Sunteți pe pagina 1din 32

27-Mar-17

Biotehnologii
Extracţia
şi
cuantificarea
ADN-ului

Definiţie

Extracţia ADN-ului este o procedură (de rutină) utilizată pentru


izolarea şi purificarea ADN-ului din diferite amestecuri compexe
(ex. celulele din cadrul unui ţesut, matrici alimentare, probe de
sol).

În majoritatea aplicaţiilor din domeniile biologiei moleculare şi


ingineriei genetice, izolarea şi purificarea ADN-ului (în general a
acizilor nucleici şi proteinelor) reprezintă prima etapă specifică
de laborator.

EXTRACTUL conţine ADN genomic (nuclear), ADN mitocondrial


şi ADN provenit din cloroplaste (doar în cazul extractelor
vegetale).

Extractul mai poate conţine şi diferite substanţe nedorite,


denumite contaminanţi.

1
27-Mar-17

Definiţie

De obicei, termenii

izolare
purificare
extracţie

sunt utilizaţi interschimbabil.

Scop

obţinerea ADN-ului pur pentru…

… efectuarea unor analize/aplicaţii specifice


domeniului markerilor moleculari
(identificarea markerilor – biologie
moleculară; utilizarea în analize sau
diagnostic)

… obţinerea ADN-ului recombinat

2
27-Mar-17

Scop

Cele mai utilizate metode de analiză în biologia


moleculară sunt:
(1) bazate pe replicare moleculară (i.e. reacţia
PCR şi derivatele/variantele sale),
(2) tehnici bazate pe hibridare moleculară (ex.
Southern blotting, microarrays)

Protocolul de extracţie

Purificarea ADN-ului dintr-o probă se face


utilizând o combinaţie de metode/principii
fizice şi chimice.

3
27-Mar-17

Caracteristicile extractului de ADN

Cele mai importante caracteristici ale ADN-ului utilizat


în analizele PCR sunt calitatea, cantitatea şi puritatea.

Aceste caracteristici sunt determinate/evaluate după


etapele de extracţie şi purificare, utilizând metode
specifice.

Degradarea
(gradul de fragmentare)

ng/μl (μg/ml)

Prezenţa substanţelor inhibitoare


pentru PCR: proteine, polizaharide,
hemoglobină, fenoli, etanol,
izopropanol, uree, EDTA etc.

Caracteristicile extractului de ADN

Cele trei caracteristici ale extractului (calitatea,


cantitatea şi puritatea) sunt legate, de fapt, de
problemele care pot fi întâlnite în timpul
extracţiei/izolării/purificării:
• degradarea parţială sau completă a ADN-ului
• coizolarea polizaharidelor, care cresc viscozitatea,
făcând dificilă manipularea probelor sau
determinând inhibarea reacţiilor enzimatice
• coizolarea acizilor organici solubili, polifenolilor sau
altor compuşi secundari, care pot degrada ADN-ul
şi/sau inhiba reacţiile enzimatice.

4
27-Mar-17

Selectarea metodei de extracţie

Datorită variaţiei deosebite a proprietăţilor grupelor de


organisme, specii şi ţesuturi, este imposibilă utilizarea unui
singur protocol de izolare a acizilor nucleici. Astfel, larga varitate
de metode destiante extracţiei şi purificării acizilor nucleici
impune utilizarea unor criterii pentru alegerea celei mai potrivite:
(1) acidul nucleic ţintă (ADN sau ARN)
(2) localizarea acidului nucleic (i.e. ADN-ul) (ex. nucleu,
cloroplaste, mitocondrii)
(3) organismul sursă
(4) materialul iniţial (ex. seminţe, frunză, material procesat)
(5) rezultate aşteptate (ex. cantitate, calitate, timpul necesar)
(6) aplicaţii ulterioare (ex. PCR, secvenţiere, clonare, RT-PCR,
sinteză de ADNc).

Etape de bază

Protocoalele (metodele) de izolare diferă din multe puncte


de vedere
modalitatea de distrugere a ţesutului sau celulei
compoziţia şi tipul reactivilor utilizaţi
modalitatea de separare a ADN-ului de ceilalţi
constituenţi celulari
deoarece există numeroase elemente comune
principii
reactivi şi soluţii de lucru
module de lucru
care pot fi utilizate în combinaţii diferite.

