BILOGIE JUDICIAR

AIT Laboratories Bucureti, 2011 978-606-8363-09-7x3

1

Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale Romne , Gorgan Vasile Srbu Bilologie judiciar / Gorgan, Srbu Vasile Bucureti: Editura AIT Laboratories s.r.l., decembrie 2011 ISBN: 978-606-8363-09-7x3

STRUCTURA I FUNCIILE MATERIALULUI GENETIC, SUPORT AL INFORMAIEI EREDITARE

1. ISTORIC

ACIZII NUCLEICI

1868 1871 Friederich Meischer descoper existena acizilor nucleici, prin analiza nucleilor leucocitelor i a esuturilor animale. 1912 Levene descoper pentoza i stabilete structura de baz a acidului dezoxiribonucleic, demonstrnd existena catenei n care legturile dintre radicalul fosfat i pentoz sunt de tipul 5`- 3`. 1924 Feulgen i Rosembach perfecioneaz metoda de colorare specific pentru ADN, cu fuxin bazic; 1944 relund un experiment efectuat de Griffith n 1928, Avery i colaboratorii au demonstrat c factorul activ, responsabil de determinismul caracterelor ereditare este ADN.

1.1 STRUCTURA ACIZILOR NUCLEICI Ideea potrivit creia, materialul genetic este transmis n descenden , este la fel de veche ca i conceptul privind motenirea caracterelor. La nceputul secolului XIX, cercetrile referitoare la structura biomoleculelor s -au dezvoltate foarte mult, culminnd cu momentul identificrii naturii chimice a materialului genetic. n deceniul 4 al secolului XX, rolul de material genetic era atribuit de cei mai muli cercettori, proteinelor. Baza acestei idei o reprezenta descoperirea potrivit creia, proteinele reprezint cel mai abundent component celular, ajungnd pn a 50% din greutatea uscat a celulelor. Ulterior, Meisher izoleaz nuclei din esuturile animale i identific o substan pe care a denumit -o nuclein. Meritul su a constat n demonstrarea faptului c aceast substan coninea foarte mult fosfor i nu coninea sulf aceasta fiind una din caracteristicile eseniale care difereniaz acizii nucleici de proteine. Mai trziu, pe baza identificrii bazelor azotate, s-a emis ipoteza tetranucleotidic, conform creia, ADN este o molecul format din alternana celor patru baze azotate: adenin, timin, citozin i guanin, proporia lor fiind de 1:1:1:1. bazndu-se pe aceast ipotez, cercettorii au artat c este imposibil ca aceste patru uniti nucleotidice s se combine n att de multe variante, nct s permit stocarea imensei informaii necesare formrii i funcionrii celulei vii. S-a presupus c cei 20 de aminoacizi eseniali existenin proteine, ofer mult mai multe posibiliti de combinare, astfel nct s-a considerat c proteinele ar putea juca rol informaional. Utiliznd cromatografia pe hrtie, biochimistul Erwin Chargaff, a analizat componena nucleotidic a macromoleculelor de ADN. Investigaiile sale au demonstrat N c proporiile celor patru baze azotate nu sunt egale (n celule prelevate de la indivizi aparinnd la specii diferite) i c baz procentul lor variazde la o specie la alta. Aceste constatri au sugerat c succesiunea nucleotidelor n macromolecul ele acidului dezoxiribonucleic, determin specificitatea informaional a acestuia. n toate probele analizate, numrul N de resturi adeninice a fost egal cu numrul de resturi 5 timidinice, iar numrul de resturi guanidinice fiind egal cu numrul de resturi citozinice: P C Macromoleculele acizilor nucleici sunt alctuite dintr-un numr mare de uniti, denumite nucleotide. O Fiecare nucleotid este alctuit dintr-un radical fosfat (radical al acidului ortofosforic) legat la C5 al moleculei de pentoz, legat la rndul ei de molecula unei baze azotate zahr (purinic sau pirimidinic). Deoarece conin deoxiriboz, nucleotidele componente ale ADN sunt denumite deoxiribonucleotide, iar cele din ARN conin riboz i se numesc ribonucleotide. Bazele azotate purinice sunt aceleai pentru ADN i ARN: OH adenina i guanina Bazele azotate pirimidinice sunt reprezentate de citozin 3 i timin pentru ADN, ier pentru ARN de citozin i uracil.

n cazul ambelor tipuri de acizi, nucleotidele sunt ansamblate prin legturi covalente, numite legturi fosfodiester presupun legarea unei grupri fosfat de la o nucleotid, la gruparea hidroxil a zahrului de la nucleotida anterioar.

n cazul ambelor tipuri de acizi, nucleotidele sunt ansamblate prin legturi covalente, numite legturi fosfodiester presupun legarea unei grupri fosfat de la o nucleotid, la gruparea hidroxil a zahrului de la nucleotida anterioar Polaritatea legturilor este n sensul 5` - 3`.

5 3
5-AATTGGCCGATC-3 3-TTAACCGGCTAG-5
Complementaritatea bazelor azotate: A T unite prin dou legturi de hidrogen C G unite prin trei legturi de hidrogen

3 5

1.2. ACIZII NUCLEICI SUBSTRAT AL INFORMAIEI GENETICE n anul 1944, Avery i colaboratorii public o lucrare fundamental pentru genetica molecular, n care au fost prezentate rezultate referitoare la natura chimic a aa-numitului principiu transformant descoperit la bacterii, studiul respectiv fiind de fapt o reluare n alte condiii a unor cercetri din 1928 realizate de Griffith. A injectat pneumococi viruleni de tip S la un lot de oareci i pneumococi neviruleni de tip R, la un alt lot. Cum de ateptat, oarecii din primul lot se mbolnvesc i mor.

Ulterior, a omort pneumococii viruleni prin ocuri de temperatur, iar resturile acestora au fost injectate unui lot de oareci, constatndu-se c acetia nu se mbolnvesc. Mai mult, a injectat unui alt lot, un amestec de pneumococi neviruleni de tip R i pneumococi viruleni de tip S, omori prin ocuri de temperatur i a constatat c oarecii se mbolnvesc i mor. Din animalele moarte, a izolat tulpini de pneumococ virulent, ceea ce demonstreaz capacitatea transformant a pneumococilor, n contact cu informaia genetic provenit de la pneumococii viruleni.

Cercetri similare au fost reluate ulterior, demonstrnd existena fenomenului de transformare i la alte genuri bacteriene (Bacillus sp., Escherichia sp. etc.). Experimentul Hershey Chase Bazat pe studii asupra bacteriei Escherichia coli i a bacteriofagului T2 Bacteriofagii au o structur special, fiind formai din capsid i genom fagic. La acel moment, erau puse la 32 punct metode de marcaj radioactiv a anumitor componente celulare numite biomolecule. Erau utilizai izotopii P 35 i S pentru marcajul acizilor nucleici i al proteinelor. Pe baza studiului ciclului de via al bacteriofagului T2, s-a constatat c dup ataarea la suprafaa peretelui celular, urmeaz o perioad cnd, aparent, n celul nu se ntmpl nimic, dar, la suprafaa bacteriei exist numeroase capside fagice. Ulterior, celula ncepe s fabrice componente fagice ce se asambleaz cu formare de bacteriofagi maturi, urmate de liza celulelor bacteriene i eliberarea bacteriofagilor. Pentru desfurarea experimentului, a fost preparat un mediu de cultur pentru bacterii, n care, toate 32 35 componentele cu fosfor conineau izotopi de P, iar componentele cu sulf, conineau izotopi de S. Mediul de cultur a fost ulterior inoculat cu Escherichia coli, bacteriile au crescut, s-au nmulit i datorit marcajului radioactiv al mediului, noile bacterii erau de asemenea marcate. Celulele bacteriene au fost colectate i trecute pe un mediu proaspt, nemarcat i infectat cu bacteriofagul T 2. Dup terminarea ciclului vital al bacteriofagului, cultura bacterian a fost omort, iar datorit marcajului bacteriilor, a fost obinut o descenden fagic radiomarcat. Aceast descenden, a fost ulterior utilizat la infectarea uneio noi culturi de Escherichia coli nemarcat. Dup un minim de contact, cnd se presupune c bacteriofagii aveau timp s se ataeze la celule i s-i infecteze materialul genetic, cultura a fost agitat mecanic, rezultnd desprinderea capsidelor de pe suprafaa bacteriilor.

n urma centrifugrii, n supernatant s-au separat capsidele, iar n depozit, celulele infectate. A fost ulterior msurat lungimea de und a radiaiei emise de supernatant, respectiv de celulele aflate n depozit 35 i s-a constatat c n supernatant exitau izotopi de S, iar n depozitul celular, doar semnal caracteristic izotopilor 32 de P. Ulterior, au fost aduse i alte argumente privind rolul genetic al ADN, unele de natur indirect, altele de natur direct. Dintre dovezile directe, putem meniona: Cea a rspndirii ADN n celul, aceasta fiind legat de un organit cu rol esenial n diviziune nucleul. s-a constatat c radiaia UV poate induce mutaii ce se manifest prin apariia unor modificri ale caracterelor organismului respectiv sau prin apariia de noi caractere. S -a constatat c frecvena maxim a mutaiilor se nregistreaz atunci cnd lungimea de und este de 260nm. Pentru ca o molecul s poat deine rolul de molecul informaional, trebuie s ndeplineasc patru condiii eseniale: S se poat replica; S poat stoca informaia; S poat exprima informaia stocat; S fie modificabil prin procese mutaionale. REPLICAREA - Constituie o etap esenial a ciclului celular, fiind o caracteristic fundamental a organismelor vii. - Presupune o dublare a cantitii de material genetic ce va fi distribuit celulelor fiice rezultate n urma diviziunii celulare. - Mitoza i meioza fac parte dintr-un mecanism general numit reproducere celular care are la baz replicarea ADN. 1.3. STOCAREA INFORMAIEI GENETICE Pentru ca o molecul s poat stoca informaie genetic, trebuie s poat codifica biochimic informaia necesar formrii unei celule sau a unui organism. Toate celulele unui organism, cu foarte mici excepii, conin toat informaia genetic necesar construirii acelui organism. La nivel de celul, este exprimat doar informaia necesar funcionrii celulelor resp ective.

2.

LEGILE EREDITII

2.1 EXPERIMENTELE EFECTUATE DE MENDEL Mendel a experimentat pe diverse specii de plante, aparinnd genurilor Hieracium, Phaseolus i Pisum, o atenie deosebit, ns, acordnd mazrii (Pisum sativum). A ales aceast specie, deoarece: este o specie autogam, ceea ce i-a permis urmrirea comportamentul hibrizilor obinui n descenden; a putut analiza puritatea genotipic a plantelor studiate, timp de 3 4 generaii. Dintre avantajele alegerii mazrii ca obiect de studiu, trebuiesc menionate: datorit autogamiei plantei, alterarea rezultatelor prin polenizri necontrolate, este exclus; perioada de vegetaie este scurt; trsturile fenotipice contrastante (dominante recesive) sunt distincte; sterilizarea plantelor se poate realiza uor; sunt multe soiuri n cadrul speciei; hibrizii dintre diferitele soiuri sunt fertili. 2.1.1. MONOHIBRIDAREA Hibridarea reprezint procesul de ncruciare ntre doi indivizi aparinnd aceleiai specii, genotipic puri (adic homozigoi), deosebii ntre ei prin manifestarea fenotipic a unui singur caracter. J. Gr. Mendel a utilizat, pentru monohibridare, dou soiuri de mazre: unul cu boabe de culoare galben i altul cu boabe de culoare verde. Reamintim c, nainte de a efect ua hibridarea, Mendel a perpetuat timp de 3-4 ani

fiecare soi, spre a se convinge c este stabil (c este pur genotipic). Recurgnd la castrare i fecundare artificial, n prima generaie hibrid, notat cu F1 (adic prima generaie filial - n latin filius, filia fiu, fiic), a obinut numai plante cu boabe de o singur culoare - galben.

G G

Prinii (P): Gameii (g):

Prima generaie (F1)

autofecundare 100% Indivizi de culoare galben

(F2)

Segregare fenotipic (Sf): Segregare genotipic (Sg):

3G 1Hd :

Prima constatare a lui Mendel a fost: toi hibrizii din prima generaie aveau o singur culoare a boabelor. Experimentnd cu alt caracter (pe aceeai specie), de pild forma boabelor - netede i zbrcite, a constatat c n F1 toi indivizii aveau boabe netede. Pe baza acestui experiment, Mendel a enunat Principiul uniformitii hibrizilor n generaia F1. Perpetund respectivii hibrizi, prin autofecundare, n c ea de-a doua generaie, Mendel a constatat reapariia fenotipurilor parentale (reapariia expresiilor fenotipice etalate de cei doi prini), n raport de aproximativ 3:1. n consecin, a fost enunat cel de-al doilea principiu - segregarea hibrizilor n generaia F2. Deci, Mendel a admis i precizat c n generaia F1 se manifest fenomenul de dominan i recesivitate, n sensul c este etalat doar una dintre posibilitile de exprimare a caracterului (cea dominant), cealalt rmnnd ascuns (recesiv ). Precizm c, pentru perpetuare, hibrizii din F1 sunt lsai s se autofecundeze, ceea ce nu presupune existena a doi parteneri. ntruct, n acel moment, nu se cunotea nimic despre cromosomi i gene (substratul material al informaiei ereditare), Mendel a folosit termenul de factori ereditari i a presupus, cu o extraordinar intuiie, c n fiecare celul a organismului, factorul ereditar determinant al unui caracter, se afl n doz dubl, n timp ce n celulele sexuale se afl n doz simpl. Schematic, situaia poate fi redat i astfel:

Evident, prin G se desemneaz factorul ereditar dominant, iar prin v factorul ereditar recesiv. Ulterior, Mendel a precizat c, dup fecundare i formarea zigotului, factorii ereditari nu se contopesc, ci doar se altur. n consecin, dup ce se formeaz din nou gameii, factorii ereditari se vor despri, fiecare trecnd ntr-un gamet. Astfel, concluzioneaz Mendel, gameii sunt puri din punct de vedere genetic. Aceasta este considerat prima lege elaborat de Mendel, numit: LEGEA PURITII GAMEILOR. 2.1.2. DIHIBRIDAREA

n a doua etap a experimentului, Mendel a recurs la ncruciarea ntre indivizi care se deosebeau prin expresia fenotipic a dou caractere - culoarea i forma boabelor. n acest scop, a utilizat soiul de mazre cu boabe netede i galbene, pe care l-a ncruciat cu soiul caracterizat prin boabe zbrcite i verzi. n prima generaie F 1 ca i la monohibridare, toi indivizii au fost uniformi - boabe netede i galbene. Deci, s-au manifestat fenomenele de dominan i recesivitate. n a doua generaie, F2, s-a manifestat segregarea, dar s-a constatat c, fiecare caracter segreg independent i, n consecin, este posibil recombinarea caracterelor i apariia de noi fenotipuri. Att forma boabelor ct i culoarea au segregat n raport de 3:1. n plus, au aprut i noi tipuri de plante - cu boabe netede i verzi, i cu boabe zbrcite i galbene. Prin G i N, s-au redat factorii ereditari dominani (determinani ai culorii galbene i ai for mei netede a bobului), iar prin v i z, s-au redat factorii ereditari recesivi (determinani ai culorii verzi i ai formei zbrcite a bobului)

Pe diagonala stnga jos - dreapta sus sunt plasai numai indivizi heterozigoti (pentru ambele caractere), pe diagonalele mici sunt heterozigoti ntr-un singur caracter (de fiecare dat altul fiind homozigotul dominant i altul homozigotul recesiv). Diagonala dreapta sus stnga jos, este diagonala homozigoilor. Prin urmare, din punct de vedere al constituiei ereditare, n hibridare, prin autofecundarea hibrizilor din generaia F1, ntlnirea probabilistic a celor patru tipuri diferite de gamei, asigur formarea a 16 descendeni, a cror constituie genotipic este de 9 tipuri i anume: 1/16 dublu homozigot dominant, 1/16 dublu homozigot recesiv, 2/16 homozigoi dominani pentru caracterul culoare i heterozigoti pentru form, 2/16 cu acelai raport de homozigoie/heterozigoie dar pentru cellalt caracter, 4/16 indivizi heterozigoti n ambele caractere, 1/16 homozigoi n ambele caractere dar unul recesiv, cellalt dominant, 1/16 cu cellalt caracter dominant (ambele homozigote), 2/16 indivizi heterozigoti pentru culoare i homozigoi recesivi pentru form i 2/16 indivizi homozigoi recesivi pentru culoare i heterozigoti pentru form. Sub aspect fenotipic, situaia se prezint astfel: 9/16 indivizi dominani (cu boabe galbene i netede), 3/16 dominani ntr-un caracter (boabe galbene i zbrcite), 3/16 dominani n cellalt caracter (boabe netede i verzi) i 1/16 indivizi recesivi n ambele caractere (boabe verzi i zbrcite). n concluzie, n dihibridare, caracterele segreg independent unul de altul. Aceasta este, de fapt, cea de -a doua lege stabilit de Mendel LEGEA SEGREGRII INDEPENDENTE A CARACTERELOR. Tipurile parentale de gamei sunt dependente de numrul de factori ereditari implicai n hibridare . n n principiu, fiind vorba de o relaie strict matematic, vom avea 2 tipuri de gamei, n reprezentnd numrul perechilor de gene, pentru care individul purttor este heterozigot. Recurgnd la o simbolistic universal, n care notm determinantul unui caracter cu A pentru expresia dominant i a pentru cea recesiv, cellalt determinant cu B i b, conform relaiei matematice precizate anterior, situaia se va prezenta astfel: - n cazul monohibridrii, prinii vor fi AA i aa, cu gameii A i respectiv a. Hibridul va fi Aa, cu gameii A i a. - n cazul dihibridrii, prinii AABB i aabb vor avea gamei de tipul AB i ab, hibridul fiind AaBb. De data aceasta ns, avnd n vedere legea segregrii independente a caracterelor, gameii vor fi AB, ab, Ab i aB (deci, n 2 2 =2 =4 tipuri de gamei). 2.2. UNIVERSALITATEA LEGILOR LUI MENDEL Experimente similare celor efectuate de Mendel au vizat i alte specii - un exemplu n acest sens, l constituie ncrucirile dintre cobai de culoare diferit: tipul slbatic, de culoare gri i tipul albinos (aprut prin mutaie). n hibridarea dintre o femel de tip albinos (cu blana de culoare alb), cu un mascul slbatic (c u blana de culoare gri), indivizii din generaia F1 aveau n totalitate blana de culoare gri. Indivizii din F 1 ncruciai ntre ei, au dat generaia F2, n care s-a produs segregarea celor dou fenotipuri n raportul de 3 gri : 1 alb. n F1 s-a manifestat dominana fenotipului unui printe (i recesivitatea celuilalt), fenotipizarea genei estompnd fenotipizarea alelei. n consecin hibrizii erau uniformi (sub aspect fenotipic). n F 2 s-a produs

segregarea, fenotipic, n raportul de 3 dominant la 1 recesiv. Evident, ca i la mazre, fenomenul a fost explicat pe baza legii puritii gameilor. n concluzie, se poate afirma faptul c: legile descoperite de Mendel au caracter de universalitate, fiind aplicabile pentru plante i animale, inclusiv pentru om. 2.3. ABATERI DE LA LEGILE LUI MENDEL 2.3.1. SEMIDOMINANA (DOMINANA INCOMPLET) Dac notm gena dominant cu A, iar alela ei, gena recesiv, rezultat prin mutaie cu a, n cazul hibridrii AA x aa va rezulta individul heterozigot, Aa. Aa cum precizam, de obicei gena A domin gena a, fenotipul heterozigotului Aa fiind identic celui al homozigotului AA. Sunt ns i cazuri n care AA Aa. Un exemplu clasic, este cel al hibrizilor dintre varieti de Mirabilis jalapa, observat n experimentele efectuate de C. Correns (n 1912). ncrucind varietatea cu floare de culoare roie, cu varietatea avnd flori de culoare alb, n F 1 s-au obinut indivizi uniformi dar toi cu flori roz. ncrucind aceti indivizi ntre ei, n F2 s -au obinut indivizi cu flori roii (25%), cu flori roz (50%) i cu flori albe (25%) (deci un raport de segregare de 1:2:1, heterozigoii fiind fenotipic diferii de ambii homozigoi). n F3 indivizii din F2 care aveau flori roii, interncruciai, au dat doar descendeni cu flori roii, cei cu flori albe, doar descendeni cu flori albe, iar descendena celor cu florile roz a segregat n continuare, n raportul de 1:2:1. n acest caz (al motenirii culorii florii), absena dominanei este explicat prin mecanismele metabolice ale formrii pigmentului rou. Pigmentul se formeaz printr -o succesiune de reacii enzimatice. Gena, notat cu I n cazul de fa (de la ivory = alb), determin producerea pigmentului rou, iar alela i determin absena pigmentului (nu determin producerea lui). n genotipul heterozigotului Ii se asigur o concentraie redus a enzimei ce determin sinteza pigmentului. La o concentraie redus a enzimei (probabil 1/2 din concentraia normal ntlnit la homozigotul II), sinteza pigmentului este, de asemenea, re dus n timpul dezvoltrii florii, deoarece pigmentul este produs n cantiti fixe i limitate de gena I.

Un asemenea efect nu apare ns n toate sistemele, deoarece 1/2 din cantitatea de enzim este suficient pentru a asigura sinteza unei cantiti adecvate de pigment, determinnd manifestarea fenotipului dominant, n cazul heterozigoilor. Pe de alt parte, chiar n cazul fenomenelor tipice de dominan/recesivitate s -au constatat manifestri de semidominan. Spre exemplu, chiar n cazul hibridrilor efectuate de Mendel, cnd se ncrucia soiul de mazre cu bobul neted cu soiul cu bobul zbrcit, prin examinri microscopice s -a constatat c i alela w (de la whnkled = zbrcit) i imprima efectul, n sensul c numrul i forma granulelor de amidon difer la indivizii WW, Ww i ww. Deci, heterozigotii Ww nu sunt identici cu homozigoii WW. Acetia din urm conin multe gruncioare de amidon, mari i rotunde, ceea ce confer boabelor capacitatea de a reine apa i a se umfla uniform. Boabele soiului zbrcit (ww) au mai puine gruncioare de amidon, neregulate ca form i mrime, fapt pentru care pierd apa i se zbrcesc. Heterozigotii Ww sunt intermediari ntre cele dou soiuri. Prin urmare, fenomenul fiziologic de baz implicat n acest caz este c el al producerii enzimei responsabile de sinteza amidonului. Exemple de manifestare a semidominanei pot fi date pentru multe alte specii de plante sau animale. De pild, n ncruciri ntre soiuri de Zea mays cu bob albastru i cu bob galben, n F1 rezult indivizi cu boabe violet. n F2

segregarea este de 1 albastru: 2 violet: 1 galben. n literatura de specialitate, pentru segregarea de acest fel se folosete expresia "segregare de tip Zea" (1:2:1), tocmai spre a o deosebi de segregarea tipic (tip Pisum, 3:1). n lumea animal, un exemplu bine cunoscut de semidominan este cel referitor la rezultatul hibridrii ntre o ras de gini cu penajul negru i o ras cu penajul alb, hibridare n urma creia rezult tipul Andaluzia, cu penajul de culoare albstruie. n F2, din ncruciarea ntre indivizi ai tipului Andaluzia, iau natere indivizi cu penaj negru (25%), indivizi tip Andaluzia (50%) i indivizi cu penaj alb (25%). Evident, tipul Andaluzia nefiind constant, nu se poate vorbi de rasa Andaluzia (rasele la animale i soiurile la plante trebuie s fie stabile ereditar). 2.3.2. CODOMINANA Codominana reprezint un fenomen genetic complex datorat n esen, polialeliei. Cel mai elocvent exemplu este furnizat de situaia grupelor sanguine umane, mai ales cele din sistemele ABO i MN. n codominan se constat un comportament difereniat al alelelor, n sensul c unele dintre ele se afl n raport de dominan i recesivitate n timp ce altele sunt codominante, n sensul c au "trie" egal i contribuie n mod egal la fenotipizarea unui nou caracter. n 1900, K. Landsteiner a remarcat c prin amestecul globulelor roii prelevate de la o persoan, cu serul sanguin prelevat de la o alt persoan, se produc dou fenomene diferite - n unele cazuri, amestecul nu are repercusiuni, iar n altele se soldeaz cu aglutinarea globulelor roii. Prin aprofundarea cercetrilor s -a constatat c n serul sanguin uman exist dou tipuri de anticorpi (notai cu anti A i anti B, sau i ) i dou tipuri de antigeni (notai cu A i B) pe globulele roii. Pe criteriul prezenei sau lipsei celor dou categorii de molecule s -a ajuns la concluzia c oamenii aparin la patru grupe sanguine, notate cu A, B, AB i 0. De fapt alelele determinante ale A B A B grupelor sanguine, notate n unele nomenclaturi cu l , l i l, n altele cu L , L i I (n onoarea lui Landsteiner), determin sau nu sinteza unor mucopolizaharide (protein identic + grup terminal de zahr, care difer) localizate pe suprafaa globulelor roii. A B Alela L determin sinteza polizaharidului A, alela L determin sinteza polizaharidului B, iar alela l recesiv nu A A A B B B determin sinteza nici unui polizaharid. n consecin, indivizii L L i L l produc antigenul A, indivizii L L i L I produc antigenul B, n timp ce indivizii ll nu produc antigeni (globulele lor roii sunt fr polizaharide). Interesant A A B B A B este faptul c descendena cuplului L L x L L (care va fi L L ) produce ambele tipuri de polizaharide, adic ambii A B antigeni (A i B). Acesta este tocmai fenomenul de codominanta, adic alelele L i L sunt dominante (fiecare) asupra alelei l, dar sunt codominante una fa de cealalt, adic ambele contribuie n mod egal la determinarea unui nou fenotip (AB, n cazul de fa). n consecin, grupele de snge din sistemul ABO pot fi redate schematic astfel:

Cunoaterea grupei sanguine a unui individ este extrem de important, din dou considerente - medical i juridic. Sub aspect medical, cunoaterea grupelor sanguine este obligatorie n cazul transfuziilor. n situaia n care antigenul A vine n contact cu anticorpul (adic globulele roii de la un individ din grupa A intr n contact cu serul sanguin al unui individ din grupa B), anticorpul (proteina) se leag la antigen (polizaharid) i l inactiveaz. Concomitent, se produce agregarea (aglutinarea) globulelor roii. n consecin, transfuziile de snge pot fi efectuate doar n sensul redat n schema urmtoare:

0 A B

AB

10

Grupa 0 este donator universal iar grupa AB este primitor universal. Grupa A poate dona grupei A i AB i poate primi de la A i 0. Grupa B poate primi de la B i 0 i poate dona grupelor B i AB. Fiind genic determinate, evident, A B A grupele sanguine sunt ereditare. Cele trei gene alele L , L i l ocup acelai locus pe cromosomii omologi. Alela L A1 A2 prezint mai multe mutaii, dou dintre ele fiind mai frecvente L i L , ntre ele existnd un raport de A1 A2 dominan (gena L domin gena L ).

