; Takahashi T. si colab., 1999 ; Weiss S. si colab.,
1998).
Astazi, se stie ca celulele stem din creierul fetal si adult se divid si formeaza alte celule stem sau
cateva tipuri de precursori celulari. Precursorii neuronali (denumiti si neuroblasti) se divid si dau
nastere tuturor tipurilor de celule nervoase (neuroni). Precursorii gliali formeaza astrocitele si
oligodendrocitele. Astrocilele reprezinta 70 – 80 % din celulele creierului adult, ele asigurand
suportul metabolic si mecanic. Oligodendrocitele formeaza mielina, materialul care inconjura axonii
si asigura viteza propagarii impulsului nervos. In conditii normale, in vivo, precursorii neuronali nu
dau nastere celulelor gliale, iar precursorii gliali nu se diferentieaza in neuroni. Prin contrast, in
sistemul nervos central fetal sau adult, celulele stem pot forma neuroni, astrocite si oligodendrocite,
aceasta diferentiere depinzand de semnalele pe care celulele le primesc si de mediul din creierul
adult. Inca nu este pe deplin acceptata ideea existentei celulelor stem in sistemul nervos central, nu
16
se cunoaste cum functioneaza aceste celule in vivo si nici cum sunt ele inrudite. Deoarece nu exista
markeri pentru identificarea celulelor stem in vivo, singura metoda disponibila pentru a demonstra
prezenta acestora in sistemul nervos central este de a le izola si manipula in vitro, proces care insa
poate duce la modificarea proprietatilor lor intrinseci (Morrison S. J. si colab., 1999).
In ciuda acestor dificultati, trei tipuri de celule stem din sistemul nervos central au fost descoperite
in creierul rozatorelor adulte. Date preliminare atesta existenta lor si in creierul uman adult. Un grup
este situat in tesutul nervos, langa ventriculi, regiune cunoscuta sub denumirea de zona ventriculara
si zona subventriculara. Ventriculii sunt distantati in creier, spatiul despartitor fiind umplut cu lichid
cerebrospinal. In timpul dezvoltarii fetale, tesutul adiacent ventriculilor este o regiune proieminenta
cu celule aflate in diviziune. La adult, acest tesut este mult mai mic, insa contine celule stem
(Morshead C. M. si colab., 2001).
Al II- lea grup de celule stem din sistemul nervos central, descris la soareci, nu si la oameni se
gaseste in linia de tesut care uneste ventriculii laterali cu bulbul olfactiv de la care pornesc semnale
olfactive catre nas. La soareci, neuronii din bulbul olfactiv sunt constant inlocuiti (Lois C. A. si
colab., 1994 ; Luskin M. B. si colab., 1993). A III- a posibila pozitionare a celulelor stem in creierul
soarecilor, precum si la omul adult, se gaseste in hippocampus, o parte din creier care joaca un rol
important in formarea tipurilor particulare de memorie (Eriksson P. S. si colab., 1998 ; Gage F. H. si
colab., 1995).

Celulele stem din zona subventriculara a sistemului nervos central

Celulele stem din sistemul nervos central care exista in creierul anterior ce inconjura ventriculii
laterali, sunt heterogene si se disting morfologic. Celulele ependimale, care sunt ciliate, contureaza
ventriculii. Adiacent stratului celulelor ependimale, in zona subventriculara, exista o populatie de
celule mixta formata din neuroblasti (neuroni imaturi) care migreaza in bulbul olfactiv, celule
precursoare si astrocite. Unele dintre celule se divid rapid, in timp ce altele se divid mult mai incet.
Celulele astrocit-like pot fi usor identificate datorita continutului lor in proteina gliala fibrilara acida
(GFAP), in timp ce celulele ependimale se coloreaza pozitiv la nestina, care este cunoscuta ca
marker pentru celulele stem neuronale. Nu este pe deplin cunoscut care din aceste celule poseda cele
mai bune caracteristici pentru a fi denumite celule stem neuronale (Panicher M. si colab., 2001). Un
studiu recent arata ca astrocitele din zona subventriculara a creierului de sobolan functioneaza ca
celule stem neuronale. Celulele care prezinta markeri de astrocite genereaza neuroni in vivo, fiind
identificati dupa markerii specifici neuronali. Deoarece aceste astrocite sunt capabile sa formeze
17
neurosfere in vitro (grupuri de celule nediferentiate care pot fi disociate si diferentiate in neuroni sau
celule gliale), s-a ajuns la concluzia ca ele reprezinta de fapt celule stem (Doetsch F. si colab.,
1999). Studii similare in vitro bazate pe formarea neurosferelor au fost folosite pentru a identifica
zona subependimala ca o sursa de celule stem a creierului adult de sobolan.

Celulele stem din zona ventriculara a sistemului nervos central

Un alt grup de celule stem din creierul adult de sobolan il reprezinta celulele ependimale
(Johansson C. B. si colab., 1999). Aceste celule sunt ciliate, captusesc ventriculii laterali si au fost
considerate lipsite de capacitatea de a se divide, functionand ca parte componenta a barierei sange-
creier (Del Bigio M. R. si colab., 1995). Intr-un studiu recent, care se bazeaza pe folosirea a doua
tinte moleculare : markerul fluorescent DiI si vectorul adenovirus lac Z precum si a celulelor
ependimale care captusesc interiorul sistemului nervos central s-a demonstrat ca acestea se comporta
asemeni celulelor stem (Gage F. si colab., 1995).

Celulele stem din hipocampus

Hipocampusul reprezinta una din cele mai vechi zone a cortexului cerebral si joaca un rol
important in unele forme de memorie. Regiunea din hipocampus in care exista celule stem, atat in
creierul sobolanilor, cat si uman, este zona subgranulara. Studiile facute la soareci, care foloseau
bromdeoxiuridina pentru evidentierea celulelor aflate in diviziune in aceasta zona, au aratat ca
aproximativ 50 % din celulele care au incorporat colorantul se diferentieaza in celule care par a fi
neuroni si 15 % devin celule gliale. Restul celulelor care au incorporat bromdeoxiuridina nu prezinta
un fenotip recunoscut. In mod interesant, multe, daca nu toate celulele din hipocampusul creierului
adult evidentiate cu acest colorant exista langa vasele de sange.

III.3. Celulele stem din maduva osoasa si sange

Se cunoaste de multa vreme ca maduva osoasa contine celule stem (Becker A. J. si colab., 1963 ;
Till J. E. si colab., 1961) : o populatie de celule stem hematopoietice responsabila de formarea
tuturor tipurilor celulare din sange, precum si o populatie mixta de celule stromale ce confera suport
celulelor hematopoietice si are capacitatea de a genera : oase, cartilaje, grasime, tesut conectiv
fibros, neuroni (Friedenstein A. J. si colab., 1966 ; Friedenstein A. J. si colab., 1970 ; Owen M. si
colab., 1988 ; Sanchez-Ramos J. si colab., 2000 ; Woodbury D. si colab., 2000). Izolarea acestora se
realizeza in functie de prezenta markerilor de suprafata, cat si de abilitatea de a forma monostrat in
18
cultura. Recent a fost izolata din sangele circulant cu originea in maduva osoasa o populatie de
celule progenitoare cu capacitatea de a se diferentia in celule endoteliale (Shi Q. si colab., 1998).
Afirmatia ca acesti progenitori ai celulelor endoteliale, care se aseamana cu angioblastii ce formeaza
vasele de sange in timpul dezvoltarii embrionare, reprezinta o populatie de celule stem adulte din
maduva osoasa este inca neconfirmata. Din acest motiv se presupune ca in maduva osoasa exista trei
populatii de celule stem : celule stem hematopoietice, celule stromale si posibil progenitori ai
celulelor endoteliale (fig.6 – Diferentierea celulelor stem stromale si hematopoietice). In sangele
circulant s-au identificat doua tipuri de celule stem, insa nu s-a demonstrat ca au originea in maduva
osoasa. O populatie, numita pericite, pare a fi inrudita cu celulele stromale medulare, insa originea
lor ramane inca necunoscuta (Bianco P. si colab., 1999). A II – a populatie de celule stem
hematopoietice, evidentiata in patru specii testate : porci de guineea, soareci, iepuri si om,
asemanatoare cu celulele stromale, poate genera os si cartilaj (Lois C. si colab., 1994).

(preluat dupaTerese Winslaw, Lydia Kibiuk, 2001)

Fig. 6 - Diferentierea celulelor stem stromale si hematopoietice

19
 III.4. Celulele stem hematopoietice
Dintre toate tipurile celulare din organism, cele care supravietuiesc pentru perioade scurte de timp
sunt celulele sangelui si unele tipuri de celule epiteliale. Spre exemplu eritrocitele, care isi pierd
nucleul, traiesc aproximativ 120 de zile in circulatie. Viata unui organism depinde de abilitatea
acestor celule precum si a altora din sange de a fi inlocuite continuu. Acest proces de inlocuire se
realizeaza in maduva osoasa, unde celulele stem hematopoietice sunt produse, se divid si se
diferentieaza in toate tipurile celulare din sange. S-a constatat ca celulele stem hematopoietice si
cele din sange au acelasi traseu : din maduva osoasa in sange si inapoi, fiind sub influenta unor
factori secretori care regleaza proliferarea, diferentierea si migrarea lor. Celulele stem
hematopoietice au capacitatea de a reconstitui sistemul hematopoietic al unui soarece supus unor
doze letale de radiatii. S-a demonstrat astfel ca aceste celule stem pot reface in intregime sangele
(Becker A. J. si colab., 1963; Till J. E. si colab., 1961). Celulele stem hematopoietice sunt definite
prin abilitatea lor de autoreannoire si de a forma toate tipurile celulare prezente in sange. O singura
celula stem este capabila sa regenereze un intreg sistem hematopoietic.
De-a lungul anilor, nenumarate combinatii de markeri de suprafata au fost folositi pentru a
identifica, izola si purifica celulele stem hematopoietice derivate din maduva osoasa sau sange.
Celulele stem hematopoietice nediferentiate si progenitorii acestora exprima : c-kit, CD 34, H-2K,
neprezentand de obicei markerii Lin, sau exprima intr-un nivel foarte scazut Lin-. Rezultate
incurajatoare in cazul transplanturilor celulare l-au avut celulele CD34+, Thy1+, Lin-.
Pana in prezent au fost identificate doua tipuri de celule stem hematopoietice : cu viata lunga, cu
activitate telomerazica crescuta si care prolifereaza pe intreaga viata a unui organism si al II-lea tip,
cu viata scurta, ele proliferand pe perioade limitate, probabil cateva luni. Celulele stem
hematopoietice cu viata scurta se diferentieaza in precursori limfoizi si mieloizi. Precursorii limfoizi
se diferentieaza in celule T, B, NK, aceste mecanisme fiind inca investigate (Akashi K. si colab.,
1999). Precursorii mieliozi se diferentieaza in : monocite, macrofage, neutrofile, eozinofile,
megacariocite, eritrocite (Akashi K. si colab., 2000). In vivo, celulele stem hematopoietice din
maduva osoasa se diferentieaza in celule mature, specializate ale sangelui, care circula constant din
maduva osoasa in sange si inapoi in maduva osoasa (Domen J. si colab., 1999). S-a demonstrat
recent ca celulele stem hematopoietice cu viata scurta reprezinta o populatie heterogena cu
capacitate de autoreannoire si de a repopula sistemul hematopoietic (Guenechea G. si colab., 2001).
Incercarile de a induce proliferarea celulelor stem hematopoietice in vitro pe numeroase
substraturi, inclusiv cele care mimeaza conditiile din stroma au fost sortite esecului multi ani. S-a
constatat ca aceste celule prolifereaza in vitro, insa de obicei se diferentieaza sau mor (Domen J. si
20
colab., 1999). De aceea majoritatea studiilor despre celulele stem hematopoietice vizeaza factorii,
interactiile celula-celula si celula-matrice care controleza proliferarea si diferentierea lor in vivo,
sperand ca aceste conditii pot fi obtinute si in vitro. Majoritatea factorilor solubili care regleaza
diferentierea celulelor stem hematopoietice in vivo sunt citochine, produse de diferite tipuri celulare
si apoi concentrate in maduva osoasa in matrixul extracelular al celulelor stromale – locul formarii
sangelui (Hunt P. si colab., 1987 ; Whitlock C. A. si colab., 1987). Cele mai studiate citochine sunt :
factorul stimulator de colonii granulocite-macrofage (GM-CSF) si interleuchina 3 (IL-3) (Gordon
M. Y. si colab., 1987 ; Roberts R.,si colab., 1988). De asemenea importante in proliferarea si
diferentierea celulelor stem hematopoietice sunt interactiile acestor celule cu moleculele de adeziune
din matrixul extracelular din stroma medulara (Roy V. si colab., 1999 ; Verfaillie C. M. si colab.,
1998 ; Zandstra P. W. si colab., 2000).

III.5. Celulele stromale din maduva osoasa

Celulele stromale din maduva osoasa detin un rol important in diferentierea celulelor mature
existente in sange din celule stem hematopoietice (fig.4 Diferentierea celulelor stem stromale si
hematopoietice). In afara faptului ca furnizeaza un mediu propice pentru diferentierea celulelor
stem hematopoietice, celulele stromale medulare pot genera: cartilaj, os, tesut adipos, precum si
celule endoteliale (Friedenstein A. J. si colab., 1966; Friedenstein A. J. si colab., 1968;Oghushi H.
si colab., 2004; Oswald J. si colab., 2004; Sun S. si colab., 2004). Ramane inca o problema daca
celulele stromale pot fi clasificate drept celule stem sau progenitori celulari prezenti in maduva
osoasa. De asemenea, nu este pe deplin cunoscut daca celulele stromale medulare si celulele stem
mezenchimale reprezinta aceeasi populatie celulara (Pittenger M. F. si colab., 2001).
Celulele stem mezenchimale pot prolifera timp indelungat in cultura si dupa perioade lungi in vitro
isi pastreaza capacitatea de diferentiere in adipocite, condroblaste, osteoblaste (Gronthos S. si colab.,
2003). In urma analizelor de biologie moleculara s-a constatat ca acestea exprima gene specifice
celor trei straturi embrionare : mezoderm, ectoderm, endoderm, precum si gene specifice celulelor
germinale (Woodbury D. si colab., 2002). Acesta expresie genica s-a dovedit caracteristica
celulelor stromale. In urma acestor rezultate s-a constatat ca celulele stem stromale au deja
capacitate de multidiferentiere, iar pentru diferentierea intr-o anumita directie fiind necesara doar
reglarea cantitativa a patternului expresiei genelor existente.
Celulele stromale din maduva osoasa prezinta numeroase caracteristici care le deosebesc de
celulele stem hematopoietice. Astfel, cele doua tipuri celulare sunt usor de separat in vitro. Dupa ce
maduva osoasa este disociata si celulele medulare sunt insamantate cu densitate scazuta, celulele
21
stromale adera la suprafata vasului de cultura, in timp ce celulele stem hematopoietice cresc in
suspensie. In vitro, cultivate in conditii specifice, celulele stromale medulare formeaza colonii
provenite dintr-o singura celula numita unitate formatoare de colonii (CFU-F). Aceste colonii pot fi
ulterior diferentiate in adipocite sau pot forma stroma medulara. Spre deosebire de celulele stem
hematopoietice, care nu se divid in vitro (sau prolifereaza pe o perioada scurta de timp), celulele
stromale pot realiza 35 dublari de populatii in vitro (Bruder S. P. si colab., 1997). Aceste celule
prolifereaza rapid sub influenta unor mitogeni ca: factorul de crestere derivat din plachete (PDGF),
factorul de crestere epidermal (EGF), factorul bazic de crestere din fibroblaste (bFGF) si factorul de
crestere insulin - like1 (IGF1) (Bianco P. si colab., 2001).
Este practic imposibila izolarea unei populatii pure de celule stromale din maduva osoasa.
Multitudinea de markeri folositi pentru identificarea acestor celule include receptori pentru citochine
(interleuchina-1, 3, 4, 6 si 7), receptori pentru proteinele din matricea extracelulara, (ICAM-1 si 2,
VCAM-1, integrienle α 1, 2 si 3 si β- 1, 2, 3 si 4) ( McKay R.).
Recent s-a obtinut izolarea celulelor mezenchimale din sangele din cordonul ombilical. Asemeni
celulelor din maduva osoasa si acestea formeaza colonii care pot realiza cel putin 20 dublari de
populatie, putand fi mentinute in vitro timp de opt pasaje. Prezinta capacitate de diferentiere
osteogenica si condrogenica, insa este redusa diferentierea adipogenica, comparativ cu celulele
mezenchimale din maduva osoasa (Bieback K. si colab., 2004). S-a consatat de asemenea ca celulele
CD34- izolate din sangele din cordonul ombilical pot forma celule endoteliale (Murga M. si colab.,
2004).
Asemeni celulelor stem hematopoietice, celulele stromale din maduva osoasa deriva din
mezoderm in timpul dezvoltarii embrionare ; insa cu toate acestea nici un precursor sau celula stem
stromala nu au fost izolate si identificate. Una dintre teoriile care dezbat originea acestora este aceea
ca un tip comun de celula progenitoare – probabil o celula primordiala endoteliala care margineste
vasele de sange embrionare – da nastere atat celulelor stem hematopoietice, cat si precursorilor
mezodermali. Mai tarziu acestia se pot diferentia in precursori miogenici (celule satelit care se
presupune ca functioneaza ca celule stem in muschii scheletici ) si celule stromale din maduva
osoasa (Bianco P. si colab., 1999).
In vivo, diferentierea celulelor stromale in tesut adipos si osos nu este deloc simpla. Adipocitele
din maduva osoasa si celulele stromale care functioneaza ca mielosuport – ambele derivate din
celulele stromale din maduva osoasa – pot fi privite ca fenotipuri alternative (Bianco P. si colab.,
1999 ; Bianco P si Riminucci, 1999). Adipocitele nu se dezvolta decat in timpul vietii postnatale,
cand oasele se maresc si cavitatea medulara creste pentru a sustine hematopoieza. Cand cresterea
22
scheletului inceteaza iar numarul celulelor stem hematopoietice descreste fata de cel normal,
fenomen dependent de varsta, celulele stromale din maduva osoasa se diferentieaza in adipocite,
care au rolul de a umple spatiile libere. Formarea noului os este evident mai accentuata in timpul
cresterii scheletului, desi turn-overul tesutului osos dureaza intreaga viata. Nu este pe deplin
cunoscuta relatia dintre osteoblaste (celulele formatoare de os) si celulele stromale din maduva
osoasa. Se presupune ca osul trabecular nou format, care reprezinta regiunea interioara a osului in
apropierea maduvei, se dezvolta prin actiunea celulelor stromale din maduva osoasa. Suprafata
exterioara a osului prezinta de asemenea turn-over, ca si osul din apropierea sistemului Haversian,
desi nici una din aceste suprafete nu este in contact cu celulele stromale medulare.