5
27-Mar-17

Etape de bază

(1) eşantionarea (colectarea/prelevarea/obţinerea probei din care


se va extrage ADN-ul)
(2) mărunţirea şi omogenizării probei (ex. prin măcinare); reducerea în
dimensiui;
(3) liza membranelor celulare (ex. prin utilizarea detergenţilor care înglobează
lipidele din membrana celulară);
(4) izolarea, i.e. eliminarea constituenţilor nedoriţi din amestecul
rezultat în urma lizei celulare (ex.: îndepărtarea lipidelor cu ajutorul
detergenţilor; îndepărtarea proteinelor cu ajutorul proteazelor, prin precipitarea cu
acetat de sodiu, cu amestec de fenol-cloroform sau cloroform; „minicoloane‟);
(5) purificarea ADN-ului, i.e. eliminarea reactivilor utilizaţi pentru
extracţie (ex.: prin precipitare şi „spălare‟ cu etanol sau izopropanol;
„minicoloane‟);
(6) solubilizarea ADN-ului obţinut într-o soluţie tampon (buffer)
cu pH uşor alcalin (ex.: TE buffer; apă ultrapură).

Eşantionarea

Eşantionul (probă, sample)



reprezintă materialul (biologic) obţinut prin recoltatre/prelevare
şi trimis apoi la laborator pentru efectuarea analizelor/testelor

în practică, se poate referi la o parte dintr-un individ (ex. frunză
sau porţiune din aceasta, o celulă, un anumit volum de sânge sau
salivă), mai mulţi indivizi (ex. celule bacteriene dintr-o suspensie
sau indivizi dintr-o populaţie), masă de seminţe dintr-un lot mai
mare, masă de sol etc.

trebuie să fie reprezentativ pentru individul/populaţia/lotul
analizat

rezultatele cele mai bune se obţin când materialul biologic este
proaspăt şi tânăr, şi dacă recoltarea se face cu cât mai puţin timp
înainte de izolarea ADN-ului

6
27-Mar-17

Eşantionarea

Trebuie să avem în vedere:


1. unde efectuăm eşantionarea
2. numărul de eşantioane/probe necesare
3. strategia de eşantionare/colectare
4. care este partea (ţesutul) cea mai potrivită – materialul
(biologic) iniţial
5. etichetarea, păstrarea şi transportul materialului colectat

sit 1
Eşantionarea

Arealul de
sit 2
recoltare/eşantionare
-
zona de provenienţă a
indivizilor/probelor sau zona în
care se face eşantionarea poate
ridica anumite probleme de
logistică

te afli aici
probă

7
27-Mar-17

Eşantionarea

Numărul de eşantioane/probe necesare


-
de obicei, o probă corespunde unui individ; excepţie fac
loturile de materii prime (ex. seminţe) sau produse
procesate
-
populaţii relativ mici – sunt analizaţi toţi indiviţii
-
populaţii mari – nu este posibilă analizarea tuturor
indivizilor; se face o selecţie randomizată şi se formează un
eşantion, care trebuie să fie reprezentativ pentru populaţie
-
loturi – se selectează o porţiune redusă

Eşantionarea

Strategia de
eşantionare

8
27-Mar-17

Eşantionarea

Strategia de
eşantionare

Eşantionarea

Materialul iniţial cel mai potrivit


-
este influenţat de foarte mulţi parametri şi
poate varia foarte mult: frunze, seminţe şi orice
altă porţiune din plantă, salivă, organe interne
sănătoase sau afectate (animale), materii fecale,
ţesut fosilizat/uscat/conservat
-
să fie cât mai puţin degradat, să fie curat şi
lipsit de material biologic străin (ex. fungi,
insecte, epifite); în primele două situaţii,
izolarea ADN-ului poate fi împiedicată, iar în
ultima poate apare contaminarea
-
organisme vegetale – frunze tinere, eventual
etiolate
-
organisme animale – sânge, salivă
-
microorganisme – culturi celulare
-
pot exista mici diferenţe genetice între părţi
diferite ale aceluiaşi organism