2.3.3. SUPRADOMINANA Reprezint fenomenul datorit cruia heterozigoii depesc ambii prini n fenotipizarea unor caractere (mai ales cantitative, cum ar fi habitusul, productivitatea, inclusiv viabilitatea), ca o component a capacitii de a da rspunsuri adecvate la presiunea seleciei. Schematic, supradominana poate fi redat astfel: AA < Aa > aa

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 AA Aa aa

Fenotipizarea hibridului Aa intermediar, comparativ cu prinii

12

10

0 AA Aa aa

Fenotipizarea hibridului Aa n supradominan Se consider c n supradominan sunt implicate mai multe gene cu caliti aditive. Supradominana reprezint rezultanta interaciunii a dou alele, rezultant ce face ca heterozigoii s se situeze n afara amplitudinii de variabilitate a fiecruia dintre cei doi homozigoi. Selecia favoriznd heterozigoii, asigur frecvena constant a unei gene. ntr-o populaie care nu este consangvinizat, cel mult 50% dintre indivizi pot fi heterozigoi pentru un anumit locus. Numai atunci cnd exist supradominan pentru un anumit caracter (pentru o anumit pereche gen-alel), consangvinizarea i ncruciarea pot realiza ceea ce selecia fr consangvinzare nu poate. n condiii "normale" de dominan i recesivitate, cel mai bun genotip este homozigotul dominant, toi indivizii unei copulaii putnd fi adui, prin selecie, n stare homozigot. Dovezile relative la supradominan sunt, de obicei, de dou tipuri (Falconer, 1967) i anume: directe i indirecte. Dovezile directe provin din compararea homozigoilo r cu

11

heterozigoii, iar dovezile indirecte sunt furnizate de studiul consecinelor supradominanei atunci cnd afecteaz proprietile genetice ale unei populaii. Ambele categorii de dovezi cunosc unele complicaii, datorit fenomenelor de nlnuire, n sensul c trebuie fcut o distincie clar ntre supradominana manifestat pentru un singur locus i supradominana manifestat pentru un ntreg segment cromosomial. Prima situaie este mai puin frecvent. Supradominana pentru segmentele de cromosomi este mult mai frecvent i este prezent chiar atunci cnd locii implicai, luai separat, nu prezint fenomenul de supradominan. 2.3.4. GENELE LETALE O alt cauz a modificrii raportului mendelian de segregare n descendena hibrizilor din F 1 o constituie prezena genelor letale. Noiunea de gen letal a fost introdus de L. Cuenot (1911). El a observat c ncrucind oareci de culoare galben, ntotdeauna n descenden rezult un amestec de indivizi de culoare galben i de alt culoare, n rap ort de 2 : 1. Rezultatele au impus dou concluzii, n primul rnd, faptul c descendena segreg ceea ce nseamn c oarecii galbeni sunt heterozigoi, iar n al doilea rnd, segregarea fiind continuu n raport de 2 : 1 i descendena indivizilor de culoare galben segregnd mereu, nseamn c o parte dintre descendenii indivizilor de culoare galben i anume cei homozigoti (a cror descenden ar trebui s nu segrege), nu iau natere. Prin urmare, gena dominant n stare homozigot este letal. Sacrificarea femelelor gestante a confirmat aceast presupunere, deoarece s-au identificat embrioni mori care corespundeau ca numr procentului indivizilor necesari pentru asigurarea raportului de segregare de 3 : 1. Dac notm gena pentru culoarea normal a blnii cu a i mutanta care determin apariia culorii galbene cu Ay (y de la cuvntul englezesc yellow = galben), situaia se va prezenta astfel: y Indivizii galbeni heterozigoi au genotipui A a. Prin ncruciarea lor rezult: Aa x Aa y A a Ay a y y y A A (25%) + 2A a (50%) + aa (25%) nseamn c, n mod continuu, indivizii A A mor n stare embrionar. Genele letale pot fi identificate dup gradul manifestrii lor (n genetic se folosete termenul de penetrant) i anume: - gene letale propriu-zise, cu penetrant de 100%, care produc moartea tuturor descendenilor; - gene semiletale, cu penetrant de 50% avnd ca rezultat moartea a circa 50% dintre indivizi; - gene subvitale, cu penetrant de 30% i procent similar de inducere aletalitii. O alt clasificare a acestor gene se face pe criteriul stadiului ontogenetic n care i instaleaz efectul. Din acest punct de vedere, ele pot fi: - gene letale gametice sau haplofazice, care determin moartea gameilor; - gene letale zigotice sau diplofazice, care determin dispariia zigotului (deci fecundarea are loc, dar zigotul nu este viabil. n funcie de cromosomii pe care sunt plasate, genele letale pot fi: a. autosomale (plasate pe autosomi) b. heterosomale (plasate pe heterosomi, adic pe cromosomii sexului) Fenomenul letalitii genice nu este caracteristic doar animalelor, ci a fost descris i la plante. Spre exemplu, la Zea mays (porumb) s-au identificat 15 gene diferite care, n stare homozigot, blocheaz formarea clorofilei i, n final, fotosinteza. Plantele de acest tip ajung albinotice i fiind incapabile de asimilaie, mor.
y y y y

3. CROMOSOMUL EUCARIOT 3.1. NUMRUL CROMOSOMILOR LA EUCARIOTE Reprezint un caracter de diagnoz, dei deine o larg amplitudine de variabilitate. Numrul de cromosomi variaz ntre 2, la Ascaris megalocephala i cteva sute, la Amoeba proteus. Pentru caracterizarea unei specii, sub aspectul numrului de cromosomi, se folosesc simbolurile: x, n, 2n i NF: - 2n reprezint numrul de cromosomi din celulele somatice ale indivizilor oricrei specii eucariote; - n reprezint numrul haploid de cromosomi, caracteristic celulelor gametice (sexuale) ale indivizilor speciilor eucariote.

12

De obicei, n cadrul unui gen, totalitatea speciilor provine dintr -o specie ancestral, prin evoluie divergent. Procesul a implicat, printre altele i modificarea numrului de cromosomi, prin autopoliploidizare, pseudopoliploidizare, aneuploidizare, amfipoliploidizare. Numrul cromosomial de la care s -a plecat, reprezint numrul cromosomial de baz, notat cu x. La diploidul de origine, numrul de baz coincide cu numrul haploid (x = n). Evident, x rmne acelai pentru triploid, tetraploid etc, n modificndu -se n concordan cu 2n. De exemplu, n cadrul genului Papaver, secia Oxytona exist speciile Papaver bracteatum (2n = 14, n = 7, x = 7), Papaver orientale (2n = 28, n = 14, x = 7) i Papaver pseodo-orientale (2n = 42, n = 21, x = 7). Este clar c n variaz n funcie de 2n, n timp ce x (numrul fundamental de cromosomi) rmne acelai, cel e trei specii fiind 2x, 4x i 6x. Exist i situaii n care, o serie poliploid nu provine printr-o poliploidizare real, ci prin pseudopoliploidie. De exemplu, dac o specie are 2n=8 cromosomi metacentrici, mediani, submediani sau subterminali, prin fisi onarea (ruperea) cromosomilor dintr-o pereche, dou, trei sau toate perechile, vor rezulta 2n=10, 2n=12, 2n=14, sau 2n=16 cromosomi. Dac, ns, se va determina cantitatea de ADN per nucleu, se va constata c aceasta rmne constant, la toate aceste variante cromosomiale. Pe de alt parte, dac se vor numra braele cromosomiale, din cariotipurile efectuate pe baza numerelor menionate, se va constata c cifra este aceeai - 16. Prin urmare NF (numrul fundamental de brae) a rmas constant, sugernd c speciile din respectiva serie nu sunt aneuploizi sau poliploizi adevrai ci pseudoaneuploizi sau pseudopoliploizi:

+
Cromosomi mediani

+
Cromosomi telocentrici

fisionare

2n=2, NF=4

2n=4, NF=4
3.2. STRUCTURA INTERN A CROMOSOMILOR LA EUCARIOTE

Referitor la compoziia chimic a cromosomilor eucariotelor, s-a stabilit c principala component o constituie substana cromatic, denumit cromatin, alctuit, la rndul ei, din acizi nucleici i proteine, n proporii egale. S-a constatat c partea proteic este reprezentat de proteine histonice, de cinci tipuri, notate cu H1, H2A, H2B, H3 i H4. Aceste cinci histone sunt prezente n cromosomii tuturor eucariotelor. Interesant este faptul c aceste proteine au secven aminoacidic asemntoare la majoritatea plantelor i animalelor, ceea ce poate sugera c gena care este responsabil de biosinteza lor are o origine foarte ndeprtat i nu a suferit prea multe mutaii, pe ntregul parcurs al procesului filogenezei. Ulterior, s-a constatat c patru dintre proteinele histonice (H2A, H2B, H3 i H4) formeaz octameri, particule n jurul crora se nfoar ADN, care, mpreun cu proteina H1 alctuiesc nucleosomul. Nucleosomul este considerat, deocamdat, structura de baz a cromosomului. Analizele cu raze X au dovedit c nucleosomii sunt legai ntre ei prin ADN neasociat cu histone, fiind sub forma unei fibrile de aproximativ 10 nm grosime. Aceast fibril se continu de la un capt la altul al cromosomului, pliat (mpachetat) foarte compact. Cromosomii sunt, deci, cromatin suprastructurat. Cromatina este numele conferit substanei totale din care sunt alctuii cromosomii. n ciclul mitotic sau meiotic, cromatina se coloreaz rapid i este uor vizualizat. n interfaz este vizibil doar heterocromatina, partea vizibil n timpul diviziunii primind numele de eucromatin. Regiunile heterocromatice ale cromosomilor sunt considerate ca fiind heteropicnotice (n limba greac pycnosis =dens). Intensitatea colorrii lor poate varia de la o etap a ciclului celular la alta. Un alt element important, l constituie paradoxul valorii C. Prin valoarea C se nelege cantitatea total de ADN din genomul unei specii. Dei numrul exact de gene dintr -un genom nu a fost stabilit la toate speciile, sunt estimri pentru multe dintre eucariote. La procariote, marea majoritate a cantitii de ADN este coninut n gene. De aceea, valoarea C, la un organism procariot, este aproximativ egal cu numrul de nucleotide coninute de gene. La eucariote ns, valoarea C este mult superioar numrului de nucleotide din gene, de unde concluzia c o mare parte din acidul dezoxiribonucleic nu conine gene. Dar cantitatea de acid dezoxiribonucleic influeneaz i mrimea cromosomilor, de unde concluzia c nu poate fi stabilit o relaie direct ntre dimensiunea cromosomilor i numrul genelor existente pe ei. De aceea unele specii au valoarea C mult mai mare dect altele strns nrudite cu ele, dei numrul genelor este destul de apropiat, dac nu chiar similar. Aceast diferen dintre valoarea C i numrul genelor din celulele unui organism, este denumit paradoxul valo rii C. Diferena se datoreaz faptului c o mare parte din ADN este nalt repetitiv sau servete ca spaiator ntre gene i funcioneaz ca regulator al activitii genelor. La om, de exemplu, aproximativ 5% din totalul ADN conine codoni pentru secvenele aminoacizilor.

13

Nucleosomii reprezint peste 95% din greutatea cromatinei i sunt considerai a fi unitile structurale de baz ale cromatinei. n celulele eucariotelor cu organizare superioar, nucleosomii conin aproximativ 195 - 200 pb de ADN, un octamer histonic alctuit din cte dou molecule de H2A, H2B, H3 i H4 i o molecul de H1. De asemenea, exist i un fragment de 27pb (perechi de baze), care nu este direct asociat cu octamerul histonic. Acest fragment conecteaz, ntre ei, doi nucleosomi consecutivi. Lungimea ADN pliat n jurul octamerului histonic este destul de variabil, de la 170 pb la Saccharomyces cerevisiae, la 241pb n spermatozoizii ariciului de mare. De asemenea, anumite esuturi, din organismul psrilor sau al mamiferelor, pot av ea lungimi diferite ale acidului dezoxiribonucieic, deosebite de cele din alte celule ale aceluiai individ. nc nu s -a oferit o explicaie acceptabil pentru aceste abateri de la regul, dar se presupune c ele au rol bine definit n reglarea activitii genice. n majoritatea cazurilor ns, octamerul histonic are n jurul lui aproximativ 1,7 ture de ADN (adic 146 pb). Octamerul histonic mpreun cu cele 146 perechi de nucleotide alctuiesc miezul, smburele, particula central a nucleosomului, cunoscut sub numele de nucleosomal sau histone core particle. Astfel, n conformitate cu acest model, exist un disc de 11nm diametru i 5,5 - 6nm nlime, care are 1,7 ture de acid dezoxiribonucleic, cu o grosime de 3nm, nfurat n jurul lui. Cele 146 de pb al e acidului dezoxiribonucleic nu sunt repartizate uniform n jurul octameruiui histonic. Tetramerii 2H3 i 2H4 interacioneaz cu macromolecula de ADN pe care o rsucesc n jurul lor. S-a demonstrat c partea central a octameruiui are histonele H3 i H4, celelalte dou histone fiind la exteriorul lor (pe feele discului). Integritatea octameruiui este asigurat de interaciunile puternice ntre moleculele de histone (H2A interacioneaz cu H2b i cu H3, H2B cu H2A i cu H4, H3 cu H4). ntre moleculele histonelor menionate exist diferene, att n ceea ce privete greutatea molecular, ct i n ceea ce privete numrul de aminoacizi coninui.

Concluzionnd, putem preciza c exist trei etape n structurarea unui nucleosom i anume: - particula central a nucleosomului, alctuit din 146 pb i octamerul histonic (cte 2 molecule de H2A, H2B, H3 i H4); - particula central plus nc 22pb, dnd un total de 168 pb, plus histona Hi, la care se adaug nc aproximativ 32pb (ajungndu-se la un total de aproximativ 200 pb), formeaz nucleosomui. Trebuie precizat c, deocamdat, nu este precis stabilit dac exist o singur molecul H1, per nucleosom. Lungimea linkerilor dintre cromatosomi variaz att de la specie la specie, ct i de la un tip cellul ar la altul. S-au descris linkeri n lungime de numai 8pb, dar i linkeri de 114pb. Nucleosomul complet conine, spre deosebire de inima nucleosomului, dou ture complete de ADN. Se mai afirm c structura i rolul nucleosomilor difer n regiunile genetic active de cele din regiunile inactive. Interaciunile dintre ADN i histone, n cadrul nucleosomului, sunt de natur electrostatic, implicnd prile aminice, cu bazicitate crescut, din lanurile de arginin i lizin, precum i unele legturi slabe ale histonelor bazice, cu prile fosfat ale ADN. Nucleosomii mpreun cu acidul dezoxiribonucleic linker alctuiesc o fibr cromatic de 11 nm grosime care se spiralizeaz, la rndul ei, dnd un solenoid de 30nm grosime. n solenoid nucleosomii sunt aranjai ntr-un helix de stnga, cte 6 pe tura de helix, cu o grosime a spiralei solenoidului egal cu diametrul nucleosomului - adic 11nm. Examinnd solenoidul pe direcia axului, observm nucleosomii aranjai radial, conform schemei:

14

Structurarea ulterioar a cromatinei (organizarea solenoidului), pentru a forma cromosomii vizibili n metafaz (sau regiunile cromosomiale heteropicnotice vizibile i n interfaz), este suficient de bine cunoscut i explicat. Prerile, ca i argumentele, celor mai muli cercettori converg ctre concluzia n conformitate cu care, fibra cromatic de 30nm grosime se pliaz i formeaz bucle, asigurnd astfel structurarea cromosomilor. Dinamica spiralizrii, de la solenoid la cromosomul metafazic, este conform cu concepiei referitoare la structura intern a cromosomului. De aceea, o etap n compactarea cromosomului este asigurat prin nfurarea ADN n jurul miezului nucleosomal i, apoi, prin spiralizri care duc la formarea solenoidului. Se asigur, astfel, o rat a mpachetrii de aproximativ 40 de ori. Deseori, restul compactrii se asigur prin alte procese. Au fost propuse, n acest sens, mai multe modele care pot fi grupate n dou mari categorii i anume: a - condensarea helicoidal (rsucirea) a fibrei de 30 nm; b - cutri ulterioare, transversale i longitudinale, repetate, care au ca rezultat formarea de bucle (n englez loop = bucl). Cromosomii metafazici reprezint condensarea cromatic maxim (observat la cromosomii eucariotelor). Rolul acestor formaiuni este acela de a organiza i mpacheta macromolecula gigantic de ADN, permind segregarea ctre nucleiii celulelor fiice. Cromosomii metafazici, care sunt eliberai de aproximativ 99% din coninutul lor histonic, i pstreaz ADN n form aproximativ constant (asemenea cromosomilor iniiali, intaci), probabil tocmai din cauz c ADN este ataat, n numeroase puncte, la scheletul proteic nonhistonic intern. Acest schelet const, n primul rnd, din dou proteine, desemnate prin Sc1 i Sc2, cu greuti moleculare de 170 kD i, respectiv, de 135 kD. Sc1 este, de fapt, Topoizomeraza II, buclele radiale ale ADN fiind ataate la aceast protein, n punctele numite SAR (engl. scaffolding attaching regions - regiuni de ataare la schelet). Structura scheletului este meninut prin interaciuni metaloproteice, prezena agenilor chelatori determinnd dispariia acestei structuri. La Drosophila melanogaster buclele sunt ataate de SAR n cromosomii interfazici, fiind poziionate n poriunile nontranscrise ale ADN. Domeniile libere ale buclelor conin poriuni transcriptibile active, reglate de poriuni de ADN asociate cu SAR. Buclele au lungimi cuprinse ntre 4 - 13kb (kilobaze) i conin mult mai mult informaie dect este necesar pentru codificarea sintez ei unei proteine. Fibra de cromatin, destins n interfaz, reprezentnd cromosomii interfazici, are un diametru de 240nm. S -a sugerat c tranziia de la fibra solenoid de 30 nm grosime, la fibra de 240nm grosime se realizeaz prin buclarea solenoidului (mpachetarea solenoidului n bucle). n consecin, se admite c mpachetarea propriu -zis se realizeaz prin rsuciri care duc la constituirea cromosomului metafazic (vizibil n timpul metafazei), de 700nm grosime i de 7,5 ori mai scurt dect corespondentul lui interfazic.

4. TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULAR UTILIZATE N INVESTIGAII JUDICIARE 4.1. PCR REACIE DE POLIMERIZARE N LAN (Polymerase chain reaction)

15

Ideea despre posibilitatea desfurrii reaciei de polimerizare n lan, a avu t-o G. H. Khorana, un specialist n biologia molecular, nscut pe 9 ianuarie 1922, n Punjabi i devenit cetean American in 1966. Acesta a primit premiul Nobel in 1968 mpreun cu Robert W. Holley i Marshall W. Nirenberg pentru studiile n interpretar ea codului genetic i rolul su n sinteza proteinelor. A fost primul care a sintetizat oligonucleotide i a izolat ADN ligaza, enzim care leag bucile de AND ntre ele. n 1971, Kleppe i colaboratorii, descriau conceptul teoretic prin care folosind AND polimeraza i primeri reprezentai de oligonucleotide s-ar produce numeroase copii de ADN. Pentru biologii de la aceea vreme acest concept a parut de nerealizat datorit dificultii si costului de producie a oligonucleotidelor, lipsei unei ADN polimeraze termostabile i a unui thermocycler. n 1985, cnd problema oligonucleotidelor a disparut, a avut loc prima demonstraie a procesului de polimerizare in lan realizat de Saiki i colaboratorii si. Totui, era necesar s se injecteze ADN polimeraz proaspt la fiecare ciclu de elongare iar theormocycler -ele nu erau pe deplin dezvoltate. n consecint, pasul cheie n realizarea potenialului reaciei de polimerizare, era dat de utilizarea unei ADN polimeraze termostabile, fapt care a fost descris de Saiki n 1988. n acelai timp, n California la corporaia Cetus, Kary Mullis, un biochimist genetician american era preocupat de gsirea unei soluii prin care s realizeze n laborator, n eprubete, sinteza de ADN pornind de la o singur sau de la cateva molecule de ADN. n primvara anului 1983, n timp ce conducea o Honda Civic, din San Francisco spre Mendocino pe autostrada 128, dungile de la circulaie trasate pe autostrad i-au aprins imaginaia i chiar i-au oferit soluia construirea unor molecule mici de aproximativ 20 de nucleotide care s se potriveasc la catenele matri, ntr -un loc unde ele prezint complementaritate i de la ele s porneasca sinteza replicilor. Asemenea molecule mici le -a numit primeri. Pentru descoperirea sa, Mullis a primit o recompens de 10.000 $ de la corporaia Cetus i premiul Nobel pentru chimie n anul 1993. Conceptul original pentru PCR, a fost, ca multe idei geniale, un amalgam de componente care deja existau. Sinteza oligonucleotidelor i utilizarea acestora cu ajutorul ADN polimerazei pentru producerea copiilor erau proceduri standard. Noutatea n conceptul lui Mullis a constat n utilizarea a dou oligonucleotide opuse pentru amplificarea spatiului cuprins ntre cele dou. Dei Mullis a fost pe deplin creditat pentru invenia original PCR, succesul aplicaiei cum o stim noi astzi, a necesitat o dezvoltare considerabil de ctre colegii si de la corporaia Cetus, mai ales cei din laboratorul lui Henri Erlich i de la asistentul su F. Faloona, n special la descoperirea unei enzimi termostabile i la procedeul de purificare a ADN. n afar de problemele legate de reacia n sine, au mai existat provocri n ceea ce privete apartenena ideei PCR-ului. Numai n Statele Unite ale Americii exist peste 600 de brevete referitoare la probleme legate de PCR. Aceast colecie de brevete este format dintr-o varietate de entiti cum ar fi: agenii guvernamentale, diferite corporaii, inventatori individuali i unele universitai. Metoda original a fost brevetat de Cetus Corporation, n anul 1984. Dei au existat numeroase brevete nu toate au rmas n picioare. Prima lovitur mpotriva brevetelor PCR a fos t dat de corporaia Promega (situat n Madison, Wisconsin, corporaie care produce reactivi i alte produ se pentru comunitatea tiinific). Hoffmann La Roche a depus o plngere mpotriva corporaiei Promega pe data de 27 octombrie 1992 atacnd brea unui contract pentru vnzarea Taq ADN polimerazei, privind anumite aspecte descoperite de Hoffman. Promega a n egat acuzaiile aduse i a cerut, printre multe alte lucruri, ca brevetul ce descria caracteristicile enzimelor purificatoare termostabile s le aparin. Dup proces, n anul 1999, tribunalul Statelor Unite a decis c corporaia Promega a demonstrat prin metode concludente c Hoffmann La Roche a avut un comportament nedrept i de neiertat deoarece ,printre multe alte lucruri, au retinut informaii fa de Oficiul pentru Brevetare, au fcut declaraii neltoare i reclamaii false, susinnd c experiment ele care au dus la aceste descoperiri s-au desfurat n laboratoarele acestora cnd de fapt nu a fost deloc aa. Tribunalul a decis c aceste omiteri sau mrturii false au fost intenionate pentru a induce n eroare Oficiul pentru Brevetare. Asemenea probleme au avut loc i n Australia i Europa. De exemplu n data de 12 octombrie 1997, Oficiul Australian pentru Brevetare susinea c toate revendicrile privind descoperirile legate de Taq polimeraza nativ i polimerazele ADN care s-au format din alte specii Thermus,descoperiri gsite ntr -un brevet aparinnd companiei Hoffmann La Roche, erau nefondate. Oficiul Australian pentru Brevete a decis c enzima a fost purificat anterior n Moscova, fapt publicat de Kaledin. n Europa n data de 30 mai 2001 div izia opusa a Oficiului European pentru Brevetare susinea c ravendicrile privind brevetul pentru descoperirea enzimelor terostabile erau de fapt incomplete deoarece le lipsea un pas inventiv important n ceea ce privete publicaia anterioara aparinndu -le lui Kaledin i Chient, ca i cunotinele generale cunoscute n acest domeniu de activitate la vremea la care a fost depus cererea pentru brevetare.