III.6. Celulele stem adulte din alte tesuturi

Este deosebit de greu, daca nu imposibil sa se faca distinctia intre celulele stem adulte specifice
unui tesut si progenitorii celulari.

III.6.1 Progenitorii endoteliali celulari

Celulele endoteliale marginesc suprafata intrena a vaselor de sange. S-a dovedit dificil de
identificat celule stem endotelilale atat in embrion, cat si in organismele mamiferelor adulte. In
timpul dezvoltarii embrionare, imediat dupa stadiul de gastrula, se formeaza un tip celular numit
hemangioblast, derivat din mezoderm, care se presupune ca reprezinta precursorul liniilor
hematopoietice si endoteliale. Vasculatura embrionului formata in acest stadiu consta din insule
sanghine in sacul vitelin, insa hemangioblastii nu au fost izolati din embrioni, iar existenta lor
ramane inca sub semnul intrebarii. Evidentele prezentei hemagioblastilor provin din studiile
efectuate pe celule stem embrionare de soarece care sunt direct diferentiate in vitro. Aceste studii
arata ca un precursor celular derivat din celule endoteliale de soarece care exprima Flk-1 (receptor
pentru factorul de crestere vascular endotelial - VEGF) poate da nastere atat celulelor sangelui, cat si
celulelor vaselor de sange (Shalaby B. si colab., 1995 ; Yamashita si colab., 2000). Atat VEGF ,
precum si factorul de crestere pentru fibroblasti 2 – FGF-2 detin un rol crucial in diferentierea
celulelor endoteliale in vivo (Poole T. J. si colab., 2001).
Studii recente au demonstrat ca maduva osoasa contine celule care dau nastere vaselor de sange in
tesuturile ischemice (leziuni provocate prin deprimare de sange si oxigen) (Ashara T. si colab.,
1963 ; Folkman J. si colab., 1998 ; Kalka C. si colab., 2000 ; Takahashi T. si colab., 1999). Ramane
insa o necunoscuta care dintre tipurile celulare din maduva osoasa induce angiogeneza.
23
 S-a observat ca celulele umane derivate din maduva osoasa injectate in coada sobolanilor cu
ischemie cardiaca indusa, migreaza in inima, unde genereaza noi vase de sange in zona infarctata,
inducand astfel angiogeneza.
S-a reusit izolarea progenitorilor endoteliali din sangele periferic folosindu-se anticorpi specifici
pentru CD34 si Flk-1. Aceste celule erau mononucleate, CD34+ si Flk+. In cultura se ataseaza de
substrat, devin fuziforme si formeaza structuri tubuli-like asemanatoare vaselor de sange.
Transplantate in soareci apartinanad aceleiasi specii (transplant autolog) cu ischemie indusa
experimental, celulele din maduva ososasa CD34 + promoveaza formarea noilor vase (Asahara T. si
colab., 1997). Astfel celulele adulte CD34+ si Flk+din maduva osoasa functioneaza in unele cazuri
asemeni celulelor stem, de obicei aceste celule fiind privite drept progenitori celulari.

III.6.2 Celulele stem din muschii scheletici

Muschiul scheletic, ca si muschiul cardiac si muschiul neted din peretii vaselor de sange este
derivat din mezoderm. S-a constatat ca exista cel putin trei populatii de celule stem in muschiul
scheletic :celulele satelit, celulele din peretele aortei dorsale si asa numita « side population » ,
observata si in maduva osoasa si ficat, cu abilitatea de a regenera tesutul muscular (Asakura A. si
coalb., 2002). Celulele satelit participa in anumite conditii la innlocuirea mioblastilor si
miofibrilelor, mediind si cresterea muschiului (Scultz E. , 1996). S-a constatat de asemenea, ca
muschiul adaposteste, alaturi de celulele stem specifice si alte celule stem ; celule stem
hematopoietice care migreaza din maduva osoasa si sangele periferic. Celulele stem derivate din
muschi au fost izolate si folosite in modele animale in regenerarea osoasa si musculara (Lee JY.,
2000). In urma studiilor efectuate pe modele animale de distrofie musculara s-a descoperit o
populatie de celule stem derivate din muschi cu capacitate de regenerare musculara (Torrente Y.,
2001). S-a dovedit ca stimularea regenerarii musculare cu celule stem derivate din muschi este mai
crescuta dupa injuria tesutului (Qu-Petersen Z., 2002 ; Polesskaya A., 2003).
Datorita asemanarilor dintre muschiul scheletic si miocard, celulele stem derivate din muschi au
fost folosite in refacerea cardiaca, observandu-se ca bataile cardiace sunt necesare pentru
diferentierea celulelor stem musculare scheletice in cardiomiocite (Atkins, B., 1999; Iijima Y.,
2003). Rezultate pozitive au fost obtinute in clinica prin utilizarea celulelor musculare scheletice in
repararea leziunilor cardiace.

24
 III.6.3. Celulele stem din ficat
Exista similitudini intre ficat si pancreas, ambele derivand din endoderm, similitudini care
faciliteaza interconvertirea celulelor din cele doua tesuturi. Studii recente au demonstrat ca un singur
precursor celular derivat din endoderm poate genera atat pancreasul ventral, cat si ficatul (Deutsch
G. si colab., 2001). La mamiferele adulte, cele doua organe sunt constituite din multiple tipuri de
celule diferentiate care provin din tipuri multiple de celule stem. Prin studii de inginerie genetica; s-
au adaugat gene provenite de la celulele pancreatice celulelor hepatice si s-a reusit convertirea
ficatului in pancreas (Yang L, si colab., 2002). Celule stem hepatice de soarece au putut fi convertite
in vitro in celule pancreatice secretoare de insulina. Transplantate in soareci cu diabet indus
experimental, aceste celule au capacitatea de a restabili concentratia normala de glucoza in sange.
De asemenea, s-a constatat ca celulele stem hepatice injectate in inima pot forma miocite ( Malouf
NN. si colab.,2001).

III.6.4. Celulele stem pancreatice

Interconvertirea intre pancreas si ficat a fost demonstrata folosindu-se celule stem din pancreas. S-
a observat ca la soareci celulele stem pancreatice pot repopula un ficat afectat si pot corecta bolile
hepatice metabolice (Wang, X. si colab., 2001). Una din posibilitatile de tratament a diabetului ar
consta in identificarea unei celule stem care poate regla nivelul insulinei secretate intr-o maniera
dependenta de glucoza. S-a reusit in acest sens prelevarea de insule pancreatice de la cadavre care
au fost apoi transplantate la pacienti cu rezultate pozitive, insa devine necesar gasirea de noi surse de
celule secretore de insulina. S-a demonstrat ca pancreasul insusi contine celule stem/progenitori
celulari care pot regenera atat in vivo, cat si in vitro celulele secretoare de insulina. Un rol important
in diferentierea celulelor stem pancreatice il detine glucagonul (Bonner-Weir S. si colab., 2000). S-a
observat ca acelasi hormon poate induce diferentierea celulelor epiteliale intestinale de soarece in
celule secretoare de insulina in vitro, iar aceste celule s-au dovedit folositoare atunci cand sunt
tranplantate la soarecii diabetici (Suzuki A. si colab., 2003). In afara celulelor stem din pancreas si
din intestin, s-au dovedit capabile de a secreta insulina si reface pancreasul lezat si alte tipuri de
celule stem adulte : celulele stem din maduva osoasa si ficat (Kale S. si colab., 2003 ; Lin F. si
colab., 2003 ; Yang L. si colab., 2002).

III.6.5. Celulele stem din limbul corneal

In prezent, celulele stem din limbul corneal sunt folosite in inlocuirile de cornee. Aceste celule pot
fi mentinute si multiplicate in cultura, crescute pe membrane amniotice pentru a forma noi cornee si
25
apoi pot fi transplantate la pacienti cu rezultate incurajatoare (Tsai si colab., 2001) . Un studiu recent
arata ca celulele stem din cornee manifesta proprietati functionale asemanatoare celulelor neuronale
in cultura (Seigel GM si colab., 2003).

III.6.6. Celulele stem mamare

Experimente facute pe celule stem mamare din soarece au artat ca acestea pot fi propagate in vitro
si se pot diferentia in cele trei linii epiteliale mamare (Dontu G. si colab., 2003). Profilul
transcriptional al acestor celule arata expresii genice similare cu cele ale celulelor stem din maduva
osoasa. Sunt studii care atesta ca celulele stem umane si cele provenite de la soareci exista ca o
populatie “side”, asemanatoare cu cele observate in maduva osoasa, ficat si celulele stem musculare
(Alvi AJ. si colab., 2003). In cultura, populatia « side » de celule stem mamare poate forma structuri
ductale epitelilale.

III.6.7. Celulele stem din glandele salivare

Studii recente au aratat ca celulele stem pot fi izolate si din glandele salivare si propagate in vitro
(Okumura K. si colab., 2003). In functie de conditiile de cultivare celulele pot exprima gene
specifice ficatului sau pancreasului ; injectate in sobolani s-a observat ca acestea se integreaza in
tesutul hepatic.

III.6.8. Celulele stem din piele

Celulele stem adulte multipotente au fost izolate din derm si foliculii firului de par de la sobolani
(Toma JG. si colab., 2002). S-a observat ca acestea joaca un rol important in mentinerea structurii
foliculilor firelor de par si a epidermei, pot fi propagate in vitro, iar celulele stem izolate clonal se
pot diferentia in cultura in neuroni, celule gliale, celule musculare netede si adipocite.

III.6.9.Celulele stem din tendoane

Un studiu recent atesta izolarea unei linii de celule stem din tendonul de soarece. Celulele prezinta
o morfologie similara cu a celulelor mezenchimale, gene cu potential de exprimare osteogenic,
condrogenic si adipogenic, similare cu cele din celulele stem mezenchimale din maduva osoasa
(Salingcarnboriboon R. si colab., 2003).

26
 III.6.10.Celulele stem din membranele sinoviale
S-a reusit izolarea celulelor stem din membrane sinoviale umane, care s-au dovedit a fi
multipotente, avand inclusiv potential miogenic (De Bari C. si colab., 2001). Celulele stem injectate
in circulatia sanghina se pot incorpora in muschi, capata fenotip muscular si au capacitatea de a
repara leziunile musculare (De Bari C. si colab., 2003).

III.6.11.Celulele stem din cartilaj

Biopsiile provenite din cartilaje umane plasate in cultura sufera un proces de dediferentiere in
condrocite primitive cu fenotip de celule stem mezenchimale (Robinson D. si colab., 2001). Aceste
condrocite au fost folosite in transplanturi in repararile cartilajelor articulare afectate si in
tratamentul copiilor cu osteogenesis imperfecta (Horwitz EM. si colab., 1999 ; Horwitz EM. si
colab., 2002).

III.6.12.Celulele progenitoare din timus

Recent s-a obtinut izolarea progenitorilor epiteliali din timus (Bennett AR. si colab., 2002).
Grefarea acestor celule in soreci determina producerea tuturor tipurilor de celule epiteliale din timus,
precum si homingul limfocitelor T.

III.6.13. Celulele stem din pulpa dentara

S-a constatat ca celulele stem izolate din pulpa dentara adulta pot fi propagate in vitro si au
capacitate de proliferare rapida (Gronthos S. si colab., 2000). De asemenea, prezinta similaritati cu
celulele stem mezenchimale din maduva osoasa, ; cand sunt injectate in soareci imunodeficienti
celulele stem adulte din pulpa dentara formeaza initial structuri dentin-like inconjurate de tesut
interstitial pulpar. O alta sursa de celule stem o reprezinta dintii prelevati de la copii in primele luni
de viata (Miura M. si colab., 2003). In vitro aceste celule pot genera ; neuroni, adipocite,
odontoblasti, iar dupa injectarea in soareci imunodeficienti, acestea participa la formarea osului,
dentinei si celulelor neuronale.

III.6.14.Celulele stem derivate din tesutul adipos

Una dintre cele mai interesante surse de celule stem umane o reprezinta tesutul adipos, in
particular grasimea liopsuctionata. Aceste celule pot fi mentinute in cultura perioade indelungate, au
o morfologie mazenchimal-like si se pot diferentia in vitro in : tesut adipos, cartilaj, muschi si tesut

27
osos (Zuk PA. si colab., 2002; Guilak F. si colab., 2004). De asemenea, s-a s-a demonstrat ca aceste
celule se pot diferentia si in neuroni (Zuk PA. si colab., 2002).

III.6.15.Celulele stem din sangele cordonului ombilical

Folosirea celulelor stem din cordonul ombilical a cunoscut un real interes in ultimul timp. Acestea
reprezinta surse pentru transplanturile sanghine similare cu transplanturile de celule stem medulare,
fiind folosite cu succes in tratamentul anemiei (Kurtzberg J. si colab., 1996). Sangele din cordonul
ombilical prezinta o imunogenicitate mai scazuta comparativ cu cel din maduva osoasa, datorita
probabil nivelului crescut de interleukina10 (Rainsford E. si colab., 2002). O alta posibilitate de a
determina scaderea rejectiei se poate obtine in cazul in care transplanturile de celule stem din sange
de cordon ombilical prezinta o expresie scazuta de beta-2-microglobulina (Beerheide W. si colab.,
2002). S-a constatat ca aceste celule pot fi crioprezervate timp indelungat (15 ani) pastrandu-si
aceleasi proprietatile functionale (Broxmeyer HE. si colab., 2003). Similitudini cu celulele stem
medulare prezinta si in ceea ce priveste potentialul de diferentiere in alte tipuri celulare. Celulele
stem umane din sange din cordon ombilical poseda markeri neuronali, iar administrarea lor
intravenoasa in modele animale ischemice a determinat recuperarea functionala a acestor animale
(Chen J si colab., 2001). Un studiu recent a artat ca o linie progenitoare de celule stem neuronale
derivata din celule din sange de cordon ombilical poate fi mentinuta in cultura timp de doi ani fara
pierderea capacitatii de diferentiere (Buzanska L. si colab., 2003). Alte studii atesta diferentierea
celulelor hepatice functionale din celule stem din sangele cordonului ombilical (Kakinuma S. si
colab., 2003).

Celulele stem mezenchimale din cordonul ombilical

S-a constatat ca si celulele din matrixul cordonului ombilical prezinta capacitate de autoreannoire.
Aceste celule prezinta markeri tipici celulelor stem (c-kit) si activitate telomerazica crescuta, pot
realiza in vitro 80 de dublari de populatie si pot fi induse sa formeze neuroni (Mitchell K si colab.,
2003). Transplantate in sobolani, celulele exprima markeri neuronali si se integreaza in creier
(Weiss ML si colab., 2003).

Celulele stem amniotice

Fluidul amniotic contine celule stem care pot prelua proprietati neuronale atunci cand sunt
injectate in creier (Mitchell K. si colab., 2003). Recent s-a reusit izolarea acestor celule din fluidul

28
amniotic si s-a constatat ca ele exprima Oct-4, gena tipica celulelor stem pluripotente (Prusa A-R . si
colab., 2003).