9
27-Mar-17

Eşantionarea

Etichetarea, păstrarea şi transportul


materialului colectat
-
etichetarea corespunzătoare este foarte, foarte importantă
-
materialul proaspăt se poate păstra doar pe perioade scurte
şi este necesară refrigerarea (nu congelarea)
-
păstrarea pe perioade mai lungi necesită congelare, de obicei
la -80 °C
-
în vederea păstrării, materialul poate fi uscat sau liofilizat
(evaporare în vid și la temperaturi foarte scăzute); materialul
uscat sau liofilizat poate fi manipulat mult mai uşor,
comparativ cu cel proaspăt, dar calitatea extractelor poate fi
mai slabă
-
uscarea se poate face la temperatura camerei, forţat (ex.
etuvă) sau cu ajutorul unor agenţi desicanţi (ex. silica gel)
-
păstrarea materialului colectat se poate face şi în diverse
soluţii chimice (ex. NaCl-CTAB, etanol 95-100%, soluţie
apoasă de detergent)
-
transportul materialului biologic recoltat trebuie efectuat în
condiţii care să nu afecteze calitatea acestuia

Laboratorul

10
27-Mar-17

Laboratorul

Distrugerea ţesuturilor
şi a celulelor

Marea majoritate (excepţie sângele,


saliva, suspensiile celulare) a
protocoalelor de izolare a ADN-ului
necesită mărunţirea materialului
(ţesutului).

Pentru cantităţi relativ mici, foarte


utilizată este congelarea în azot
lichid şi mojararea. Pentru cantităţi
mai mari de material se poate utiliza
moara cu cuţite, moara cu bile sau
omogenizatorul.

11
27-Mar-17

Distrugerea ţesuturilor
şi a celulelor
Liza membranelor celulare se face
concomitent şi/sau imediat după
mărunţirea ţesutului. În cea de-a
doua parte, acţionează diverse
substanţe chimice. Adăugarea
reactivilor, după mărunţiere, trebuie
să se facă într-un timp cât mai
scurt, pentru evita dezgheţarea
materialului biologic, ceea ce duce la
degradarea ADN-ului de către
enzimele celulare. Problema
dezgheţării poate fi rezolvată prin
utilizarea ţesutului liofilizat sau
uscat.

Purificarea ADN-ului

Purificarea ADN-ului din lizatele celulare se face cu diverse tehnici (utilizate singure
sau în combinaţie) :

precipitare combinată cu separarea fazelor prin centrifugare


-
utilizarea unor reactivi specifici pentru precipitarea constituenţilor celulari sau a
acizilor nucleici (ex. fenol, cloroform, izopropanol, etanol, CTAB, SDS, protează,
RNază, diverse săruri) şi separarea şi recuparea fazei dorite prin centrifugare

legarea selectivă (adsorbţie) şi reversibilă a ADN-ului la o suprafaţă solidă


-
este, practic, o formă de cromatografie, iar suprafeţele solide pot fi reprezentate de
silica gel sau răşini schimbătoare de anioni; în prezenţa anumitor săruri
chaotropice (ex. tiocianat de guanidină) particulele menţionate au capacitatea de a
lega moleculele de ADN

legarea selectivă (adsorbţie) şi reversibilă a ADN-ului la o suprafaţă solidă


-
mediul care adsoarbe ADN-ul este reprezentat de particule magnetice (magnetic
beads/carriers); particulele au miezul magnetic şi un înveliş exterior care prezintă
afinitate pentru diferite molecule (ex. ADN, ARN)

ultracentrifugare în gradient de densitate


-
ex. CsCl

12
27-Mar-17

Protocoale/metode

CTAB-based DNA extraction


Fenol-chloroform extraction
“Quick and dirty” DNA extraction

Kit-uri comerciale:
DNeasy Plant Mini/Maxi Kit – Qiagen
NucleoSpin Food Kit – Macherey-Nagel
High Pure GMO Sample Preparation Kit – Roche
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Roche
Maxwell 16 Tissue DNA Purification Kit – Promega

etc.
etc.
etc.

CTAB

(1) CTAB - bromură de cetiltrimetil amoniu (cetyltrimethyl


ammonium bromide) – detergent cationic

(2) concepută de Murray and Thompson (1980), preluată de


Wagner et al. (1987), Doyle and Doyle (1987), Lipp et al.
(1999; 2001) ....................

