Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Biotehnologii
Extracţia
şi
cuantificarea
ADN-ului
Definiţie
1
27-Mar-17
Definiţie
De obicei, termenii
izolare
purificare
extracţie
Scop
2
27-Mar-17
Scop
Protocolul de extracţie
3
27-Mar-17
Degradarea
(gradul de fragmentare)
ng/μl (μg/ml)
4
27-Mar-17
Etape de bază
5
27-Mar-17
Etape de bază
Eşantionarea
6
27-Mar-17
Eşantionarea
sit 1
Eşantionarea
Arealul de
sit 2
recoltare/eşantionare
-
zona de provenienţă a
indivizilor/probelor sau zona în
care se face eşantionarea poate
ridica anumite probleme de
logistică
te afli aici
probă
7
27-Mar-17
Eşantionarea
Eşantionarea
Strategia de
eşantionare
8
27-Mar-17
Eşantionarea
Strategia de
eşantionare
Eşantionarea
9
27-Mar-17
Eşantionarea
Laboratorul
10
27-Mar-17
Laboratorul
Distrugerea ţesuturilor
şi a celulelor
11
27-Mar-17
Distrugerea ţesuturilor
şi a celulelor
Liza membranelor celulare se face
concomitent şi/sau imediat după
mărunţirea ţesutului. În cea de-a
doua parte, acţionează diverse
substanţe chimice. Adăugarea
reactivilor, după mărunţiere, trebuie
să se facă într-un timp cât mai
scurt, pentru evita dezgheţarea
materialului biologic, ceea ce duce la
degradarea ADN-ului de către
enzimele celulare. Problema
dezgheţării poate fi rezolvată prin
utilizarea ţesutului liofilizat sau
uscat.
Purificarea ADN-ului
Purificarea ADN-ului din lizatele celulare se face cu diverse tehnici (utilizate singure
sau în combinaţie) :
12
27-Mar-17
Protocoale/metode
Kit-uri comerciale:
DNeasy Plant Mini/Maxi Kit – Qiagen
NucleoSpin Food Kit – Macherey-Nagel
High Pure GMO Sample Preparation Kit – Roche
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Roche
Maxwell 16 Tissue DNA Purification Kit – Promega
etc.
etc.
etc.
CTAB
13
27-Mar-17
CTAB
Etapele metodei
Izolarea ADN-ului
Purificarea ADN-ului
CTAB
Liza celulară
14
27-Mar-17
CTAB
Liza celulară
CTAB
Liza celulară
15
27-Mar-17
CTAB
Proteinaza-K
Liza celulară
CTAB
Liza celulară
16
27-Mar-17
CTAB
Liza celulară
Prin centrifugare
sunt
sedimentate
debriurile
celulare mari
(faza solidă,
inferioară).
ADN-ul şi alte
molecule
(proteine, fenoli,
polizaharide etc.)
sunt prezente în
faza apoasă
(superioara),
care va fi
recuperată prin
pipetare şi
transferată în
etapa următoare.
CTAB
Izolarea
17
27-Mar-17
CTAB
Izolarea
CTAB
Precipitarea
„pellet-ul‟ de ADN
poate conţine substanţe nedorite (contaminaţi):
ARN, polizaharide etc.
18
27-Mar-17
CTAB
Precipitarea
„pellet-ul‟
de ADN
CTAB
Precipitarea
19
27-Mar-17
CTAB
Purificarea
CTAB
Polifenolii
20
27-Mar-17
CTAB
Polizaharidele
CTAB
Ex. protocol de lucru (1)
Somma, M., 2004, Extraction and purification of DNA In: Querci, Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede,
The analysis of food samples for the presence of genetically modified organisms, http://gmotraining.jrc.it/.
21
27-Mar-17
CTAB
Ex. 1. Reactivi şi soluţii de lucru
Izopropanol
Soluţie de etanol 70% (v/v)
Cloroform •se amestecă 70 ml etanol pur cu 30 ml apă sterilă deionizată
Somma, M., 2004, Extraction and purification of DNA In: Querci, Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede,
The analysis of food samples for the presence of genetically modified organisms, http://gmotraining.jrc.it/.
CTAB
Ex. protocol de lucru (1)
22
27-Mar-17
CTAB
Ex. protocol de lucru (2)
CTAB
Ex. 2. Reactivi şi soluţii de lucru
TE buffer TE buffer
•10 mM Tris-HCl pH 8 •Tamponul 2 x CTAB de extracţie
•1 mM EDTA pH 8 •100 mM Tris pH 8
•25 mM EDTA
•1,4 M NaCl
•2% (w/v) CTAB
+
Apă deionizată sterilă •0,2% mercaptoetanol
Alcool izoamilic
Izopropanoll
Cloroform
23
27-Mar-17
Protocol de lucru:
• obţinerea pudrei
• hidroxid de sodiu (NaOH) – degradarea pereţilor celulari
• incubare (apă fierbinte)
• neutraliziare cu TE buffer (0,03 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0)
• incubarea la +4 ºC pentru cel puţin 1 h pentru sedimentarea amidonului
(inhibator al reacţiei PCR)
Kiturile comerciale
24
27-Mar-17
Separare cu
membrane/
coloane
pe baza
afinităţii.
25
27-Mar-17
Particule magnetice
26
27-Mar-17
Extracţie automatizată cu
ajutorul unor particule
magnetice şi pe baza afinităţii
Maxwell™ 16 (Promega)
Maxwell 16 (Promega)
Extracţie
automatizată
cu ajutorul
unor particule
magnetice şi
pe baza
afinităţii.
27
27-Mar-17
Probleme
28
27-Mar-17
(1) spectrofotometrie
(2) fluorimetrie
(3) (restricţia enzimatică şi) migrarea în gel de agaroză
şi marcarea cu bromură de etidiu
Cuantificarea spectrofotometrică
29
27-Mar-17
Cuantificarea spectrofotometrică
Spectrofotometria
-
utilizează transmisia luminii printr-o soluţie, pentru determinarea
concentraţiei unei substanţe dizolvate în soluţia respectivă
-
implică trecerea luminii cu o anumită lungime de undă printr-o probă
(i.e. soluţie), cantitatea de energie luminoasă transmisă fiind măsurată
cu o fotocelulă în cealaltă parte a probei.
Cuantificarea spectrofotometrică
30
27-Mar-17
Cuantificarea spectrofotometrică
Proteinele şi acizii nucleici absorb lumina din spectul UV, între lungimile
de undă 210 şi 300 nm:
(1) acizii nucleici (ADN şi ARN) prezintă absorbţie maximă pentru
lungimea de undă de 260 nm
(2) proteinele absorb la 280 nm
(3) absorbţia la 230 nm reflectă gradul de contaminare al probei cu
substanţe de tipul carbohidraţilor, peptidelor, fenolilor sau compuşilor
aromatici
Cuantificarea spectrofotometrică
31
27-Mar-17
(restricţie enzimatică +)
electroforeză +
marcare şi vizualizare
32