Capitolul IV - CELULELE STEM HEMATOPOIETICE

IV.1. Introducere
Celulele sangelui sunt responsabile pentru mentinerea constanta si protectia imuna a tuturor
tipurilor celulare din organism. Aceste celule, alaturi de cele din piele prezinta o mare capacitate de
autoreannoire comparativ cu oricare alt tesut adult.
Celulele stem care formeaza sangele si celulele sistemului imunitar sunt cunoscute drept celule
stem hematopoietice. Acestea sunt responsabile de innoirea constanta a sangelui – productia
bilioanelor de noi celule sanghine din fiecare zi.
Speranta ca numeroase boli pot fi candva tratate cu ajutorul terapiei cu celule stem este inspirata
de succesul transplanturilor cu celule provenite din maduva osoasa in cresterea ratei de supravietuire
a pacietilor cu leucemie si alte forme de cancer, incluzand boli ale sistemului imun si ale sangelui
(Thomas si Blume, 1999).

IV.2.Ce sunt celulele stem hematopoietice ?

Celulele stem hematopoietice reprezinta celule izolate din maduva osoasa cu capacitate de
autoreannoire, se pot diferentia intr-o varietate de tipuri celulare specializate, pot fi mobilizate in
sangele circulant si isi pot incheia viata prin apoptoza - moarte celulara programata.
Celulele stem hematopoietice au fost descoperite si caracterizate inca din anul 1960. Deoarece in
cultura acestea arata si se comporta asemeni celulelor albe ale sangelui, s-au dovedit foarte greu de
identificat dupa morfologie (dimensiuni si forma). Studiile pe soareci au avut un rol deosebit in
elucidarea proprietatilor celulelor stem hematopoietice. Astfel, s-a observat ca numai una din 10.000
– 15.000 de celule din maduva osoasa este o celula stem, in sangele circulant, proportia fiind mult
mai mica : o celula stem la 100.000 celule ale sangelui. Astazi se incearca gasirea unor teste prin
care sa se evidentieze capacitatea de autoreannoire si plasticitatea celulelor stem hematopoietice.
Numeroase studii au evidentiat prezenta a doua tipuri de celule stem hematopoietice : cu viata lunga,
capabile de autoreannoire si cele cu viata scurta. Celulele stem cu viata lunga introduse in animale al
caror sistem hematopoietic a fost iradiat, au capacitatea de a reface acest sistem in cateva luni.
Celulele stem hematopoietice cu viata scurta pot regenera imediat toate tipurile celulare prezente in

29
sange, insa in conditii normale nu se pot autoreannoi, fapt pentru care li s-a acordat denumirea de
progenitori / precursori cu viata scurta. Progenitorii / precursorii sunt in general celule imature care
pot forma anumite tipuri celulare complet diferentiate. Sunt capabili de proliferare, insa au
capacitate limitata de diferentiere in mai mult de un singur tip celular. Spre exemplu ; un progenitor
celular poate forma o celula rosie din sange (fig.7 – Diferentierea celulelor stem hematopoietice ).

( preluat din “Stem cells and the future of regenerative medicine”, 2001)
Fig. 7 – Diferentierea celulelor stem hematopoietice

IV.3.Celulele stem hematopoietice pot fi identificate cu ajutorul markerilor celulari?

Exista o mare dificultate in identificarea celulelor stem hematopoietice. Fie datorita existentei
tipurilor multiple de celule stem, fie aspectului asemanator al acestora cu al altor specii celulare
prezente in sange sau in maduva osoasa. Cel mai folosit criteriu in identificarea celulelor stem
hematopoietice s-a dovedit a fi evidentierea markerilor de suprafata specifici.

30
 Inca din anul 1988 a fost identificat un set de markeri proteici prezenti pe suprafata celulelor stem
sanghine de la soareci cu viata lunga (long-term) (Spangrude G.R. si colab., 1988). Ulterior s-a
descoperit un set de markeri specifici celulelor stem umane (Baum C. M. si colab., 1992). Weissman
introduce pentru identificarea celulelor stem hematopoietice un set de markeri apropiati atat
celulelor de soarece, cat si celulelor umane ( tabelul nr. 2) (Weissman I. L., comunicare personala).
Tabelule nr. 2 – Markerii celulari de suprafata propusi pentru identificarea celulelor stem
hematopoietice nediferentiate

Soarece Om
low/- +
CD34 CD34
SCA- 1+ CD59+
Thy1 +/low Thy1+
+
CD38 CD38low/-
C-kit+ C-kit-/low
lin- lin-

numai o familie de markeri CD59 a fost evaluata

Lin – markerii celulelor lipsesc din 13, 14 linii mature sanghine
Tabelul cuprinde markerii de suprafata ai celulelor stem hematopoietice uname si de soarece
aflate in stadiu nediferentiat, markeri prezenti atat in vivo, cat si in vitro. Cand celulele incep sa se
diferntieze ca linii celulare distincte, markerii de suprafata nu mai sunt prezenti.
Grupul celulelor sortate dupa markerii de suprafata este heterogen si cuprinde : celule stem cu
viata lunga capabile de autoreannoire, unii progenitori cu viata scurta si cateva celule non-stem.

IV.4. Surse de celule stem hematopoietice

IV.4.1. Maduva osoasa
Sursa clasica de celule stem hematopoietice o reprezinta maduva osoasa. Transplanturile de
maduva osoasa se practicau inca in urma cu patruzeci de ani. Celulele erau recoltate prin punctie
osoasa, cu precadere in creasta iliaca. S-a dovedit ca una din 100.000 celule din maduva osoasa este
o celula capabila de multiplicare pe termen lung, celula formatoare de sange. Alte celule fiind
reprezentate de : celule stromale, celule progenitoare ale sangelui, precum si celule mature sau in
curs de maturare albe si rosii.

IV.4.2. Sangele periferic

31
 O alta sursa de celule stem sanghine, folosita in clinica o consituie sangele periferic, circulant.
Este cunoscut de multa vreme ca un numar scazut de celule stem si progenitori celulari circula in
sangele periferic, insa in urma cu zece ani s-a descoperit ca se poate determina migrarea celulelor
stem din maduva osoasa in sange prin administrarea unei citochine, cum ar fi factorul stimulator de
colonii granulocitare (GCSF). S-a observat ca 5 pana la 20% din celulele recoltate sunt reprezentate
de celule stem hematopoietice.
In ultimii ani se pune un accent tot mai mare pe transplanturile autologe sau alogene cu celule
nucleate sanghine recoltate din sangele periferic. S-a observat (constatat) ca sangele periferic
contine de doua ori mai multe celule stem hematopoietice decat maduva osoasa. Astfel, in cazul
acestor transplante recuperarea se realizeaza mai repede. S-a constatat, de asemenea, ca celulele
CD34+ si Thy-1+ purificate din sangele periferic se grefeaza rapid si fara complicatii in cazul
pacientilor cu cancer mamar carora li s-a realizat un transplant autolog dupa chemoterapie (Negrin
R. S., si colab., 2000).

IV.4.3. Sangele din cordonul ombilical

La sfarsitul anilor 1980, inceputul anilor 1990, s-a observat ca sangele din cordonul ombilical si
placenta este bogat in celule stem hematopoietice. Acest tesut realizeaza dezvoltarea fetusului in
timpul vietii intrauterine. Celulele stem recoltate din sangele placentar ombilical au fost folosite cu
succes in realizarea transplanturilor (Laughlin M. J. si colab., 2001). De asemenea, s-a demonstrat
ca aceste celule stem, comparativ cu celulele stem din maduva osoasa sunt multipotente, avand
capacitatea de a dezvolta celule din cele trei straturi embrionare, sau chiar din toate cele trei straturi
embrionare : endoderm, ectoderm, mezoderm (pluripotente). Nu s-au descoperit pana in prezent
diferente calitative intre celulele diferentiate provenite din celule stem hematopoietice recoltate din
sangele din cordonul ombilical, sangele periferic si maduva osoasa.

IV.4.4. Sistemul hematopoietic fetal

O sursa de celule stem sanghine folosita in cercetare, insa nu si in clinica o reprezinta sangele
fetal. Celulele hematopoietice apar timpuriu in dezvoltarea tuturor vertebratelor. Majoritatea
celulelor stem care exista in maduva osoasa adulta si in circulatie sunt derivate din celule care apar
tarziu in cursul vietii intrauterine si localizate altundeva decat in sacul vitelin. Cele mai multe studii
care vizeaza celulele stem fetale folosesc celule recoltate de la soareci sau alte animale, insa exista
putine informatii despre celulele stem hematopoietice fetale si embrionare umane. In urma cu cativa
ani s-au descris precursori hematopoietici in embrionii umani si mult mai recent celule stem
32
sanghine circulante in fetusii umani avortati in varsta de 12 pana la 18 saptamani (Huyhn A. si
colab., 1995 ; Tavian M. si colab., 1996 ; Gallacher L si colab., 2000 ; Labastie M. C. si colab.,
1998 ; Tavian M. si colab., 1996). S-a constatat ca aceste celule prezinta markeri diferiti de cei ai
celulelor fetale hepatice, din maduva osoasa sau cele din sangele din cordonul ombilical.

IV.4.5. Celulele stem embrionare si celulele stem germinale

In anul 1985 s-a aratat ca este posibil sa se obtina precursori pentru multe tipuri celulare sanghine
din celule stem embrionare de soarece (Doetschman T. si colab., 1985). S-a reusit obtinerea in vitro
a tuturor liniilor majore de progenitori celulari din corpii embrioizi proveniti de la soareci, chiar si
fara adaugarea factorilor de crestere hematopoietici (Perkins A. C. si colab., 1998).
Cu toate acestea se cunosc putine date despre celulele stem embrionare umane si germinale.
Exista studii care atesta obtinerea progenitorilor sanghini din celule stem embrionare umane care
insa nu pot fi cultivate in laborator (Kaufman D. S. si colab., 1999). S-a reusit diferentierea
celulelor stem embrionare in celule sanghine, acestea avand capacitatea de a produce gama-
globulina (Itskovitz-Eldor J. si colab., 2000). Celulele stem germinale pot genera in anumite conditii
celule CD34+ (Shamblott M. J. si colab., 2001). Celulele hematopoietice derivate din celule stem
embrionare si germinale umane nu au fost riguros testate in privinta capacitatii lor proliferative pe
termen lung si in ceea ce priveste abilitatea de a forma toate tipurile celulare sanghine.

IV.5. Cum difera celulele stem hematopoietice care provin din surse diferite ?
S-a observat ca celulele stem hematopoietice recoltate din tesuturi aflate in stadii timpurii de
dezvoltare prezinta o mare capacitate de autoreplicare, precum si o scazuta imunogenicitate.
Populatiile de celule stem din maduva osoasa
Ramane inca o necunoscuta fenomenul prin care celulele stem sanghine migreaza din locatiile
timpurii in care se afla in timpul dezvoltarii fetale spre maduva osoasa adulta. S-a constatat ca
numarul relativ de celule CD34+ izolate din sangele cordului descreste cu varsta de gestatie, iar
expresia moleculelor de adeziune prezente la aceste celule este crescuta. Se presupune ca aceste
schimbari ar determina pregatirea celulelor pentru homingul spre ficatul fetal si catre maduva osoasa
(Surbek D. V. si colab., 2000).
Aceste date sunt destul de controversate, insa exista studii pe soareci care arata ca celulele stem
hematopoietice provenite de la animale batrane populeaza intr-un procent scazut maduva osoasa
comparativ cu celulele stem recoltate de la animale adulte tinere (Chen J. si colab., 1999). De
asemenea, s-a demonstrat ca celulele fetale prezinta un procent de repopulare de 50 pana la 100 mai
33
bun comparativ cu celulele recoltate de la animale tinere. Potentialul de repopulare a maduvei
osoase s-a dovedit specific fiecarei varste, insa in ambele cazuri acesta descreste odata cu varsta
(Sudo K. si colab., 2000).

Rolul celulelor stem hematopoietice si factorii implicati in activitatea acestora

O celula stem hematopoietica prezinta patru caracteristici : 1) se poate autoreannoi ; 2) se poate
diferentia in alte tipuri celulare : 3) se poate mobiliza din maduva osoasa in circulatie (si inapoi) ; 4)
poate sa-si incheie viata prin apoptoza.
Autoreannoirea celulelor stem hematopoietice
S-a dovedit dificil de multiplicat si mentinut in vitro celule stem capabile sa-si pastreze aceeasi
capacitatea de autoreanniore si diferentiere cu cea existenta la celulele din organism. S-a observat ca
in cultura apare diferentierea acestor celule catre progenitori ce formeaza diferite linii sanghine, care
insa isi pierd capacitatea de autoreannoire. Se cunoaste ca celulele stem « adevarate » se divid si se
innlocuiesc cu o rata scazuta in maduva osoasa adulta.
Studiul celulelor stem sanghine este foarte laborios tocmai datorita problemelor amintite mai sus.
S-a observat ca pentru mentinerea in vitro a acestor celule este necesara folosirea factorilor de
crestere. Astfel, s-a artatat ca doua citochine : factorul celulelor stem si trombopoietina, determina
diviziunea inegala, in urma careia una din celulele fiice rezultate da nastere unui descendent cu
potential de autoreannoire. S-a observat, de asemenea ca activarea moleculei de semnalizare gp130
este critica pentru supravietuirea si proliferarea celulelor stem hematopoietice de soarece in cultura.
Folosirea in vitro a citokinelor si moleculelor de adeziune specifice a determinat o usoara crestere a
numarului celulelor stem .
Diferentierea celulelor stem hematopoietice in celule sanghine si celule specifice sistemului imun
Functia principala a celulelor stem sanghine o constituie formarea celulelor albe si rosii prezente
in sange. S-a constatat (calculat) ca in timpul producerii unei celule mature, circulanta, prezenta in
sange, celula stem hematopoietica originala realizeaza intre 17 – 19,5 diviziuni (MacKey M. C. ,
2001). Un rol decisiv in diferentierea progenitorilor catre diferite tipuri celulare il detin factorii de
crestre si citochinele. Acesti factori controleaza producerea celulelor sanghine prin cai complexe ce
vizeaza controlul expresiei genice.

Migrarea celulelor stem hematopoietice in interiorul si in afara maduvei osoase si a tesuturilor

34
 Se cunoaste de multa vreme ca celulele stem hematopoietice se gasesc in conexiune intima cu
stroma medulara. Insa astfel de celule sunt prezente si in splina, circulatia periferica si alte tesuturi.
Conexiunile cu interstitiul maduvei osoase sunt importante in sustinerea transplanturilor cu celule
stem, precum si pentru mentinerea acestora ca o populatie capabila de autoreannoire. Conexiunile cu
stroma sunt de asemenea, importante in proliferarea, diferentierea si maturarea celulelor sanghine
(Whettton A. D. si colab., 1999).
S-a observat ca celulele stem care sunt mobilizate din maduva osoasa catre circulatia periferica
sunt cu precadere celule care nu se divid (Wright D. E. si colab., 2001). Moleculele de adeziune din
stroma joaca un rol important in mobilizare, in atasarea celulelor la stroma precum si in transmiterea
semnalelor ce regleaza autoreannoirea celulelor stem hematopoietice si diferentierea progenitorilor
(Wang M. W. si colab., 1998).

Plasticiatea celulelor stem hematopoietice

S-a reusit inducerea diferentierii celulelor stem hematopoietice din maduva osoasa in alte tipuri
celulare: creier, muschi si ficat (Fang TC. si colab., 2004).
Studiile pe soareci au aratat ca grefele de maduva osoasa sau de celule stem sanghine s-au dovedit
eficiente in regenerarea muschilor scheletici si cardiaci, precum si a ficatului lezat (Bittner R. E. si
colab., 1999; Lagasse E. si colab., 2000). Astfel, s-a reusit tratarea distrofiei musculare cu ajutorul
transplantului de maduva osoasa provenita de la animale sanatoase. S-a demonstrat, de asemenea
integrarea celulelor stem hematopoietice in alte tesuturi decat cel de origine. S-a dovedit ca o
singura celula stem sanghina selectata poate determina mai mult decat repopularea maduvei osoase
(Krause D. S. si colab., 2001). Celulele stem hematopoietice pot creste si in alte tesuturi ca raspuns
la infectii sau ca urmare a lezarilor produse in urma iradierilor.

CAP. V CELULELE STEM IN MEDICINA REGENERATIVA

35
 V.1. Terapia cu celule stem in bolile autoimune
O atentie deosebita in cercetarea biomedicala este acordata bolilor autoimune. Ramane inca o
enigma mecanismul care determina sistemul imun sa-si atace propriile celule, tesuturi, organe.
Elucidarea acestei probleme este necesara in intelegerea bolilor autoimune ca artrita reumatoida,
diabetul de tip I, lupusul eritematos sistemic si sindromul Sjogren. Cand unele dintre proteinele
celulare din organism sunt recunoscute ca non-self de catre limfocitele T (celule care apartin
sistemului imun) este declansata o cascada distructiva inflamatorie (fig. 8 – Raspunsul imun catre
self si nonself).