(3) printre cele mai utilizate principii

(4) utilizată pentru extracţia şi purificarea ADN-ului din plante şi


alimente derivate din plante, fiind extrem de utilă în
eliminarea polizaharidelor şi compuşilor fenolici, substanţe ce
influenţează negativ puritatea şi calitatea soluţiei de ADN

(5) adaptarea metodei la o gamă cât mai largă de matrici

13
27-Mar-17

CTAB
Etapele metodei

(Mărunţirea probei) şi liza


celulară

Izolarea ADN-ului

Purificarea ADN-ului

CTAB
Liza celulară

După cum s-a menţionat deja, liza se face concomitent


și/sau imedit după mărunţirea şi omogenizarea
ţesutului. Proba mărunţită şi omogenizată este tratată
cu o soluţie tampon de extracţie (liză) ce conţine, în
principal, EDTA, Tris/HCl şi CTAB.

Toate membranele celulare au o structură generală ce


include molecule de lipide şi proteine; lipidele sunt
dispuse sub forma unui strat dublu în cadrul căruia
sunt intercalate moleculele proteice. Lipidele sunt
alcătuite dintr-un “cap” hidrofil şi o “coadă” hidrofobă.

Liza celulară este produsă de detergent (i.e. CTAB),


care are o structură bipolară asemănătoare lipidelor,
un pol fiind hidrofil, iar celălalt hidrofob. CTAB-ul din
soluţia de extracţie are rolul de a îngloba lipidele ce
intră în alcătuirea membranei celulare şi a celei
nucleare.

În momentul în care membrana celulară este expusă la


acţiunea CTAB-ului (din tamponul de extracţie), acesta
înglobează lipidele şi proteinele, permiţând eliberarea
ADN-ului genomic.

14
27-Mar-17

CTAB
Liza celulară

CTAB
Liza celulară

CTAB contribuie de asemenea la denaturarea şi disocierea proteinelor.


Există şi alţi detergenţi (ex. SDS) care pot fi utilizaţi în locul CTAB.

Tris/HCl (tris(hydroxymethyl)aminomethane) are rol de tampona soluţia de


extracţie, protejând ADN-ul de valorile extreme ale pH-ului şi inhibâd
activitatea diverselor enzime celulare.

Concentraţiile ridicate de săruri (ex. >1 M NaCl) asigură disocierea


proteinelor (în special histonice) de molecula de ADN.

EDTA (ethylenediaminetetraacetate) are efect chelatizant, leagând


(imobilizând) ionii metalici bivalenţi (ex. magneziul) care sunt cofactori
pentru DNaze (enzime ce degradează ADN-ul), şi determinând astfel
reducerea activităţii acestor enzime.

Soluţia tampon de extracţie/liză poate conţine şi agenţi reducători (ex. β-


mercaptoetanolul, acid ascorbic) pentru inhibarea reacţiilor de oxidare a
polifenolilor, ce afectează, direct sau indirect, ADN-ul.

15
27-Mar-17

CTAB
Proteinaza-K
Liza celulară

Etapa de izolare mai poate include şi tratamente cu


• RNaza A pentru degradează ARN-ului care este coizolat, de obicei, cu
ADN-ul
• Proteinaza K pentru disocierea histonelor – degradarea proteinelor care
complexează molecula de ADN
• pectinaze pentru degradarea polizaharidelor.

CTAB
Liza celulară

Tratamentele din etapa de liză celulară sunt


favorizate de temperaturi ridicate, de aceea
amestecul (proba mărunţită + tamponul de extracţie)
este, de obicei, incubat la aprox. 60-70 °C.

Urmează izolarea şi purificarea ADN-ului.

16
27-Mar-17

CTAB
Liza celulară

Prin centrifugare
sunt
sedimentate
debriurile
celulare mari
(faza solidă,
inferioară).
ADN-ul şi alte
molecule
(proteine, fenoli,
polizaharide etc.)
sunt prezente în
faza apoasă
(superioara),
care va fi
recuperată prin
pipetare şi
transferată în
etapa următoare.