16

Brevetele PCR au fost atacate de ctre Dr. Gobin Khorana i colegii si pe baza unor descoperiri reali zate la inceputul anilor 1960 sfritul anilor 1970. Aceste descoperiri nu se refera la procesul PCR n sine dar privete amplificarea i reaciile ciclice, aspecte implicate n PCR. Descoperirile Dr. Khorana au inclus urmtorii pai care se regsesc n m etoda PCR: extensia unui primer asociat la o template, separarea catenelor i reasocierea primerilor la template pentru repetarea ciclului. Dei Dr. Khorana nu i-a brevetat munca, acesta a lsat-o publicului. La acea vreme procesul de amplificare nu putea fi folosit pentru amplificarea acizilor nucleici i tehnica nu a fost aprobat ca o metod comercial datorit costului exorbitant determinat de lipsa oligonucleotidelor sintetizate i a enzimelor termostabile. Exist multe astfel de procese legate de apartenena ideeilor i dei tiina aa zisei reacii de polimerizare este bine cunoscut, povestea legal asociat PCR -ului este n cea mai mare parte nenteleas i ntr -o continu schimbare deoarece un brevet aparine unui inventator pn cnd un tribunal susine altceva. Kary Mullis i toi ceilali cercettori au ajutat la realizarea primilor pai ai PCR -ului ca mai apoi s se dezvolte o explozie de descoperiri n numeroase domenii. O dat cu descoperirea PCR a devenit posibil analiza ADN din resturi fosile i rmie de cadavre umane, din vechime. A devenit, totodata, posibil analiza celor care au decedat de curand i nu au fost identificai nainte de nmormntare. Genetica medical a mers chiar mai departe n timp cu tehnica PCR. Dup ce a murit John Dalton n 1844, cercettorii au prelevat o parte de esut din ochii acestuia. Renumitul chimist britanic, John Dalton era cunoscut pentru ncapacitatea sa de a deosebi rou de verde i rozul de albastru. Acesta a cerut investigaii post mortem pentru aflarea cauzei. O examinare recenta a ADN-ului extras din esutul prelevat din ochii acestuia i amplificat, cu grij, prin PCR, a artat c lui Dalton i lipsea o gen pentru realizarea unuia din cei trei fotopigmeni eseniali pentru perceperea normala a culorilor. n anul 1994, s-a consemnat o epidemie ciudat de boal virotic n Sud -Vestul SUA, cunoscut sub numele de boala celor patru coluri. Boala s-a rspndit rapid printre americanii nativi, provocnd hemoragii severe, pneumonie i boli de rinichi care au dus la 35 de mori din 52 de cazuri. Analizele au depistat un virus cunoscut sub numele de hantavirus, de la numele rului Hantaan din Coreea, unde este endemic. S -a extras ADN de la virusuri ale aceleiai familii virale cultivate i s-au realizat primeri, spre a realiza probe ADN specifice hantavirusului. Aceste probe au permis identificarea agentului viral al bolii din America, elaborndu -se o cale sigura de diagnosticare, nainte de izolarea i cultivarea virusului cauzator bolii. Moleculele fosile sunt astzi analizate cu implicaii mai mari dect prefigurase Michael Crichton n celebra sa carte Jurassic Park. Aceste molecule fosile prelevate de la specii disprute deschid largi ferestre spre trecutul biologic al Terrei, oferind posibilitatea de a reconstitui felul n care se prezenta viaa cu milioane de ani n urm. Obinerea de ADN din materialul arheologic i din specimene aflate ca piese n muzeele de tiine ale naturii ofer perspectiva de a rspunde la multe ntrebri despre nrudirile animalelor, migraia vechilor popoare, ratele evolutive ale speciilor de mult disprute, etc. Studiul ADN al speciilor Vechi face obiectivul Paleontologiei moleculare i reprezint o alt aplicare practic a tehnologiei ADN. A fost realizat i clonarea ADN de la o rud a zebrei, numit quagga, din Africa de Sud, victim a exterminrii n mas de ctre vntorii europeni, la 1800. Ultimul animal a murit n anul 1883, ntr -o gradin zoologic din Amsterdam. Tot ceea ce a rmas de la aceast specie au fost cele 23 de animale mpiate, din muzeele Europei. n anul 1984, grupul de cercettori condus de Alan Wilson, de la Universitatea din California, a extras o mica cantitate de ADN, dintr-o piele de quagga, veche de 140 de ani. ADN a fost clonat i s -a dovedit a avea o lungime de 229 nucleotide, adica mai puin de o milionime din genom. Cum la vremea respectiv, tehnologia PCR nu era nc aplicabil, acest ADN a fost nserionat n plasmide bacteriene i multiplicat n vivo, spre a fi amplificat. Dar, s -a reuit obinerea unei cantiti de ADN cu ajutorul creia s-a continuat analiza molecular. Aceasta a artat c quagga era o subspecie a zebrei de cmpie i nu o rud a calului sau o specie aparte de zebr, cum se credea. n anul 1985, Svante Pabo, biochimist de la Universitatea Uppsala, a obinut ADN din rmiele unei mumii egiptene,vechi de 2400 de ani. A fost amplificat ADN extras din mumie i s -au secveniat 3400 de baze azotate. n anul 1989, Bryan Sykes, Robert Hedges i colaboratorii, de la Universitatea Oxford, au dat ceasul evoluiei i mai napoi, extrgnd ADN din oase fosile umane, datnd de acum 5500 de ani. Amplificarea acestuia s -a realizat prin PCR. n anul 1990, Darwin si Prockop, de la Jefferson Medical Center, din Philadelphia, au realizat extracie i amplificare de ADN din fragmentele de oase craniene produse n urma mpucturii primului preedinte american Abe Lincon i pstrate n Muzeul Naional al Sntii i Medicinei, mpreun cu urmele de snge de pe cama, precum i uviele de pr ale lui Lincoln, n ideea de a identifica gena sindromului Marfan, dup numele medicului francez Antonin Marfan, care a descris sindromul acesta, n anul 1896. Sindromul are la baz dereglri ale esutului conjunctiv care determin anomali n sistemul scheletic, la ochi i n sistemul cardiovascular, genernd susceptibilitate la anevrisme aortice, dilatarea aortei putnd fi fatal. Analizele nu au fost nsa finalizate pentru gena care era responsabil de acest sindrom pentru c nu era, nc, identificat. Dar, n anul 1991, a fost descoperit cauza genetic a sindromului Marfan i anume mutaia genei care

17

codific pentru proteina fibrilin, responsabil de asigurarea triei i staturii esutului conjunctiv. La pacienii cu sindrom Marfan, esutul conjunctiv este lipsit de suportul su molecular esenial. n anul 1992, cercettorii de la Universitatea Stanford, din California, au extras ADN din albina fosil, iar cercettorii Muzeului American de Istorie Natural, din New York, au extras ADN din termite fosile. n ambele cazuri, specimenele de insecte au fost conservate n bucti de chihlimbar, excelent conservate, acestea constituind un material ideal pentru studii de paleontologie molecular. Studiul ADN din specii vechi sau disprute ofer date de o importana excepional pentru biologul evoluionist, deoarece permite stabilirea originii reale a speciilor actuale, refacerea arborilor filogenetici, identificarea cauzelor interne ale extinciei speciilor etc. Biologii moleculari de la Universitatea Oxford au studiat ADN din mormintele anglo-saxone din secolul al XVlea, spre a vedea dac acetia au venit din Germania, cum sugereaz tradiia, sau sunt mai nrudii cu romanii, care au venit naintea lor. Ali antropologi moleculariti utilizeaz analizele ADN spre a identifica ramaiele de brbai sau de femei, mai ales la vrsta copilriei, n vederea elaborrii unor studii privitoare la organizarea social a oamenilor primitivi i selecia practic pentru un sex sau altul. Studiul mamuilor, mastodonilor i al altor mamifere gigantice terestre are semnificaie n identificarea spectrului microorganismelor patogene, n vederea stabilirii cauzelor dispariiei lor. Studiul ADN viral fosil poate fi util paleontologilor, spre a inelege epidemiile moderne, la speciile actuale. Analiza ADN bacterian din mumiile umane poate arunca lumina asupra rspndirii unor boli infecioase. Se poate, astfel, gsi rspuns la dilematica problem a aducerii tuberculozei n Lumea Nou, de ctre exploratorii anilor 1500, sau aceasta a existat acolo nainte. n anul 1994, s-a dat rspuns la aceast ntrebare. Cercettorii de la Universitatea Minesota au extras i identificat ADN de la bacilul tuberculozei din plmnii unei mumii peruane, care a trit n anii 1000, nainte de aezarea europenilor acolo. Astfel, aparut la nceputul anilor 80, Reacia de Polimerizare n Lan (PCR) este att de utilizat n zilele noastre n nenumrate domenii, nct s-a uitat meritul su revoluionar . tiina aa numitei Reacii de Polimerizare n lan este astzi foarte bine cunoscut i ntlnit n multe laboratoare. Reacia de Polimerizare n Lan permite o rapid amplificare a secvenelor ADN, chiar i atunci cnd materialul de iniiere este un ADN puternic degradat, acesta fiind utilizat n studii de antropologie molecular i paleogenetic, cum ar fi analiza ADN recuperat din oase fosile, din mumii sau din esuturi formolizate. Se poate realiza amplificarea ADN-ului chiar i dintr-o singur celula. Practic, PCR-ul reprezint o form de clonare in vitro ce poate genera i modifica fragmente de lungimi i secvene bine definite ntr-o simpl reacie automatizat. Metaforic vorbind, metoda permite s fie gsit acul in carul cu fn, deoarece prin ea, o singur gen dintre nenumaratele gene purtate de o molecul de ADN poate fi reprodus in cteva ore in miliarde de copii identice; ceea ce unei celule, in starea sa cea mai activ proliferativ (celula canceroas) i -ar trebui o lun de zile, pentru a realiza acelai lucru. Probele ADN si Reacia de Polimerizare in Lan sunt descoperiri ce au fost puse imediat in practic, n medicina legal i n identificarea genelor responsabile de boli ereditare. ADN-ul prelevat din materialul biologic lsat la locul crimei (snge, sperm, buci de piele, fire de pr cu rdcin) poate prezenta cea mai singur prob n incriminarea fptaului. Astfel, detectivul ADN devine infailibil. n criminalistic se poate dovedi c ADN-ul prelevat din scheletul unui individ uman necunoscut, decedat de mult vreme, poate constitui baza identificrii acelui individ. Detectivul ADN a devenit un interpret de cea mai mare importan, in elucidarea aspectelor controversate din antropologie i evoluie, deoarece actualmente sunt puse la punct tehnici de izola re i clonare ADN din specimene fosile, care dateaz de milioane de ani.

4.1.1. PRINCIPIUL REACIEI DE POLIMERIZARE N LAN 4.1.1.1 Principii generale Reacia de Polimerizare n Lan este o metod foarte sensibil de amplificare, n care se realizeaz miliarde de copii identice a unei anumite gene a moleculei de ADN, n numai cteva ore, sistemul putnd fi contaminat foarte uor de elemente ale genelor ADN amplificate anterior sau de particule externe . Posibilitatea de contaminare n reaciile de amplificare este un aspect cu implicaii deosebite, att n aplicaii de cercetare ct i n cele cu specific diagnostic. n ciuda sensibilitii deosebite, PCR este victima propriului su succes. Pot aprea reac ii fals pozitive prin acizii nucleici contaminai datorit puterii de amplificare incredibile a reactiei. Contaminarea noilor probe cu ADN amplificat anterior este o problem important a laboratoarelor n care se execut PCR. Un singur aerosol poate conine pn la 24.000 de copii de ADN amplificat.

18

Reacia de polimerizare n lan permite manipularea directa a secvenelor de acizi nucleici, putndu -se realiza astfel secvenierea unui fragment ADN (determinarea ordinii de succesiune a bazelor azotate n molecula de ADN), determinarea variaiilor existente ntre diferite molecule ADN, modificarea secvenei moleculelor de acizi nucleici de interes. Este o tehnica ingenioasa bazat pe capacitatea ADN-polimerazei de a copia o caten ADN prin elongarea catenelor complementare, iniiat de o pereche de amorse oligonucleotidice adecvate. Teoretic fiecare ciclu dubleaz cantitatea de ADN int. Comportamentul i manipularea ADN polimerazei a fost o concentrare a eforturilor pentru a nelege felul n care materialul genetic este copiat, reparat i motenit. Se poate porni cu o cantitate extrem de mica de ADN, de la o singur sau cateva molecule de ADN ce trebuie amplificat, denumit ADN int.Acest ADN int ce urmeaz a fi amplificat are n mod curent sub 45 Kilobaze. Reacia de polimerizare n lan se desfaoar n eprubet ( in vitro ), avnd nevoie de urmtorii reactivi: template ADN ce urmeaz a fi amplificat, primerii necesari amplificrii unui anumit sector din templateul ADN inta, deoxiribonucleotide sub form de trifosfai (dATP, dGTP, dTTP si dCTP) care pot fi dozai n soluie apoas prin spectofotometrie UV la 260 nm (acestea, putnd fi frecvent utilizate fr neutralizare, dar acest proces poate perturba funcionarea enzimei prin creterea salinitii) , ADN polimeraza special, capabil de a rmne funcional la temperaturi nalte de pn la 100 C i tamponul (MgCl 2 n concentraii de aproximativ 1,5 mM) care este de o importana vital, deoarece determin condiiile de hibridare a primerilor i cele de funcionare a polimerazei (Taq polimeraza nu poate funciona cnd salinitatea mediului este crescut). ADN-ul ce urmeaz a fi amplificat se afl n cantitate foarte mic i este utilizat ca template pe un sector limitat (ADN int), delimitat de doi primeri, cu orientare opus, unul pe catena template t , pe catena template sunt reprezentai de oligonucleotide sintetizate in vitro , reprezentnd piese scurte de ADN monocatenar, de numai 20-30 nucleotide lungime. Secvena primerilor este astfel stabilit (proiectat) n cursul sintezei artificiale a lor, nct s fie realizat mperecherea complementar cu o secven aflat napoia sectorului din ADN inta ce urmeaz a fi amplificat, primerii delimitnd astfel acest sector. Cei doi primeri sunt proiectai s se asocieze unul aproape de cellalt dar sunt situai pe catene diferite i sunt orientai n aa fel nct ei copie secvena de ADN care se gsete ntre ei. Cu ct primerii sunt mai lungi, cu att temperatura de asociere poate fi mai mare ceea ce creeaz o specificitate sporit. Cu toate acestea priimerii nepurificai i lungi vor conine cantit i mai mari de produse nespecifice n amestecul final. Dac este necesar utilizarea unor primeri mai lungi atunci se recomand purificarea lor, n caz contrar aceasta nu este necesar. Exist i aa numii primeri nespecifici sau degenerai care sunt de fapt un amestec de oligonucleotide ale unor secvene de acizi nucleici diferite i sunt utilizai pentru amplificarea simultan a mai multor loci n ADN-ul int. Primele metode PCR utilizau electroforeza n gel pentru detectarea produilor de amplificare PCR sau ampliconilor. Dei aceast metoda s-a dovedit a fi folositoare, specificitatea i sensibilitatea sa erau compromise de ngreunarea acestei metode de detecie. Specificitatea nalta a PCR este parial datorat faptului c primerii trebuie s hibrideze n apropiere de ADN int n condiii stricte de temperatura nainte de apariia amplificrii. Hibridizarea acizilor nucleici permite identificare unor secvente specifice (int) de A DN sau ARN cu ajutorul unor sonde genotipice monocatenare corespunztoare secvenelor respective, cu care se vor lega exclusiv n funcie de complementaritatea nucleotidelor. Formndu -se n final un duplex hibrid. Sondele sunt marcate radioizotopic sau imunohistochimic, ceea ce permite vizualizarea hibridizrii prin diferite metode de tip blot (aspiraie capilar).

19

Reprezentarea schematic a reaciei de polimerizare n lan (dup John M. S. Bartlett et al., 2002)

Metoda Southern-blot (introdus de Southern n 1975) const n obinerea de fragmente monocatenare de ADN, urmat de hibridizarea acesteia cu sonde monocatenare specifice unei anumite zone de interes, complexul ADN-sond obinut fiind evideniabil prin autoradiografie. Pot fi identificate astfel att deleii ct i inserii genice mai mari de 100 de perechi de baze, ct i muta ii care distrug situsurile de restricie. Limita metodei const n aceea c nu poate detecta mutaiile punctiforme. Metoda Northern-blot constituie o adaptare a metodei Southern, viznd studierea cantitativ a ARNm intracelular. Se foloete mai rar deoarece ARNm este mult mai sensibil la degradarea prin ribonucleaze (ARN-ul celular este de fapt un amestec de ARN ribozomal 80%, ARN de transfer 18% si ARN mesager 2 %). Metoda Westhern-blot evalueaz intensitatea expresiei genice prin determinarea nivelului proteic. Toate aceste metode de tip blot constituie de fapt preludiul metodologic necesar pentru caracterizarea nucleotidica a unei gene. Apariia enzimelor linkate probelor hibridizate (PCR-ELISA) utilizate pentru detectarea produilor de amplificare au imbuntit procesul ins tot era necesar o manipulare ndelungat . PCR-ELISA a facilitat introducerea PCR-ului cantitativ (QPCR) care este o modificare a reaciei de polimerizare utilizat pentru a msura rapid cantitatea de ADN, ARN prezent n eantion ns cu toate acestea acurateea cuantificrii era limitat. Testul Elisa este o tehnic de dozare enzimatic a sngelui permi nd detectarea imunoglobulinelor ndreptate mpotriva unui agent bacterian sau viral. Testul Elisa permite determinarea faptului c o persoana este sau nu infectat cu un organism dat. Testul este numit seropozitiv n caz de infecie i seonegativ n caz contrar.El serve te mai ales la diagnosticarea unei seropozitiviti datorate virusului SIDA. Orice pozitivitate a acestui test implic verificarea sa printr-un procedeu mai specific, ca reacia Western-blot. Dei sunt multe metode de detectare a secventelor specifice, PCR-ELISA sunt folositoare pentru detectare i difereniere dintre inte multiple. De asemenea , se mai utilizeaz pentru testarea unor eantioane n special cnd numrul acestora este foarte mare. 4.1.1.2. Ciclurile reaciei PCR

20

Extracia i purificarea acizilor nucleici este primul pas n studiile de biologie molecular, n toate tehnicile ADN ului recombinant. Deoarece exist o mare varietate de metode pentru extracia i purificarea ADN, alegerea celei mai potrivite dintre ele se bazeaz n general pe urmtoarele criterii: acidul nucleic analizat organismul surs materialul de la care se pleac (esut, frunze, semine) rezultatul dorit (cantitate, puritate, timpul disponibil pentru purificare) tehnica folosit ulterior pentru analiz (PCR, clonare, etichetare, blotting, RT -PCR, cADN, sinteza de ADN etc). Principiul unora dintre cele mai utilizate metode este urmtorul: extracia acizilor nucleici din materialul biologic necesit liza celulei, inactivarea nucleazelor celulare i separarea acidului nucleic dorit din amestecul celular. Procedura comun de liz include: ruperea mecanic (zdrobire, liza hipotonic etc), tratamentul chimic (detergent, ali ageni etc), digestie enzimatic (proteinaze). Extragerea ADN-ului se produce utilizndu-se o serie de enzime specifice, n primul rnd, cele de restricie, capabile s rup molecula de ADN n anumite locuri. Restrictazele reprezint instrumentul de baz al ingineriei genice, deoarece au capacitatea unic de a tia molecula de ADN n anumite sectoare (loci). Prima restrictaz a fost obinut din bacteriile Haemophillus influenzae serotipul i se folosea pentru fragmentarea ADN-ului virusului SV-40 i cartarea lui (Kelly, Smith, 1970). Pentru eliminarea contaminailor se folosesc solveni de extracie. De exemplu, o combinaie ntre fenol i cloroform este folosit frecvent pentru a ndeprta proteinele. Precipitarea cu izopropanol sau etanol este folosit n general pentru a concentra acizii nucleici. Daca este vorba de o cantitate sczut de acizi nucleici, un purttor inert (cum ar glicogenul) poate fi adugat n mixtur pentru a crete eficiena precipitrii. Alte metode de precipitare presupun o precipitare selectiv, care se realizeaz prin folosirea unor concentraii mari de sruri (salting out) sau precipitarea proteinelor folosind schimbrile de pH. Se poate extrage ADN din aproape orice pentru a fi apoi utilizat n reacia PCR (din gel de agaroz, din snge integral, din drojdii, bacterii, esuturi, esuturi parafinate sau ngheate etc.). Fiecare ciclu de polimerizare (C), n PCR are trei etape: denaturarea, asocierea sau alinierea (annealing) i elongarea/alungirea (extension). 1. Denaturarea ADN int Soluia de reacie se pune n tub de eprubet inchis i se supune unei temperaturi de 93 C - 96 C ntre 15 secunde i un minut, n aparatul pentru PCR numit thermocycler. Acest echipament ofer maximul de performant n analizele real-time PCR constituindu-se ntr-o platform puternic pentru laboratoare n care este necesar obinerea de rezultate performante. Platforma reprezint un sistem optic inovativ, cu sensibilitate ridicata, care permite accesul la o gama larga de fluorofori. Platforma capabil s detecteze cinci culori este calibrat pentru cel mai larg interval posibil de absorbie al markerilor . Sistemul optic specializat permite calibrarea usoar i precis pentru markerii noi fr a fi necesar adugarea de filtre noi. Aparatul mai prezint un termobloc care poate fi fabricat din diferite metale sau conductori de cldur, cum ar fi argintul , care con ine microplci cu un numr variabil de godeuri sau sonde (96 pn la 384) i tuburi de 0,2 sau 0,5 ml. Viteza de nclzire maxim a blocului este de 2,5C iar domeniul de temperatura este cuprins ntre 4- 100C. Capacul trebuie s realizeze dou sarcini, eseniale pentru desfaurarea corecta a procesului: s previn condensarea i s se nchida ermetic, pentru a forma o suprafa steril ntre probe i termobloc, evitnd astfel contaminarea. Sistemul permite up-gradarea la Fast Real-Time PCR prin creterea vitezei de lucru astfel nct timpul necesar efecturii unei analize devine de circa 30 de minute folosind un volum de prob foarte mic (de 10-30 l). Dup ce s-a ales programul specific, thermocyclerul scade i creste temperatura fiind capabil s realizeze pn la 50 de astfel de cicluri n mai puin de 30 de minute. Denaturarea lanurilor de ADN se face enzimatic in vivo i termic in vitro. nclzirea insuficient pe parcursul etapei de denaturare este o cauz comun a ratrilor n tehnica PCR. Este foarte important ca reacia s ating o temperatur la care sa se produca completa separare a lanurilor.

21

Reprezentarea schematic a primului ciclu PCR (http://www.bioversityinternational.org/Publications/Molecular_Markers_Volume, prelucrare dup IPGRI i Cornell University, 2003)

4.1.1.3. Alinierea primerilor la template-ul de ADN (annealing), Se realizeaz n timp ce temperatura soluiei este scazut la aproximativ 60C timp de 15 secunde pn la 2 minute. Asocierea primerilor se realizeaz cu ajutorul unor secvene scurte de aproximativ 20-25 perechi de baze de ADN complementar, numite primer sens i antisens iar temperatura la care are loc reactia se calculeaza n funcie de structura primerilor. Expunerea limitat la temperaturi nalte ajut la meninerea activitii polimerazei la cote de maxim pe parcursul reaciei.

Reprezentarea schematic al celui de al doilea ciclu PCR (http://www.bioversityinternational.org/Publications/Molecular_Markers_Volume, prelucrare dup IPGRI i Cornell University, 2003)

4.1.1.4. Elongarea Fiecare ciclu se termin cu cateva minute (15 secunde pana la 3 minute), la 68 C, n cursul crora ADN polimeraza special alungeste secvena primerilor, sintetiznd replicile catenelor matrie ale ADN int, adugnd deoxiribonucle

22

Reprezentarea schematic al celui de al treilea ciclu PCR (http://www.bioversityinternational.org/Publications/Molecular_Markers_Volume, prelucrare dup IPGRI i Cornell University, 2003)

Dei majoritatea polimerazelor recunosc ADN-ul mono catenar ca fiind cel mai adecvat ca template i se leag temporar de acesta ntr-un punct adiacent unei ntinderi dublu catenare, ADN polimeraza se leaga de asemenea i la deoxinucleotid trifosfai care se gsesc n mediul de reacie i utilizeaz energia stocat n legturile trifosfat, cataliznd o reacie care ataeaz nucleotidele la a doua catent a ADN -ului. Enzima se muta apoi la noul capt dublu catenar, alungit i acest proces este repetat de sute sau mii de ori pe secund. ADN polimeraza este unidirecional. ncepe prin a sintetiza captul 3' al moleculei dublu catenare i sintetizeaz ADN nou n direc ia 5'3'.Cu toate acestea, natura bipolar a celor dou catene complementare ale helixului standard face posibil ca o polimeraz s sintetizeze oricare din catene. Cele mai multe reacii PCR au 20-40 de asemenea cicluri. Tehermocycler-ul sau maina PCR ridic i coboar ciclic temperatura amestecului de reacie, sub coordonarea riguroas a unui computer, utiliznd programul stepcycle. De obicei, rata de ncalzire este de 0,3 C pe secund i cea de rcire de 1 C pe secund, pentru un singur 30 ciclu de aproximativ 3,55 minute. Dup 30 de cicluri, fiecare gen inta este amplificat cu un factor de 2 , dar n 30 30 practic nu se atinge o eficiena de 100%, ci numai de 70% (amplificare 1,70 ) pn la 90% (1,90 ). Se obine, astfel, 1g de ADN, reprezentnd o singur gen amplificat n miliarde de copii, pornind de la 1 ng de ADN pe care l conin 10 milioane de gene diferite. Teoretic, 20 de cicluri trebuie s produc aproximativ de un milion de ori mai mult ADN int fa de momentul iniial. Practic, pentru o eficien de 100 % sunt necesare aproximativ 43-45 de astfel de cicluri. Un microgram de ADN produs prin Reacia de Polimerizare n Lan poate fi suficient pentru multe analize de detecie genetic, stabilirea dimensiunii, clonare i secveniere, etc.