36
 (preluat dupaTerese Winslow, 2001)
Fig. 8 – Raspunsul imun catre self si non self

37
 Terapiile curente folosite in combaterea acestor maladii se bazeaza pe deprimarea raspunsului
imun facand astfel pacientii susceptibili pe parcursul intregii vieti la infectii.
Astfel, se incearca abordarea unor noi tratamente care se bazeaza pe utilizarea celulelor stem
urmarindu-se inlocuirea celulelor anormale cu astfel de celule care au capacitatea de a se diferentia
in celule imunitare specifice.
Cauza care determina aparitia acestor boli o constituie un dezechilibru intre inducerea si
mentinerea unei tolerante imune scazute. Apare astfel o distrugere a celulelor si tesuturilor de catre
limfocitele T citotoxice CD8 sau de autoanticorpi, fenomen insotit si de un proces inflamator. Acest
mecanism poate duce la distrugerea articulatiilor in artritele reumatoide, a celulelor beta pancreatice
producatoare de insulina in diabetul de tip I, sau la afectarea rinichilor in lupusul eritematos
sistemic. Mecanismul defectiv al inducerii si mentinerii tolerantei ramane inca neelucidat. Se stie ca
printre cauzele aparitiei acestor boli le constituie: factorii genetici, hormonali, precum si unele
infectii (Cooper, G.S. si colab.,1998; Grossman, J.M. si colab., 2000).
In prezent, tratamentul bolilor autoimune consta in administrarea medicamentelor
antiinflamatoare, imunosupresive si agentilor imunomodulatori. In ciuda efectului asupra
raspunsului imun, aceste terapii s-au dovedit in unele cazuri ineficiente, neobtinandu-se intotdeauna
remisia bolii.
Leziunile mediate imun pot fi organ specifice, cum sunt cele din diabetul de tip I, caracterizat prin
distrugerea celulelor beta pancreatice sau scleroza multipla datorata distrugerii tecii de mielina.
Terapia acestora presupune repararea sau inlocuirea celulelor si tesuturilor lezate. Spre deosebire,
bolile autoimune non-organ specifice, spre exemplu, lupusul sunt caracterizate prin leziuni larg
raspandite datorate reactiilor imune care au loc in multe organe si tesuturi. Obsatcolul major in
tratamentul acestora constituindu-l lipsa unei tinte specifice.
In terapia lupusului sistemic eritematos se incearca distrugerea celulelor imune mature si
autoreactive, urmand apoi innlocuirea acestora cu celule stem hematopoietice. Pentru a nu aparea
probleme de histocompatibilitate sunt folosite transplanturile autologe. S-a constatat ca aceasta
modalitate de reannlocuire poate insa altera sistemul imun al pacientului supus acesteia.
Posibilitatea de a genera si propaga in numar mare celule stem sanghine in afara organismului, fie
ca acestea provin din sange din cordon ombilical, surse adulte, fetale sau embrion furnizeaza
siguranta, costuri mici precum si celule viabile.
Cu toate ca celulele stem embrionare ofera avantaje comparativ cu cele provenite din cordonul
ombilical sau din maduva ososasa, celulele stem hematopoietice raman insa cele mai utilizate in
astfel de terapii (Itskovitz-Eldor si colab., 2000; Shamblott, M.J. si colab., 2000). Se cunoaste ca
38
celulele stem hematopoietice, fie ca provin din sangele din cordonul ombilical, fie din maduva
osoasa hematogena prezinta un potential de autoreannoire limitat comparativ cu cele embrionare ,
insa ofera avantajul ca pot fi prelevate de la indivizi sanatosi, cu factori de predispozitie genetica
bine definiti.

Terapia genica si celulele stem in bolile autoimune

Terapia genica consta in modificarea genetica a celulelor cu scopul de a obtine un efect terapeutic.
DNA-ul care contine genele terapeutice este introdus in vitro in celule, iar acestea sunt apoi
administrate la animale sau la pacienti. Celulele preiau DNA-ul si vor incepe sa produca proteina
terapeutica codificata de gena specifica. In acest fel se incearca modificarea raspunsului imun
aberant caracteristic bolilor autoimune (Prud’homme, G.J. ,2000 ; Tsokos, G.C., 2000). Sunt folosite
cel mai adesea doua strategii pentru modularea sistemului imun. Prima consta in blocarea
citochinelor inflamatorii (secretate de celulele imune activate si de tesuturile inflamate) prin
transferul unei gene intr-o celula care astfel “capteaza”receptorul specific citochinei respective. Sau,
o alta metoda consta in transferarea unei gene ce codifica o citochina antiinflamatoare,
redirectionand astfel raspunsul imun autoinflamator catre o stare mult mai “toleranta”. In
numeraose modele animale aceste abordari au evidentiat rezultate incurajatoare, avand de asemenea
o contributie esentiala in intelegerea mecanismului care declanseaza aceste boli, precum si in
identificarea citochinelor inflamatorii implicate in progresia bolilor (Prud’homme, G.J. ,2000 ;
Tsokos, G.C., 2000).
Exista insa unele probleme in terapia genica umana. S-a dovedit dificil de transferat materialul
genetic in celule adulte, precum si producerea proteinei codificata de gena specifica la un nivel care
sa poata anihila efectele bolii.
Se incearca dezvoltarea unor noi metode pentru modularea imuna. In tratamentul lupusului
eritematos sistemic s-a realizat modificarea celulelor stem hematopoietice sau tesuturilor cu un
receptor specific citochinei inflamatorii interferon gama. S-a obtinut in acest fel regresia bolii pe
modele animale (Lawson, B.R., 2000). Abordari similare se incearca pentru prevenirea distrugerii
progresive a articulatiilor si pierderea cartilajului, precum si pentru repararea articulatiilor in modele
animale de artrita reumatoida. Artrita reumatoida este o boala autoimuna caracterizata prin
inflamarea acuta si cronica produsa de sistemul imunitar care ataca cu precadere articulatiile. S-a
reusit transfectia celulelor dendritice cu gena care codifica citochina antiinflamatoare IL – 4 si apoi
injectarea acestor celule secretoare de IL 4 in soareci care dezvolta artrita reumatoida. Se presupune
ca celulele dendritice secretoare de IL 4 actioneaza pe limfocitele CD4 T helper pentru a
39
reintroduce toleranta fata de proteinele proprii. S-a obtinut supresia completa a bolii, observandu-se
ca IL 4 determina si blocarea resorbtiei osoase (o complicatie serioasa aparuta in artrita reumatoida)
(Kim, S.H. si colab., 2001).
Condrocitele, celulele formatoare de cartilaj, pot reprezenta o alta alternativa in terapia artritelor
reumatoide cu celule stem. Aceste celule deriva din celule stem stromale medulare (Pittenger, M.F.
si colab., 1999). Sunt putine date despre celulele intermediare care se diferentieaza apoi in
condrocite. Se presupune ca o celula ideala capabila de refacerea cartilajului ar fi o celula mai
primitiva decat condrocitele, poate o celula stromala sau un intermediar aparut in cursul diferentierii
celulare. Date care sustin aceasta ipoteza au fost furnizate de studiile pe celule stem embrionare.
Acestea se diferentieaza intr-un precursor care apoi formeaza celula stem stromala (Schuldiner, M.
si colab., 2000). Studii efectuate pe modele animale de iepuri au demonstrat ca celulele stem
stromale pot genera noi condrocite facilitand repararea cartilajului afectat (Caplan, A.I. si colab.,
1997).
Exista insa doua obstacole majore in folosirea celulelor stem stromale si condrocitelor in terapia
artritei reumatoide: numarul limitat al acestora, precum si dificultatile care apar la propagarea lor in
vitro.

V.2. Celulele stem in diabet

Diabetul reprezinta un grup de simptome caracterizat prin nivele anormal de mari ale glucozei in
sange. Acest exces de glucoza constituie cauza multor complicatii : orbire, insuficienta renala, boli
cardiace, infarct, neuropatie, amputatii. Diabetul de tip I, cunoscut si sub denumirea de diabet
juvenil, este intalnit cu precadere la copii si tineri. Apare atunci cand sistemul imunitar ataca
propriile celule distrugandu-le. Ca rezultat, celulele insulare ale pancreasului, care in mod normal
produc insulina, sunt distruse. In absenta insulinei, glucoza nu mai poate patrunde in celule si se
acumuleaza in sange. Diabetul de tip II, apare la adulti, la persoanele in varsta, sedentare, avand insa
si o componenta ereditara. In acest caz organismul nu poate utiliza in mod eficient insulina. Apare
astfel rezistenta la insulina, iar rezultatul este ca si in cazul diabetului de tip I – cresterea glucozei in
sange.
Pana in prezent nu exista nici un remediu pentru aceasta boala. Pacientii cu diabet tip I trebuie sa–
si administreze insulina de cateva ori pe zi si sa-si controleze concentratia glucozei de 3 – 4 ori in
cursul aceleiasi zile. Devine astfel foarte importanta monitorizarea frecventa, deoarece prin
mentinerea unui nivel de glucoza in sange cat mai apropiat de cel normal se reduce semnificativ

40
riscul aparitiei complicatiilor. De asemenea, este necesar ca persoanele cu diabet de tip II sa urmeze
o dieta adecvata, exercitii fizice, precum si o medicatie corespunzatoare.
In cazul diabetului de tip I , singura modalitate de tratament o constituie transplantul de pancreas.
Insa pentru a se reduce riscul rejectiilor este necesara administrarea medicamentelor imunosupresive
care determina riscul aparitiei altor boli, cu precadere boli renale. De aceea cele mai multe
transplanturi de pancreas sunt insotite de transplanturi renale.
De-a lungul anilor s-au incercat numeroase modalitati de tratament a diabetului. Una din aceste
tehnici consta in injectarea la pacienti a celulelor insulare pancreatice, insa in acest fel nu s-a reusit
depasirea tratamentului imunosupresor. S-a observat ca steroizii deterioreaza mult mai mult celulele
administrate, comparativ cu transplantul de pancreas. Un alt dezavantaj este acela ca celulele
transplantate sunt recoltate de la cadrave si procedura necesita cel putin doua cadravre pentru un
transplant. Intervine si problema imunocompatibilitatii, iar tesutul trebuie obtinut in primele ore de
la deces.

V.2.1. Utilizarea terapiilor celulare in diabet

Se cunoaste ca pancreasul este un organ complex alcatuit din celule multiple. La mamifere
pancreasul contine trei tipuri celulare: celulele ductale (canaliculare), celulele acinare si celulele
endocrine. Celulele endocrine produc: glucagonul, somatostatina, polipeptidul pancreatic (PP) si
insulina. Celulele acinare fac parte din sistemul exocrin care secreta enzime digestive. Celulele
ductale din ductul pancreatic conecteaza celulele acinare la organele digestive. Pancreasul se
dezvolta ca o excrescenta a duodenului. Atata celulele sistemului exocrin, cat si cele ale sistemului
endocrin se considera ca deriva din celulele canaliculare in timpul dezvoltarii embrionare. Apoi
aceste celule endocrine formeaza agregate denumite insule Langerhans. La om exista patru tipuri de
celule insulare: celulele beta producatoare de insulina, celulele alfa care secreta glucagonul, celulele
delta ce secreta somatostatina si celulele PP care produc polipeptidul pancreatic. 65 – 90% din
celulele insulare sunt reprezentate de celule beta, 15 – 20% sunt celule alfa, 3 – 10% celule delta si
1% celule PP (fig.9 – Producerea insulinei in pancreasul uman).
Nu se cunoaste cu precizie sursa celulelor din insulele Langerhans existand anumite controverse
ce vizeaza prezenta celulelor stem adulte in pancreas. Unii cercetatori considera ca celulele stem
insulare sunt asemeni celulelor care pot fi gasite in ductul pancreatic sau chiar in insule. Altii afirma
ca celulele ductale se pot diferentia in precursori insulari, in timp ce altii sustin ca aceste celule
insulare deriva din celulele stem din sange. S-au dezvoltat cateva tehnici de izolare si cultivare a

41
celulelor stem sau a precursorilor insulari din tesut pancreatic adult si fetal, precum si din celule
stem embrionare (Roche R. si Soria B.; 2004).

(preluat dupaTerese Winslow, Lydia Kibiuk, 2001)

Fig. 9 – Producerea insulinei in pancreasul uman

42
 V.2.2. Tesuturile adulte – surse de celule insulare
Multa vreme principala sursa de celule insulare au constituit-o cadravele. S-a constatat insa ca
celulele beta pancreatice prelevate din asemenea surse sunt dificil de cultivat si prolifereaza foarte
lent in vitro. Prin studii de inginerie genetica s-a reusit adaugarea genelor implicate in stimularea
proliferarii. Odata cu stabilirea unei astfel de linii celulare, celulele isi pierd capacitatea de a secreta
insulina. Prin introducerea in aceste celule a genei specifice celulelor beta pancreatice – PDX-1, s-au
obtinut celule capabile de o buna multiplicare in cultura si cu capacitate secretorie. Transplantate in
soareci imunodeficienti s-a constatat ca celulele secreta insulina ca raspuns la glucoza. In prezent se
urmareste daca aceste celule pot determina reversia diabetului in modele animale de soareci.
(Dufayet de la Tour si colab., 2001; Itkin-Ansari si colab., 2001; Itkin-Asari P. si Levine F.; 2004).
S-a observat ca celulele transfectate nu produc insulina asemeni celulelor normale din insule, ci
intr-o cantitate mai scazuta. Problema majora in aceste studii o constituie imposibilitatea de a
mentine o balanta adecvata intre crestere si diferentiere. Celulele care prolifereaza bine nu produc
insulina in mod eficient, iar cele care produc insulina nu prolifereaza bine. Potrivit acestor date,
scopul principal consta in dezvoltarea unor tehnologii capabile sa genereze un numar suficient de
celule secretoare de insulina in cantitati suficiente.
O alta sursa promitatoare de celule insulare o reprezinta celulele din ductul pancreatic. Sunt studii
care sustin ca celulele stem multipotente sunt amestecate cu celule canaliculare mature, diferentiate,
in timp ce alte studii atesta ca celulele ductale sufera diferentiere, sau reversul acesteia, catre tipuri
celulare mai putin mature care apoi se pot diferentia in celule insulare producatoare de insulina. S-a
demonstrat ca celulele ductale izolate din pancreas uman adult in cultura se diferentiaza in clusteri
ce contin atat celule ductale, cat si endocrine. Dupa trei sau patru saptamani in cultura celulele
secreta cantitati scazute de insulina atunci cand sunt expuse la concentratii mici de glucoza si
cantitati mari de insulina cand li se administreaza glucoza in concentratie mare. Prin studii de
imunohistochimie si analize ultrastructurale s-a demonstart ca aceste clustere contin toate celulele
endocrine prezente in insulele Langerhans (Bonner-Weir, S. si colab., 2000).
In prezent se incearca prelevarea celulelor ductale din biopsii si cultivarea acestora in vitro si apoi
administrarea lor inapoi la pacient. Aceasta posibilitate se poate aplica persoanelor cu diabet de tip I
a caror celule beta sunt afectate dar care prezinta celule ductale intacte. Oricum in acest fel nu este
inlaturata distrugerea autoimuna care ar putea determina distrugerea celulelor transplantate (Bonner-
Weir, S.). Tehnica se pote aplica cu succes la pacientii cu diabet de tip II care nu au probleme
autoimune.

43
 Nu se cunoaste cu precizie daca celulele ductale sunt celule dediferentiate sau reprezinta un subset
de celule stem sau progenitori insulari care populeaza ductul pancreatic si pot fi co-cultivate
impreuna cu celulele ductale. Daca celulele ductale mor, progenitorii insulari prolifereaza si este
posibil ca acestia sa preia locul celulelor ductale in cultura si poate parea in acest fel ca celulele
ductale se dediferentieaza in celule stem. Potrivit lui Bonner-Weir, atat celulele dediferentiate, cat si
progenitorii insulari sunt prezenti in ductul pancreatic.
In sprijinul celor afirmate de Bonner-Weir s-a demonstrat ca celulele epiteliale din ductul
pancreatic recoltate de la soarecii adulti pot forma structuri insulare similare clusterilor observati de
Bonner-Weir. S-a constatat de asemenea ca aceste celule au capacitatea de a secreta: glucagon,
insulina, somatostatina si polipeptidul pancreatic. Transplantate soarecilor diabetici s-a obtinut
regresia bolii.
Terapiile bazate pe transplant celular necesita o atenta manipulare a materialului biologic. Nu se
cunoaste comportarea acestor celule in vivo. Exista pericolul ca orice precursor sau celula stem
odata introdusa in organism sa revina la un stadiu pluripotent determinand in acest fel aparitia
tumorilor. Acest risc poate fi evitat prin folosirea celulelor complet diferentiate.