CTAB
Izolarea

Următoarea etapă a protocolului, izolarea (numită deseori şi extracţie),


presupune separarea compuşilor polifenolici, a proteinelor, a altor
substanţe celulare şi, parţial, a polizaharidelor.

În prezenţa unei concetraţii reduse de săruri (< 0,5 M NaCl),


cloroformul denaturează proteinele şi facilitează separarea, prin
centrifugare,
(1) a fazei apoase, ce conţine ADN-ul, dar şi contaminanţi ca săruri,
polizaharide etc.
(2) de cea organică (cloroform + proteine); proteinele denaturate,
precipită, de fapt, într-o peliculă dispusă între faza apoasă şi cea
organică.

Izolarea (extracţia) cu cloroform se poate repeta de una sau două ori


pentru îndepărtarea completă a impurităţilor din faza apoasă.

Rolul cloroformului poate fi îndeplinit şi de fenol sau amestecuri de


fenol-cloroform, cloroform-alcool izoamilic.

17
27-Mar-17

CTAB
Izolarea

CTAB
Precipitarea

Soluţia apoasă este tratată cu un amestec de precipitare compus


din CTAB şi NaCl (în concentraţie de peste 0,8 M). Clorura de
sodiu poate fi înlocuită cu acetatul de sodiu care are o capacitate
mai bună de tamponare.

„pellet-ul‟ de ADN
poate conţine substanţe nedorite (contaminaţi):
ARN, polizaharide etc.

18
27-Mar-17

CTAB
Precipitarea

„pellet-ul‟
de ADN

CTAB
Precipitarea

19
27-Mar-17

CTAB
Purificarea

Complexul ADN-CTAB este apoi solubilizat prin creşterea concentraţiei de


săruri şi precipitat cu etanol şi/sau izopropanol. Prin tratamente succesive
cu soluţie de etanol cu concentraţie de 70% acizii nucleici sunt purificaţi de
sărurile rămase.

ADN-ul este insolubil în etanol şi precipită. Utilizarea etanolului 100%


determină coprecipitarea unor săruri şi polizaharide, alături de ADN. De
aceea, este necesară o etapă ulterioară de spălare a pellet-ului rezultat prin
precipitare, cu EtOH 70-80%. Acesta va precipita ADN-ul dar va spăla
sărurile.
În locul EtOH-ului, se poate utiliza izopropanol. Acesta are o eficienţă de
precipitare mai mare, dar este şi mai puţin volatil, necesitând o perioadă
mai lungă de uscare.

CTAB
Polifenolii

Organismele vegetale produc o gamă foarte largă de compuşi secundari:


(poli)fenoli, terpene, alcaliozi, flavonoide, polizaharide etc.
-
Fenolii şi polifenolii prezintă un interes deosebit datorită reacţiilor de
oxidare în care pot fi implicaţi. Produşii rezultaţi au de asemenea
capacitate oxidativă şi determină brunificarea extractelor, degradarea ADN-
ul şi proteinelor sau pot face ADN-ul inaccesibil pentru anumite enzime.
-
Evitarea efectelor polifenolilor se poate face prin:
• adsorbţia polifenolilor cu diverse substanţe (ex. BSA, PVP) ce pot fi
incluse în soluţia tampon de extracţie
• adăugarea în soluţia tampon de extracţie a unor inhibitori ai
fenoloxidazei (ex. DIECA)
• inhibarea oxidării cu ajuturol unor antixodanţi (ex. bisulfit de Na, acid
ascorbic, β-mercaptoetanol) adăugaţi în tamponul de extracţie
• creşterea volumului de tampon de extracţie va dilua concentraţia
polifenolilor şi va reduce efectele acestora.