Reprezentarea schematic a amplificrii exponeniale a unei gene prin reacia de polimerizare n lan

Mullis i colaboratorii au descoperit c ADN polimeraza din bacteria termofil Thermus aquaticus, denumit Taq polimeraza sau ADN polimeraza Taq-1 care are o greutate de 94 kDa, rezist mult timp la temperaturi de 96C, fiind activ enzimatic ntre 60 i 70C, astfel c nu mai este necesar adugarea de ADN polimeraza proaspt, la fiecare etap de alungire a primerilor i amplificare a ADN int, a a cum se proceda cu ADN polimeraza obinuit, nainte de descoperirea ADN polimerazei Taq-1.La temperatura sa optim, viteza de polimerizare variaz de la 50 la 150 baze per secund, dar scade repede cu temperatura (1 5 baze per secund la 37 C, 0.25 baze per secunda la 22 C) Iniial la mijlocul anilor 80 cnd a fost pus la punct tehnica polimerizrii n lan se folosea ca enzim de amplificare o polimeraz extras din E. Coli care trebuia adugat fiec rui ciclu de amplificare deoarece la etapa de denaturare enzima la 96C se coagula fiind inactivata.

23

4.1.2. Optimizarea reaciei PCR Tehnica PCR implic realizarea unui amestec de reacie care include proba ADN i primerii oligonucleotidici, deoxinucleotid trifosfat i Taq-ADN-polimeraza termostabil ntr-o soluie tampon specific, urmat de nclzirea i rcirea repetat a amestecului, timp de cteva ore, pn la atingerea nivelului dorit de amplificare. Amplificarea poate fi realizat n thermocycler utiliznd programul "step-cycle" pentru: o denaturare la 94 C, timp de 20 de secunde; o cuplare la 55 C, timp de 20 de secunde; o extensie la 72 C, timp de 30 de secunde, la un total de 30 de cicluri. o o De obicei, rata de nclzire este de 0,3 C / secund i cea de rcire de 1 C / pe secund, pentru un singur ciclu de aproximativ 3,55 de minute. Aceste condiii pot fi utilizate pentru amplificarea unui domeniu de secven-int cu specificitate excelent. Cea mai dificil problem a utilizrii tehnicii PCR- care este cea mai important tehnic a biologiei moleculare contemporane este problema contaminrii cu ADN de alt provenient. PCR este extrem de eficient, ceea ce face ca i ADN de pe suprafaa pielii sau din celulele moarte aflate pe mna cercettorului s poat servi ca substrat, ca i ADN din reacia anterioar efectuat n laborator s indeplineasc acest rol, contaminnd uneltele de lucru. Chiar i moleculele de ADN aflate n aerul laboratorului pot contamina reacia, atunci cnd nu se asigur condiii riguroase de sterilizare. Calitatea i puritatea acizilor nucleici reprezint unii dintre cei mai critici factori pentru analiza PCR. Exist compui care se folosec n analiza PCR , care n anumite cantiti devin inhibitori cum ar fi: fenoli (0,2 %), etanol (1 %), izopropanol (1 %), acetat de sodiu (5 mM), clorura de sodiu (25 mM), EDTA (0,5 % mM), hemoglobina (1 ml), heparina (0,1 ml), uree (20 mM), mixtura de reacie (15 %). Toate acestea impun msuri drastice de curenie i puritate a atmonsferei n care se desfoar procedura PCR i se recomand msurarea cu atenie a cantittilor compuilor utilizai n analiza PCR. De asemenea pipetarea cu atenie i schimbarea constant a pipetelor sau a vrfului acestora, va minimiza riscul contaminrii. Seapararea efectiv, prin camere diferite, a etapelor PCR ntr-un sens unidirecional, este obligatorie pentru obinerea unui rezultat corect i ct mai exact.

4.1.3. Selecia primerilor Majoritatea primerilor pot fi utilizai n contextul urmatoarelor repere: cnd este posibil se selecteaz primerii cu o distribuie ntamplatoare a bazelor i cu un coninut similar celui aparinnd fragmentului ce trebuie amplificat (a se evita primerii cu urme fine de polipurine, polipirimidine sau alte secvene mai puin uzuale). evitarea secvenelor cu structura secundar semnificativ, n special la captul 3 aferent primerului; programele computerizate fiind foarte utile n relevarea acestei structuri. se sugereaz alegerea primer-ului de sens opus pentru complementaritate. Primerii pot fi orice secven dar cei ideali conin un numr egal din fiecare nucleotid fr repetri interioare sau similariti. De exemplu, un primer cu secvena AAATT-TAAATTT poate duce la realizarea de copii ale sale i la produse de tip primer-dimer. Cum am menionat i mai sus exist aa numii primeri degenera i, nespecifici sau arbitrari care pot fi utilizai cu secvene de ADN int necunoscute. Sintetizarea de oligonucleotide permite ca raiile molare egale a doi, trei sau patru baze diferite s fie adaugat ntr-o anumit poziie. Avantajul acestui model este acela c, teoretic, ar fi o coresponden exact a unei secvene int cu ceva din amestecul de primeri. Dezavantajul l constituie, depinznd de gradul de degenerare, concentraia primerilor care este foarte scazut. De asemenea, deoarece un amestec complex de primeri va arata un spectru de afinitai pentru template, este dificil s estimezi concentraia optim de primeri utilizat pentru amestec, fr a titra cu atenie experimentele. Dupa ce un primer universal sau arbitrar este realizat i utilizat cu succes, deseori este o idee buna s proiectam un set nou de primeri deoarece cantitatea de ADN utilizat pentru studiu poate fi deseori limitat. Utilizarea primerilor degenerai n PCR este metoda cea mai bun pentru a depai aceste limitri i pentru a realiza amplificarea complet a ntregului genom. Aceast tehnic nu ine cont de specie dac este vorba de cantiti mici de ADN. Pe scurt, utilizarea unui primer degenerat permite asocierea simultan a oligonucleotidelor acestuia n mai multe situsuri din ADN-ul int, n primele cinci cicluri ale PCR-ului, la o temperatur joas. Acest metod este utilizat n nenumrate domenii: n clinic pentru a produce o cantitate suficient de ADN din celulele tumorale, n laboratoarele medico-legale unde cantitatea de ADN de analizat este foarte limitat, n diagnosticul prenatal i n multe alte investigaii. 4.1.3.1. Factorii care influeneaz specificitatea Exemple de factori ce pot afecta serios specificitatea reaciei de amplificare, n tehnica PCR sunt:

24

 stringena etapei de cuplare poate fi controlat pn la o oarecare extensie prin ajustarea te mperaturii de cuplare; micorand timpul de incubare pe parcursul etapelor de cuplare i extensie, se vor limita posibilitile i oportunitile de extensie de ctre alte molecule dect cele ale ADN -polimerazei; reducerea concentraiei primer-ului i a enzimei servete la limitarea tipului de subreacie care conduce la dimerizare; schimbarea nivelului de MgCl 2 (i probabil KCl) pot afecta ulterior specificitatea, fie prin creterea stringenei reaciei, fie prin efectele directe ale polimerazei nsi. nefuncionarea unor primeri ntr-o reacie PCR este o situaie normal; motiv pentru care, n fiecare caz n parte, primerii trebuiesc testai pentru a se constata randamentul n reacie

4.1.4. TIPURI DE PCR Dimensiunea intei ce trebuie amplificat a fost iniial de aproximativ 3000 perechi de baze, dar fidelitatea sa este destul de precara, aprnd mutaii la fiecare 1000 pb, sub ac iunea Taq polimerazei. Pn acum civa ani, o amplificare sigura i fr prea multe erori a unor secven e lungi de ADN era dificil de realizat. Cu toate acestea, n 1994, o important descoperire a fost facut de Barnes. El a susinut ca un obstacol major n realizarea unui Long PCR (PCR extins/de lung durat) ar fi rata de eroare a Taq polimeraza, care cauzeaz nepotriviri ale bazelor azotate ce fac alungirea catenei de ADN foarte ineficient. Ulterior aceste performane au fost mbunatatite de aproape zece ori, prin adugarea n concentraie sczut a unei alte ADN polimeraze asociat Taq polimerazei . Multe alte ADN polimeraze termostabile au o activitate exonucleasic marit i o mai bun acuratete. Cu toate acestea, utilizarea numai a acestor polimeraze, nu garanteaz succesul tehnicii Long-PCR, probabil din cauza degradrii excesive a primerilor de activitate exonucleasic. Gradul de activitate a exonucleasei nu este o garanie pentru fidela multiplicare a ADN-ului. Fidelitatea copierii depinde i de gradul de discriminare mpotriva erorilor de inserare, a ratei nepotrivirilor i a diferenelor dintre modurile de polimerizare i corectare a erorilor. Aceste ADN polimeraze provin de la unele specii de Archaebacteria, ce traiesc n vecintatea vulcanilor o submarini i a craterelor acestora i ele suport temperaturi chiar mai ridicate (110 C) dect poate suporta Taq polimeraza. Dar, cea mai important proprietate a acestor polimeraze arhebacteriene este aceea de a avea capacitatea de corecie a citirii (proofreading), pe care Taq polimeraza nu o are, pierznd-o n cursul evoluiei. Aceste ADN polimeraze auxiliare nltura bazele greit mperecheate din catena replic, pe care le inserioneaz ocazional Taq polimeraza. Activitatea de corectie a citirii este o activitate exonucleasica care nlatura (hidrolizeaza) (exonucleaza 3) ale primerilor legai sau nelegai la template, precum i bazele greit mperecheate. Interesant apare faptul c activitatea exonucleasic 3 este mult mai rapid la nivelul bazelor greit mperecheate, dec t la nivelul bazelor normal mperecheate i, astfel, ea nu afecteaz funcionarea normal a primerilor mperecheai cu templateul. Noutatea raportat de Barnes a contat n efectuarea PCR-ului cu un amestec de dou ADN polimeraze: o component major reprezentat de o ADN polimeraz non-proofing activity (highly processive activity) i o component minor reprezentat de o ADN polimeraz cu o activitate exonucleasica ridicat (proofreding activity). Cu un asemenea amestec de enzime s-a reuit cu succes amplificarea unor matrie de ADN cu lungimi de pn la 35 kb, fiind demonstrat astfel eficacitatea amestecului de enzime n comparaie cu Taq polimeraza. Alte modificri, incluznd optimizarea soluiei tampon i a condiiilor de desfurare a ciclurilor termice, au contribuit la perfecionarea tehnicii Long PCR. Algoritmul desfurrii unui PCR de lung durat, dar i precis, desfurat cu acuratee, este urmtorul: Taq polimeraza asigur sinteza de baz a ADN ce trebuie amplificat. Cnd aceast enzim comite o eroare (de exemplu, inserioneaz un A, n replic, corespunznd unui A, din templateul, n locul unui T, cum ar fi normal), rezult un -un unghi ascuit, ndeprtndu-se de template.

25

Corecia enzimatic a citirii prin eliminarea bazei mperecheate greit (http://www.hawaii.edu/microbiology/MO/longpcr.htm,

prelucrat dupa Alm's Lab, Departamentul de Microbiologie, Univeritatea Hawaii, 2003)

Dac enzima polimeraz continu totui alungirea catenei replica, va fi generat o mutaie punctiform , la nivelul erorii de includere (ncorporare), dar dac enzima polimerizatoare este blocat la nivelul acestei contorsiuni tor al unei erori de includere, reac ia de polimerizare va fi i ea blocat. n prezena unei enzime ce are capacitatea de corecie a citirii, are loc eliminarea bazei greit mperecheate, permind Taq polimerazei s revin n regiunea de dinaintea operaiei de corecie a citirii i s reia procesul normal de polimerizare. n felul acesta, pot fi amplificate cu mare fidelitate, nu numai sectoare scurte din ADN ce trebuie amplificat, dar i sectoare lungi. Totodat, amplificarea acestor sectoare se realizeaz cu mare fidelitate, asigurndu -se acurateea sintezei replicilor. n plus, reaciile de sintez devin mai eficiente, iar produii PCR pot fi utilizai ei inii ca prime ri eficieni, devenind ceea ce s-a numit megaprimeri , n cursul procedurilor de realizare a unor construcii de gene complexe i de plasmide. Fr acest amestec de polimeraze, problema utilizrii ca primeri a produilor PCR nu poate fi rezolvat, deoarece Taq polimeraza, ca i oricare ADN polimeraz lipsit de activitate exonucleasic pune un r i acesta se mperecheaz cu T, fcnd primarea ineficient, dat fiind faptul c dupa o asemenea mperechere normal, urmeaz o mperechere eronat (mismatch). Nu se recomand utilizarea enzimelor proofreading (care au capacitatea de corecie a citirii) pure, deoarece activitatea lor exonucleazic va hidroliza primerii PCR, lsnd doar n jur de 15 nucleotide, la capt nd o asemenea activitate se exercit pentru produi inta, produsul de amplificare este de nalt fidelitate. Produii de amplificare se separ electroforetic, fiind pui s migreze ntr-un gel de agaroza 2% cu ethidium bromid (bromura de etidiu) alturi de un marker molecular cu greutate molecular deja cunoscut i vizualiza i apoi cu ajutorul unei lampe UV. Ca i n cazul PCR-ului standard, componentele sunt n majoritate aceleai, existnd deosebiri n privina enzimelor (ADN polimeraze): templateul de ADN, primeri, (oligonucleotide), deoxinucleosidtrifosfat (dNTPs), amestec de dou ADN polimeraze, soluie tampon, cationi bivaleni (Mg +) i ioni de K+. Rolul cheie n tehnica Long PCR l are amestecul de enzime : ADN polimeraza ce este folosit n cantitate mai mare amplific secvenele de ADN dorite iar cealalt polimeraz, cu activitate exonucleasic 3' 5' identific i corecteaz erorile de inserare (nepotrivirea bazelor azotate). n vederea optimizrii amplificrii unor secvene de ADN prin aceast tehnic trebuie s se aib n vedere urmatoarele: n cazul clonrii de secvene de ADN mai lungi de 10 kpb, extracia i purificarea ADN -ului s fie realizate cu acuratee, concentraia primerilor folosii s fie optim (0,1 - 1,0 mM), la o concentraie mai mic, cantitatea de ADN clonat este mai redus iar la o concentraie mai mare pot s apar reacii nespecifice care influeneaz procesul normal al amplific rii materialului genetic, numrul de cicluri de denaturare-renaturare s se ncadreze ntre 25 i 35, avnd n vedere cantitatea i complexitatea ADN-ului template i lungimea secvenei amplificate, un numr prea mic de astfel de cicluri nu va genera destul material genetic, pe cnd depirea optimului poate provoca apariia unor pete pe electroforez , n cadrul ciclurilor de denaturare-renaturare, tranziia rapid a temperaturilor, eficientizeaz procesul de amplificare, aceasta realizndu-se prin folosirea unor volume mai mici de reactivi, a tuburilor de PCR cu perei subiri i a unor termocyclere performante se obin astfel fragmente de ADN cu lungimea de pn la 42 kb n cercetrile de biologie molecular pentru ob inerea de ampliconi lungi se utilizeaz o diversitate de ADN polimeraze, cu performane diferite, dintre care : Pfu ADN polimeraza LA pro Taq ADN polimeraza, amestec format din Taq polimeraza i o enzim termostabil cu activitate endonucleasic TaKaRa LA Taq polimeraza Phusion High- Fidelity ADN polimeraza

26

Grafic de eficien a diferitelor polimeraze n Long PCR (http://www.hawaii.edu/microbiology/MO/longpcr.htm, prelucrat dupa Alm's
Lab, Departamentul de Microbiologie, Univeritatea Hawaii, 2003)

Utilizarea numai a Taq polimerazei determin o rat mai mare a erorilor, comparativ cu folosirea ei n cadrul unui complex enzimatic.

Compararea PCR standard cu Long PCR (Cheng, S., et al., 1994)

Long PCR-ul prezint numeroase aplicaii cum ar fi : amplificarea intronilor unor secvene de material genetic folosind primerii ataati la exonii adiacenti, caracterizarea de transpozomi la Drosophila, clasificarea bacteriilor, amplificarea genomului n scopul determinrii deleiilor n bolile genetice, clonarea n ntregime sau aproape n ntregime a genomurilor mai multor virusuri cum ar fi virusul hepatitei B, virusul papiloma, virusul HIV. Multiplex PCR Prin amplificarea simultan a mai multor inte n aceeai reacie utilizndu-se un numr mare de perechi de primeri, PCR-ul multiplex devine o metod rapid i convenabil att n clinic ct i n laboratoarele de cercetare. Aceast tehnic a fost descris pentru prima dat n 1988 de ctre Chamberlain i de atunci a fost utilizat n numeroase domenii ale testrii ADN. Acesta se utilizeaz n mod curent pentru aplicaii genotipice n cadrul crora analizele simultane ale unor markeri multiplii sunt nec esare. Cel mai important lucru n realizarea reaciei Multiplex PCR const n concentraiile primerilor necesari la realizarea intelor variate, de asemenea concentraiille soluiilor tampon, temperaturile de ciclizare si echilibrul dintre clorura de magneziu i concentraiile deoxinucleotidelor.

Reprezentarea schematic a PCR tip Multiplex

Primul pas const n alegerea perechilor de primeri care se pot combina. Atunci cnd are loc amplificarea individual a perechilor de primeri, cea mai important cerin este utilizarea unui program care s permit o amplificare optim a tuturor secvenelor iar aceast cerin este conditiona de timpul i temperaturile din timpul asocierii i extensiei primerilor. Urmtorul pas const n realizarea unui amestec format din cantiti echimolare ale fiecrui primer din perechile dorite. n urma amplificrii individuale produii sunt supui electroforezei i apoi vizualizai cu ajutorul lampei UV, alegndu-se astfel perechile de primeri dorite pentru realizarea mixului echimolar.

27

4.1.4.1. RT-PCR (Reverse transcription PCR) RT-PCR se bazeaz pe procesul revers transcripiei, care transcrie ARN n ADN, proces care a fost izolat iniial n retrovirusuri. Tehnica permite formarea ADN-ului complementar din ARN, care stocheaza secvena de ARN ntr-o form mai stabil. Acest transcripie invers a ARN-ului n forma invers complementar a ADN-ului este primul pas dintr-un proces care are de obicei dou etape. Mai mult prin copierea ARN-ului n ADN, se poate amplifica secvena de ADN complementar prin utilizarea primerilor specifici pentru aceast secven. Aceast amplificare este cel de al doilea pas. n primul pas al RT-PCR denumit i "reacia primei catene", ADN-ul complementar este realizat din templateul rezultat dintr-o poriune de ARN mesager , cu ajutorul oligonucleotidelor, a deoxinucleosid trifosfailor, a ADN polimerazei ARN dependente, i a revers transcriptazei. Toi aceti factori sunt combinai ntr-un tampon pentru revers transcripie dup care se las o ora la 37 C. Dup ce reacia este complet i ADN-ul complementar a fost sintetizat, se adaug ribonucleaza care va digera ARN-ul din compoziie. Dup incubarea cu ribonucleaz are loc reacia de amplificare utiliznd primeri oligonucleotidici ADN specifici pentru secvena dorit. Al doilea pas sau "reacia celei de a doua catene" se realizeaz prin adugarea ADN polimerazei, dup care moleculele de ADN monocatenare, prin reacia de polimerizare, devin dublu catenare. Acest lucru permite detectarea ARN-ului prin amplificarea ADN-ului su complementar. Amplificarea exponenial a secvenelor complementare ale ARN-ului mesager sau a secvenelor ARN prin RT-PCR permit ca aceast tehnic de o mare sensibilitate, unde exist un numar redus de copii, s poat detecta produii rezultai. Este utilizat de asemenea pentru clonarea ARN-ului sub forma secvenelor complementare de ADN . 4.1.4.2. Q-PCR (PCR cantitativ n timp real) Real Time Quantitative- PCR (Q PCR) sau PCR cantitativ n timp real este o tehnic nou, care permite cuantificarea cu acuratee a produilor PCR, ceea ce este n contrast deplin cu tehnicile clasice semicantitative de cuantificare n punctul terminus. Datorit deteciei n timp real a semnalelor fluorescente, n cursul fiecrui ciclu PCR, datele cantitative pot fi obinute n scurt timp, nemaifiind necesar vreo procesare ulterioar, ceea ce reduce drastic ansa contaminrii produsului PCR. n chimia reaciei sunt incluse diferite tipuri de sonde oligonucleotidice care, ntr-o anumit etap a amplificrii, se prind specific fie de produsul amplificat, fie de fragm entul int ce urmeaz a fi copiat. Apariia mai recent a acestuia a revoluionat diagnosticul molecular al metodelor de detecie n microbiologia clinica. Aceste tuburi nchise elimin cu adevarat riscul de contaminare al ampliconilor deoarece eantioanele nu sunt deschise n cursul ciclurilor.Aceast tehnic ofer n plus fa de PCR-ul simplu cuantificarea i detecia ampliconilor. Q-PCR este cu adevarat o unealt util n multiple domenii datorit vitezei de reacie i a riscului redus de contaminare. Prin aceast tehnic putem realiza detecia calitativ (prezent/absent) i cantitativ (cuantificarea absolut) a unor ageni infecioi (microorganisme, virusuri, etc.), caracterizarea unei gene de interes ntr-un genom (nivelul de expresie) sau cuantificarea relativ, confirmarea unor maladii metabolice de supra sau sub exprimare a unor gene fa de un nivel normal, constatarea efectelor unu i tratament pilot asupra exprimrii unei gene int fa de o gen housekeeping al crui nivel de transcriere nu se modific n urma tratamentului, discriminarea alelelor i detecia SNP-urilor (Single Nucleotid Polymorphism). n prezent, analiza RQ-PCR se poate realiza prin aplicarea a trei tehnici bazate pe fluorescen, care detecteaz produii PCR pe trei ci diferite.

4.1.4.3. Nested PCR (PCR n cadrul unui produs anterior obinut) Are loc atunci cnd se realizeaz primarea n cteva locuri nedorite n template ADN sau n ADN contaminant, amplificnd alte gene dect aceea pe care o studiem. n acest caz, se folosesc primerii de reamplificare ntr-o etap secundar de PCR, n care se utilizeaz ca template o parte din produsul primei runde PCR. Primerii de reamplificare sunt proiectai s primeze la nivelul unei secvene aflat n prima pereche de primeri, de o parte i de cealalt a intei. Deci se utilizeaz dou perechi de primeri: prima pereche amplific fragmentul similar cu PCR-ul standard iar cea de a doua, de reamplificare, se leag n interiorul primului fragment rezultat din amplificarea primei perechi formndu-se cel de al doilea fragment care este mai scurt dect primul. Uneori, reamplificarea este

28

doar pe o parte, iar alteori poate avea loc o tripl reamplificare. n toate aceste situaii, genele nedorite a fi amplificate nu vor prezenta secvena de reamplificare, astfel c va fi amplificat doar inta dorit. Avantajul PCR-ului de tip nested este acela c, chiar dac prima dat a fost amplificat un fragment greit, probabilitatea ca acesta s fie amplificat i a doua oar este destul de redus . De aceea acest tip de PCR este unul foarte exact. n primul pas al reaciei PCR, templateul ADN este delimitat de primul set de primeri (n schema reprezentai cu albastru). n a doua etap produii PCR din prima reacie sunt supui unui nou ciclu PCR, dar de data asta, utilizndu-se un nou set de primeri, respectiv cei de reamplificare (reprezentai cu rou). Pe msur ce acetia se ataeaz n interiorul primului fragment, reduc foarte mult posibilitatea formrii unor produi nedorii. Probabilitatea ca n urma amplificrii produii PCR nespecifici s conin ambele situsuri de legare a primerilor este foarte redus. PCR-ul de reamplificare ofer sigurana c produii rezultai din a doua etapa a reaciei nu sunt contaminai de produii nespecifici rezultai n urma amplificrii din secvene int alternative. Reamplificarea este necesar n cazuri extreme de amplificare, cum ar fi atunci cnd se pornete doar de la o copie a matriei. Acesta este cazul n care, de exemplu, se recupereaz un singur spermatozoid ntr -o investigaie criminalistic sau n cazul PCR linker, n acest caz, reamplificara realizndu-se doar pe o singur parte

Reprezentarea schematic a PCR de reamplificare

APLICAII ALE REACIEI PCR PCR-ul are utilizri nenumrate i extinse n toate domeniile cum ar fi n diagnosticarea bolilor genetice, amprenta ADN-ului, n detectarea unor bacterii i virusuri, n studiul evoluiei omului i nu numai, n clonarea ADNului, etc. PCR-ul a devenit foarte repede indispensabil i n cercetrile de mbuntire a sn taii umane i a vieii umane. Cercetrile medicale i medicina clinica sunt ndrumate de PCR n special n dou direcii : n detectarea organismelor cauzatoare de boli infecioase i n detectarea mutaiilor din genom, n special n cel uman. n bacterilogie i virusologie ofer un avantaj datorit specificitii n detectarea agenilor patogeni i n uurina cu care realizeaz detectarea n special n cazul microorganismelor care nu cresc pe culturi bacteriene sau au o dezvoltare lent . n genetic este extrem de indispensabil datorit capacitii sale de a detecta chiar i cele mai mici modificri din genomul fiecruia, ceea ajut la depistarea bolilor transmise ereditar i a mutaiilor. n paleontologie replicarea ADN-ului prin PCR ne ajut la reconstituirea crrilor evoluiei. Putem compara dup amplificare, ADN-ul diferitelor specii, lucru care ne ajut la determinarea subspeciilor i a gradelor de nrudire.

29

PCR-ul a devenit o unealt esenial pentru biologi, pentru legiti, i pentru multe alte laboratoare care studiaz materialul genetic.

