C5.

Analiza acizilor nucleici pe baza

hibridizrii. Microarray
 Termodinamica acizilor nucleici

Termodinamica acizilor
nucleici consta n
studierea modului n
care temperatura
influeneaz structura
dublu catenar a
acidului nucleic
(ADNdc). Procesul de
separare a lanurilor se
numete topire
(melting).
 Hibridizarea

Hibridizarea este procesul de

stabilire a unei interacii non-
covalente ce depinde de
secven, ntre doua sau mai
multe catene complementare
ale acizilor nucleici

Hibridul dublucatenar se
numeste duplex.

Pot hibridiza numai

monocatene :
-
- oligonucleotidele (ex.
primeri, sonde),
-
- catenele ADN
-
- catena ARN
 Alinierea

n practica hibridizarea este realizat printr-un

procedeu numit aliniere n condiii adecvate de
temperatur, concentraie ionic i pH

Hibridizarea este condiionat de

complementaritatea bazelor azotate

Odat legate, catenele se pot disocia doar prin

creterea temperaturii

Sondele moleculare sunt fragmente de ADN

sau ARN, marcate sau nu, care recunosc
secvente complementare de pe o catena de ADN
supusa investigarii
 Denaturarea ADN

Denaturarea ADN este un proces prin care

acidul dezoxiribonucleic dublu catenar se
desface n doua catene separate prin ruperea
legturilor de hidrogen ntre baze

Termenul sugereaz un proces clasic de topire,

referirea fiind fcut la un proces care decurge
prin nclzirea amestecului de nucleotide, de i
termenul denaturare poate sa se refere i la
separarea catenelor de ADN indus de
substane chimice precum ureea
 Denaturare - Renaturare

ADN 2c

Denaturare Prin tratment termic sau chimic a

ADN
legturile de hidrogen se rup =
denaturarea ADN
monocatenele de ADN rcite
lent se pot reasocia pe baza
ADN partial denaturat complementaritii =
renaturare sau hibridizare.

Prin rcire brusc ADN ramane

sub forma
monocatenara
 Temperatura de topire (Tm)

Temperatura de topire (Tm) se definete ca

temperatura la care jumtate din catenele ADN
sunt n stare de nativa (dublu helix) i jumtate
au o configuratie monocatenara

Tm depinde de lungimea moleculei de ADN i

de compozitia nucleotidelor

Atunci cnd cele doua catene ale moleculei de

ADN sunt disociate (adic, molecula de ADNdc
exista sub forma a doua catene independente
de ADNmc), denaturarea a fost completa
 Aplicaii

Procesul de denaturare a ADN poate fi utilizat

pentru a analiza compozitia ADN

Deoarece perechea de baze citozina/guanina

este mai puternica dect perechea de baze
adenozina/timina, cantitatea de citozina si
guanin din genom (numit procent GC) poate
fi estimat prin msurarea temperaturii la care
ADN-ul genomic se topete

Temperaturile mai nalte sunt asociate cu un

coninut mare de GC.
 SSouthern Blotting

Este o metod folosit n mod

curent in biologia molecular
pentru a detecta o secvena
de ADN specific. Combin
transferul de fragmente de
ADN separate prin
electroforeza pe o membran
i detectarea fragmentului de
interes prin hibridizare cu o
sond

Southern, Edwin Mellor (5

November 1975). "Detection of
specific sequences among
DNA fragments separated by
gel electrophoresis". Journal of
Molecular Biology 98 (3): 503
517.
 Tehnica Southern blot
transferul ADN pe membrane de nitroceluloza

- Clivarea ADN cu enzime de restrictie si migrarea fragmentelor in gel de agaroza

- asamblarea sistemului de transfer: cuva cu solutie alcalina, gelul de agaroza si
- membrana de nitroceluloza plasate intre hartii de filtru
- Transferul ADN din gel pe membrana prin capilaritate
- Hibridizarea ADN transferat pe membrana cu sonde ADN sau ARN, marcate cu
- radioizotopi sau cu fluorocromi

Tehnica dezvoltata de Edwin Southern

Expresia genelor poate fi reglata in
timpul transcrierii

DNA RNA PROTEIN

TRANSCRIPTION TRANSLATION

Totalitateagenelorcaresunttranscrisesenumeste
transcriptom
 Northern Blotting

Este o tehnica de analiza a

ARN prin care este posibil
s se observe nivelele
specifice de expresie a
genelor n condiii normale
sau patologice. Tehnica
implic utilizarea
electroforezei la separarea
probelor de ARN iar apoi
detectare cu o sond
complementara hibridizata
la secvena int

A fost dezvoltat in 1977

de ctre James Alwine,
David Kemp, i George
Stark de la Universitatea
Stanford.
 Microarray

In tehnica microarray o matrice poate conine zeci de mii de sonde

Sondele sunt sintetizate i apoi ataate pe un suport prin legturi

covalente.
 Studiul expresiei genelor
Analiza ADN prin tehnica microarray

Molecule ADN monocatenare (sonde) sunt fixate pe un

suport (lama de sticla sau microcip) printr-o tehnica
robotizata
Pe un singur suport se pot atasa 10.000 de molecule
ADN (spots of DNA)
Se extrage din tesutul de investigat ARN mesager
(ARNm), se marcheaza cu un colorant fluorescent si se
incubeaza in mediu lichid pentru hibridizare cu sondele
ADN aflate pe suport (lama de sticla)
ARNm va hibridiza cu sondele ADN complementare
Lama este apoi scanata cu un laser care va induce
aparitia unor spoturi fluorescente
DNA microarray assay for gene
expression
 Principle of Microarray (Chip) Assay
Prehybridization Posthybridization

Synthetic DNA probes Probes with

hybridized DNA
DNA microarray
microcip
- Microarray permite analiza simultana a expresiei
ARNm provenit de la citeva mii de gene

- Pentru organismele cu genomul secventiat

integral (cum este genomul uman) microarrays
poate analiza expresia fiecarei gene

- Pot fi analizate 30.000 de gene in acelasi timp

- Inainte de introducerea acestei tehnici

automatizate, evaluarea cantitativa a ARN era
facuta cu Northern blot pe care se analizau
maxim 40 de probe
Analiza exprimarii genelor
Poate fi utilizata ca test de diagnostic, de ex.
pentru cancer

Poate indica modificari cantitative ale ARNm

legate de expresia genelor:

- in timpul ciclului celular

-in timpul dezvoltarii organismului de la embrion la
adult
-dupa expunere la diferiti stimuli
-In conditii patologice versus conditia normala
(cancer)

Ofera informatii despre functionarea unui sistem

ca intreg
 Affymetrix

Affymetrix este una din primele

companii care au produs
microarrays

- au dezvoltat tehnologia
microarray si sinteza bazata pe
chimie combinatorie. Aceste
metode au fost aplicate pentru a
construi matrici de nalt densitate
in oligonucleotide pe substraturi de
sticla sau silicon (chip-uri).
Affymetrix
 Interpretarea datelor pe microcip
Verde reprezinta hibridizare Control
Rosu reprezinta hibridizare Sample (proba de
testat)
Galben reprezinta combinatia dintre Control
si proba hibridizate in acelasi loc

Negru zone unde nu hibridizeaza nici Proba

nici Controlul.
DNA Microarrays