20
27-Mar-17

CTAB
Polizaharidele

Organismele vegetale produc o gamă foarte largă de compuşi secundari:


(poli)fenoli, terpene, alcaliozi, flavonoide, polizaharide etc.
-
Polizaharidele (de tip pectic) sunt, de obicei, solubile în apă şi pot fi
coizolate cu ADN-ul. Prezenţa lor creşte viscozitatea extractului şi poate
inhiba activitatea enzimatică (ex. enzimele de restricţie, polimeraza).
-
Pentru îndepărtarea polizaharidelor din preparatele ADN se pot utiliza
diverse strategii:
• mărirea concentraţiei CTAB – determină precipitarea poliz.
• limitarea timpului de incubare la cald, în etapa de extracţie
• precipitarea ADN-ului la temperatura camerei
• tratamente cu enzime pectice (menţionată anterior)
• precipitarea cu alcooli în soluţie salină din etapa de purificare
(menţionată anterior); există diverse variante.
-
Trebuie avut în vedere faptul că polizaharidele reprezintă o clasă de
compuşi destul de variaţi, eficienţa strategiilor putând diferi în funcţie de
specie.

CTAB
Ex. protocol de lucru (1)

•se transferă 100 mg din proba omogenizată într-un tub de microcentrifugă


•se adaugă 300 μl de apă sterilă deionizată şi se amestecă cu spatula
•se adaugă 500 μl de tampon CTAB de extracţie şi se amestecă
•se adaugă 20 μl Proteinază K (20 mg/ml) se agită şi se incubează la 65 °C timp de 30-90 minute
•se adaugă 20 μl RNază A (10 mg/ml) se agită şi se incubează la 65 °C timp de 5-10 minute
•se centrifughează la 10000 rpm timp de 10 minute
•supernatantul se transferă într-un tub de microcentrifugă ce conţine 500 μl cloroform şi se agită timp de 30 sec
•se centrifughează la 10000 rpm timp de 10 minute pentru separara fazelor
•se transferă 500 μl din faza superioară într-un nou tub ce conţine 500 μl cloroform şi se agită
•se centrifughează la 10000 rpm timp de 5 minute
•se tansferă faza superioară într-un tub nou
•se adaugă două volume de soluţie de precipitare CTAB şi se amestecă prin pipetare
•se lasă în repaus timp te 60 minute la temperatura camerei
•se centrifughează la 10000 rpm timp de 5 minute
•se elimină supernatantul
•se dizolvă precipitatul în 350 μl NaCl (1,2 M)
•se adaugă 350 μl cloroform şi se agită timp de 30 secunde
•se centrifughează la 10000 rpm timp de 10 minute pentru separarea fazelor
•se transferă faza superioară într-un tub nou
•se adaugă 0,6 volume izopropanol şi se agită
•se centrifughează la 10000 rpm timp de 10 minute
•se elimină supernatantul
•se adaugă 500 μl de etanol 70% şi se agită uşor
•se centrifughează la 10000 rpm timp de 10 minute
•se elimină supernatantul
•pellet-urile de ADN uscate sunt redizolvate în 100 μl apă deionizată sterilă
•soluţia de ADN poate fi păstrată la frigider pentru cel mult două săptamâni, sau la congelator (-20 °C) pe
perioade mai lungi de timp

Somma, M., 2004, Extraction and purification of DNA In: Querci, Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede,
The analysis of food samples for the presence of genetically modified organisms, http://gmotraining.jrc.it/.

21
27-Mar-17

CTAB
Ex. 1. Reactivi şi soluţii de lucru

Tampon CTAB de precipitare Tamponul CTAB de extracţie


5 g/l CTAB – 1 g 20 g/l CTAB – 4 g
0,04 M NaCl – 0,5 g 1,4 M NaCl – 16,4 g
•se adaugă 100 ml apă deionizată 0,1 M Tris-HCl – 3,15 g
•se corectează pH-ul la 8,0 cu 1 M NaOH 20 mM Na2EDTA – 1,5 g
•se completeză până la 200 ml şi se autoclavează •se adaugă 100 ml apă deionizată
•se menţine la 4 °C pentru maxim 6 luni •se corectează pH-ul la 8,0 cu 1 M NaOH
•se completeză până la 200 ml
•se autoclavează
Apă deionizată sterilă
•se menţine la 4 °C pentru maxim 6 luni
Proteinză K 20 mg/ml
•se păstrează la -20 °C
NaCl 1,2 M
•se dizolvă 7,0 g NaCl în 100 ml apă deionizată
RNază A 10 mg/ml
•se autoclavează şi se păstrează la temperatura camerei
•se păstrează la -20 °C

Izopropanol
Soluţie de etanol 70% (v/v)
Cloroform •se amestecă 70 ml etanol pur cu 30 ml apă sterilă deionizată

Somma, M., 2004, Extraction and purification of DNA In: Querci, Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede,
The analysis of food samples for the presence of genetically modified organisms, http://gmotraining.jrc.it/.