4.1.5.1. Identificarea variabilitii genetice prin PCR Datorit faptulului c PCR-ul poate deosebi cu uurin micile variaii ale ADN-ului care se gsete n noi toi i care ne face unici din punct de vedere genetic, acesta duce la descoperirea unor noi tipuri de teste genetice. Aceste teste ajut nu numai la diagnosticarea persoanelor cu boli motenite ci i la detectarea mutaiilor care s-ar putea transmite generaiilor urmtoare, pentru c purt torii genelor mutante, de obicei, nu sunt afectai dar se manifest la copii acestora. Cercetrile dezvolt teste care s lmureasca aspecte ca de exemplu aflarea persoanelor predispuse bolilor comune pe care noi nu le considerm genetice (boli de inim, cancer, etc.). Aceste descoperiri ajut la aplicarea metodelor de prevenire din timp pentru aceste boli care au cea mai mare mortalitate din lume. Cu analizele PCR ale celulelor gsite n fecale ,de exemplu, doctorii au demonstrat deja schimbri premaligne n tractul gastrointestinal, ca mutaiile n genele care protejeaz organismul mpotriva tumorilor iar acest lucru ajut la selectarea candidailor cu un risc crescut pentru cancerul de colon. PCR-ul poate da o linite enorm persoanelor care vor s conceap un copil prin reasigurarea parinilor c copilul nu sufer de nici o boal genetic. Tehnica salveaz vieile copiilor chiar nainte de natere, fiind utilizat spre exemplu pentru aflarea grupei sanguine a fetusului i incompatibilitatea sa cu a mamei. De asemenea, se mai poate utiliza ca un mijloc direct pentru detectarea diferitelor mutaii dintr-o singur gen, care ar putea duce la o afeciune ca distrofia muscular Duchenne. Ajut doctorii s localizeze prezena sau absena anormalitilor din ADN caracteristice pentru diferite tipuri de cancer, pentru a putea ncepe sau stopa tratamentul cu medicamente i terapia prin radiaii ct mai repede posibil. mbuntete foarte mult compatibilitatea din punct de vedere genetic pentru donatorii i primitorii transplantului de mduv. Multe din aceste teste genetice sunt rezultatul Proiectului Genomul Uman, care face efortul imens, pe plan internaional, de a identifica i studia toate genele umane. Cercettorii sper ca pn la finalul secolului, acest proiect s ajung la final pentru c se dezvolt mult mai rapid dect se astepta iniial spre scopul final care este secvenierea complet a ADN-ului n celulele umane tipice. Secvenierea complet a ADN-ului se refer la determinarea ordinii precise a celor patru nucleotide din alcatuirea catenei i a rolului fiecrei din aceste ordini diferite. Secvenierea ADN-ului dezvluie variaii cruciale n nucleotidele care constituie genele. Aceste schimbri mutaionale produc boli i chiar moartea prin forarea genelor s produc unele proteine anormale, sau uneori s nu produc proteine deloc. Secvenierea ADN-ului implic nti isolarea i duplicarea segmentelor ADN pentru analiza nucleotidelor. Aici PCR-ul devine extrem de important n Proiectul Genomul Uman pentru c poate genera rapid cantiti nelimitate din orice fragment ADN. O tehnic n care este necesar PCR-ul i cu ajutorul creia se pot face modificri n ordinea nucleotidelor din alctuirea ADN-ului este mutageneza. Exist situaii n care un cercetator este interesat de mutanti ale ADN -ului intr-o anumit directie, de exemplu, la ncercarea de a evalua funcia unei gene sau a unei proteine in vitro in evolutie. Mutaii pot fi introduse n secvente de ADN -ului copiat n dou moduri fundamental diferite n procesul de PCR. Regia mutagenesis experiment ce permite de a introduce o mu taie la o anumit locaie pe directie a ADNului. De obicei, este de dorit ca mutaia sa fie ncorporat n primeri folositi pentru programul de PCR. Random mutagenesis, pe de alt parte, se bazeaz pe utilizarea de eroare de care predispun polimerazele in procesul de PCR. n cazul aleator mutagenesis, amplasarea i natura acestor mutaii nu pot fi controlate. O utilizare a aleatoar mutagenesis este de a analiza relaiile structur-funcie ale unei proteine. PCR-ul mai poate fi utilizat n clonarea unei gene. Clonarea unei gene nu trebuie s fie confundat cu clonarea unui ntreg organism. Aceasta descrie procesul de izolare a unei gene de la un organism i apoi inserarea ntr-un alt organism (numit acum un organism modificat genetic -OMG). PCR este adesea folosit pentru a amplificarea de gene, care pot fi apoi introduse ntr -un vector (un vector este un fragment de ADN care "poart" genele n OUG), cum ar fi o plasmid(o molecul circular de ADN). Molecula de ADN poate fi apoi transferat ntr-un organism (OMG) n cazul n care s-au produs gene de produs i poate fi studiata mai ndeaproape. Exprimarea de gene clonate (atunci cnd o gen este exprimata de gene de produs -de obicei proteine sau ARN- este produs prin OMGului) pot fi, de asemenea, o modalitate productoare de proteine - de exemplu, medicamente sau de enzime biologice n pulberi de spalat. Incorporarea unei afiniti pe o etichet de recombinare a proteinelor va genera o proteina de fuziune, adic o protein creat prin ingineria genetic , care poate fi mai uor de purificat prin cromatografia de afinitate.

30

Clonarea unei gene folosind un plasmid. (1) ADN cromosomial din organismul A. (2) PCR. (3) Copii multiple ale unei gene dinorganismul A. (4) Inseria unei gene ntr-un plasmid. (5) Plasmidul cu gene din organismul A. (6) Inseria plasmidului n organismul B. (7) Multiplicarea sau exprimarea genei provenit din organismul A, n cadrul organismului B.

4.1.5.2. Utilizarea PCR n bioterorism Aceste analize sunt ntr-o dezvoltare rapid pentru detectarea acestor poteniali ageni bioteroriti care devin nite arme din ce n ce mai utilizate. Bioterorismul este definit ca eliberarea intenionat de virusuri, bacterii sau ali ageni cu scopul de a mbolnvii sau ucide oameni, animale sau plante. Agenii folosii n bioterorism includ bacterii (antraxul, pesta, tularemia,etc.), virusuri (variola virus, febrele virale hemoragice, etc.) i toxine (botulism, enterotoxina B stafilococica) Antraxul este cauzat de Bacillus anthracis, bacil gram pozitiv formator de spori. Exist trei forme de manifestare a bolii: pulmonar, cutanat i gastrointestinal. Antraxul este transmis aerogen - prin spori, prin contact direct cu leziunea cutanat sau prin ingestia de mncare contaminat. Perioada de incubaie variaz : aerogen (2-60 zile), cutanat (1-7 zile), digestiv (1-7 zile). Nu se transmite de la persoan la persoan pe cale aerian, deci prevenirea transmiterii implic doar proceduri standard. Decontaminarea pacientilor implic: scoaterea hainelor contaminate, splarea ntregului corp cu ap i spun iar pentru mediu se pot folosi ageni sporicidali, ca de exemplu 0,5 soluie de hipoclorit. Botulismul este cauzat de toxina botulinic, o neurotoxin puternic produs de Clostridium botulinum, bacil gram pozitiv. Transmiterea se face prin mncare contaminat, dar aerosolizarea toxinei poate fi un mecanism ales n bioterorism. Incubaia variaz de la 12-36 de ore n intoxicaia alimentar, 24-72 de ore n expunerea prin inhalaie. Nu se transmite de la persoan la persoan.Tratamentul const n antitoxina botulinic . Pesta este o boal bacterian cauzat de Yersinia pestis. Dispersia bolii se poate face prin aerosoli, prin folosirea de vectori (rozatoare infectate, purici) i de la persoan la persoan prin picturi aerogene. Incubaia dureaz ntre 2-8 zile prin vectori , 1-3 zile pentru transmiterea prin expunere pulmonar. Decontaminarea persoanei i a mediului este similar antraxului. Variola a fost eradicat n 1980. n lume exist dou locuri unde se g sesc culturi vii de virus variolic (CDC i unele facilitti din Rusia). Se transmite de la pacient la pacient prin picturi aerogene i prin contact cu leziunile cutanate. Incubaia este cuprins ntre 7-17 zile. Dintre toate acestea cel mai periculos este considerat Bacillus anthracis, cu excepia variolei. Sporii acestuia provoac boala numit antrax sau infecia crbunoasa. Pentru a fi eficienii sporii trebuie s fie transmi i sub forma unor aerosoli foarte fini, amestecai cu diferii ageni care s mpiedice aglutinarea. Dimensiunea care ar permite ptrunderea n alveolele pulmonare este de 5 m n diametru, numrul sporilor depinznd de m rimea particulelor. Majoritatea cercetrilor genetice s-au concentrat pe detectarea sporilor de antrax. Drago a elaborat n 2002 un protocol pentru detectarea rapid a sporilor de antrax n specimenele din exudatele nasofaringeale i din plgi. Studiile exudatelor au demonstrat c analiza Q-PCR are capacitatea de a detecta cel puin 25 de spori/ml diluentin aproximativ 90 de minute ncluznd i extragerea ADN-ului. Makino a filtrat 100 de litri de aer printr-un dispozitiv de monitorizare a aerului i apoi a introdus n membrana filtrului un singur spor de antrax. Dei singurul spor a fost detectat prin analiza PCR, abilitatea sa de a detecta aa o cantitate redusa de spori n aerul contaminat nu a fost validat. Bell n 2002 a realizat o analiz real time PCR pentru detectarea antraxului n care a mai introdus un control intern al amplificrii.Specificitatea analizei a fost validat pentru o serie de specii Yersinia. Acest test s-a dovedit a fi o unealt foarte folositoare pentru identificarea rapid a Yersiniei pestis n colonii. n ceea ce privete variola, dou analize RQ-PCR au fost descrise pentru detectarea virusului variolic amndoua avnd n centrul lor gena hemaglutininei. Analiza a fost realizat att pe SmartCycler ct i pe LC platforms. Specificitatea i sensibilitatea testelor au fost de 96,1% i 99,3% cu SmartCycler-ul i 99,5% respectiv 95,7% cu LC platforms. 4.1.5.3. Utilizarea PCR n bacteriologii PCR-ul ofer un avantaj evident fa de celelalte tehnici utilizate frecvent n laboratoare, n detectarea bacteriilor patogene, a viruilor sau a paraziilor. Acest lucru este valabil mai ales n cazul microorganismelor care nu cresc pe culturi bacteriene sau au o dezvoltare lent cum ar fi mycobacteriile, bacteriile anaerobe sau viruii, n cazul crora trebuie s se realizeze medii de cultur din esuturi sau din carne (bulionul de carne) pentru creterea

31

i dezvoltarea lor. Baza diagnosticului prin PCR const n detectrile microobiologice a agenilor infecioi i n deosebirea catenelor patogene de cele nepatogene (E. coli) prin existena sau absena unor gene specifice. S-au realizat primeri i pentru detectarea paraziilor intracelulari ca Toxoplasma gondi, Plasmodium falciparum i pentru Trypanosoma . n virologie au fost descrise un numr mare de analize PCR pentru virusurile imunodeficiente ntlnite la om. De asemenea se utiliza la detectarea unei afeciuni adesea ncpnata i foarte dureroas a copilriei numit otita medie localizat n urechea medie. Tehnica detecteaz n ADN-ul bacterian din lichidul din urechea mijlocie a copiilor infecia activ atunci cnd tehnicile standard de cultur nu o pot detecta. Boala Lyme manifestat prin inflamarea articulaiilor fiind foarte dureroase i cauzat de bacteria Borderrelia burgdorferi i transmis prin muctura unei cpue, este diagnosticat de obicei prin simptomele care apar. Boala Lyme mai este supranumit i "boala cu 1000 de fee" din pricina faptului c, afectnd ntregul organism, simptomele ei mimeaz foarte bine simptomele altor boli i reacia individual fa de agentul patogen este foarte diferit de la om la om. Cu ajutorul tehnicii PCR se poate afla cu exactitate ce cauzeaz simptomele prin prelevarea de ADN din lichidul din ncheieturile inflamate i astfel se poate aplica un tratament imediat evitndu-se complicaiile. Testul PCR este cel mai sensibil i mai exact pentru detectarea bacteriei Heliocobacter pylori , organismul cunoscut ca agentul cauzator de cele mai multe tipuri de ulcer stomacal. PCR-ul mai poate detecta trei tipuri diferite de boli cu transmitere sexual ntr-o singur repriza (ex. Herpes, Papillomavirus si Chlamydia) i poate chiar s diferenieze care catene de papillomavirus predispusun cancerul, ceea ce clar alte teste nu pot realiza. Peste 60 de protocoale PCR pentru identificarea agenilor patogeni au fost descrise pn astzi i cel puin 10 produse clinice sunt disponibile pentru detectarea organismelor invazive care cauzeaz boli ca tuberculoza, chlamydia, meningita virala, hepatita virala, SIDA i cytomegalovirusurile. Dintre bacteriile patogene care cauzeaz probleme respiratorii, Bordetella pertussis cauzeaz tusea convulsiv, care este ntlnit mai ales la adolesceni. Aceast bacterie este un organism pretenios care are o cretere foarte nceat i de aceea isolarea sa poate dura ntre 3 i 12 zile. Dac este detectat rapid atunci se poate stabili tratamentul i profilaxia persoanelor afectate. Aceast nevoie a dus la realizarea unor analize tipice att PCR clasice ct i RQ-PCR pentru o detectare foarte rapid a bacteriei. Reisch a descris un set de analize pentru aceasta dar sa dovetit c rezultatele erau pozitive i n cazul speciilor nrudite ca Bordetella holmesii sau Bordetella parapertusii. Cu toate acestea analiza PCR prezint o sensibilitate mult mai mare dect metoda clasic a culturilor bacteriene iar rata de detecie a fost aproape dublat. Testul RQ-PCR a demonstrat aceasta sensibilitate printr-o analiza comparativ n care 28 de pacieni au avut rezultate pozitive prin PCR i negative prin culturile bacteriene. De asemenea RQ-PCR a mai fost aplicat pentru detectarea directa a Mycobacterium tuberculosis prin amplificarea secvenei IS6110, element specific pentru aceast bacterie. Legionella pneumophila este agentul care cauzeaz o infecie pulmonar care poate fi foarte grav cu un tratament pe viaa. Infecia se ntlne te la pacienii compromii din punct de vedere imunitar i se transmite prin inhalarea bacteriei dintr-un mediu contaminat.Ocazional alte specii de Legionella cum ar fi Legionella micdadei, Legionella bozemanii, Legionella dumofii i Legionella longbeachae pot cauza pneumonie oportun. Chlamidya pneumoniae este un patogen intracelular care cauzeaz infecii ale tractului respirator la oameni. Se crede de asemenea c este responsabil de aproximativ 10% din cazurile de pneumonie. Ca i la celelalte cazuri diagnosticul pus pe baza testelor de serologie sau culturi celulare poate oferi rezultate neconcludente dar detectarea PCR este mult mai sigur i mai rapid. Detectarea meningitei bacteriene este o problem serioas deoarece aceasta cauzeaz o boal care afecteaz sistemul nervos central cu o rat a mortalitii foarte crescut . Trei bacterii sunt responsabile de aceast afeciune: Niesseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae i Haemophilus influenzae.Metoda tradiional de detectare necesit extragerea unei cantiti de lichid cerebrospinal prin puncie lombar dar rezultatul ar fi durat 3-4 zile. Primul test PCR care a fost descris se baza pe electroforeza n gel sau pe PCR-ELISA i putea folosi ca prob de cercetat snge, plasm sau ser. Detectarea patogenilor gastrointestinali cum ar fi Escherichia coli care a fost identificat ca agentul cauzator al colitei hemoragice si infecii urinare sau chiar insuficien renal. Aceasta poate fi isolat relativ uor utiliz nd un mediu selectiv din agar dar pe acesta mai pot aprea i alte serotipuri ale altor boli. Au aprut metode alternative de detectare bazate pe PCR-ul convenional care prezint o varietate de gene int printre care i genele Shiga toxin produse de E. coli. O analiz RQ-PCR a fost descris de Sharma i Dean- Nystrom n 2003 i pare a fi promitoare ca o unealt pentru testarea rapid a alimentelor sau a materiilor fecale n cutarea genelor caracteristice acestei bacterii. O alt bacterie de acest tip este Clostridium difficile cunoscut pentru provocarea la om a diareei asociat cu antibiotice (AAD - antibiotic asociated diarrhea) i afeciuni intestinale precum colita i colita pseudomembranoas. mpreun cu alte trei echipe, cercettorii de la Universitatea McGill au reuit s secvenieze genomul uneia dintre cele mai periculoase tulpini a microbului Clostridium difficile, cunoscut i sub numele de C. difficile, ce a ucis 2000 de locuitori ai Quebecului ncepnd cu anul 2003. n Marea Britanie i Tara Galilor , ntre anii 1999 i 2006 numrul deceselor atribuite acestei infecii a fost de 6480. n mod normal C. difficile se gsete n intestinul gros la

32

aproape 3% din populaia adult sntoasa. El se rspndete prin intermediul suprafe elor sau a obiectelor contaminate. Bacilul poate produce inflamaia peretelui intestinal care produce sngerare i poate duce chiar la perforarea peretelui intestinal. Bacilul elaboreaz toxine pe care le rspndete n tot organismul. Putem spune c a avut loc o explozie de interes pentru aceast tehnic de la introducerea ei i de la publicarea a ctorva sute de rapoarte care descriu aplicabilitatea sa n clinica bacteriologic , parasitologic (pentru detectarea speciilor de Cryptosporidium, Cyclospora, Entamoeba, Plasmodium, Encefalitozoon, Enterocytozoon, Leishmania, Toxoplasma, Trypanosoma, . a.) i virologic (detectarea viruilor care produc boli respiratorii cum sunt influenza virus, parainfluenza virus, virusul sinciial respirator, adenovirusuri i cel mai recent descoperit metapneumovirusul, virui care produc herpesurile, infecii entrovirale, febre hemoragice, etc.) 4.1.5.4. Utilizarea PCR n medicin Aceast tehnic se aplic pentru detecia frecvenei sczute de celule maligne n leucemii, datele cantitative PCR servind la mbuntirea semnificativa a analizei eficienei tratamentului. Detecia bolii reziduale minime (MRD) la pacienii cu leucemie limfoblastic acut (ALL) i leucemie mielogen cronic (CML) ofer indicii clinice relevante asupra eficacitii tratamentului. Informaia sensibil cantitativ MRD poate fi utilizat pentru clasificarea grupelor de risc n ALL : asemenea date cantitative i sensibile MRD pot fi acum obinute prin analiza RQ-PCR a aberaiilor cromozomale specifice leucemiilor ca inte PCR (CML, subseturi de ALL etc.), precum i regiunilor joncionale ale genelor imunoglobulinelor (Ig) i genelor receptorilor de celule T (TCR) care sufer rearanjamente n ALL. Dac rearanjamentele regiunilor joncionale ale genelor Ig i TCR sunt utilizate ca inte pentru PCR n detecia MRD pot fi realizate analize cu proba ASO (oligonucleotid cu specificitate alelic) i analize cu primer ASO. n primul caz, proba TaqMan este poziionat n regiunea de jonciune (DH) aflat ntre VH i JH i utilizat n combinaie cu primeri din linia germinal, implicnd faptul c proba TaqMan este o prob ASO, adic un oligonucleotid cu specificitate alelic care detecteaz produii PCR specifici leucemiei din cadrul unui fundal de produi PCR, derivai din rearanjamente genice Ig policlonale sau TCR din celulele normale. Aceast abordare impune desemnarea de noi probe TaqMan, pentru fiecar e rearanjament. n abordarea cu primerul ASO, proba TaqMan i unul dintre primeri sunt poziionati la secvenele liniei germinale, pe c nd celalalt primer este localizat n regiunea joncional (primer ASO). Pe aceast cale, se urmrete amplificarea specific a regiunii joncionale specifice leucemiei. -4 Sensibilitatea metodei este mare, putnd fi depistate celulele leucemice cu o rata de 10 (o celul leucemic la 4 10 celule normale). Analiza nainte i dup instituirea unui tratament specific ofer medicului o imagine clar, obiectiv, cantitativ, a eficienei acestui tratament. n toate cazurile, se utilizeaz o gen martor, de control, cum ar fi gena albuminei pentru ADN sau Abelson pentru ARN, spre a cuantifica cantitatea tota l de ADN/ARN i amplificabilitatea sa. Aceast analiz se utilizeaz n medicin pentru depistarea bolilor genetice precum imunodeficiena, detectarea celulelor tumorale, detecia citomegalovirusului la pacieni, dup transplantarea mduvei osoase, etc. De asemenea se poate detecta virusul SIDA n primele sptmni ale infeciei, mai repede dect prin testul ELISA, pentru c tehnica PCR caut ADN-ul specific virusului nu indicii, ca ELISA cum ar fi anticorpii prezeni la apariia infeciei. n afara unei detecii mult mai rapide este i foarte exact, foarte specific comparativ cu metodele standard de detecie.

4.2. ELECTROFOREZA 4.2.1. PRINCIPIUL ELECTROFOREZEI Termenul de electroforez descrie migrarea unei particule ncrcate sub influena unui cmp electric. (Andrews A.T., 1996) Speciile ionice dintr-un mediu fluid supuse cmpului electric prezint energii poteniale corespunztoare sarcinei lor i intensitii cmpului. Particulele se vor deplasa mai lent sau mai rapid n funcie de caracteristicile lor proprii, pe direcia liniilor de for ale cmpului electric i n sensul determinat de sarcin. Drumul de migrare va fi parcurs astfel cu viteze diferite rezultnd, n final, separarea. Denumirea de electroforez provine din asocierea cuvntului grec electron (electric) cu cel latin phore (purttor), evideniindu-se astfel rolul esenial al cmpului electric n procedeul descris. (Jercan E., 1984) n condiii de vitez constant, fora motrice exercitat asupra particulei reprezint produsul dintre sarcina efectiv a particulei i gradientul de potenial E i este echilibrat de rezistena de frecare f a mediului. Mobilitatea electroforetic m este definit drept distana d parcurs n intervalul t de o particul sub influena gradientului de potenial E

33

Distanele de migrare msurate sunt proporionale cu mobilitile electroforetice, ns compararea direct a diferitelor experimente se poate face doar dac produsele tE sunt egale n toate cazurile. De aici decurge i faptul c, n mod ideal, dac toate celelalte condiii sunt identice, un al doilea experiment, desfurat la dublul gradient de concentraie (tensiunii) ntr-un timp redus la jumtate, va avea ca rezultat migrarea particulei la aceeai distan ca n primul experiment. Cu toate acestea, relaia este doar n parte adevrat, ea fiind influenat de un numr de factori ce includ ndeosebi efectele excesului de cldur generat de creterea curentului. Cele mai multe molecule de dimensiuni mari la care ne referim au n structura lor att grupri anionice ct i grupri cationice, din aceast pricin fiind numite amfioni. Constantele de disociere vor diferi mult, sarcina net a unei asemenea molecule va depinde de pH-ul mediului, care n acest fel va influena i mobilitatea moleculei. Fora ionic determin potenialul electrocinetic care va reduce sarcina net la valoarea sarcinii efective, tiindu -se c mobilitatea particulei cu sarcin este aproximativ invers proporional cu rdcina ptrat a forei ionice. Forele ionice sczute permit o rat nalt a migrrii, n timp ce forele ionice nalte dau rate mai lente, dar practice i zone mai nete de separare, comparative cu tampoanele de trie ionic redus. Temperatura ridicat produce creterea vitezelor de difuzie a ionilor i totodat, o cretere a mobilitii de pn la 2-4% spor de temperatur per grad Celsius. n acela timp, vscozitatea mediului scade o dat cu creterea temperaturii. n felul acesta, scade rezistena electric i, la tensiune constant, curentul va crete, sporind i mai mult producerea de cldur. Din aceasta cauz, alegerea triei ionice a tamponului se dovedete a fi hotrtoare, ea determinnd efectiv puterea electric ce poate fi aplicat sistemului. ndeprtarea cldurii generate de trecerea curentului electric constituie una dintre problemele majore n cele mai multe forme de electroforez, rcirea producnd inevitabil un gradient de temperatur ntre prile mai bine rcite ale mediului i celelalte. Datorit factorilor menionai, orice diferen de temperatur va produce distorsionarea benzilor de molecule separate, datorit variaiilor vitezei de migrare prin mediu. n formele de electroforez realizate n tuburi cilindrice sau pe plci, rcirea este mai eficient la extremitile mediului dect la mijlocul lui, benzile astfel rezultate fiind arcuite. Cel mai bine este ca experimentele de electroforez s se defoare la temperatur constant, de mare ajutor fiind utilizarea izolaiilor pe coloanele de preparaie, ca i a incintelor de rcire. Electroforeza se refer doar la deplasarea ionilor printr -un mediu, astfel nct factorii de influen luai n discuie pn acum se aplic la toate formele de electroforez, fie ea n soluie liber, ca de pild electroforeza frontal, fie n medii stabilizate, cum sunt gelurile de amidon, i poliacrilamid, acetatul de celuloz sau hrtia. Cu toate acestea, la utilizarea unui mediusuport, pot intervene factori suplimentari n mobilitatea i rezoluia separrii. Acetia se refer la efectele de absorbie pe suport, neomogenitile matricei -suport, schimburile ionice cu gruprile ncrcate electric ale moleculelor-suport i electroendosmoza. Aceasta apare n general datorit gruprilor ncrcate electric din materialul-suport. De pild hrtia conine un mic numr de grupri carbonil, iar agaroza posed grupri sulfonice acide. n tampoanele neutre sau bazice, n cursul electroforezei, acestea vor fi ionizate i apoi atrase spre anod. ntr-un mediu solid, deplasarea spre electrozi este, firete, imposibil, nct efectul este compensat prin migrarea ionilor H spre catod, ceea ce rezult ntr -o deplasare a solventului fa de mediul-suport. Se poate deci vedea c electroforeza reprezint un concept extrem de simplu, dar c naintarea particulelor ncrcate electric sau a ionilor prin mediu este influenat de un numr surprinztor de factori. Totui, tocmai datorit acestor numeroase influene, principiul general poate fi ntors n folosul cercettorului. De exemplu, fr intervenia factorului dimensional nu ar exista separarea particulelor mari de cele mici cu aceeai sarcin electric. O matrice-suport neomogen este deliberat introdus n tehnica electroforezei n gradient de gel, pentru a facilita separarea, n timp ce egalizarea sarcinilor gruprilor anionice i cationice n scopul producerii de molecule lipsite de sarcin net constitue cerina fundamental a localizrii izoelectrice. (Andrews A.T., 1996)

4.2.2. ELECTROFOREZA FRONTAL I ZONAL Dup cum electromigrarea se desfoar n absena unui mediu stabilizat, adic n mod liber n coloan de lichid sau n prezena mediului de stabilizare (foi, membrane, strat subire) rezult principala clasificare a metodelor electroforetice: - electroforeza n mediu liber, n coloan de lichid sau electroforeza cu front mobil (frontal); - electroforeza pe medii stabilizate sau electroforeza n zone (zonal).