V.3. Celulele stem in tratamentul infarctului de miocard

In prezent atacurile de cord si bolile congestive ale inimii constituie principala cauza de deces. In
pofida modalitatilor de prevenire a bolilor cardiovasculare, restaurarea functiilor unei inimi lezate
ramane in continuare o problema. Studii recente au evidentiat ca celulele stem adulte si embrionare
pot inlocui celulele miocardului lezat si pot genera noi vase de sange.
Se cunoaste ca distrugerea celulelor miocardice, cunoscute drept cardiomiocite se poate datora
hipertensiunii, insuficientei cronice aparute in vascularizatia inimii cauzata de boli arteriale
coronariene, atacurile de cord, obstructia vaselor sanghine ale cordului. Un rol decisiv in
functionarea inimii il detin cardiomiocitele a caror contractie determina expulzarea sangelui din
ventriculi catre artere. Alte doua tipuri celulare care intra in alcatuirea cordului sunt: celulele
endoteliale vasculare care formeaza stratul intern al vaselor sanghine si celulele musculare netede
care formeaza peretele vaselor de sange. Inima prezinta o vascularizatie bogata, iar aceste celule
specializate sunt importante pentru dezvoltarea unei noi retele de arteriole care asigura hranirea si
oxigenarea cardiomiocitelor. Potentialul celulelor stem embrionare si adulte de a se diferentia in
aceste tipuri celulare a fost exploatat ca o strategie pentru restaurarea functiilor cardiace la
persoanele cu infarct miocardic sau boli congestive. In conditii specifice de laborator s-a reusit
diferentierea celulelor stem in cardiomiocite si celule endoteliale vasculare (Yu Liu si colab., 2003;
44
Shahin Rafii si David Lyden, 2003). Studiile care urmaresc utilizarea unor noi terapii in tratamentul
atacurilor de cord au fost efectuate pe modele animale; sobolan la care s-a indus un atac cardiac
(Fig.10– Model de infarct miocardic la sobolan)

(preluat dupaTerese Winslow, Lydia Kibiuk, 2001)

Fig. 10 – Model de infarct miocardic la sobolan
Pentru a determina un atac cardiac la soarece sau sobolan se realizeaza o ligatura in jurul vasului
sanghin major al inimii, deprimand in acest fel cardiomiocitele de oxigen si nutrienti.
Aceste modele animale au fost folosite cu succes in aplicatiile experimentale cu celule stem. Astfel,
la soarece s-a realizat un atac cardiac prin ligaturarea arterei coronare stangi si apoi au fost utilizate
celule stem pentru refacerea zonei afectate. Din maduva osoasa au fost izolate celule stem cu
capacitate de a se diferentia in multiple tipuri celulare. Injectate in peretele ventriculului afectat, s-a
constatat ca aceste celule pot genera cardiomiocite, endoteliu vascular, precum si celule musculare
netede, avand capacitatea de a forma de novo miocardul, inclusiv artere coronare, arteriole si

45
capilare (Orlic, D.). De asemenea, s-a demonstrat ca tesutul cardiac poate fi refacut si de celule stem
hematopoietice. S-a reusit izolarea unei populatii “side” de celule stem hematopoietice care apoi au
fost injectate in maduva osoasa a soarecilor iradiati care dezvoltau si infarct miocardic (la nivelul
arterei coronare descendente anterioare). S-a dovedit ca aceste celule prezinta potentialul de a reface
miocardul, migrand in zona afectata. Astfel, celulele stem hematopoietice transplantate in maduva
osoasa sau injectate direct in zona lezata pot regenera tesutul cardiac.
Alte date care sustin terapia cu celule stem provin dintr-un studiu ce atesta ca celulele stem adulte
umane prelevate din maduva osoasa sunt capabile sa formeze celule endoteliale atunci cand sunt
transplantate in sobolani (Kocher, A.A. si colab., 2001).
Asemeni celulelor stem de la soareci, celulele stem hematopoietice umane pot forma in vitro
numeroase tipuri celulare, inclusiv muschi cardiac (Pittenger, M.F. si colab., 1999) (Fig. 11 –
Repararea miocardului cu ajutorul celulelor stem adulte). Injectate in circulatia soarecilor cu infract
de miocard, aceste celule previn moartea prin hipertrofie a celulelor cardiace viabile si reduc
formarea progresiva a fibrelor de colagen.

(preluat dupaTerese Winslow, Lydia Kibiuk, 2001)

Fig. 11 – Repararea miocardului cu ajutorul celulelor stem adulte

46
Studiile realizate pe modele animale au evidentiat faptul ca celulele stem adulte se pot diferentia in
multiple tipuri celulare. Aceasta capacitate, denumita plasticitate, face din aceste celule candidati
viabili in repararea tisulara.
Exista ca si in cazul celorlaltor boli prezentate unele aspecte practice care pana in prezent nu au
fost depasite. Asfel, pentru repararea cordului uman sunt necesare milioane de celule. Capacitatea
unica a celulelor stem embrionare de a se replica in cultura le confera acestora un avantaj fata de
celulele stem adulte. De asemena, exista inca multe intrebari care nu si-au gasit raspuns: “Cat timp
dupa transplant celulele continua sa functioneze?
Modelele animale de sobolani redau cu acuratete conditiile din cordul uman si raspund asemeni
acestuia la transplant? Cardiomiocitele obtinute prin diferentierea celulelor stem au aceeasi
conductibilitate electrica ca si celulele cardiace native si se integreaza functional in mecanismul de
contractie al inimii?”

V.4. Celulele stem in terapia bolilor sistemului nervos

Astazi abordarile terapeutice in bolile neuronale constau in identificarea simptomelor si limitarea
leziunilor. Odata cu descoperirea celulelor stem neuronale s-au conturat noi posibilitati de tratament.
S-a constatat ca celulele stem neuronale pot forma toate tipurile celulare prezente in creier; neuroni
functionali (care se integreaza in tesut realizand sinapse), celule gliale si oligodendrocite (fig. 12 –
Neuronul).
Descoperirea capacitatii regenerative a sistemului nervos central adult ofera sperante in
tratamentul bolilor degenerative precum Parkinson. S-au evidentiat doua strategii in incercarile de
restabilire a functiilor nervoase. Prima consta in multiplicarea si diferentierea celulelor in vitro si
apoi transplantarea lor la pacienti. Se urmareste administrarea celulelor diferentiate in neuroni din
celule stem, sau direct implantarea celulelor nediferentiate, integrarea si maturarea acestora in zona
afectata. Pot fi utilizate in acest scop o varietate de celule: precursorii neuronali deja “committed”
catre un anumit tip celular, fie celule embrionare pluripotente. O alta strategie reparatorie o
constituie utilizarea “factorilor trofici” ca: factori de crestere, hormoni si alte molecule de
semnalizare care ajuta la supravietuirea si cresterea celulelor, putand determina stimularea celulelor
stem si mecanismele reparatorii endogene. In acest fel se pot reface zonele afectate si restaura
functiile tesutului lezat.
Studiile pe modele animale de boli degenerative (scleroza laterala amfitrofica, sau boala Lou
Gehrig) au relevat rezultate incurajatoare prin folosirea celulelor stem embrionare germinale (Kerr

47
D. A. si colab., 2001). S-a constatat ca dupa injectarea aceste celule se diferentieaza in neuroni
motori iar mobilitatea animalelor se imbunatateste semnificativ.

(preluat dupa Terese Winslow, 2001)

Fig. 12 – Neuronul

V.4.1. Celulele stem in tratamentul bolii Parkinson

Boala Parkinson apare dupa varsta de 50 ani si consta in degenerarea progresiva a neuronilor
prezenti in creier. Simptomele se manifesta de cele mai multe ori printr-un tremur necontrolat al
mainilor, urmat apoi de o rigiditate crescuta, dificultati in mers precum si dificultati in intierea
miscarilor voluntare. Acestea se datoreaza mortii unui tip particular de neuroni prezenti in creier.

48
Acesti neuroni conecteaza o structura din creier numita substanta neagra cu o alta formatiune
anatomica – striatum, parte componenta a nucleului caudat si a putamenului (Fig.13 – Calea
neuronala care degenereaza in boala Parkinson). Acesti neuroni “nigro-striati” elibereaza dopamina
spre neuronii tinta din striatum. Una din functiile majore ale dopaminei o reprezinta reglarea
nervilor care controleaza miscarile organismului. Odata cu moartea acestor celule, este produsa mai
putina dopamina ceea ce duce la aparitia dificultatilor in miscare caracteristice bolii Parkinson. Nu

49
se cunoaste pana astazi cauza mortii acestor neuroni.

50
 (preluat dupa Terese Winslow, Lydia Kibiuk, 2001)
Fig.13 – Calea neuronala care degenereaza in boala Parkinson

Ideea cultivarii celulelor dopaminergice in laborator si apoi transplantarea lor bolnavilor afectati
de Parkinson in vederea inlocuirii neuronilor distrusi reprezinta una din cele mai recente modalitati
terapeutice. S-a constatat insa ca neuronii producatori de dopamina nu supravietuiesc transplantului,
astfel ca transplantul tesutului nervos provenit de la cadavre nu s-a dovedit o modalitate de
tratament.

51
 Rezultate modeste si de scurta durata (dispar dupa un an de la interventie) s-au obtinut in cazul
administrarii celulelor cromafine producatoare de dopamina din glandele adrenale (Quinn N. P.,
1990). O alta strategie bazata pe transplantul neuronilor dopaminergici proveniti din tesutul neuronal
fetal a condus la rezultate incurajatoare (Dunnett S. B. si colab., 2001). Studiile pe modele animale
au aratat ca acesti neuroni se dezvolta in continuare si realizeaza conexiuni cu tesutul inconjurator in
vivo. De asemenea s-a observat ca precursorii dopaminergici derivati din celule stem embrionare au
capacitatea de a elimina simptomele bolii pe modele animale de Parkinson.
In prezent se urmareste identificarea unei combinatii optime intre factorii de crestere si conditiile
de cultivare in vederea mentinerii celulelor in vitro din stadiu de nediferentiate pana la punctul in
care ele devin committed catre neuroni dopaminergici. Urmeza apoi implantarea lor in creierul
afectat unde isi incheie cresterea si diferentierea. O alta posibilitate o reprezinta transplantarea
celulelor nediferentiate in creierul lezat si diferentierea lor sub influenta semnalelor din micromediul
existent in tipul celular adecvat necesar inlocuirii celulelor afectate. De asemenea se incearca
utilizarea transplanturilor de celule stem din surse embrionare sau adulte in scopul inducerii
organismului sa-si decalnseze propriile mecanisme reparatorii (Bjorklund A. si colab., 2000). O alta
strategie consta in combinarea terapiilor medicamentoase cu cele care vizeaza utilizarea celulelor
stem.
Terapia regenerativa in boala Parkinson consta in inlocuirea unui singur tip celular aflat intr-o
singura regiune din creier, ceea ce reprezinta o tinta relativ usoara comparativ cu celelalte boli
neuronale degenerative.

V.4.2. Rolul celulelor stem in regenerarea leziunilor maduvei spinarii

Datorita potentialului de diferentiere catre multiple tipuri celulare, celulele stem au fost utilizate si
in scopul restabilirii functiilor maduvei spinarii dupa injuria acesteia. Si astazi constituie o mare
problema restaurarea completa dupa lezarea majora a maduvei spinarii. Multe tipuri celulare sunt
distruse in aceasta injurie, inclusiv neuronii care realizeaza conexiunile intre creier si restul
organismului. In multe astfel de cazuri nu toti neuronii purtatori de semnale au axonii lezati, insa
axonii acestora nu mai pot transmite impulsul nervos deoarece oligodendrocitele care izoleaza
axonii cu mielina sunt distruse. Recent s-a realizat un prim pas in inceracarea de inlocuire a
oligodendrocitelor (Raisman G., 2001). S-a demonstrat ca celulele stem pot induce remielinizarea la
sobolani (Liu S. si colab., 2000; McDonald J.W. si colab., 1999). De asemenea, oligodendrocitele
diferentiate din celule stem embrionare pot restabili remielinizarea axonilor in modelele animale de
paralizii ale maduvei spinarii.
52
 In ciuda faptului ca sunt inca multe necunoscute, multe intrebari care inca nu si-au gasit raspunsul,
rezultatele obtinute prin utilizarea celulelor stem in terapia bolilor neuronale sunt incurajatoare. Fie
prin inlocuirea celulelor lezate, sau prin activarea propriilor celule stem in vivo, s-a demonstrat ca
aceste celule reprezinta un potential tratament al bolilor neuronale, fiind un camp de cercetare cu
avansare rapida.

V.5. Refacerea sistemului osos prin terapia cu celule stem

Se cunoste de multa vreme ca principala sursa de celulele stem mezenchimale o reprezinta maduva
osoasa hematogena care contine si progenitorii tesutului osos. Studii recente au evidentiat insa ca
celule stem mezenchimale asemanatoare cu cele medulare sunt prezente si in osul trabecular, cu
acelas potential de diferentiere catre osteoblaste, condrocite, adipocite (Sakaguchi Y. si colab.,
2004). De asemeni, potential osteogenic s-a constatat ca prezinta si celulele stem din partea fetala a
placentei umane (Takahashi K. si colab., 2004; Zhang Y. si colab., 2004). In clinica umana a
implantologiei si transplantului sunt puse multe sperante in utilizarea acestor celule cu multiple
posibilitati de diferentiere.
Se stie ca osteoblastele au un rol decisiv in procesul de formare si refacere osoasa. Acestea sunt
celule de forma cuboidala sau cilindrica ce se dispun la periferia suprafetei care urmeaza a fi
transformata in tesut osos (fig.14 – Osteoblastul si osteocitul). Au capacitati secretorii, sintetizand
colagen de tip I (Christenson R. H., 1997), osteocalcina, cea mai abundenta proteina necolagenica a
matricei osoase si fosfataza alcalina, enzima marker a osteoblastului (Voegele T. J. si colab., 2000;
Jilka V. V. si colab., 1998; Balint si colab., 2001; Di Gregorio E. si colab., 2001).
Exista numeroase afectiuni ale sistemului osos in care este afectata capacitatea secretorie a
osteoblastelor, implicit refacerea tesutului osos. Intr-un studiu Irwin si colaboratorii (2001)
evidentiaeaza o parte a cazuisticii care vizeaza defectele osoase, in special tumorale:
endocondroame, chisturi anevrismale osoase, chisturi benigne, defecte fibroase metafizare, lipoame
intraosoase, condroblastoame, ganglioni intraososi, infarcte osoase, leziuni fibro-osoase, osteoame
osteoide, condrosarcoame, necroze osoase; acestea reprezentand peste 55% din cazuistica unei
clinici de chirurgie ortopedica. Astfel s-a impus necesara gasirea unor modalitati terapeutice in
vederea eradicarii bolilor care afecteaza tesutul osos.

53
 (preluat din http://www.medes.fr/Eristo/Osteoporosis/OsteocytesImage.html)
Fig. 14 - Osteoblastul si osteocitul

Incercarile de cultivare a osteoblastelor in vitro sunt de data recenta. Au fost utilizate surse de
celule stem localizate in epifizele femurului de sobolan (Ohgushi H. si colab., 1996; Nordstrom E. si
colab., 1999; Roth A. J. si colab., 1999), calvaria fetala umana (Malekzadeh R. si colab., 1998),
maduva osoasa a tibiei de sobolan (Palmieri D. si colab., 2000), maduva osoasa umana obtinuta prin
punctie in creasta iliaca postero-superioara (Kassem M. si colab., 1991; Jorgensen R. si colab.,
2000;). Diferentierea catre osteoblast a fost realizata prin suplimentarea mediului de cultivare cu:
acid ascorbic, dexametazona si β glicerofosfat de sodiu (Cheng S. L. si colab., 1994; Sunyer T. si
colab., 1999, Buttery L. D. si colab., 2001, Takamizawa S. si colab., 2002). O mai buna diferentiere
s-a obtinut prin adaugarea in mediu de cultivare a 1, 25 dihidroxicolecalciferolului, forma activa a
vitaminei D3. Studiile pe modele animale au demonstrat potentialul osteogenic al acestor
osteoblaste in vivo (Gurevich O. si colab., 2002), precum si rolul major al vitaminei D in
osteogeneza, aceasta inducand osteoblastogeneza si inhiband adipogeneza in maduva osoasa (Duque
G. si colab., 2004). S-a constatat ca diferentierea celulelor stem mezenchimale in osteoblaste este
influentata si de suporturile de cultivare, biomateriale utilizate tot mai mult in medicina reparatorie.
In prezent numeroase studii urmaresc diferentierea si gradul de populare a biomaterialelor cu
osteoblaste precum si utilizarea lor ca substituienti ososi. S-a constatat ca suporturi materiale

54
precum: hidroxiapatita, matricile de colagen compozit, ceramicile de aluminiu, determina o mai
buna diferentiere catre osteoblaste (Iida J. si colab., 2004; Itho S. si colab., 2004; Liao F. Z. si
colab., 2004, Kitamura S., 2004). Au fost de asemenea testate asocierile intre biomateriale si astfel
de celule in vivo, constatandu-se ca un potential osteogenic mai ridicat il detin suporturile biologice
populate cu osteoblaste comparativ cu cele populate cu celulele stem mezenchimale (Iida J. si
colab., 2004). Se contureaza astfel aparitia ingineriei tisulare care ofera noi perspective chirurgiei
reconstructive (Wiedmann si colab., 2002).