CTAB
Ex. protocol de lucru (1)

22
27-Mar-17

CTAB
Ex. protocol de lucru (2)

•într-un tub Eppendorf de 1,5 ml se adaugă frunze şi azot lichid; se mojarează


•se adaugă 800 μl tampon 2 x CTAB de extracţie (temperatura camerei)
•se incubează la 64 °C timp de 60 minute
•se adaugă 600 μl cloroform:alcool izoamilic 24:1 (v/v)
•se amestecă uşor 2 minute
•se centrifugează la 10000 rpm timp de 10 minute
•supernatantul se trece într-un alt tub şi se adaugă 0,66 volume izoprpanol rece
•se centrifugează la 12000 rpm timp de 8 minute
•se adaugă alcool etilic 70%
•se centrifugează la 10000 rpm 5 minute
•se resuspendă în 100 μl TE

CTAB
Ex. 2. Reactivi şi soluţii de lucru

TE buffer TE buffer
•10 mM Tris-HCl pH 8 •Tamponul 2 x CTAB de extracţie
•1 mM EDTA pH 8 •100 mM Tris pH 8
•25 mM EDTA
•1,4 M NaCl
•2% (w/v) CTAB
+
Apă deionizată sterilă •0,2% mercaptoetanol

Alcool izoamilic

Izopropanoll

Cloroform

Soluţie de etanol 70% (v/v)


•se amestecă 70 ml etanol pur cu 30 ml apă sterilă deionizată

23
27-Mar-17

“Quick & Dirty”

von Post et al., 2003, A high-throughput


DNA extraction method for barley seed,
Euphytica 130: 255-260.

Protocol de lucru:
• obţinerea pudrei
• hidroxid de sodiu (NaOH) – degradarea pereţilor celulari
• incubare (apă fierbinte)
• neutraliziare cu TE buffer (0,03 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0)
• incubarea la +4 ºC pentru cel puţin 1 h pentru sedimentarea amidonului
(inhibator al reacţiei PCR)

Pentru PCR se utilizează doar supernatantul. Extractul conţine inhibitori şi


cantităţi reduse de ADN, fiind necesară diluarea sa (1:10 sau 1:20), respectiv
adăugarea uor cicluri PCR suplimetare (5-10). Benzile rezultate sunt slabe.

Avantaje practice ale metodei:


• protocol foare simplu; perminte procesarea unui număr foarte mare de probe
• nu este necesară semănarea pentru obţinerea materialului vegetal pentru extracţie ADN de calitate bună
• nu distruge seminţele

Dezavantaj major: se poate obţine doar un extract de calitate slabă.

optimă pentru analize simple, de rutină


ADN de calitate slabă (degradat)

Kiturile comerciale

Dezavantajele metodeor CTAB, fenol-cloroform, “quick and dirty” etc.

(1) lungi şi laborioase


(2) uneori rezultatele sunt nesatisfăcătoare
(3) utilizează anumite substanţe periculoase (ex. cloroform,
fenol) şi care pot influnţa analizele ulterioare (ex. fenolul
şi cloroformul inhibă reacţia PCR)

alternativa, utilizarea kit-urilor de extracţie produse companii


specializate (ex. Qiagen, Roche, Promega)

24
27-Mar-17

DNeasy Plant Kit (Qiagen)

Separare cu membrane/coloane pe baza afinităţii

High Pure GMO Sample Preparation Kit


(Roche)

Separare cu
membrane/
coloane
pe baza
afinităţii.

25
27-Mar-17

High Pure GMO Sample Preparation Kit


(Roche)

Separare cu membrane/coloane pe baza afinităţii

Particule magnetice

26
27-Mar-17

MagNA Pure LC (Roche)

Extracţie automatizată cu
ajutorul unor particule
magnetice şi pe baza afinităţii

Maxwell™ 16 (Promega)

Maxwell 16 (Promega)

Extracţie
automatizată
cu ajutorul
unor particule
magnetice şi
pe baza
afinităţii.