4.2.2.1. Elecroforeza frontal

34

Electroforeza n mediu liber- frontal ofer rezultate corelate cu punctele izoelectrice i n funcie de mobilitile electrice ale particulelor ncrcate. Procedeul este util pentru obinerea unor informaii privind compoziia unor compui labili, n special de interes biochimic, deoarece nu implic nici o alterare a si stemelor iniiale. Astfel se pot studia substane cu caracteristici electroforetice nete, cum sunt : proteine, enzime i compui coloidali. Pe lng faptul c nu conduce la separri complete, acest procedeu prezint o serie de probleme incluznd dificulti legate de instabilitatea fronturilor care delimiteaz fraciunile i anomalii generate de factori perturbtori cum sunt: gradienii de concentraie, de densitate, gravitaionali dar mai ales curenii de convecie care pot provoca amestecarea spontan a sistemului. Electroforeza n mediu liber sau frontal constitue procedeul de separare bazat pe electromigrarea speciilor ionice ntr-o coloan de lichid n care deplasarea are loc n mod liber. n final, diferitele specii caracterizate prin acela comportament electroforetic se grupeaz n fraciuni delimitate prin fronturi. Aceste trsturi care particularizeaz metoda i confer i denumirea. Prin lucrrile sale, Tiselius a adus nbuntiri substaniale electroforezei frontale, n scopul obinerii uno r fronturi nete, bine delimitate i uor detectabile. Contribuiile sale principale sunt urmtoarele: - control termic riguros. S-a constatat c cele mai bune rezultate se obin cnd temperatura de lucru este apropiat de cea corespunztoare densitii maxime a soluiei tampon, deoarece la aceast temperatur variaiile de densitate sunt minime, suprimndu-se astfel covecia termic; - utilizarea unui sistem optic sensibil pentru urmrirea deplasrii fronturilor de separare; - folosirea unor celule compartimentate i a electrozilor reversibili n vase mari, pentru a preveni contaminarea cu produii de reacie. Prima aparatur utilizat include celula electroforetic de tip Tiselius format dintr-un tub de sticl n forma literei U. Celula este umplut cu o soluie tampon i este meninut la o temperatur constant, de preferin +4C deoarece s-a constatat c, n condiiile densitii maxime a apei se nregistreaz cea mai bun stabilitate a fronturilor. Soluia este omogen cu excepia prii care conine proba. La trecerea curentului electric, particulele ncrcate migreaz cu viteze diferite spre electrozi, n funcie de sarcina i caracteristicile lor, realizndu -se o serie de suprafee de separare - fronturi care despart spaii corespunztoare numrului de componeni. Separarea se poate urmri prin determinarea unor proprieti fizico -chimice ale speciilor care migreaz, n mod obinuit prin msurarea indicelui de refracie. La analiza unui amestec format din substane anionice compartimentul anodic i tubul trebuie s conin un electrolit care s includ o specie anionic selecionat cu o mobilitate superioar celor corespunztoare componenilor. Speciile anionice se deplaseaz spre anod nedepind electrolitul purttor n ordinea mobilitii lor. Rezultatul se poate ilustra printr-un grafic similar de developare.

Separarea prin electroforez liber a unor specii anionice: a- introducerea probei n compartimentul catodic; b- realizarea separrii pariale; c- reprezentarea schematic a analizei frontale ( d- distana parcurs).

Procesul electroforezei frontale este aplicabil substanelor cu mas molecular mare, deoarece acestea prezint conductibiliti moderate neinfluennd valoarea cmpului aplicat. Conductivitatea n sistem trebuie s fie asigurat de mediul de migrare fr s se dezvolte o cldur semnificativ. Electrolitul purttor este constituit dintr-o soluie tampon, deoarece nu este permis variaia pH -ului care poate interveni ca efect perturbator. n mod practic, electroforeza liber este eficient numai n condiii izoterme prin aplicarea unui cmp electric constant i fr variaii sensibile ale pH-ului. Dac se urmrete determinarea mobilitii electroforetice absolute, erorile pot fi estimate i corectate. Se subnelege c aplicarea procedeului n scop preparativ este posibil numai pentru colectarea speciilor cu mobiliti extreme specia cu mobilitate mai mare i specia cu mobilitatea cea mai mic. Dei prezint o serie de dezavantaje, metoda electroforezei n mediu liber este util pentru fracionarea i caracterizarea unor materiale biologice i este indispensabil n cazul sistemelor labile, mai ales dac acestea se

35

altereaz ntr-un mediu anticonvectiv (pe medii stabilizate). Totodat procedeul permite deteminare a neomogenitii coloizilor mono i polidiperi i evaluarea fenomenelor care au loc la suprafaa de separare solvent soluie sau soluiesoluie. De fapt este singura metod indicat pentru abordarea studiului pseudocoloizilor (suspensii, emulsii) care sedimenteaz foarte repede. Prin utilizarea aparatelor moderne procedeul poate fi aplicat n scopuri preparative.

4.2.2.2. Electroforeza zonal Electroforeza pe medii stabilizate zonal ocup un loc important printre metodele de analiz datorit eficienei sale deosebite, simplitii, caracterului microanalitic i capacitii superioare de rezoluie a componenilor chimic asemntori. Electroforeza zonal s -a dovedit foarte fecund pentru evaluarea mobilitilor, identificarea i determinarea unor categorii diversificate de substane electric ncrcate att macromoleculare ct i a celora cu mas molecular mic, permind separarea integral a amestecului de analizat sub aciunea cmpului electric i ntr-un mediu electrolitic fixat pe un suport poros. Aplicaiile electroforezei zonale n scopuri analitice de separare sau n scop preparativ dateaz din 1950 dei metoda se bazeaz pe experienele lui Lodge (1886) care se refer la studiul migrrii ionilor simpli ntr -o mas de gel. Ca mediu anticonvetiv se utilizeaz n afar de gel hrtia de filtru de calitate superioar, membrane, strat subire etc. (Jercan E., 1984) Tehnicile zonale pot fi aplicate la toate substanele solubile i ncrcate i prezint numeroase avantaje: vitez ridicat; posibilitatea separrii mai multor probe simultan; echipament i tehnic simpl; identificarea specific a componenilor. n funcie de tensiunea aplicat celulei electroforetice, electroforeza zonal poate fi realizat la: - tensiune joas; - tensiune nalt; Electroforeza la tensiune joas : Aceasta are un principal avantaj, acela c necesit o aparatur foarte simpl, format dintr-o camer de electroforez i un redresor de curent continuu stabilizat. Dup separare, o etap important este vizualizarea componenilor separai din amestec. n acest scop se utilizeaz diferii reactivi analitici care dau reacii de culoare cu componenii separai. De exemplu pentru proteine se pot utiliza soluii de albastru de bromfenol iar pentru acizi nucleici se utilizeaz bromur de etidiu. Elecroforeza la tensiune nalt: Metodele electroforetice la tensiune nalt se utilizeaz atunci cnd se dorete a scurta timpul de lucru i a mri eficiena de separare a componenilor din amestec. Principalul dezavantaj al utilizrii electroforezei la tensiune nalt pentru separarea componeilor biochimici este datorat faptului c odat cu creterea gradientului de potenial are loc i creterea cantitii de cldur generate, ceea ce poate duce la degradarea probei n timpul procesului de separare. Acest dezavantaj poate fi mult minimalizat prin stabilirea riguroas a condiiilor de lucru. (Tofan L., Toma O. i colab, 2007) n principiu tehnica electroforezei zonale const din migrarea sub aciunea cmpului electric a speciilor ionizat e la pH-ul electrolitului cu care este mbibat suportul inert. Ca urmare a mobilitilor diferite i datorit prezenei suportului inert, componenii se separ n zone distincte i net conturate. Comparativ cu electroforeza n mediu liber, electroforeza pe medii stabilizate prezint urmtoarele avantaje: - se realizeaz o separare complet a tuturor componenilor din amestecul de analizat, inclusiv a celor cu mobiliti intermediare; - se poate aplica la studiul substanelor cu mas molecular mic i substanelor macromoleculare; - necesit cantiti mici de prob, fiind o metod convenabil pentru investigarea produselor care nu se pot colecta n proporii ridicate (substane biologice); cnd procedeul are un obiectiv preparativ, se poate extinde cantitatea de prob de la scar analitic, la cea preparativ fr a compromite separarea; - nu este necesar s se menin n mod riguros temperatura constant, deoarece suportul inert micoreaz mult perturbaiile induse de convecia caloric. - se realizeaz uor cu aparatur ieftin necesitnd o manipulare simpl i nu impune o supraveghere continu; - permite realizarea unor separri reproductibile la scar preparativ; - se pot analiza concomitent mai multe probe, iar durata scurt a unei separri permite realizarea zilnic a mai multor serii de determinri. Pe lng aceste avantaje, electroforeza zonal prezint i o serie de dezavantaje. Unul dintre cele mai importante inconveniente rezult din efectul geometric al structrurii mediului, care face ca particulele ncrcate s parcurg drumuri mai lungi comparativ cu cele strbtute n mediu omogen. Un alt inconvenient este dat de fluxul electroosmotic al soluiei electrolitice care se suprapune migrrii electroforetice alternd valorile mobilitilor. Transportul electroosmotic impune introducerea unor factori de corecie.Totodat, mediul anticonvectiv genereaz interacii cu substaele care migreaz, acestea fiind manifestate prin fenomene de absorbie. Absorbia reversibil sau lent reversibil este inoportun deoarece determin apariia unor prelungiri ale zonelor sau chiar o

36

imobilizare complet. La msurarea mobilitilor electroforetice mai pot interveni o serie de erori provenite din neuniformitatea conductibilitii electrice a mediului i a pH -ului soluiei tampon n timpul determinrii, ca o consecin a variaiilor de temperatur, a evaporrilor i a condensrilor. Electroforeza pe medii stabilizate include principiile electroforezei frontale i caracteristicile cromatografiei. Diferenele ntre mobilitile electroforetice pe medii suport reies din mobilitile electroforetice n mediu liber i din comportamentele cromatografice. Multe studii au verificat conexiunea dintre datele cromatografice i cele electroforetice pe medii stabilizante i posibilitatea corelrii lor. Din msurtorile efectuate pentru determinarea izotermelor s -a confirmat faptul c nu este o diferen fundamental ntre electroforez i cromatografie din punct de vedere al interaciunii substanei cu faz fix. n cromatografie viteza fazei mobile este la fel pentru toi componenii, separarea rezultnd din diferenele ntre coeficienii de distribuie interfazic, iar n electroforez gradientul de potenial este acelai pentru toate speciile, separarea avnd loc datorit diferenelor de mobilitate.

4.2.2.2.1. Medii suport n electroforeza zonal Ca medii suport n elecroforeza zonal se poate utiliza o mare varietate de medii de stabilizare sub form de granule, foi sau geluri astfel ca: hrtie de filtru, acetate de celuloz, gelatin, agar, agaroz, gel de amidon sau gel de poliacrilamid. Suportul electrolitului n electroforez trebuie s ndeplineasc mai multe condiii. Printre cele mai importante menionm: trebuie s fie stabil i inert chimic fa de substanele cercetate i cele din electrolitul purttor, s aib o putere de absorbie neglijabil, structur omogen, transparen i grosime egal pentru a oferi un mediu uniform pentru migrare i pentru evaluri ct mai precise a fraciunilor separate proprieti mecanice bune pentru o manipulare uoar. Electroforegramele oinute la separarea aceluia sistem de substane pe diverse medii suport pot s se deosebeasc mult datorit diferenelor forelor de rezisten opuse pe parcursul drumurilor de migrare oferite, coliziunilor, a fenomenelor de absorbie. Alegerea mediului potrivit se face n funcie de proprietile fizice i chimice ale amestecului de analizat n corelaie cu soluia tampon utilizat. Gelurile sunt medii suport recomandate mai ales n scopuri analitice. n continuare se vor prezenta pe scurt cteva din principalele materiale utilizate mai des ca medii suport n electroforez. Pentru electroforez se utilizeaz o hrtie de filtru special . nsuirile cele mai importante ale hrtiei electroforetice sunt: puritatea, omogenitatea, porozitatea i rezistena. Acetatul de celuloz este folosit sub form de membran. Structura membranei este fin, subire i microporoas, prezentnd nsuiri neabsorbante. Fa de hrtia de filtru, membranele de acetate de celuloz ofer separri nete fr fenomene de difuziune. Gelul de amidon se folosete ca mediu suport n electroforeza zonal. Pe acesta se pot realiza rezoluii deosebit de bune prin participarea lui ca efect de inhibare a difuziunii. Amidonul poate fi utilizat n electroforez sub form de bloc format din granule de amidon i soluie tampon sau sub form de gel preparat prin nclzirea amidonului chiar n soluia tampon. Gelul de poliacrilamid este probabil cel mai eficient mediu stabilizant utilizat n electroforeza zonal. Cu ajutorul lui se obin zone compacte uor de evaluat deoarece nu prezint un fenomen de absorbie semnificativ. Separarea se realizeaz ntr-un timp mai scurt datorit dispersiei redus a zonelor. Gelul de poliacrilamid este transparent, rezistent, flexibil i relativ uor de mnuit si admite utilizarea unei varieti largi de soluii tampon. n principal exist dou tehnici care au la baz gelul de poliacrilamid. Una dintre ele utilizeaz foile de gel ca mediu stabilizant, iar cealalt utilizeaz gelul sub form de bare verticale pentru electroforeza n disc. Gelul de agar este folosit la separarea electroforetic a vitaminelor, carbohidratilor, acizilor nucleici etc. Cel mai important domeniu de aplicaie a gelului de agar ca mediu de stabilizare este cel al tehnicii imunoelectroforezei. Principalele caracteristici ale gelului de agar sunt: furnizeaz rezoluii superioare celor obinute pe hrtie, dar inferioare celor date de gelul de poliacrilamid i amidon; gelul de agar se prepar destul de uor, cu concentraii mici de agar (aproximativ 2%). Atunci cnd rezultatele nu sunt reproductibile este necesar purificarea lui pentru a elimina impuritile interferente. Prezint un fenomen de electroosmoz mare. Datorit concentraiei mici de gel i a porozitii relativ mari, mobilitile electroforetice au valori similare celor obinute prin electroforeza liber. Gelul este transparent i se poate colora uor. Permite separarea unor cantiti mai mari , ceea ce l face acesibil scopurilor micropreparative. Suportul este format prin simpla dizolvare a gelului de agar n tampon i ntinderea lui pe plci de sticl, lame pentru microscop sau benzi de plastic transparente. Electroforegramele care s-au obinut nu se altereaz i se pot pstra un timp ndelungat. Pentru a putea fi ntinse gelurile pe plac este necesar s se realizeze pelicule sau straturi ct mai omogene i uniforme. (Jercan E., 1984)

37

4.2.3. ELECTROFOREZA PE GEL Aici migrarea componenilor din proba de analizat se realizeaz pe un suport semisolid, care este un gel polimeric. Separarea se realizeaz ca urmare a deplasrii diferite a componeilor pe suportul de gel, care se afl n contact cu o soluie de electrolit (soluie tampon), sub aciunea curentului electric. Realizarea unei separri electroforetice pe gel, din punct de vedere experimental presupune parcurgerea unor etape: prepararea gelului i pregtirea suportului pentru electroforez; aplicarea probei ce urmeaz a fi separat; realizarea migrrii componenilor probei, sub aciunea curentului electric; vizualizarea spoturilor n urma separrii; efectuarea analizei cantitative i calitative a componenilor din amestec.

4.2.3.1. Prepararea gelurilor Gelurile folosite n electroforez sunt obinute prin polimerizare direct urmat de cele mai multe ori de reticularea lanurilor polimerice. Gelul, pentru a putea fi utilizat n separrile electroforetice, trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: s fie chimic inert n cursul procesului de separare; s permit eliminarea curenilor de convecie i difuzie astfel nct zonele de separare s ramn net delimitate; s poat fi preparat repede; s aib proprieti uniforme; s fie reproductibil. Aceste condiii cerute sunt practic total satisfcute de gelul de agaroz , gelul de poliacrilamid i de gelul de amidon, aceste geluri fiind cele mai de folosite n separrile electroforetice. n mediile gelificante, trecerea oricrei particule este ntrziat chiar de structura suportului de gel, aceast ntrziere fiind direct proporional cu dimensiunea porilor din reeaua gelului. Din aceast cauz, eficiena procesului de separare electroforetic depinde att de dimensiunile ct i de sarcina moleculelor din proba de analizat. De exemplu: n gelurile de agaroz dimensiunea porilor este mare, astfel nct influena dimensiunii porilor, este mai puin evident dect n cazul gelurilor de amidon sau de poliacrilamid. Pentru a se obine geluri cu dimensiuni controlate a porilor i reductibile din punct de v edere analitic se utilizeaz ageni de reticulare. Aceti ageni de reticulare sunt monomeri organici, care pot conine n molecula lor grupri funcionale i care n timpul procesului de polimerizare despart lanurile polimerice, formnd caviti cu dimensiuni mari. Un alt factor ce influeneaz eficiena separrii este temperatura la care are loc polimerizarea gelului. Dac aceste geluri sunt polimerizate la temperaturi mici (0-4C) se obin geluri neomogene i nereproductibile.Temperaturile ridicate (peste 50C) sunt i ele neadecvate, deoarece genereaz lanuri polimerice scurte i neelastice, care influeneaz migrarea componenilor din proba de analizat. Din aceste cauze n electroforeza pe gel, gelul este obinut prin polimerizare la temperaturi cuprinse ntre 25 i 30C. n electroforeza pe gel, gelul poate fi dispus sub trei forme geometrice: plci orizontale, plci verticale i cilindrii verticali, fiecare avnd avantajele i dezavantajele ei. a. Electroforeza cu geluri plate orizontale: n acest caz gelul se obine ntr-o matri, care are grosimea exact stabilit n funcie de natura probei. Pe placa obinut se decupeaz nulee n care se pun volume cunoscute de prob de analizat. Placa de gel se monteaz ntr-un tanc obinuit de electroforez, iar contactul electric ntre gelulplac i soluia tampon se face cu ajutorul unor bucele de vat sau hrtie de filtru. (Figura 2). Un astfel de montaj are urmtoarele avantaje: - proba se poate aplica n orice punct de pe plac, fr a fi necesar cunoaterea direciei de migrare a componenilor; - aparatura de care este nevoie nu este costisitoare.

38

Figura 2. Aparatura utilizat n electroforeza cu geluri plate orizontale b. Electroforeza cu geluri plane verticale: n aceast metod plcile de gel sunt prinse ntre dou plci de sticl sau plexiglas. Plcile sunt montate n aparat cu ajutorul unor garnituri de cauciuc i introduse n soluia tampon. (Figura 3). Avantajele utilizrii acestei tehnici sunt: - aparatura este simplu conceput; - se pot monta simultan mai multe plci, permindu -se analiza simultan a mai multor probe; - montarea plcilor de gel verticale poate fi modificat, n funcie de natura probelor de analizat.

Figura 3 A Aparat utilizat pentru electroforeza cu geluri plate verticale B (Schema) c. Eelctroforeza cu geluri cilindrice: polimerizarea se face n tuburi de sticl (cu diam. de 4-5 mm i o lungime de 7-11 cm), iar cilindrii de gel obinui sunt montai vertical ntre dou compartimente cu tampon care conin electrozi. (Figura 4). Pentru obinerea unei separri eficiente i reproductibile este necesar ca toate tuburile s aib dimensiuni identice, s fie absolut verticale, s aib aceeai cantitate de gel i suprafaa gelului s fie perfect plan.

39

Figura 4. Montajul experimental n electroforeza cu geluri cilindrice

4.2.3.2. Alegerea unei soluii tampon n metodele de electroforez, tamponul electroforetic reprezint soluia care asigur transportul curentului electric de la surs, la placa de gel unde este depus proba de analizat. Migrarea componenilor din prob are loc doar atunci cnd acetia posed sarcin electric, este normal ca i tamponul electroforetic s asigure prezena componeilor din prob n form ionic. Pentru a se alege un tampon electroforetic adecvat trebuie avut n vedere urmtoarele: - n cazul n care unele dintre componentele probei devin instabile sau precipit la o anumit valoare de pH, acea valoare trebuie evitat n timpul separrii; - n soluii libere, cu ct pH-ul tamponului electroforetic este mai diferit dect cel al punctului izoelectric cu att mobilitatea biomoleculelor crete. Din aceast cauz cnd se analizeaz un amestec necunoscut se prefer utilizarea unui tampon cu pH extrem, care s permit deplasarea tuturor componenilor n acela sens; - de obicei biomoleculele cu caracter bazic se separ la pH acid, unde au mobilitate maxim, iar biomoleculele cu caracter slab acid (pH cuprins ntre 4 i 7,5), se separ n tampoane cu pH bazic. - tampoanele electroforetice trebuie s aib o trie ionic suficient ca s poat menine proba n soluie i s asigure o capacitate de tamponare optim. De cele mai multe ori prezint o trie ionic cu valori cuprinse ntre 0,05-0,1M, dar se pot utiliza i concentraii mai sczute pn la 0,025M, sau mai mari de pn la 0,5M. n momentul n care gradul de separare a componenilor este nesatisfctor, pot fi utilizate tampoanele multifazice care pot mbuntii separarea. Tampoanele multifazice sunt preferate mai ales atunci cnd se analizeaz amestecuri complexe. Acestea se utilizeaz cu succes atunci cnd n timpul separrii pH -ul trebuie meninut constant n limite foarte stricte; cnd trebuie s se evite inactivarea probei; cnd se realizeaz separarea selectiv a unui anumit component din prob i pentru experimente preparative.

4.2.3.3. ncrcarea probelor n gel n momentul n care se folosesc geluri i soluii tampon omogene, n primele etape ale electroforezei nu se realizeaz concentrarea componenilor din proba de analizat. Astfel este important s se utilizeze volume foarte mici de prob (20-25l) care s se aplice n substraturi subiri. Odat cu aplicarea probei, pe suportul de gel se pun i cantiti foarte mici de colorant trasor. Acest colorant poate migra n timpul electroforezei cu o vitez mult mai mare dect oricare dintre componenii probei de analizat i arat momentul de frit al separrii, de obicei cnd colorantul ajunge la 5 cm de marginea superioar a gelului. Poziia iniial a colorantului trasor este de fapt punctul de referin, fa de care se msoar deplasarea componenilor din prob. Dup aplicarea probei, electroforeza trebuie s nceap imediat, pentru a se evita difuzia componenilor din prob n masa de gel.

4.2.3.4. Colorarea gelului dup electroforez

40

Dup ce s-a ncheiat electroforeza, se ntrupe curentul electric i gelul este ndeprtat din aparat pentru a se localiza componentele separate. Localizarea i vizualizarea se face prin colorare folosindu -se un colorant adecvat.Acesta este reprezentat de fapt de amestecuri ce conin o substan organic ce formeaz cu anumite componente din prob produi colorai ce sunt uor de identificat. Pentru a se colora gelurile sunt introduse n bi ce conin amestecul de colorare pentru cel mult 24 de ore, timp n care poate fi necesar schimbarea de mai multe ori a colorantului. n practica experimental se prefer metodele care coloreaz doar zonele din gel n care se afl componenii separai n urma electroforezei, i mai puin cele ce coloreaz ntreg gelul. Indiferent de metoda folosit se produce o absorbie nespecific de fond, care trebuie redus printr -o etap de decolorare pentru ca benzile de pe placa de gel s poat fi vizualizate si eventual cuantificate. Gelurile pot fi decolorate prin splare sau printr-o electroforare ulterioar. Splarea const n ndeprtarea colorantului prin imersarea gelului intr-un volum mare de solvent adecvat, iar decolorarea electroforetic const n plasarea gelului ntre doi electrozi, astfel nct potenialul electric s se aplice prin geluri. A doua etap se aplic numai cnd componentele separate din proba de analizat sunt uor sau complet fixate n etapa de c olorare.