V.5. Refacerea sistemului osos prin terapia cu celule stem

55
 Se cunoste de multa vreme ca principala sursa de celulele stem mezenchimale o reprezinta maduva
osoasa hematogena care contine si progenitorii tesutului osos. Studii recente au evidentiat insa ca
celule stem mezenchimale asemanatoare cu cele medulare sunt prezente si in osul trabecular, cu
acelas potential de diferentiere catre osteoblaste, condrocite, adipocite (Sakaguchi Y. si colab.,
2004). De asemeni, potential osteogenic s-a constatat ca prezinta si celulele stem din partea fetala a
placentei umane (Takahashi K. si colab., 2004; Zhang Y. si colab., 2004). In clinica umana a
implantologiei si transplantului sunt puse multe sperante in utilizarea acestor celule cu multiple
posibilitati de diferentiere.
Se stie ca osteoblastele au un rol decisiv in procesul de formare si refacere osoasa. Acestea sunt
celule de forma cuboidala sau cilindrica ce se dispun la periferia suprafetei care urmeaza a fi
transformata in tesut osos (fig.14 – Osteoblastul si osteocitul). Au capacitati secretorii, sintetizand
colagen de tip I (Christenson R. H., 1997), osteocalcina, cea mai abundenta proteina necolagenica a
matricei osoase si fosfataza alcalina, enzima marker a osteoblastului (Voegele T. J. si colab., 2000;
Jilka V. V. si colab., 1998; Balint si colab., 2001; Di Gregorio E. si colab., 2001).

(preluat din http://www.medes.fr/Eristo/Osteoporosis/OsteocytesImage.html)

Fig. 14 - Osteoblastul si osteocitul
Exista numeroase afectiuni ale sistemului osos in care este afectata capacitatea secretorie a
osteoblastelor, implicit refacerea tesutului osos. Intr-un studiu Irwin si colaboratorii (2001)
evidentiaeaza o parte a cazuisticii care vizeaza defectele osoase, in special tumorale:
endocondroame, chisturi anevrismale osoase, chisturi benigne, defecte fibroase metafizare, lipoame
56
intraosoase, condroblastoame, ganglioni intraososi, infarcte osoase, leziuni fibro-osoase, osteoame
osteoide, condrosarcoame, necroze osoase; acestea reprezentand peste 55% din cazuistica unei
clinici de chirurgie ortopedica. Astfel s-a impus necesara gasirea unor modalitati terapeutice in
vederea eradicarii bolilor care afecteaza tesutul osos.
Incercarile de cultivare a osteoblastelor in vitro sunt de data recenta. Au fost utilizate surse de
celule stem localizate in epifizele femurului de sobolan (Ohgushi H. si colab., 1996; Nordstrom E. si
colab., 1999; Roth A. J. si colab., 1999), calvaria fetala umana (Malekzadeh R. si colab., 1998),
maduva osoasa a tibiei de sobolan (Palmieri D. si colab., 2000), maduva osoasa umana obtinuta prin
punctie in creasta iliaca postero-superioara (Kassem M. si colab., 1991; Jorgensen R. si colab.,
2000;). Diferentierea catre osteoblast a fost realizata prin suplimentarea mediului de cultivare cu:
acid ascorbic, dexametazona si β glicerofosfat de sodiu (Cheng S. L. si colab., 1994; Sunyer T. si
colab., 1999, Buttery L. D. si colab., 2001, Takamizawa S. si colab., 2002). O mai buna diferentiere
s-a obtinut prin adaugarea in mediu de cultivare a 1, 25 dihidroxicolecalciferolului, forma activa a
vitaminei D3. Studiile pe modele animale au demonstrat potentialul osteogenic al acestor
osteoblaste in vivo, precum si rolul major al vitaminei D in osteogeneza, aceasta inducand
osteoblastogeneza si inhiband adipogeneza in maduva osoasa (Duque G. si colab., 2004). S-a
constatat ca diferentierea celulelor stem mezenchimale in osteoblaste este influentata si de
suporturile de cultivare, biomateriale utilizate tot mai mult in medicina reparatorie.
In prezent numeroase studii urmaresc diferentierea si gradul de populare a biomaterialelor cu
osteoblaste precum si utilizarea lor ca substituienti ososi. S-a constatat ca suporturi materiale
precum: hidroxiapatita, matricile de colagen compozit, ceramicile de aluminiu, determina o mai
buna diferentiere catre osteoblaste (Iida J. si colab., 2004; Itoh S. si colab., 2004; Liao S. S. si
colab., 2004, Kitamura S., 2004). Au fost de asemenea testate asocierile intre biomateriale si astfel
de celule in vivo, constatandu-se ca un potential osteogenic mai ridicat il detin suporturile biologice
populate cu osteoblaste comparativ cu cele populate cu celulele stem mezenchimale (Iida J. si
colab., 2004). Se contureaza astfel aparitia ingineriei tisulare care ofera noi perspective chirurgiei
reconstructive (Wiedmann si colab., 2002).

CUPRINS
Capitolul I – Celulele stem ...3
1. Introducere

57
 2. Ce sunt celulele stem si de ce sunt ele importante?
Capitolul II – Celulele stem adulte ...7
1.Ce sunt celulele stem adulte?
2. Dovezi ale prezentei celulelor stem adulte
3. Mecanismul diferentierii celulelor stem adulte
4. Markerii celulelor stem
Capitolul III – Plasticitatea celulelor stem adulte . . . 13
1.Abordari pentru demonstarea plasticitatii celuleor stem adulte
2. Evidentele plasticitatii
2.1. Evidente experimentale ale plasticitatii celulelor stem adulte
3. Celulele stem din maduva osoasa si sange
4. Celulele stem hematopoietice
5. Celulele stromale din maduva osoasa
6. Celulele stem adulte din alte tesuturi
6.1. Progenitorii endoteliali celulari
6.2. Celulele stem din muschii scheletici
6.3. Celulele stem din ficat
6.4. Celulele stem pancreatice
6.5. Celulele stem din limbul corneal
6.6. Celulele stem mamare
6.7. Celulele stem din glandele salivare
6.8. Celulele stem din piele
6.9. Celulele stem din tendoane
6.10. Celulele stem din membranele sinoviale
6.11. Celulele stem din cartilaj
6.12. Celulele progenitoare din timus
6.13. Celulele stem din pulpa dentara
6.14. Celulele stem din tesutul adipos
6.15. Celulele stem din cordonul ombilical
6.16. Celulele stem mezenchimale din cordonul ombilical
6.17. Celulele stem amniotice
Capitolul IV – Celulele stem hematopoietice . . . 29
1. Introducere
2. Ce sunt celulele stem hematopoietice?
3. Celulele stem hematopoietice pot fi identificate cu ajutorul markerilor celulari?
4. Surse de celule stem hematopoietice
Maduva osoasa
Sangele periferic
Sangele din cordonul ombilical
Sistemul hematopoietic fetal
Celulele stem embrionare si celulele stem germinale
5. Cum difera celulele stem hematopoietice care provin din surse diferite?
6. Rolul celulelor stem hematopoietice si factorii implicati in activitatea acestora
Capitolul V – Celulele stem in medicina regenerativa . . . 36
1.Terapia cu celule stem in bolile autoimune
2. Celulele stem in diabet
2.1. Utilizarea terapiilor celulare in diabet
2.2. Tesuturile adulte – surse de celula insulare
3. Celulele stem in tratamentul infarctului de miocard
4. Celulele stem in terapia bolilor sistemului nervos
4.1. Celulele stem in tratamentul bolii Parkinson
5. Refacerea sistemului osos prin terapia cu celule stem
Capitolul VI – Bibliografie . . . 53
Capitolul VI - Bibliografie

58
1. Akashi K., Kondo M., Cheshier S., Shizuru J., Gandy K., Domen J., Mebius R., Traver D. si
Weissman I.L. “Lymphoid development from stem cells and the common lymphocyte
progenitors”, Biol. 64, 1-12, 2000 ;
2. Akashi K., Traver D., Kondo M. si Weissman I.L. “Lymphoid development from hematopoietic
stem cells”, Int. J. Hematol. 69,217-226, 1999 ;
3. Alison M. R., Poulsom R., Jeffery R., Dhilion A. P.,Quaglia A., Jacob J., Novelli M., Prentice
G., Williamson J. si Wright N. A., “Hepatocytes from non-hepatic adult stem cells”, Nature.
406, 257, 2000 ;
4. Altman J. si Das G. D., “Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal
neurogenesis in rats”, J. Comp. Neurol.124, 319-335, 1965 ;
5. Altman J., “Autoradiographic and histological studies of postnatal neurogenesis. IV. Cell
proliferation and migration in the anterior forebrain, with special reference to persisting
neurogenesis in the olfactory bulb” , J. Comp. Neurol. 137, 433-457, 1969 ;
6. Alvi AJ et al., “Functional and molecular characterisation of mammary side population cells”,
Breast Cancer Research 5, R1-R8; 2003 ;
7. Anderson D. J., Gage F. H. si Weissman I. L., “Can stem cells cross lineage boundaries?”, Nat.
Med. 7, 393-395, 2001;
8. Asahara T., Murohara T., Sullivan A., Silver M., van der Zee R., Li T., Witzenbichler B.,
Schatteman G. si Isner J. M., “Isolation of putative progenitor endothelial cells for
angiogenesis ”, Science. 275, 964-967,1997 ;
9. Asakura A et al., “Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle”, Journal
of Cell Biology 159, 123–134; 14, 2002;
10. Atkins B et al., “Intracardiac Transplantation of Skeletal Myoblasts Yields Two Populations of
Striated Cells In Situ”; Annals of Thoracic Surgery 67, 124-129; 1999 ;
11. Balint E., Szaho P., Marshall C.F., Sprague S. M.,”Glucose induced inhibition of in vitro bone
mineralization”, Bone, 28 (1) : 21-28, 2001 ;
12. Baum C.M., Weissman I.L., Tsukamoto A.S., Buckle A.M. si Peault B., “Isolation of a
candidate human hematopoietic stem-cell population”, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 2804-
2808., 1992 ;
13. Beattie G.M., Otonkoski T., Lopez A.D. si Hayek A., “Functional beta-cell mass
aftertransplantation ofhuman fetal pancreatic cells: differentiation or proliferation?”, Diabetes.
46, 244-248., 1997 ;
14. Becker A. J., McCullough E. A. si Till J. E., “Cytological demonstration of the clonal nature of
spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells”, Nature.197, 452-454, 1963 ;
15. Beerheide W et al., “Downregulation of ß2-microglobulin in human cord blood somatic stem
cells after transplantation into livers of SCID-mice: an escape mechanism of stem cells?”,
Biochemical and Biophysical Research Communications 294, 1052–1063, 2002 ;
16. Bennett AR et al., “Identification and characterization of thymic epithelial progenitor cells”,
Immunity 803-814, 2002 ;
17. Bianco P. si Cossu G., “Uno nessuno e centomila : searching for the identity of mesodermal
progenitors”, Exp. Cell Res. 251, 257-263, 1999 ;
18. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S. si Robey P. G., “Bone marrow stromal cells ; nature,
biology and potential applications ”, Stem Cells. 19, 180-192, 2001;
19. Bianco P., Riminucci M., Kuznetsov S. si Robey P. G, “Multipotential cells in the bone marrow
stroma : regulation in the context of organ physiology” , Crit. Rev. Eukaryotic.Gene Expr. 9,
159-173, 1999 ;

59
20. Bieback K., Kern S., Kluter H. si Eichler H., “Critical parameters for the izolation of
mesencymal stem cells from umbilical cord blood ” , Stem cells 22 :625-634, 2004 ;
21. Bittner R.E., Schofer C., Weipoltshammer K., Ivanova S., Streubel B., Hauser E., Freilinger M.,
Hoger H., Elbe-Burger A. si Wachtler F., “Recruitment of bone-marrowderived cells by skeletal
and cardiac muscle in adult dystrophic mdx mice”, Anat. Embryol. (Berl) 199, 391-396., 1999 ;
22. Bjornson C. R., Rietze R. L., Reynolds B.A., Magli M. C. si Vescovi A. L., “Turning brain into
blood : a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo”, Science. 283, 534-537,
1999 ;
23. Blau HM, “Stem-cell fusion: A twist of fate”, Nature 419, 437; 3, 2002 ;
24. Bonner-Weir S., Taneja M., Weir G.C., Tatarkiewicz K., Song K.H., Sharma A. si O’Neil J.J.,
“In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue”, Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A.
97, 7999-8004., 2000 ;
25. Brazelton T. R., Rossi F. M., Keshet G. I. si Blau H. M., “From marrow to brain: expressionof
neuronal phenotypes in adult mice”, Science. 290, 1775-1779, 2000 ;
26. Broxmeyer HE et al., “High-efficiency recovery of functional hematopoietic progenitor and
stem cells from human cord blood cryopreserved for 15 years”, Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 100, 645-650, 2003 ;
27. Bruder S. P. Jaiswal N. si Haynesworth S. E., “Growth kinetics, self-renewal, and the osteogenic
potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and
following cryopreservation”, J. Cell Biochem. 64, 278-294, 1997;
28. Brustle O.,Choudhary K., Karram K., Huttner A., Murray K., Dubois D. M., McKay R. D.,
“Chimeric brains generated by intraventricular transplantation of human brain cells into
embryonic rats”, Nat. Biotechnol. 16 (11) : 1040-1044, 1998 ;
29. Buttery L. D., Bourne S., Xynos J. D., Wood H., Hughes F., Hughes S. P., Episkopou V., Polak
J. M., “Differentiation of osteoblast and in vitro bone formation from murine embryonic stem
cells”, Tissue Eng.,7(1): 89-99, 2000 ;
30. Buzanska L et al., “Neural stem cell line derived from human umbilical cord blood -
morphological and functional properties”, Journal of Neurochemistry 85, Suppl 2, 33; 2003 ;
31. Caplan A.I., Elyaderani M., Mochizuki Y., Wakitani S. si Goldberg V.M., “Principles of
cartilage repair andregeneration”, Clin. Orthop. 342, 254-269, 1997 ;
32. Chandross K.J. si Mezey E.,” Plasticity of adultbone marrow stem cells”, Mattson M.P. si Van
Zant G.eds. (Greenwich, CT: JAI Press)., 2001 ;
33. Chen, J. Astle C.M. si Harrison D.E., “Development and aging of primitive hematopoietic stem
cells in BALB/cBy mice”, Exp. Hematol. 27, 928-935., 1999 ;
34. Cheng S. L., Yang J., Rifas L., Zhang S. F., Arioli L., “Differentiation of human bone marrow
osteogenic stromal cells in vitro: induction of the osteobalst phenotyphe by dexamethasone”,
Endocrinology 134: 277-286, 1994 ;
35. Christenson R. H., "Biochemical markers of bone metabolism: an overview”, Clin. Biochem.,
30: 573-593, 1997 ;
36. Clarke D.L., Johansson C.B., Wilbertz J., Veress B., Nilsson E., Karlström H., Lendahl U. si
Frisen J., “Generalized potential of adult neural stem cells”, Science. 288, 1660-1663., 2000 ;
37. Cooper G.S., Dooley M.A., Treadwell E.L., St Clair E.W., Parks C.G. si Gilkeson G.S.,
“Hormonal, environmental, and infectious risk factors for developing systemic lupus
erythematosus,” Arthritis Rheum. 41, 1714-1724, 1998 ;
38. De Bari C et al., “Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane”,
Arthritis Rheumatism 44, 1928-1942, 2001;