27
27-Mar-17

Centrifugare în gardient de densitate

Probleme

(1) obţinerea unei cantităţi reduse de ADN


(2) degradarea ADN-ului
(3) contaminarea cu reactivi sau compuşi organici
(proteine, fenoli, etc.)

28
27-Mar-17

Evaluarea parametrilor extractului


de ADN

(1) spectrofotometrie
(2) fluorimetrie
(3) (restricţia enzimatică şi) migrarea în gel de agaroză
şi marcarea cu bromură de etidiu

Cuantificarea spectrofotometrică

Toate moleculele absorb enegia cu


o lungime de undă specifică, iar pe
baza intensităţii absorbţiei se poate
determina concentraţia unei
substanţe dizolvate într-o soluţie.

ADN-ul, ARN-ul, oligonucleotidele


şi chiar mononucleotidele pot fi
măsurate în soluţii apoase diluate
sau nediluate prin înregistrarea
absorbanţei A (denumită şi
densitate optică, OD) în lumină
ultravioletă (sau în spectrul vizibil).

29
27-Mar-17

Cuantificarea spectrofotometrică

Spectrofotometria
-
utilizează transmisia luminii printr-o soluţie, pentru determinarea
concentraţiei unei substanţe dizolvate în soluţia respectivă
-
implică trecerea luminii cu o anumită lungime de undă printr-o probă
(i.e. soluţie), cantitatea de energie luminoasă transmisă fiind măsurată
cu o fotocelulă în cealaltă parte a probei.

Cuantificarea spectrofotometrică

Măsurătorile se fac în raport cu o probă neutră (apa sau soluţia


tampon în care este diluată proba).

Dacă proba este pură (lipsidă de proteine, fenoli, polizaharide


etc.) măsurătoarea spectofotometrică a cantităţii de radiaţie
ultravioletă absorbită de bazele azotate este simplă şi precisă.

30
27-Mar-17

Cuantificarea spectrofotometrică

Proteinele şi acizii nucleici absorb lumina din spectul UV, între lungimile
de undă 210 şi 300 nm:
(1) acizii nucleici (ADN şi ARN) prezintă absorbţie maximă pentru
lungimea de undă de 260 nm
(2) proteinele absorb la 280 nm
(3) absorbţia la 230 nm reflectă gradul de contaminare al probei cu
substanţe de tipul carbohidraţilor, peptidelor, fenolilor sau compuşilor
aromatici

Prezenţa contaminanţilor poate fi determinată prin calcularea unui raport


între citiri la lungimi de undă diferite. Rapoartele A260/A280 şi
A260/A230 sunt utilizate pentru estimarea purităţii acidului nucleic. ADN-
ul este pur dacă:
(1) raportul A260/A280 este de aproximativ 1,8; în cazul contaminării cu
proteine, raportul va fi semnificativ mai mic, iar cuantificarea precisă a
cantităţii de acid nucleic nu e posibilă
(2) raportul A260/A230 trebui să fie de aproximativ 2.

Cuantificarea spectrofotometrică

Trebuie menţionat faptul că, în cazul spectrofotometriei,


indentificarea sigură a contaminării soluţiei de ADN cu ARN nu
poate fi realizată. De asemenea, nu poate fi determinat gradul de
fragmentare al ADN-ului.

Pentru lungimea cuvetei de 10 mm şi lungimea de undă de 260


nm, absrobanţa A = 1 corespunde la:
• ~ 50 μm/ml ADN dublu catenar,
• ~ 37 μm/ml ADN monocatenar,
• ~ 40 μm/ml ARN sau
• ~ aproximativ 30 μm/ml nucleotide.

Conc. ADN (μg/ml) = (OD260) x (factorul de diluţie) x (50 μg ADN/ml)

31
27-Mar-17

Separarea electroforetică şi marcarea cu EtBr

(restricţie enzimatică +)
electroforeză +
marcare şi vizualizare

Cantitatea de acid nucleic poate fi


estimată prin comparare cu un interval
de concentraţii standard, pe baza
intensităţii fluorescenţei emise de
EtBr, după iradierea cu lumină UV.

Profilul obţinut permite, în principal,


evaluarea stării de degradare a ADN-
ului.

32