4.2.4. TIPURI DE ELECTROFOREZ 4.2.4.1. Electroforeza acizilor nucleici n geluri de agaroz i poliacrilamid Electroforeza n gelurile de agaroz i acrilamid reprezint metoda standard de analiz a acizilor nucleici. Aceast metod este simpl, rapid si este capabil s diferenieze fragmente care difer cu numai 0,2% n lungime. Electroforeza apare sub influena cmpului de curent astfel nct moleculele de acizi nucleici migreaz n direcia electrodului avnd sarcin electric diferit. Mobilitatea electroforetic a acizilor nucleici este determinat de mai muli parametri, dar n special moleculele de ADN liniar dublu catenar migreaz prin gel la o rat care este invers proporional cu log10 al numrului de baze perechi, i astfel moleculele mai lungi migreaz mult mai ncet din cauza forelor de frecare. Mobilitatea electroforetic mai este influenat i de ali factori cum ar fi: concentraia de agaroz, conformaia moleculei de ADN, prezena bromurii de etidiu n gel i a tampo nului de electroforez, voltajul aplicat, tipul de agaroz i tipul de tampon de electroforez. Intercalarea bromurii de etidiu determin o diminuare a sarcinii negative a ADN, producnd n acelai timp cretera n lungime a moleculei dar i creterea duritii ei. Rata de migrare a complexului se reduce cu un factor de 15%. La voltaj mic, rata de migrare a moleculelor lineare este proporional cu voltajul aplicat. Pe msur ce puterea cmpului electric crete, i mobilitatea moleculelor cu greutate molecular mare crete difereniat. Se reduce astfel intervalul de separare n gelul de agaroz odat cu creterea voltajului. Rezoluia maxim se obine prin rularea gelurilor la concentraii mai mici de 5-8%. n ceea ce privete tipul de agaroz exist dou clase importante de agaroz: agaroza standard i agaroza cu temperatur de topire sczut. Ultima este utilizat pentru a recupera ADN -ul din gelul de agaroz, deoarece aceasta are temperatura de topire de ~65C, care este sub temperatura de topire a duplexului ADN. Aceast caracteristic permite purificarea facil din gel. Mai este i al treilea tip de agaroz , cea cu un grad mare de rezoluie. Aceasta este ideal pentru separarea produilor de PCR ntre care exist diferene mai mici de 2%. Mobilitatea electroforetic a ADN este afectat de compoziia i tria ionic a tamponului. n absena ionilor (apa), conductivitatea electric este minim, iar ADN migreaz ncet, ns ntr -un tampon cu trie ionic mare conductivitatea electric este crescut, generndu-se o cantitate mare de cldur. Matrixul folosit pentru electroforez trebuie s aib capacitatea de reglare a dimensiunilor porilor i s fie inert chimic. Gelurile de agaroz sunt cele mai folosite pentru separarea acizilor nucleici de lungime mare, dar au o capacitate de difereniere sczut ntre moleculele cu lungimi apropiate. Exist mai multe tipuri de tampoane de electroforez care pot conine Tris-acetat (TAE, pH 8.0), Tris-borat (TBE) sauTris-fosfat (TPE). TAE este cel mai utilizat tampon pentru gelurile de agaroz, ns capacitatea sa ca sistem tampon este mic i i pierde proprietile dup utilizare intensiv. TBE ofer o capacitate de tamponare mult crescut. Dei puterea de separare a celor dou sisteme tampon este aproape la fel, ADN dublu catenar migreaz cu ~10% mai repede n TAE, dect n TBE, iar rezoluia structurilor ADN supernfurate este de asemenea mai mare n TAE. Tampoanele de electroforez sunt sunt preparate ca soluii stoc concentrate i pstrate la temperatura camerei. Stocarea ndelungat a soluiilor stoc de tampon duce la formarea de precipitate. Dup apariia de precipitate soluia stoc se arunc. Metoda cea mai utilizat pentru vizualizarea ADN n gelurile de agaroz i acrilamid este colorarea cu colorantul fluorescent bromur de etidiu, care prezint proprietatea de a se intercala ntre bazele stivuite din ADN. Bromura de etidiu este capabil s interacioneze cu perechile de baze ale dublului helix. (Coco R. i colab., 2006)

41

Electroforez orizontal n gel de agaroz dup colorarea cu bromur de etidiu

Gelurile de agaroz de concentraii variate se pot utiliza n dispozitive verticale sau orizontale. Bromura de etidiu se poate aduga i n gel, fiind astfel facilitat urmrirea migrrii i observarea la tran sluminator. Aceasta ca i ali colorani cationici folosii n practic, ca acridiu oranj sau proflavina se intercaleaz ntre perechile de baze ale acizilor nucleici formnd un sendwich iar ca urmare a excitaiei cu lumin ultraviolet cu = 320nm se emite o radiaie fluorescent de culoare roie-portocalie mult mai intens dect a colorantului ca atare. Limita de detectabilitate este de sub 50 mg de ADN.( Ardelean A., Lupea A.X., 2007)

Agaroza este un polimer linear extras dintr-o varietate de alge roii care formeaz o matrice sub form de gel prin intremediul legturilor de hidrogen, cnd este nclzit i rcit ntr -o soluie de tampon. Lanurile de agaroz formeaz fibre sub form de helix care se agreg n structuri super rsucite cu un diamet ru de 20-30 nm. Atunci cnd agaroza se gelifiaz se formeaz o structur tridimensional de canale cu diameter cuprinse ntre 50 -200 nm. n funcie de concentraia de agaroz folosit este determinat densitatea i porozitatea matricei de gel. Aceast concentraie de agaroz poart denumirea i de procentul de agaroz n tamponul de electroforez. Gelurile de agaroz se folosesc n concentraii situate ntre 0,3 -3%, n funcie de mrimea fragmentelor de ADN care sunt separate. Datorit faptului c are o toxicitate sczut agaroza are o larg utilizare. Cel mai utilizat sistem de electroforez n gel de agaroz este cel pe orizontal. Agaroza, datorit forei mecanice sczute este turnat n tvie de plastic transparent. Electroforeza este realizat cu ge lul scufundat sub tamponul de electroforez, la civa mm de suprafaa acestuia, i datorit faptului c rezistena gelului i cea a tamponului sunt similare, curentul trece prin gel. Scufundarea gelului mpedic uscarea gelului i asigur rcirea acestuia. (Coco R. i colab., 2006) Gelurile preparate din polizaharidul agar, produs n mod natural, au constituit unele din primele medii utilizate n depirea problemelor ridicate de convecia asociat electroforezei n soluie liber. n prezent, comerul p oate pune la dispoziie zaharidul agaroz purificat ce nu prezint unele neajunsuri. n momentul cnd este necesar, agaroza poate fi supus i altor purificri ulterioare prin cromatografie schimbtoare de ioni (Johansson i Hjertn, 1974). Gelul de acrilamid se formeaz prin polimerizarea monomerilor de acrilamid care sunt interconectai n prezena N,N- metilen-bis-acrilamidei. Lanurile interconectate formeaz structura de gel cu pori cu diametre ce depind de concentraia iniial de acrilamid i crosslinker. Pentu a descrie concentraia gelului se utilizeaz nomenclatura introdus de Hjertn, unde T reprezint concentraia total de monomer (acrilamid+bis), exprimat n grame la 100 ml (mas/ volum la sut), iar termenul C reprezint proporia d e agent de reticulare din amestecul total de monomer exprimat n grame la 100g de amestec. Dimensiunea porilor poate fi schimbat prin modificarea concentraiilor celor doi monomeri. Dac se investigheaz acizi nucleici cu greuti moleculare mari se impune alegerea unui gel cu pori mari, avnd o concentraie T de poliacrilamid de sub 5% pentru a se evita efectul excesiv de sit molecular. n mod asemntor, T cuprins ntre 15 -20% ar putea constitui o alegere bun pentru moleculele cu dimensiuni mici, concentraiile accentund astfel diferenele minore de dimensiune n cadrul aceluiai nivel de greutate. Polimerizarea este catalizat de radicalii liberi care sunt generai de persulfatul de amoniu n prezena N,N,NN-tetrametiletilendiaminei (TEMED). Lungimea lanurilor este determinat de concentraia de acrilamid din reacia de polimerizare (ntre 3,5% i 20%).

42

Gelurile de acrilamid sunt rulate ntre dou foi de geam, care asigur condiiile electrice uniforme. Gelurile sunt turnate i rulate n TBE1x, la voltaje joase pentru a nu se denature fragmentele mici de ADN, prin generarea de cldur ce rezult la trecerea curentului electric. Se cunosc dou tipuri de geluri de poliacrilamid : geluri de poliacrilamid denaturate i geluri de poliacrilamid nedenaturate. Cele denaturate sunt folosite pentru separarea i purificarea fragmentelor de ADN monocarenare. Aceste geluri sunt polimerizate n prezena unui agent, uree i/sau formamid, care poate s npedice formarea de baze perechi. ADN denaturant migreaz prin gel aproape independent de compoziia sa n baze azotate i de sacvena sa. Gelurile denaturate sunt utilizate pentru izolarea probelor marcate radioactiv, analiza produilor digestiei cu nucleaza S1 i pentru analiza produilor reaciilor de secveniere. Gelurile de poliacrilamid nedenaturate sunt folosite pentru separarea i purificarea fragmentelor de ADN dublu catenar. ADN -ul dublu catenar migreaz prin gelurile nedenaturate la o rat care este invers proporional cu lg al lungimii acestuia. ns mobilitatea electroforetic este totui afectat i de compoziia i secvena moleculei de ADN. Exist astfel duplexuri ADN de aceeai lungime care pot avea o diferen de mobilitate electroforetic de pn la 10%. Gelurile nedenaturate sunt utilizate pentru prepararea fragmentelor nalt purificate de ADN i pentru detectare complexelor protein-ADN. Gelurile de agaroz sunt utilizate pentru vizualizarea fragmentelor care au o lungime cuprins ntre 100 de nucleotide i 10-15kb. Sub lungimea de 100 de nucleotide fragmentele s sunt greu de separat i vizualizat din cauza difuziunii n reeaua gelului de agaroz . Aceste probleme sunt rezolvate de gelurile de poliacrilamid, care deceleaz ntre fragmente care difer cu numai o singur baz azotat i perm it analizarea fragmentelor mici de 10bp pn la 1pb. De asemenea, gelurile de acrilamid au i alte avantaje: 1. au o capacitate de nccare de pn la 10 g ADN ntr -un singur godeu (1cm x1mm), fr o pierdere semnificativ a rezoluiei. 2. conin puini inhibitori enzimtici, astfel nct permit izolarea fragmentelor ADN i utilizarea lor pentru subclonare sau alte tehnici de biologie molecular. Pe lng avantaje gelurile de poliacrilamid prezint i dou dezavantaje cum ar fi slbirea semnalului fluorescent i afectarea mobilitii electroforetice n funcie de compoziia n nucleotide, care ngreuneaz estimarea corect a lungimii benzilor. (Coco R. i colab., 2006) n 1966 Uriel i Berges au introdus conceptul de gel compozit din agaroz i poliacrilamid pentru separarea proteinelor ns el a fost aplicat ulterior i n separrile de acizi nucleici de ctre Peacock i Dingman n 1968. Aceste geluri pstreaz puterea mare de rezoluie a poliacrilamidei i extind considerabil domeniul util de greutate molecular, deoarece adaosul de agaroz le confer rezisten mecanic i rigiditate i permite reducerea concentraiei de acrilamid la niveluri (T=1%) ce nu pot fi nicidecum utilizate doar n prezena acrilamidei. Pentru toate moleculele, cu excepia celor foarte mari, agaroza din gelurile compozite nu pare s contribuie la separarea dimensional prin efectul de sit molecular, acesta rmnnd proporional cu concentraia monomerului de acrilamid. Gelurile compozite sunt mult mai greu de preparat dect cele formate numai din agaroz sau numai din poliacrilamid. Utilizarea gelurilor compozite, chiar dac este mult folosit pentru separarea unor probe moleculare de dimensiuni adecvate, a fost pus sub semnul ntrebrii de Serwel n 1983. Acesta consider c gelurile de agaroz relative concentrate posed aceleai proprieti de sit molecular i capacitate de rezoluie ca i gelurile diluate (cu T procentual sczut) sau nalt reticulate (procent mare de C) de poliacrilamid poroas, nct s nu mai fie nevoie de categorii intermediare de geluri compozite. (Andrews A.T., 1996). Gelurile compozite au fost utilizate ca matrice suport n experimentele concentrrii izoelectrice (IEF) dar i atunci ele par s ofere doar puine avantaje n comparaie cu poliacrilamida singur pentru moleculele mici, sau agaroza pentru moleculele foarte mari. (Pino i Hart, 1984).

4.2.4.1.1. Secvenierea ADN n secvenarea unei molecule de ADN purificat, prima etap const n ruperea ei ntr -un numr de fragmente bine definite, cu ajutorul unei endonucleaze de restricie, ca i n alegerea i pregtirea ulterioar a fragmentelor pentru secvenare. n a doua etap se pregtete din piesa iniial, unele fragmente de familii nrudite. Aceste fragmente sunt apoi fracionate n funcie de diferenele de dimensiune, prin electroforez n gel de poliacrilamid, iar rezultatele pot fi interpretate manual sau prin scanare i prelucrarea automat a datelor. Separarea electroforetic i interpretarea hrilor difer n principal prin modul n care sunt generate fragmentele de ADN. Maxam i Gilbert (1977) au marcat fragmentele de enzim de restricie prin transferarea cu polinucleotid 32 kinaz a P din ATP-ul tacram, dup ndeprtarea preliminar a gruprilor fosfat din fragmente cu ajutor ul fosfatazei alcaline. Apoi amestecul de fragmente marcate trebuie purificat i supus separrii de lanuri, deoarece

43

aceast metod necesit disponibilizarea unor serii de ADN -uri marcate pe un singur lan. Aceste obiective pot fi atinse cu succes prin metode electroforetice. James i Bradshaw (1984) au separat pentru prima dat fragmente radiomarcate de ADN de componentele cu greutate mic din amestecul de reacie radiomarcat, lucru care s -a realizat prin filtrare n gel pe o coloan de Sephadex G-50. Probele de ADN au fost apoi denaturate, prin adugare de uree solid pn la 10M. Dup aceea probele au fost nclzite 3 minute la 65C rcite rapid i aplicate pe o plac de gel PAGE, folosind un sistem tampon pentru gel format din tris 90mM i acid boric 90Mm. Dup ce se separ prin electroforez, gelurile sunt supuse autoradiografierii, iar zonele purificate de ADN marcat au fost ndeprtate. Ali cercettori au utilizat inhibitori ai terminalizrii lanului, pentru a forma seturi similare de fragment e. Folosind 2,3- dideoxiribonucleozid-trifosfatul lanul nu mai poate fi extins. Astfel, dac se incubeaz fragmentul precursor i matria cu ADN-polimeraz n prezena unui amestec de 2,3-dideoxi~ i 2-deoxiderivai, se produce un set de fragmente, poziia terminatorului putnd fi dedus din configuraia electroforetic. Metoda original necesit prepararea unui material monocatenar din ADN -ul dublu catenar care s acioneze ca matri. Dup realizarea acestui lucru factorii cei mai importani rmn puritatea precursorului i integritatea captului 5-terminal. Metoda a fost revoluionat de apariia vectorilor de clonare a lanului monocatenar al bacteriofagului M 13. Metoda chimic a lui Maxam i Gilbert a fost modificat i dezvoltat, constituind fundamentul tehnicii cunoscute drept secvenare genomic. Amestecul de fragmente nemarcate de ADN provenite de la enzime de restricie i clivri chimice pariale ale totalitii genomului sunt operate conform diferenelor de mrime pe un gel de poliacrilamid cu T=6%. Intervalele de fragmente separate din ADN sunt transferate electrolitic pe membran de naylon, apoi sunt 32 reticulate i imobilizate prin iradiere cu UV. Hibridarea cu o prob monocatenar marcat cu P produce ulterior imaginea unei secvene de ADN n trepte, care se ntinde de la captul 3 - sau 5-terminal al situsului de restricie de pe genom. Gelurile de secvenare folosite la caracterizarea seturilor de fragmente sunt extreme de asemntoare. (Figura 14). Sistemul de gel al lui Air, Sanger, este tipic i const din plci de poliacrilamid de 200mm x 400mm seciune transvers i grosime de 1,5mm, preparate n tampon cu pH=8,3 care conine 18,8g tris, 50,5g acid boric, 0,98g EDTA i 480g uree per litru. De obicei se folosesc doi colorani trasori, Cyanol FF i albastru de bromfenol. Printr-o modificare ulterioar s-a demonstrat clar posibilitatea obinerii unei rezoluii superioare, n condiiile folosirii aceluia sistem de gel, dar mult mai subire (0,4mm). Ameliorarea i are originea parial n faptul c tot materialul marcat se gsete fizic mai aproape de emulsia de pe filmul autoradiografic i, parial n aceea c se pot folosi n cursul electroforezei cureni de valoare mare. Utilizarea gelurilor subiri este n mare msur rspunztoare pentru ameliorrile de rezoluie obinute dup cercetrile de nceput, potrivindu-se chiar i gelurile de 0.1mm, dar de regul gelurile pentru secvenare sunt de dimensiuni mari, lungi de cel puin 40 cm, adesea pn la 1m. Optimul depinde cu siguran, de dimensiunile fragmentelor ce urmeaz a fi separate, dar se folosesc, de obicei, geluri de 6 -8% pentru fragmente relativ mari i treptele derivate din acestea (Church i Gilbert, 1984), iar gelurile de pn la 20%(T) se folosesc pentru fragmente relative mici.

Configuraia autoradiografic a gelului de secvenare a gelului de poliacrilamid ce infieaz patru secvene pariale obinute cu ajutorul metodei dideoxi pe clone de ADN lambda.

44

Gelurile sunt procesate n mod obinuit la cald, fr r cire optimul fiind la 50-60C . Temperaturile att de nalte impun procesarea gelurilor ntre plci de sticl, nu n aparate cu camerele de separare din plastic. Dac nu se obine o rezoluie adecvat, gelurile pot fi uscate naintea radiografierii, ceea ce reduce distana medie dintre moleculele radioactive i gel. S-a introdus i folosirea gradienilor de concentraie n separarea treptelor de fragmente de ADN. S -au pregtit dou porii de soluie de gel n tampon tris borat -EDTA (TBE) concentrat de 5, respectiv 0,5 ori. Un volum mic de amestec de gel n n tampon TBE 0,5x este tas cu para de cauciuc ntr -o pipet de sticl, urmat de un volum egal de amestec de tampon TBE 5x. Cele dou faze se amestec uor, pipeta se golete uor n matria de gel, care se umple apoi cu un exces de amestec de gel n tampon TBE 0,5x. Gelul care a rezultat prezint o concentraie constant de poliacrilamid i o compozie aproape constant de tampon, dar la partea inferioar a plcii de gel se nregistreaz o concentraie abrupt cresctoare de tampon, nct fragmentele de ADN cu deplasarea cea mai rapid sunt ncetinite. n concluzie pe o singur plac se poate citi o succesiune mai mare de secvenare dect pe un gel cu o concentraie constant de tampon. Cele mai frecvente artefacte observate n gelurile de secvenare sunt compresiile de band, determinate de replierea peste ele nsele a secvenelor autocomplementare, formnd bucle care migreaz cu viteze variabile spre ADN-ul complet denaturant. Aceste structuri cuprind n general secvene bogate n G+C i pot fi detectate prin prezena unui numr de benzi cu mai puine spaii ntre ele, dect benzile care le preced.

4.2.4.1.2. Secvenierea ARN n ultimii ani n tehnicile de secvenare ale ARN -ului s-au produs numeroase ameliorri. Primele metode au fost destul de eficiente deoarece Fiers a putut descrie secvena complet de 3569 de nucleotide ale ARN -ului din bacteriofagul MS2. Metoda plus-minus descris de Sanger i Coulson a fost destul de urmarit de ali cercettori. n prima etap, ARNm a fost copiat n prezena unui precursor specific i a reverstranscriptazei, pentru a se obine ARN -ul 32 complementar marcat cu P. Dup ce s-a produs reciclizarea n prezen de ARNm, s-au produs incubri minus, cu ajutorul reverstranscriptazei. Pentru reacia plus s-a utilizat fragmentul Klenow de ADN polimeraz I, n prezena 2+ Mg i a unui singur deoxinucleozidtrifosfat. Separarea amestecurilor de incubare s -a fcut pe plci din gel de poliacrilamid n tampon tris-borat-EDTA ce conine uree 8M. Dup separare s-au efectuat autoradiografii i au fost citite secvenele. mbuntirile care au urmat n scopul secvenrii ADN -ului se aplic n prezent i ARN-ului. Ele au fost aplicate n evaluarea secvenei complete de nucleotide a ARN-ului ribozomal 16S de la E. coli. Avnd n vedere c ARN-ul care codific fie i o protein mic, avnd GM de 24 000, va conine minimum 600 de nucleotide i c este dificil secvenarea a mai mult de 150 -200 dintr-un capt ce trebuie marcat, sunt necesare cteva clivri specifice preliminare i fracionarea fragmentelor rezultate. D Alesio recomand n acest scop utilizarea ribonucleazei H, degradnd enzimatic poriunea de ARN a unui hibrid ARN -ADN. Enzima atac hibrizi de 4 sau mai multe perechi de baze pentru a da natere unor fragmente cu grupri fosfat 5 -terminale i hidroxil 3terminale, ce pot fi autoradiografiate. Tot el a secvenat apoi fragmente de ARN prin metode de degradare chimic sau fizic ce produce clivarea specific dar limitat a lanului nucleotidic. Metodele enzimatice se bazeaz pe endoribonucleaze specifice care rup lanul la nivelul unei anumite baze, astfel, hidroliza parial prin tratarea probelor de ARN cu endoribonucleaze specifice fiecruia din cele patru tipuri de baze d natere la patru produi de digestie care, dac se aplic pe un gel de secvenare, dau trepte de fragmentare din care se poate deduce simplu secvena de ARN. Clivarea chimic este mai lesne de interpretat i mai puin supus interferenelor, cu o singur condiie aceea de a se folosi reactivi de puritate adecvat. Pentru ambele tipuri de digestie, gelurile de secvenare sunt identice. Ele sunt mari, lungi de 40 cm sau mai mult, conin uree 8M i EDTA 2mM sunt pregtite n tampon tris-borat i procesate la cald (5060C), la 1500-2000 V. DAlesio recomand gelurile cu T=20% i C=5% pentru secvenele de pn la 30 de baze,T=10pentru 15 -20 de baze i T=20% pentru 200 sau mai multe baze. Timpul necesar pentru separare este de 5-6 ore, pn ce trasorii albastru de bromfenol sau Xylene Cyanol ating fundul gelului. O abordare diferit a secvenierii ARN-ului a fost dezvoltat de Tanaka i colaboratorii (1980). Dup ce ARN-ul a fost purificat se dizolv n 1-2 ml formamid, se nchide ermetic i se hidrolizeaz prin nclzire pe baie de ap timp de 5 minute. Proba este apoi turnat n 50 ml tampon acetat de sodium 0,3M, cu pH=5,5 i preluat prin precipitare cu etanol. Astfel, hidroliza se limiteaz la un atac per molecul, ceea ce formeaz o singur molecul hidroxil 5 intern, care poate fi radiomarcat. n acest scop ARN -ul este dizolvat n 5 ml tampon tris-HCl 10mM, cu pH=8,0. Amestecul este transferat ntr-un tub Eppendorf i incubat 60 minute la 37C. Dup incubare, se adaug un volum de amestec formamid-colorant i proba se nclzete 5 s pe baia de ap. Fragmentele de prob (2-3ml) se separ prin electroforez n gel timp de 8 ore la tensiune constant de 2,9 kV pe plci subiri din gel de poliacrilamid, preparat ntr -un tampon cu pH=8,3. Ia natere o fie de gel care conine

45

o secven de polinucleotide separate, poziia individual a fiecrei benzi fiind determinat prin autoradiografiere. Se transfer treapta de nucleotide pe placa n strat subire, gelul putnd fi desprins i ndeprtat. Ma terialul polinucleotidic este apoi digerat enzimatic n situ. Materialul din fiecare band este digerat pn la un amestec de nucleozide, ns doar poriunile provenite din captul 5 -terminal liber vor fi marcate radioactive i detectate prin autoradiografiere ulterioar Dup incubare placa n strat subire se imerseaz n metanol timp de 5 -10 minute i se usuc. Placa este apoi supus electroforezei n unghi drept pe linia treptelor de nucleotide, folosind un tampon la pH=2,3, o or la 400V. Dup ce se usuc la aer, se determin poziia bazelor marcate prin fluorografie. (Andrew A. T., 1996)

4.2.4.2. Electroforeza capilar Electroforeza capilar este o tehnic de separare eficient si relativ nou, ideal pentru a lucra cu eantioane mici. Aceast necesitate ncepe s aib o importan major n cercetarea n domeniul bioanalizei, ca spre exemplu n biotehnologie i diverse aplicaii n medicin, diagnosticare, genetic i medicin legal. n prezenta configuraie instrumental, electroforeza capilar este cunoscut de mai bine de un deceniu. n perioada de dinaintea electroforezei capilare moderne, este interesant de observat c, nc din 1953, unii experimentatori admiteau importana aparaturii n miniatur/n format mic pentru analiza anumitor m ostre biologice. De exemplu, ribonucleotidele au putut fi identificate n celule unice folosind micro-electroforeza pentru fibre de matase fin . Principiul separrii prin electroforeza capilar const n migrarea compuilor ncrcai electric aflai n tr-un amestec, cu viteze diferite, purtai de un electrolit cu proprieti tampon, ntr -un cmp electric de diferite intensiti. Electroforeza capilar prezint cteva asemnri cu cromatografia lichid de nalt performan, cum ar fi uurina cu care poate fi utilizat, marea putere de separare, viteza, identificarea direct, i posibilitatea de automatizare deplin. Electroforeza capilar, care a preluat componente eseniale din cromatografia lichid de nalt performan precum i din electroforez, poate fi vzut ca o abordare tehnic a electroforezei. n relativa scurta sa istorie, electroforeza capilar i-a gsit utilitatea ndeosebi n bioanaliz. Fiind asemntoare cu cromatografia lichid de nalt performan, electroforeza capilar este deseori numit i electroforez capilar de nalt performan. (Drghici C., 2002). Dei primele lucrri privind analiza ADN-ului prin electroforez capilar au aprut abia n 1988 (Kasper et al., 1988; Cohen et al., 1988), numrul lor a crescut simitor de atunci. Aceast cretere a fost parial stimulat de apariia unor noi instrumente n biologia molecular, n special reacia de polimerizare n lan i proiectul genomului uman, cu ale sale produse secundare cum ar fi tehnica selectrii genelor. Este din ce n ce mai clar c cele mai multe, dac nu toate, dintre tehnicile de electroforez n gel omogen pot fi transferate pe un format capilar. Printre beneficiile unei asemenea transformri sunt viteza, analiza detaliat i precis, posibilitatea de automatizare/mecanizare total i de stocare de date; n plus, tehnicile de electroforez necesit doar mostre minuscule. n ceea ce privete problema menionat anterior, recenta introducere a unui detector de emisie stimulat a deschis noi perspective pentru analiza n profunzime a ADN-ului, de exemplu explorarea n sfera zeta -21 molecule-gram (10 mol). n electroforeza capilar separrile sunt uurate prin folosirea unor voltaje nalte, care pot genera o curgere electroosmotic i electroforetic a soluiilor tampon i speciilor ionice, respective n interiorul capilarului. Proprietile separrii i electroferogamul au caracteristici asemntoare unei treceri ntre gelurile tradiionale de poliacrilamid i lichidul cromatografic de nalt performan (HPLC). Electroforeza capilar ofer un format nou pentru lichidul cromatografic i electroforez ca: - folosirea tubului capilar n care se produce separarea electroforetic - utilizeaz forele cmpului electric foarte nalt, chiar mai nalt dect 500V/cm - folosete tehnologia detectorului modern ca electroferogramul care adesea se aseaman cu cromatogramul - are eficiene cerute de gazul cromatografic capilar sau chiar mai mult - este uor automatizat pentru a realiza o analiz precis a cantitii i este uor de folosit - consum cantiti limitate de reactivi - este aplicabil la o selectare mai larg a analizelor comparative cu alte tehnici analitice de separare. Pentru EC s-au dezvoltat diferite procedee de separare. Pentru fiecare dintre aceste procedee, Tabelul II prezint cel mai important principiu de operare i aplicabilitatea n analiza ADN -ului. Focalizarea izoelectric nu va fi discutat deoarece aceast tehnic este folosit aproape exclusiv pentru peptide i proteine. Electroforeza capilar n solutie neutr, cromatografia electrocinetic micelar, izotacoforeza sunt tehnici de lucru n soluie neutr. Folosind electroforeza capilar n solutie neutr doar varietile ncrcate cu sarcin electric pot fi separate. Cromatografia electrocinetic micelar este folosit n special pentru separarea moleculelor neutre i relativ mici, ca de exemplu mai toate produsele farmaceutice. Bazele, nucleosidele, nucleotidele, i

46

oligonucleotidele mici (mai mici dect 10 baze) de asemenea pot fi separate prin cromatografia electrocinetic micelar. Aceast tehnic utilizeaz surfactani/ageni activi de suprafa (de exemplu dodecil sulfat de sodiu sau bromur de cetil-trimetil-amoniu) care, atunci cnd sunt adugai fluxului de soluie tampon ntr -o concentraie suficient de mare, formeaz micele n soluie. n timpului fluxului de curent de mare voltaj, micelele migreaz n direcia opus ctre fluxul electroosmotic care produce separarea. Analiii se distribuie n micele n mod diferit n funcie de gradul lor de hidrofobie, astfel ducnd la nregistrarea unor timpi diferii de eluie. Pentru fragmentele mici de ADN, cum ar fi nucleosidele, nucleotidele i oligonucleotidele mici, tehnicile de lucru n soluie neutr pot fi aplicate de obicei folosind capilare necptuite.