60
39. De Bari C et al.; "Skeletal muscle repair by adult human mesenchymal stem cells from synovial
membrane"; Journal of Cell Biology 160, 909-918, 2003 ;
40. Del Bigio M.R., “The ependyma: a protective barrier between brain and cerebrospinal fluid”,
Glia. 14, 1-13., 1995 ;
41. Deutsch G., Jung J., Zheng M., Lora J.si Zaret K.S., “A bipotential precursor population for
pancreas and liver within the embryonic endoderm”, Development. 128,871-881., 2001 ;
42. Di Gregorio G. B., Yamamoto M., Afshan A., Abe E., Roberson P., Manolagas C. S., Jilka R. L.
"Attenuation of the self-renewal of transit-amplifying osteoblasts progenitors in the murine bone
marrow by 17 β-estradiol”, J. Clin. Invest., 107: 803-812, 2001;
43. Doetsch F., Garcia-Verdugo J.M. si Alvarez-Buylla A., “Cellular composition and three-
dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adul tmammalian brain”, J.
Neurosci. 17, 5046-5061., 1997 ;
44. Doetschman T., Eistetter H., Katz M., Schmit W. si Kemler R., “The in vitro development of
blastocystderived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and
myocardium”, J. Embryol. Exp. Morph. 87, 27-45., 1985 ;
45. Domen J. si Weissman I.L., “Self-renewal, differentiation or death: regulation and manipulation
of hematopoietic stem cell fate”, Mol. Med. Today. 5, 201-208., 1999 ;
46. Dontu G et al., “In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary
stem/progenitor cells”, Genes and Development 17, 1253-1270, 2003 ;
47. Dufayet de la Tour D., Halvorsen T., Demeterco C., Tyrberg B., Itkin-Ansari P., Loy M., Yoo
S.J., Hao S., Bossie S.si Levine F., “b-cell differentiation from a humanpancreatic cell line in
vitro and in vivo.”, Mol.Endocrinol. 15, 476-483., 2001 ;
48. Duque G., Macoritto M., Kremer R., “1,25(OH)2D3 inhibits bone marrow adipogenesis in
senescence accelerated mice (SAM-P/6) by decreasing the expression of peroxisome proliferator
activated receptor gamma 2 (PPARgamma2)”, Exp Gerontol., 39(3):333-8, 2004 ;
49. Eriksson P.S., Perfilieva E., Bjork-Eriksson T., Alborn A.M., Nordborg C., Peterson D.A. si
Gage F.H., “ Neurogenesis in the adult human hippocampus”, Nat. Med. 4, 1313-1317., 1998;
50. Fang TC, Alison MR, Wright NA, Poulsom R., “Adult stem cell plasticity: will engineered
tissues be rejected?”, Int J Exp Pathol., 85(3):115-24, 2004 ;
51. Ferrari G., Cusella-De Angelis G., Coletta M., Paolucci E., Stornaiuolo A., Cossu G. si Mavilio
F., “Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors”, Science. 279, 1528-
1530., 1998 ;
52. Folkman, J., “Therapeutic angiogenesis in ischemic limbs”, Circulation. 97, 1108-1110. ,1998 ;
53. Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K. si Lalykina K.S., “The development of fibroblast colonies in
monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells”, Cell Tissue Kinet. 3, 393-403.,
1970 ;
54. Friedenstein A.J., Petrakova K.V., Kurolesova A.I. si Frolova G.P., “Heterotopic of bone
marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues”, Transplantation.
6, 230-247., 1968 ;
55. Friedenstein A.J., Piatetzky-Shapiro I.I. si Petrakova K.V., “Osteogenesis in transplants of bone
marrow cells”, J. Embryol. Exp. Morphol. 16, 381-390., 1966 ;
56. Gage F.H., Coates P.W., Palmer T.D., Kuhn H.G., Fisher L.J., Suhonen J.O., Peterson D.A.,
Suhr S.T. si Ray J., “Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted
to the adult brain”, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 11879-11883., 1995 ;
57. Gage F.H., Ray J. si Fisher L.J.,”Isolation, characterization, and use of stem cells from the
CNS”, Annu. Rev. Neurosci. 18, 159-192., 1995 ;

61
58. Gallacher L., Murdoch B., Wu D., Karanu F., Fellows F. si Bhatia M., “Identification of novel
circulating human embryonic blood stem cells”, Blood. 96, 1740-1747., 2000 ;
59. Gordon M.Y., Riley G.P., Watt S.M. si Greaves M.F., “Compartmentalization of a
haematopoietic growth factor (GM-CSF) by glycosaminoglycans in the bone marrow
microenvironment”, Nature. 326, 403-405., 1987 ;
60. Gronthos S et al., “Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells
derived from human bone marrow”, Journal of Cell Science 116, 1827-1835; 2003 ;
61. Gronthos S. et al., “Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo”,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97, 13625-13630, 2000 ;
62. Grossman, J.M. si Tsao, B.P., “Genetics and systemic lupus erythematosus”, Curr. Rheumatol.
Rep. 2, 13-18., 2000 ;
63. Grove Joanna E., Bruscia E., Krause D. S., “Plasaticity of bone marrow-derived stem cells”,
Stem Cells, 2004 ;
64. Guenechea G., Gan O.I., Dorrell C. si Dick J.E., “Distinct classes of human stem cells that differ
in proliferative and self-renewal potential”, Nat. Immunol. 2, 75-82., 2001 ;
65. Guilak Farshid, Hani A. Awad , Beverley Fermor , Holly A. Leddy , Jeffrey M. Gimble
“Adipose-derived adult stem cells for cartilage tissue engineering”, Biorheology, 41,3-4 , 2004 ;
66. Gussoni E., Soneoka Y., Strickland C.D., Buzney E.A., Khan M.K., Flint A.F., Kunkel L.M. si
Mulligan R.C., “Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation”,
Nature. 401, 390-394., 1999 ;
67. Holtzer H., “Cell lineages, stem cells and the‘quantal’ cell cycle concept. In: Stem cells and
tissue homeostasis”, Eds: B.I. Lord, C.S. Potten, and R.J. Cole. (Cambridge, New York:
Cambridge University Press). 1-28., 1978 ;
68. Horwitz EM et al., “Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells engraft and
stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: Implications for cell therapy of
bone”, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99, 8932-8937; 2002 ;
69. Horwitz EM et al., “Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived
mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta”, Nature Medicine 5, 309–313;
1999;
70. Hunt P., Robertson D., Weiss D., Rennick D., Lee F. si Witte O.N., “A single bone marrow-
derived stromal cell type supports the in vitro growth of early lymphoid and myeloid cells” Cell.
48, 997-1007., 1987 ;
71. Huyhn A., Dommergues M., Izac B., Croisille L., Katz A., Vainchenker W. si Coulombel L.
“Characterization of hematopoietic progenitors from human yolk sacs and embryos”, Blood. 86,
4474-4485., 1995 ;
72. Iida J., Takafumi Yoshikawa,1 Manabu Akahane, Hajime Ohgushi, Yoshiko Dohi, Yoshinori
Takakura si Akitaka Nonomura, “Osteogenic Potential of Cultured Bone/Ceramic Construct:
Comparison With Marrow Mesenchymal Cell/Ceramic Composite”, Cell Transplantation, 13:
3571-365, 2004 ;
73. Iijima Y et al., “Beating is necessary for transdifferentiation of skeletal muscle-derived cells into
cardiomyocytes”, FASEB Journal 17, 1361-1363, 2003 ;
74. Itkin-Ansari P., Demeterco C., Bossie S., Dufayet de la Tour D., Beattie G.M., Movassat J.,
Mally M.I., Hayek A. si Levine F., “PDX-1 and cell-cell contact act in synergyto promote d-cell
development in a human pancreatic endocrine precursor cell line”, Mol. Endocrinol. 14, 814-
822., 2001 ;
75. Itkin-Asari P. si Levine F.; “Sources of beta-Cells for Human Cell-Based Therapies for
Diabetes”, Cell Biochem Biophys, 40(3 Suppl):103-12, 2004 ;

62
76. Itoh S., Masanori Kikuchi, Yoshihisa Koyama, Kazuo Takakuda, Kenichi Shinomiya, Junzo
Tanaka, “Development of a Hydroxyapatite/Collagen Nanocomposite as a Medical Device”,
Cell Transplantation, 13: 451-461, 2004 ;
77. Itskovitz-Eldor J., Schuldiner M., Karsenti D., Eden A., Yanuka O., Amit M., Soreq H., si
Benvenisty N., “Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising
the three embryonic germ layers” , Mol. Med. 6, 88-95., 2000 ;
78. Jackson K.A., Majka S.M., Wang H., Pocius J., Hartley C.J., Majesky M.W., Entman M.L.,
Michael L.H., Hirschi K.K. si Goodell M.A., “Regeneration of ischemic cardiac muscle and
vascular endothelium by adult stem cells”, J. Clin. Invest. 107, 1-8., 2001 ;
79. Jilka L.R., Takahashi K., Munsci M., Williams D., Robertson K. P., Monolagas S. C., „Loss of
estrogens upregulates osteoblastogenesis in murine bone marrow“, J. Clin. Invest., 101: 1942-
1950, 1998 ;
80. Johansson C.B., Momma S., Clarke D.L., Risling M., Lendahl U. si Frisen, J., “Identification of
a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system”, Cell. 96, 25-34., 1999 ;
81. Johe K.K., Hazel T.G., Muller T., Dugich-Djordjevic M.M. si McKay, R.D., “Single factors
direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system”, Genes
Dev. 10, 3129-3140., 1996 ;
82. Jorgensen R.,HenriksenZ., Brott C., Eriksen E. F., Sorensen O. H., Civittelli R., Steinberg T. T.
H., “Human osteoblastic cells propagate intercellular calcium signals by two different
mechanisms”, J. Bone Miner. Res., 15: 1024-1032, 2000 ;
83. Kakinuma S et al; “Human Umbilical Cord Blood as a Source of Transplantable Hepatic
Progenitor Cells”; Stem Cells 21, 217-227, 2003 ;
84. Kale S et al., “Bone marrow stem cells contribute to repair of the ischemically injured renal
tubule”, Journal of Clinical Investigation 112, 42-49, 2003 ;
85. Kalka C., Masuda H., Takahashi T., Kalka-Moll W.M., Silver M., Kearney M., Li T., Isner J.M,
si Asahara T., “Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic
neovascularization”, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 3422-3427., 2000 ;
86. Kassem M., Risteli L., Mosekilde L., Melsen F., Eriksebn E. F., “Formation of osteoblasts-like
cells from human mononuclear bone marrow cultures”, APMIS 99: 269-274, 1991 ;
87. Kaufman D. S., Lewis R. L., Auerbach R. si altii, “Directed differentiation of human embryonic
stem cells into hematopoietic colony forming cells”, Blood 94, 34a, 1999 ;
88. Kim S.H., Kim S. Evans C.H., Ghivizzani S.C., Oligino T., si Robbins P.D., “Effective
treatment of established murine collagen-induced arthritis by systemic administration of
dendritic cells genetically modified to express IL-4.”, J. Immunol. 166, 3499-3505., 2001
89. Kitamura S., “Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Cells
Cultured on Alumina Ceramics”, Artificial Organs, 28 (1): 72, 2004 ;
90. Kocher A.A., Schuster M.D., Szabolcs M.J., Takuma S., Burkhoff D., Wang J., Homma S.,
Edwards N.M., si Itescu S., “Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-
marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and
improves cardiac function”, Nat. Med. 7, 430-436., 2001 ;
91. Krause D.S., Theise N.D., Collector M.I., Henegariu O., Hwang S., Gardner R., Neutzel S. si
Sharkis S.J., “Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem
cell”, Cell. 105, 369-377., 2001 ;
92. Krause D.S., Theise N.D., Collector M.I., Henegariu O., Hwang S., Gardner R., Neutzel S. si
Sharkis S.J., “Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem
cell”, Cell. 105, 369-377., 2001 ;

63
93. Kurtzberg J et al., “Placental blood as a source of hematopoietic stem cells for transplantation
into unrelated recipients”, New England Journal of Medicine 335, 157-166; 1996 ;
94. Labastie M.C., Cortes F., Romeo P.H., Dulac C. si Peault B., “Molecular identity of
ematopoietic precursor cells emerging in the human embryo”, Blood. 92, 3624-3635., 1998
95. Labastie, M.C., Cortes, F., Romeo, P.H., Dulac, C. si Peault, B. “Molecular identity of
hematopoietic precursor cells emerging in the human embryo”, Blood. 92, 3624-3635, 1998 ;
96. Lagasse E., Connors H., Al Dhalimy M., Reitsma M., Dohse M., Osborne L., Wang X., Finegold
M., Weissman I.L. si Grompe M., “Purified hematopoietic stem cells can differentiate into
hepatocytes in vivo”, Nat. Med. 6, 1229-1234., 2000 ;
97. Lagasse E., Connors H., Al Dhalimy M., Reitsma M., Dohse M., Osborne L., Wang X., Finegold
M., Weissman I.L. si Grompe M., “Purified hematopoietic stemcells can differentiate into
hepatocytes in vivo”, Nat. Med. 6, 1229-1234., 2000 ;
98. Laughlin M.J., “Umbilical cord blood for allogeneic transplantation in children and adults”,
Bone Marrow Transplant. 27, 1-6., 2001 ;
99. Lawson B.R., Prud’homme G.J., Chang Y., Gardner H.A., Kuan J., Kono, D.H. si
Theofilopoulos A.N., “Treatment of murine lupus with cDNA encoding IFN gamma R/Fc.”, J.
Clin. Invest. 106, 207-215., 2000 ;
100. Lee JY et al., “Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle
regeneration and bone healing”, Journal of Cell Biology 150, 1085-1099; 2000 ;
101. Lee OK, Kuo TK, Chen WM, Lee KD, Hsieh SL, Chen TH “Isolation of multipotent
mesenchymal stem cells from umbilical cord blood”, Blood. 103(5):1669-75, 2004 ;
102. Liao S. S., Cui F. Z., Zhu Y., “Osteoblasts Adherence and Migration through Three-
dimensional Porous Mineralized Collagen Based Composite: nHAC/PLA”, Journal of Bioactive
and Compatible Polymers, 19, 117-130, 2004 ;
103. Lin F et al; “Hematopoietic stem cells contribute to the regeneration of renal tubules after
renal ischemia-reperfusion injury in mice”; Journal of the  American Society of Nephrology 14,
1188-1199, 2003 ;
104. Lois C. si Alvarez-Buylla A., “Long-distance neuronal migration in the adult mammalian
brain”, Science. 264, 1145-1148., 1994 ;
105. Lois C. si Alvarez-Buylla A., “Long-distance neuronal migration in the adult mammalian
brain”, Science. 264, 1145-1148, 1994 ;
106. Luskin M.B., “Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons
derived from the forebrain subventricular zone”, Neuron. 11, 173-189, 1993 ;
107. MacKey M.C., “Cell kinetic status of haematopoietic stem cells”, Cell. Prolif. 34, 71-83. ,
2001 ;
108. Malekzadeh R., Hollinger J. O., Buck D., Adams F. D., Mc Allister S. B., “Isolation of
human osteoblast-like cells and in vitro amplification for tissue engineering”, J. Periodontol., 69:
1256-1262, 1998 ;
109. Malouf, NN et al.; “Adult-derived stem cells from the liver become myocytes in the heart in
vivo”; American Journal of Pathology 158, 1929-1935, 2001 ;
110. McKay R., “Stem cells in the central nervous system” Science. 276, 66-71., 1997 ;
111. Mezey E., Chandross K.J., Harta G., Maki R.A. si McKercher S.R., “Turning blood into
brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow”, Science. 290, 1779-
1782., 2000 ;
112. Mitchell K et al; “Matrix Cells from Wharton’s Jelly Form Neurons and Glia”; Stem Cells
21, 51-60, 2003 ;

64
113. Miura M et al; “SHED: Stem cells from human exfoliated deciduous teeth”; Proceedings of
the National Academy of Sciences USA 100, 5807-5812; 2003 ;
114. Momma, S., Johansson, C.B si Frisen, J., “Get to know your stem cells”, Curr. Opin.
Neurobiol. 10, 45-49, 2000 ;
115. Morrison S.J., White P.M., Zock C. si Anderson D.J., “Prospective identification, isolation
by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalia nneural crest stem cells”,
Cell. 96, 737-749., 1999 ;
116. Morshead C.M. si van der Kooy K.D., “A new ‘spin’ on neural stem cells?”, Curr. Opin.
Neurobiol. 11, 59-65, 2001 ;
117. Murga M., Yao Lei si Tosato G., “Derivation of endothelilal cells from CD34 - umbilical
cord blood”, Stem Cells 22:385-395, 2004 ;
118. Negrin R.S., Atkinson K., Leemhuis T., Hanania E., Juttner C., Tierney K., Hu W.W.,
Johnston L.J., Shizurn J.A., Stockerl-Goldstein K.E., Blume K.G., Weissman I.L., Bower S.,
Baynes R., Dansey R., Karanes C., Peters W. si Klein, J., “Transplantation of highly purified
CD34+ Thy-1+ hematopoietic stem cells in patients with metastatic breast cancer”, Biol. Blood
Marrow Transplant. 6, 262-271., 2000 ;
119. Newsome PN et al., “Human cord blood-derived cells can differentiate into hepatocytes in
the mouse liver with no evidence of cellular fusion”, Gastroenterology 124, 1891-1900; 2003 ;
120. Nordstrom E., Ohgushi H., Yoshikawa T., Yokobori A. T., Yokobori T., “Osteogenic
differentiation of cultured marrow stromal stem cells on surface of microporous hydroxyapatite
based mica composite and macroporous synthetic hydroxyapatite”, Bio-Medical Materials
Engineering , 9:21-26, 1999 ;
121. Ohgushi H, Kitamura S, Kotobuki N, Hirose M, Machida H, Muraki K, Takakura Y.,
“Clinical application of marrow mesenchymal stem cells for hard tissue repair”,
Yonsei Med J.;45 Suppl:61-7, 2004 ;
122. Ohgushi H., DohiY., Yoshikawa, Tamai S., Tabata S., Okunga K., Shibuga T., “Osteogenic
differentiation of cultured marrow stromal stem cells on the surface of bioactive glass
ceramics”, J. Biomed. Mater. Res., 32, 1996 ;
123. Okumura K et al., “Salivary gland progenitor cells induced by duct ligation differentiate into
hepatic and pancreatic lineages”, Hepatology 38, 104-113, 2003 ;
124. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Jakoniuk I., Anderson S.M., Li B., Pickel J., McKay R.,
Nadal-Ginard B., Bodine D.M., Leri A. si Anversa P., “Bone marrow cellsregenerate infarcted
myocardium”, Nature. 410, 701-705, 2001 ;
125. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Jakoniuk I., Anderson S.M., Li B., Pickel J., McKay R.,
Nadal-Ginard B., Bodine D.M., Leri A. si Anversa P., “Bone marrow cells regenerate infarcted
myocardium”, Nature. 410, 701-705., 2001 ;
126. Oswald J., Boxberger S., Jorgensen B., Feldmann S., Ehninger G., Bornhauser M si Werner
C., “Mesencymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro”, Stem Cells
22:377-384, 2004 ;
127. Owen M., “Marrow derived stromal stem cells”, J. Cell Science Supp. 10, 63-76., 1988 ;
128. Palmieri D., Camardella L., Ulivi V., Guasco G., Manduca P., “Trimer carboxyl propeptide
of collagen I produced by mature osteobalsts is chemotactic for endothelial cells”, J. Biol.
Chem., 275: 32658-32663, 2000 ;
129. Panicker M. si Rao M., “Stem cells and neurogenesis” , Marshak, D.R., Gardner, D.K., and
Gottlieb, D. eds. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). 399-
438., 2001 ;

65
130. Perkins A.C., “Enrichment of blood from embryonic stem cells in vitro”, Reprod. Fertil.
Dev. 10, 563-572., 1998 ;
131. Petersen B.E., Bowen W.C., Patrene K.D., Mars W.M., Sullivan A.K., Murase N., Boggs
S.S., Greenberger J.S. si Goff J.P., “Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells”,
Science. 284, 1168-1170., 1999 ;
132. Pittenger M.F. si Marshak D.R., “Mesenchymal stem cells of human adult bone marrow”
Marshak D.R., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). 349-374., 2001 ;
133. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman
M.A., Simonetti D.W., Craig S. si Marshak D.R., “Multilineage potential of adult human
mesenchymal stem cells”, Science. 284, 143-147., 1999 ;
134. Polesskaya A et al., “Wnt signaling induces the myogenic specification of resident CD45+
adult stem cells during muscle regeneration”, Cell 113, 841-852; 2003;
135. Poole T.J., Finkelstein E.B. si Cox C.M., “The role of FGF and VEGF in angioblast
induction and migration during vascular development”, Dev. Dyn. 220, 1-17., 2001 ;
136. Prud’homme G.J., “Gene therapy of autoimmunediseases with vectors encoding regulatory
cytokines or inflammatory cytokine inhibitors” J. Gene. Med. 2, 222-232, 2000 ;
137. Prusa A-R et al., “Oct-4-expressing cells in human amniotic fluid: a new source for stem cell
research?”, Human Reproduction 18, 1489-1493; 2003 ;
138. Qu-Petersen Z et al.; “Identification of a novel population of muscle stem cells in mice:
potential for muscle regeneration”; Journal of Cell Biology 157, 851-864; 2002 ;
139. Rainsford E, Reen DJ, “Interleukin 10, produced in abundance by human newborn T cells,
may be the regulator of increased tolerance associated with cord blood stem cell transplantation”,
British Journal of Haematology 116, 702-709; 2002 ;
140. Roberts R., Gallagher J., Spooncer E., Allen T.D., Bloomfield F. si Dexter T.M., “Heparan
sulphate bound growth factors: a mechanism for stromal cell mediated haemopoiesis”, Nature.
332, 376-378., 1988 ;
141. Robey P.G., “Stem cells near the century mark”, J. Clin. Invest. 105, 1489-1491., 2000
142. Robinson D et al., “Characteristics of cartilage biopsies used for autologous chondrocytes
transplantation”, Cell Transplant 10,  203-208; 2001 ;
143. Roche R. si Soria B Generation of new islets from stem cells; Cell Biochem
Biophys.40(3Suppl):113-24,2004;
Roy V. si Verfaillie C.M., “Expression and functionof cell adhesion molecules on fetal liver,
cord blood and bone marrow hematopoietic progenitors: implications for anatomical localization
and developmental stage specificregulation of hematopoiesis”, Exp. Hematol. 27, 302-312,
1999 ;
144. Roth A. J., Kim B. G., Lin Wen-Lang, Cho Moon-II, “Melatonin promotes osteoblasts
differentiation and bone formation”, J. Biol. Chem., 247: 22041-22047, 1999 ;
145. Sakaguchi Y., Ichiro Sekiya, Kazuyoshi Yagishita, Shizuko Ichinose, Kenichi Shinomiya,
Takeshi Muneta, “Suspended cells from trabecular bone by collagenase digestion become
virtually identical to mesenchymal stem cells obtained from marrow aspirates”, Blood, 2004 ;
146. Salingcarnboriboon R et al., “Establishment of tendon-derived cell lines exhibiting
pluripotent mesenchymal stem cell-like property”, Experimental Cell Research 287, 289-300;
2003 ;
147. Sanchez-Ramos J et al., “Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in
vitro”, Experimental Neurology 164, 247-256; 2000 ;

66
148. Schuldiner M., Yanuka O., Itskovitz-Eldor J., Melton D. si Benvenisty N., “Effects of eight
growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic stem cells”, Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 11307-11312, 2000 ;
149. Schultz E., “Satellite cell proliferative compartments in growing skeletal muscles”, Dev.
Biol. 175, 84-94., 1996 ;
150. Seigel GM et al., “Human corneal stem cells display functional neuronal properties”,
Molecular Vision 9, 159-163, 2003 ;
151. Shahin Rafii si David Lyden, “Terapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ
vasculariyation and regeneration”, Nature Medicine, 2003 ;
152. Shalaby F., Rossant J., Yamaguchi T.P., Gertsenstein M.,Wu X.F., Breitman M.L. si Schuh
A.C., “Failure of blood-island formation and vasculogenesis inFlk-1-deficient mice”, Nature.
376, 62-66., 1995 ;
153. Shamblott M. J., Axelman J., Wang S., Bugg E. M., Littlefield J. W., Donovan P. J.,
Blumenthal P. D., Huggins G. R., Gearhart J. D., “Derivation of pluripotent stem cells from
cultured human primordial germ cells”, Pro. Nat. Acad. Sci U.S.A. 95;13726-31; 1998 ;
154. Shamblott M.J., Axelman J., Littlefield J.W., Blumenthal P.D., Huggins G.R., Cui Y., Cheng
L. si Gearhart J.D., “Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of
developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro” Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S. A. 98, 113-118., 2001 ;
155. Shi Q., Rafii S., Wu M.H., Wijelath E.S., Yu C., Ishida A., Fujita Y., Kothari S., Mohle R.,
Sauvage L.R., Moore M.A., Storb R.F. si Hammond W.P., “Evidence for circulating bone
marrow-derived endothelial cells”, Blood. 92,362-367, 1998 ;
156. Shihabuddin L.S., Palmer T.D. si Gage F.H., “The search for neural progenitor cells:
prospects for the therapy of neurodegenerative disease”, Mol. Med. Today. 5, 474-480., 1999 ;
157. Slack J.M., “Stem Cells in Epithelial Tissues”, Science. 287, 1431-1433., 2000 ;
158. Slack J.M., “Stem cells in epithelial tissues”, Science.287, 1431-1433., 2000 ;
159. Spangrude G.J., Heimfeld S., Weissman, I.L., “Purification and characterization of mouse
hematopoietic stem cells”, Science. 241, 58-62, 1988 ;
160. Spees JL et al., “Differentiation, cell fusion, and nuclear fusion during ex vivo repair of
epithelium by human adult stem cells from bone marrow stroma”, Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 100, 2397-2402; 2003 ;
161. Studer L., Tabar V. si Mckay R.D.G., “Transplantation of expanded mesencephalic
precursors leads to recovery in Parkinsonian rats”, Nat. Neurosci. 1 :290-5, 1998 ;
162. Sudo K., Ema H., Morita Y. si Nakauchi H., “Ageassociated characteristics of murine
hematopoietic stem cells”, J. Exp. Med. 192, 1273-1280, 2000 ;
163. Sun S., Guo Z., Xiao X., Liu B., Liu X., Tang Pei-Hsien siMao N., “Isolation of mouse
marrow mesencymal progenitors by a novel and reliable method”, Stem Cells 21:527-535, 2004;
164. Sunyer T.,Lewis J., Collin_ Osdoby P., “Estrogens bone-protective effects may involve
differential IL-1 regulation in human osteoblast-like cells”, J. Clin. Invest., 103: 1409-1418,
1999 ;
165. Surbek D.V., Steinmann C., Burk M., Hahn S., Tichelli A. si Holzgreve W.,
“Developmental changes in adhesion molecule expressions in umbilical cord blood CD34+
hematopoietic progenitor and stem cells”, Am. J. Obstet. Gynecol. 183, 1152-1157, 2000 ;
166. Suzuki A et al.; “Glucagon-like peptide 1 (1-37) converts intestinal epithelial cells into
insulin-producing cells”; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100, 5034-
5039; 2003 ;

67
167. Tada M et al., “Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES
cells”, Current Biology 11, 1553-1558; 2001 ;
168. Takahashi K., Igura K.,.Zhang X, Mitsuru A., Takahashi T. A., “Effects of Osteogenic
Induction on Mesenchymal Cells From Fetal and Maternal Parts of Human Placenta”, Cell
Transplantation, 13: 337-341, 2004 ;
169. Takahashi T., Kalka C., Masuda H., Chen D., Silver M., Kearney M., Magner M., Isner J.M.
si Asahara T., “Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived
endothelial progenitor cells for neovascularization”, Nat. Med. 5, 434-438., 1999;
170. Takamizawa S., Maehata Y., Ozawa S., Okada S., Kato Y., Kubota E., Sato S., “Ascorbic
acid 2-phosphate stimulates proliferation and differentiation of human osteoblasts”,
Endocrinology, 143(5):1942-1949, 2002 ;
171. Tavian M., Coulombel L., Luton D., Clemente H.S., ieterlen-Lievre F. si Peault B. “Aorta-
associated CD34+ hematopoietic cells in the early human embryo”, Blood. 87, 67-72. 1996 ;
172. Terese Winsiow, Caitlin Duckwall, “Stem cells - NIH”, 2001 ;
173. Terese Winslaw, Lydia Kibiuk, “Stem cells - NIH”, 2001;
174. Theise N. D., Nimmakayalu M., Gardner R., Illei P. B., Morgan G., Teperman L.,
Henegariu O. si Krausse D. S., “Liver from bone marrow in humans”, Hepatology 32: 11-16,
2000 ;
175. Thomas E. D. si Blume K. G., “Historical markers in the develpoment of allogeneic
hematopoietic cell tranplantation” , Biol. Blood Marrow Transpl. 5 :341-6, 1999 ;
176. Till J.E. si McCullough, E.A., “A direct measurement of the radiation sensitivity of normal
mouse bone marrow cells” Radiat. Res. 14, 213-222., 1961 ;
177. Toma JG et al; “Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian
skin”; Nature Cell Biology 3, 778-784; 2002 ;
178. Torrente Y., Tremblay J. P., Pisati F., Belicchi M., Rossi B., Sironi M., Fortunato F., El
Fahime M., D΄Angelo M. G., Caron N. J., Constantin G., Paulin D., Scarlato G. si Bresolin N., “
Intraarterial injection of muscle-derived CD34+Sca-1 stem cells restores dystrophin in mdx
mice”, J. Cell Biol. 152:335-48, 2001 ;
179. Tran SD et al.; “Differentiation of human bone marrow-derived cells into buccal epithelial
cells in vivo: a molecular analytical study”; Lancet 361, 1084-1088; 2003 ;
180. Tsai et al.; “The long term outcome of limbal allografts: the search for surviving cells”,
British Journal of Ophthalmology 85, 604-609; 2001 ;
181. Tsokos G.C. si Nepom G.T., “Gene therapy in the treatment of autoimmune diseases”, J.
Clin. Invest. 106, 181-183, 2000 ;
182. Verfaillie C.M., “Adhesion receptors as regulators of the hematopoietic process”, Blood. 92,
2609-2612., 1998 ;
183. Villa A., Snyder E. Y., VescoviA., Martinez-Serrano A., “Establishment and propertes of a
growth factor-dependent perpetual neural stem cell line from the human CNS ”, Exp. Neurol 161
(1) :67-84, 2000 ;
184. Vogele T. J., Voegele – Kadietz M., Esposito V., Macfelda K., Oberndorfer U., Vecsei V.,
Schahus R., ,"The effect of different isolation techniques on human osteoblast-like cell growth”,
Anticancer Res., 20: 3575-3581, 2000 ;
185. Wang M.W., Consoli U., Lane C.M., Durett A., Lauppe M.J., Champlin R., Andreeff M. si
Deisseroth A.B., “Rescue from apoptosis in early (CD34-selected)versus late (non-CD34-
selected) human hematopoietic cells by very late antigen 4- and vascular cell adhesion molecule

68
 (VCAM) 1-dependent adhesion to bone marrow stromal cells”, Cell Growth Differ. 9, 105-112.,
1998 ;
186. Wang X et al.; “Cell fusion is the principal source of bone-marrow-derived hepatocytes”; 
Nature 422, 897-901; 24 April 2003; Vassilopoulos G et al.;“Transplanted bone marrow
regenerates liver by cell fusion”; Nature 422, 901-904; 2003 ;
187. Wang, X et al; “Liver repopulation and correction of metabolic liver disease by transplanted
adult mouse pancreatic cells” American Journal of Pathology 158, 571-579; 2001 ;
188. Weiss ML si colab., “Transplantation of porcine umbilical cord matrix cells into the rat
brain”, Experimental Neurology , 2003 ;
189. Weiss, S. si van der Kooy D., “CNS stem cells: where’s the biology?”, J. Neurobiol. 36,
307-314., 1998 ;
190. Weissman I.L., “Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in
evolution”, Cell. 100,157-168., 2000 ;
191. Whetton A.D. si Graham G.J., “Homing and mobilization in the stem cell niche”, Trends
Cell. Biol. 9, 233-238, 1999 ;
192. Whitlock C.A., Tidmarsh G.F., Muller-Sieburg C. si Weissman I.L., “Bone marrow stromal
cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated
molecule”, Cell. 48, 1009-1021, 1987 ;
193. Wiedmann A., Gutwald R., Lauer G., Hubner U., Schmelzeisen R., "How to optimize
seeding and culturing of human osteoblast-like cells on various biomaterials”, Biomaterials:
23(16) ; 3319-3328, 2002 ;
194. Woodbury D et al., “Adult bone marrow stromal stem cells express germline, ectodermal,
endodermal, and mesodermal genes prior to neurogenesis”, Journal of Neuroscience Research
96, 908-917; 2002 ;
195. Woodbury D et al; “Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate
intoneurons” Journal of Neuroscience Research 61, 364-370; 2000 ;
196. Wright D.E., Cheshier S.H., Wagers A.J., Randall T.D., Christensen J.L. si Weissman I.L.,
“Cyclophosphamide/granulocyte colony-stimulating factor causes selective mobilization of bone
marrow hematopoietic stem cells into the blood after M-phase of the cell cycle” , 2001 ;
197. Yamashita J., Itoh H., Hirashima M., Ogawa M., Nishikawa S., Yurugi T., Naito M., Nakao
K.si Nishikawa S., “Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular
progenitors”, Nature. 408, 92-96., 2000 ;
198. Yang L et al.; “In vitro trans-differentiation of adult hepatic stem cells into pancreatic
endocrine hormone-producing cells”; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 99,
8078-8083; 2002 ;
199. Zandstra P.W., Lauffenburger D.A. si Eaves C.J., “A ligand-receptor signaling threshold
model of stem cell differentiation control: a biologically conserved mechanism applicable to
hematopoiesis”, Blood. 96, 1215-1222, 2000 ;
200. Zhang Y., Li CD, Jiang XX, Li HL, Tang PH, Mao N., “Comparison of mesenchymal stem
cells from human placenta and bone marrow”, Chin Med J (Engl)., 117(6):882-7, 2004 ;
201. Zuk PA et al., “Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells”, Molecular
Biology of the Cell 13, 4279-4295; Dec 2002; Safford KM et al., “Neurogenic differentiation of
murine and human adipose-derived stromal cells”, Biochemical and Biophysical Research
Communications 294, 371–379; 2002 ;

69