Diferite procedee de separare electroforetic capilar

PROCEDEU Electroforeza capilar n solutie soluie neutr Cromatografia Electrocinetic micelar Izotacoforeza Focalizare izoelectric MECA MECANISM DE SEPARARE Soluii neutre /m /m, divizare n micele APLICAIE/UTILIZARE Baze, nucleoside, resturi de ADN, nucleotide, oligonucleotide Idem Tehnica de preconcentrare pentru electroforeza capi-lar n solutie neutr i cromatografia electro-cinetic micelar Proteine Oligonucleotide, primeri, catena antistres a ADN, ADN dublu catenar, secvenialitate ADN, mutaii punctuale, produi ai reaciei n lan de polimerizare

Limit mobil/deviere Punct izoelectric Gel, reea de polimeri

Electroforez capilar n gel

Sortare molecular

Izotacoforeza sau electroforeza de deviere s-a produs la nivelul capilarelor n anii 1960 i 1970 (Everaerts, 1976). Mostra este poziionat ntre electrolii conductori i fundai seleionai cu grij n timpul migraiei, nivelul de concentraie a mostrei este adaptat la concentraia electroliilor din zona de conducere. Izotacoforeza se particularizeaz n gama tehnicilor electroforetice prin capacitatea de a permite separarea simultan a unor substane purttoare de sarcini positive i negative. Sistemele de separare prin izotacoforez sunt formate din trei uniti. n componena sistemului de separare izotacoforetic intr : - compartimentul anodic, n care se gsete tamponul cu electrolitul prin a crui disociere se formeaz ionul conductor; - compartimentul n care se introduce amestecul de analizat; - compartimentul catodic, care conine tamponul cu electrolitul generator al anionului terminal. Izotacoforeza capilar se realizeaz n tuburi capilare, confecionate dintr -un material inert, la tensiuni nalte sau la tensiuni joase. Principiul izotacoforezei capilare const n migrarea compuilor n cmp electric constant ntre doi electrolii diferii prin tria lor ionic, numii electrolit frontal (conductor) i electrolit terminal. (Figura 17). Ca ioni conductori se folosesc clorura, sulfatul sau fosfatul care au mobiliti mari. Ionii terminali care trebuie s aib mobiliti joase provin din acid aminocaproic, acid aminobutiric, alanin i glicin. Cel mai frecvent contraion utilizat este Ammediol. Zonele separate prin izotacoforez capilar sunt detectate, n general, prin metode termice sau bazate pe absorbia molecular n UV. Principalele avantaje ale izotacoforezei n tuburi capilare sunt associate cu: 1) timpii scuri de analiz; 2) posibilitatea efecturii de analize cantitative i calitative pe cantiti foarte mici de prob; 3) reproductibilitate nalt i rezoluie bun; 4) posibilitatea utilizrii de electrolii apoi sau neapoi; 5) absena etapei de pretratare special a probelor. Izotacoforeza poate fi considerat ca precursor a EC moderne multe dintre principiile sale putnd fi utilizate n tehnicile moderne de EC, n afar de utilitatea sa ca i tehnic de preconcentrare pentru electroforeza capilar n soluie neutr (de exemplu n separarea nucleotidelor). Pentru ADN mai mare (catena antisens a ADN, fragmente secveniale, fragmente restrictive), sunt necesare tehnici de sortatre n gel (reele de polimeri).

47

Principiul separrii unei probe de compui 1, 2 i 3 prin izotacoforez capilar: a. injecia electroliilor i probei; b. migrarea i separarea compuilor; c. profilul cmpului electric i al pH-ului de-a lungul capilarei

4.2.4.2.1. Electroosmoza Unul din procesele fundamentale care conduce electroforeza capilar este electroosmoza. Acest fenomen este o consecin a ncrcturii de pe peretele tubului capilar. Peretele ncrcat negativ atrage ionii ncrcai pozitiv din soluia de tampon, crend un dublu strat electric. Cnd un voltaj este aplicat de-a lungul capilarului, cationii din poriunea difuz a stratului dublu migreaz n direcia catodului ducnd apa cu ei. Rezultatul este un curs net al soluiei tampon n direcia electrodului negativ. Acest curs electroosmotic poare fi destul de puternic cu o vitez liniar n j ur de 2mm/s la un pH 9. Pentru un capilar de 5m i.d. acesta trece ntr-un volum de curgere de aproximativ 4nL/s. La un pH 3 fluxul electroosmotic este mult mai sczut n jur de 0,5nL/s. Fluxul electroosmotic face posibil simultaneitatea analizelor cationice, anionice i speciilor neutre ntr-o singur analiz. De la un pH neutru la unul alcalin, fluxul electroosmotic trebuie s fie mai puternic dect migrarea electroforetic la care toate speciile sunt ndeprtate spre electrodul negativ. (Figura 18). n capilare netratate cele mai multe soluii migreaz spre electrodul negativ n vederea ncrcrii, cnd soluia tampon are pH peste 7,0. La un pH acid cei mai muli cationic vor migra mai ales ctre electrodul negativ. n sistemele ct mai exact controlate este necesar msurarea fluxului electroosmotic. Aceast cerin este ndeplinit prin injectarea cu un solvent neutru prin msurarea timpului pcare i trebuie s ajung la detector. Solveni cum ar fi metanol i oxid de metil sunt frecvent folosii. Pentru a reda performana tehnic cum ar fi focalizarea izoelectric sau izotacoforeza fluxul electroosmotic trebuie s fie suprimat. Aceasta este posibil dac o descrcare e.g., Teflon, sau o captueal capilar este folosit. Aditivi precum metil -celuloza sunt mai ales eficieni n reinerea fluxului electroosmotic.

Reprezentare schematic a electroforezei i electroosmozei cu separare de analii anionici, neutri i cationici.

4.2.4.2.2. Detecia n EC: Absorbia UV vs. Fluorescena indus Tehnicile de detecie optic pentru EC au fost revizuite recent de Pentoney i Sweedler (1994). n analiza ADNului precum i n alte aplicaii ale EC, s-a folosit detecia prin absorbie UV-Vis. n aplicaiile din domeniul biotiinei, de multe ori trebuie s observm cantiti foarte mici de analii n prezena a multe alte componente ale mostrei, iar detecia poate deveni problematic. Limita de detectare cu UV se raporteaz, printre multe altele, la diametrul mic al interiorului capilarei; de exemplu, un fragment de ADN de 200 perechi de baze are o concentraie minim detectabil de 0,5 g/ml. Stivuirea i/sau alte metode de preconcentrare, precum i optimizarea condiiilor optice, pot duce la mbuntirea limitelor de detecie printr -un factor de 2 la 10. n oric e caz, detecia pe baz de fluorescen poate oferi limite ale deteciei mult mai mici i totui este folosit de decenii

48

n multe aplicaii ADN. Testele pe baz de fluorescen au avantajul de a oferi att o selectivitate excelent ct i un grad mare de precizie. Fluorescena sau detecia pe baz de LIF (fluorescen indus), mpreun cu sistemul de marcare cu fluorin, au fost dezvoltate n cazul multor aplicaii biomedicale, spre exemplu n sortarea cromozomilor, secvenialitatea ADN i luarea amprentelor. Cu aparatur sofisticat, a devenit posibil examinarea coninutului de proteine sau acid nucleic al unei singure celule umane, sau chiar detectarea unei singure molecule de ADN marcat. Recent, Beckman a realizat un detector LIF pentru EC. Figura 26 arat un detaliu al schiei optice folosite n sistemul de electroforez automat P/ACE 5000. Interfaa sistemului P/ACE-EIF este prevzut cu un laser Ar-ion de 488 cm, dar poate fi conectat la diferite alte surse de laser. Detectorul include un reflector elipsoidal pentru a maximaliza eficiena colectrii emisiei de lumin.

Imagine schematic a unui detector pe baz de fluorescen indus pentru EC (aparatur Beckman). Cablul de fibr optic transmite lumin laser dinspre laser nspre detector i ilumineaz o seciune din capilar. Fluorescena este colectat de oglinda elipsoidal i focalizat napoi pe tubul fotomultiplicator. Pentru a reduce lumina de laser nedorit, o cavitate central n oglind permite trecerea radiaiei. Un sistem de blocare a radiaiei este folosit pentru a atenua mprtierea luminii laser

Laserele mai economice verzi sau galbene" He-Ne pot fi folosite cu diferii derivai ai rodaminei i sunt compatibili cu vopsele intercalante precum bromura de etidium sau bromura de propidium. Dintre toate sursele de laser, laserele combinate Ar-Kr produc cea mai larg arie de lungime de und posibil (mai mult de 20 de linii de emisie n zona 350 - 725 nm). Lasere economice, semiconductoare (diode") pot fi de asemenea folosite pentru EC. Lungimile lor de und sunt n zona 625-850 nm; fluorescena de fond de la matricele de mostr biologic este mult redus la aceste lungimi mari de und. Pentru a mri utilitatea laserelor de diode roii n domeniul electroforezei capilare, se dezvolt n prezent noi reactivi indicatori (bazai pe compui de tip tiazin -, oxazin-, cianin-) deoarece doar civa analii produc o fluorescen natural n nuane de rou sau apropiat de infrarou (Katz, 1993). Intercalatori Metoda cea mai direct i mai obinuit de detecie prin fluorescen indus n cadrul EC presupune folosirea intercalatorilor fluoresceni. Beckman a introdus un sistem de EC pentru analiza ADN -ului dublucatenar care include o vopsea - intercalator special, EnhanCE. n cadrul procesului de EC pata de culoare nuclear este introdus n soluia tampon i/sau mostr i interacioneaz n mod specific cu mostra de ADN dublucatenar sau cu moleculele de ARN. Culoarea se intercaleaz ntre perechile de baze de ADN, astfel modificndu -i lungimea, conformaia i sarcina ducnd la o reducere a mobilitii electroforetice dar i la mrirea puterii de separare. Mai mult, complexul ADN-agent de colorare lumineaz puternic fluorescent n momentul n care este stimulat de un laser potrivit, n timp ce intercalatorul singur - precum i celelalte componente din mostr de pe lng ADN - nu lumineaz n general. Prin urmare. selectivitatea separrii este cu mult mbuntit, de obicei ducnd la realizarea unei electroferograme mult mai ,,curate" dect ar fi posibil folosind detecia prin UV. Folosirea de culori intercalante fluorescente duce la mrirea magnitudinii preciziei cu 2 pn la 3 ordine n comparaie cu detecia prin UV (Schwartz i Ulfelder, 1994).

4.2.5. APLICAII ALE TEHNICILOR DE ELECTROFOREZ

4.2.5.1. Electroforeza n geluri cu gradient de denaturare (DGGE) Electroforeza n gel cu gradient de denaturare a fost descris de Fisher n 1983 i este o metod ce permite decelarea mutaiilor punctiforme n molecula de ADN. Metoda permite diferenierea ntre fragmente mari de ADN

49

care se deosebesc printr-o singur nucleotid. DGGE este cea mai utilizat metod de detectare a mutaiilor necunoscute. Onfer numeroase avantaje n comparaie cu alte tehnici de detectare a mutaiilor, cum ar fi: 1. este capabil s detecteze 100% din mutaiile punctiforme aprute n fragmente de ADN cu lungimi de pn la 100 de pb, 2. utilizeaz metode neradioactive de detectare a benzilor, 3. formarea hereroduplexurilor mbuntete semnificativ identificarea heterozigoilor, 4. benzile de ADN pot fi isolate cu uurin din geluri pentru secvenierea ulterioar. Metoda are i unele dezavantaje, cum ar fi : sensibilitatea descrete pentru fragmentele mai mari de 500 de pb, este necesar un echipament specializat i este necesar o cunoatere foarte bun a comportamentului catenei de ADN n procesul de denaturare. Analiza DGGE implic electroforeza fragmentelor de ADN dublu catenar ntr -un gel de poliacrilamid ce conine o concentraie liniar cresctoare de denaturani, uree sau formamid. Temperatura poate fi folosit ca factor denaturant. n timpul migrrii regiuni discrete din fragmentele de ADN, cunoscute ca domenii de topire se denatureaz n poziii specifice de-a lungul gradientului de denaturare. Concentraia de denatu rant la care apare denaturarea unui anumit domeniu de topire se numete temperatura de topire (T m ). ADN disociaz n funcie de temperature de topire odat cu creterea concentraiei de denaturant sau a temperaturii. Poriunile denaturate ramificate ale fragmentelor de ADN se aga mai uor de matrixul de poliacrilamid i ca o consecin are loc descreterea rapid a mobilitii ntregului fragmet de ADN. Un fagment de ADN poate conine mai multe domenii de topire fiecare fiind strict dependent de secvena sa de nucleotide. Alterarea secvenei de nucleotide (mutaiile) modific proprietile de topire ale ntregii secvene de ADN alterndu-I mobilitatea electroforetic. Moleculele de ADN hibrid de 100-1000 pb conin pn la 2-5 domenii de topire, fiecare avnd o temperatur diferit. Diferena cu numai o baz pereche ntr dou molecule de ADN homoduplex poate modifica temperatura de topire cu unul sau mai multe grade. mperecherile greite ntre bazele azotate din heteroduplexuri conduc la destabilizarea semnificativ a domeniilor inducnd diferene ale temperatueii de topire ntr homo i heteroduplexuri de pn la 6C. De aceea, se folosesc pentru analiza mutaiilor punctiforme heteroduplexurile rezultate ntre fragmente mutante i cele slbatice. Modificarea bazelor azotate n domeniul cu cea mai alt temperatur de topire nu poate fi detectat din cauz lipsei migrrii secvenei dect dup disocierea complet a catenei. Prin ataarea unui segment termostabil cunoscut ca GC clamp la unul din capetele fragmentului de ADN, aceast limitare este depit. Clama GC este introdus efficient n timpul procesului de PCR prin utilizarea unui primer modificat ce conine o coad GC la captul 5. Introducerea clamei crete procentajul mutaiilor detectabile. Pe msur ce fragmentele de ADN intr n condiii de denaturare, poriuni minore ale acestora se vor denature. Poriunea unde ADN dublu catenar se topete i devine monocatenar, este dependent de secvena de nucleotide i se traduce prin poziii diferite n gel. Pentru succesul DGGE trebuie cunoscut comportamentul de topire a fiecrui fragment de ADN. Fragmentele ce conin doar unul sau dou domenii de topire ofer rezultatele cele mai bune. Vizualizare comportamentului de topire a fiecrei secvene de ADN se face prin analiza computerizat folosindu -se software cum ar fi MELT95 sau MACMELT. DGGE este o metod sensibil pentru screening -ul modificrilor nucleotidice heterozigote i este utilizat pentru analiza genelor ce determin boli genetice cu ereditate dominant. mperecherile greite prezent6e n moleculele de heteroduplexuri aprute n timpul ciclurilor PCR reduce semnificativ stabilitatea termic a ntregului fragment ADN, cauznd topirea lor la la o concentraie de denaturare mai mic dect a homo duplexurilor. Moleculele de heteroduplexuri apar de obicei ca benzi suplimentate deasupra homoduplexurilor i astfel faciliteaz detectarea mutaiilor homozigote. Mutaiile homozIgote pot fi detectate prin DGGE dac produii homoduplexului mutant migreaz n poziii diferite de-a lungul gradientului de denaturare fa de partenerii lor normali. Crearea unui gradient de denaturare liniar cresctor cu orientare n direcia sus -jos intr-un gel de poliacrilamid vertical este realizat utilizndu-se un dispozitiv de turnare a gelului n gradient. Alegea gradientului de denaturare (a concentraiilor de soluii de poliacrilamid cu gradient mare i sczut) se bazeaz pe temperaturile de topire ale domeniilor de interes cu o diferen ntre cele dou de aproximativ 30%. Gelurile sunt supuse electroforezei la 60C. (Bimal D. i colab. 2002) n principiu, starea heterozigot genereaz dup denaturare i renaturare 4 benzi care corespund dou homoduplexurilor (WW, MM) i dou heteroduplexurilor (WM, WM). Mutaiile de tip homozigot formeaz 4 benzi numai dup adugarea unui ADN de tip slbatic.

4.2.5.2. Screning-ul mutaiilor Polimorfismul de restricie este dat de variaiile individuale ale secvenei de ADN. Enzimele de restricie sunt endonucleaze bacteriene care scindeaz ADN-ul la nivelul unor zone specifice dnd natere la fragmente de

50

lungimi variabile numite fragmente de restricie. n urma amplificrii, gena de interes este supus restriciei cu enzyme specifice pentru a identifica situs-urile n care apar mutaii. Mutaiile pot crea un situs de restricie nou sau pot represa unul deja existent. O microdeleie sau o inserie care afecteaz situs -ul de restricie va produce o reducere sau o cretere a lungimii fragmentelor de restricie n care se afl, genernd ceea ce este cunoscut n termini de specialitate ca polimorfismul lungimii fragmentelor de restricie (RFLP). Enzimele de restricie recunosc situs-urile din ADN, care difer prin variaiile alelice sau din cauza alterrilor induse de mutaii n secvena ADN de analizat. RLFP-ul este caracterizat prin variabilitatea specific de la un individ la altul. Regiunile variabile se pot gsi n introni, exoni genernd polimorfisme variate n aceste secvene. Detectarea RFLP se poate realize direct prin analiza modelelor de migrare a fragmentelor de restricie enzimatic n geluri de agaroz sau acrilamid, ori prim metoda Southern blotting. Dup transferal fragmentelor de ADN din ngel pe diferite suporturi se face hibridizarea cu o sond specific acestor fragmente. Metoda Southern pune n evidena doar RFLP -urile exonice sau segmentele adiacente exonilor, cnd se folosete un ADN complementar. Variaiile RFLP sunt cauzate de mutaii punctiforme, inserii i deleii ADN. Inseriile i deleiile pot modifica ntreaga structur a unei gene, prin amplificarea sau deleia total a acesteia, efecte ce pot fi detectate cu sondele de hibridizare, dac inseria sau deleia este destul de mare i este poziionat n interiorul unui fragment de restricie. Fragmentele de restricie mai mari sau mai mici pot fi detectate astfel cu ajutorul metodei Southern blotting. Pentru a putea fi utilizat ca marker genetic, RFLP trebuie s fie specific unei secvene unice din genom i s aib character informaional (existena a dou allele diferite). RFLP pot fi de mai multe tipuri cum ar fi RFLP bialelice i multialelice. Cele bialelice sunt cele mai frecvente i corespund polimorfismelor induse de mutaii punctiforme care genereaz sau nltur un singur situs de restricie. RFLP multialelice sunt polimorfisme de rearanjare sau de repetiie care se asociaz cu o secvena repetat n tandem la acelai situs. Numrul de repetiii variaz de la un individ la altul i constitue o alel. ME-PCR Dac situs-urile de restricie nu sunt afectate de mutaii, se pot crea situs-uri de restricie noi n ADN int prin utilizarea unor primeri modificai. Cea mai important modificare adus acestei tehnici este reprezentat de metode ME-PCR. Prin folosirea unor primeri parial necomplementari localizai n vecintatea situs-urilor posibile de mutaie, au fost introduce situs-uri dr restricie n varianta de ADN slbatic. Se pot genera astfel, ca rezultat al substituiei de baze nucleotidice, n varianta mutant situs -uri de restricie ce nu pot fi tiate, dar nu i n cea normal. n prima reacie PCR se amplific secvena dorit cu doi primeri, unul cu complementaritate exact iar altul cu o nucleotid modificat. Primerul modificat este cuplat n apropierea codonului analizat i substitute ast fel o nucleotid n secvenele amplificate. n variantele normale nucleotide de substituie formeaz secvena specific de restricie pentru enzima MVA I, n timp ce n codonul 12, secvena de restricie introdus este modificat de mutaie. Dup inchierea primei runde de amplificare, variantele de ADN salbatic sunt eleiminate prin digestia enzimatic, deoarece numai acestea prezint secvena de restricie nealterat. n a doua rund de amplificare sunt utilizai aceeai primeri amlificndu-se numai alelele mutante. Metoda ME-PCR crete gradul de detectare a alelelor mutante putnd fi identificat o alel mutant la 1000 de alele normale. Metoda se utilizeaz pentru analiza mutaiilor punctiforme n gene cum sunt: K-ras, H-ras i Braf-1,3. Identificarea mutaiilor n K-ras cu ME-PCR Ca materiale sunt necesare :Thermal cycler, ap dilat steril, ADN polimeraza Taq, tampon PCR 10X fr MgCl 2, primer 1,2,3 diluai , enzyme de restricie: BstX 1, Xcm 1 i Mva1, micropipete. Metode AND-ul este izolat din snge, ser sau esut. Probele din esut se pstreaz la -80C iar cele de snge i ser se pstreaz la -20C. n peima reacie de polimarizare se utilizeaz primerii 1i 2, care vor introduce un sit de restricie n variantele normale. n prima rund PCR-ul se desfoar astfel: denaturare iniial la 95C, 4 munute, urmat de 30 de cicluri (cu etape de denaturare de 1 minut la 96C, aliniere 1 minut la 55C i polimerizare 30 de secunde la 72C) i extensia final 5 minute la 72C. Dup prima rund de PCR probele se pstreaz la 4C. Primerii 1 i 2 introduc un sit de restricie pentru enzima Mva1, n ampliconul pentru secvena slbatic. Din cauza secvenei modificate introduce de primei, enzima Mva1 este capabil s taie ampliconul dac primele dou baze ale codonului12 sunt de tip slbatic. Produii de PCR generai dup prima rund de amplificare sunt supui digestiei enzimatice cu cele dou enzime. Pentru restricie se utilizeaz 2U de enzim n fiecare reacie. Pentru a doua rund amplificare se utilizeaz 3l de produs de digestie. Se utilizeaz primerii 1 i 3 ca i n prima rund de amplificare cu o singur diferen care const n numrul diferit de cicluri (32). A doua reacie de digestie enzimatic se realizeaz ntr-un volum de 40l utiliznd 5U de enzim de restricie.

51

Produii de digestie sunt analizai ntr-un gel de 5% poliacrilamid, colorat cu bromur de etidiu 10 minute. Vizualizarea are loc n lumina UV. Dup cele dou reacii de PCR i cele dou restricii enzimatice , s -au identificat variantele normale prin intermediul fragmentelor de 106 pb, iar cele mutante care nu sunt restricionate enzimatic n a doua reacie de digestie enzimatic au o lungime de 135pb (Huber K. R., i colab., 1998).

4.2.5.3. Hibridizarea. Southern blotting n hibridizarea absorbiei Southern, se folosete n general o matrice de gel pentru fragmente de ADN desprinse din ADN nuclear. Dup absorbia fragmentelor ntr -o membran, o reacie de hibridizare are loc pentru a identifica anumite secvene de nucleotide. Cnd se folosete mpreun cu autoradiografia, poate fi o metod extrem de precis (de exemplu n aplicatii n medicina legal). Este de asemenea o metod foarte selectiv, avnd n vedere c ADN-ul int se va uni doar CU ADN-ul din proba care are o secven complementar. Totui, metoda clasic este laborioas i irosete mult timp, uneori fiind necesare cteva zile pentru a o duce la capt. Brownlee, Sunzeri i colaboratorii (1990, 1991) au fost primii care au demonstrat posibilitatea de realizare a hibridiz rii cu probe de ADN marcate fluorescent pentru detectarea secvenelor de ADN int (HIV-I i HTLV-1). Folosind probe marcate cu rodamina i izotiocianat fluorescein, aceste secvene au putut fi identiflcate ntr -un singur ciclu prin detecie cu o serie de diode fluorescente la 563 nm, respectiv 519 nm. Lucrnd de asemenea cu secvene de genomi HIV -1, Bianchi (1993), a analizat produi ai reaciei de polimerizare n lan prin hibridizare pre-capilar. Un fragment de ADN monocatenar de nudeotid - 299 a fost hibridizat cu un mer-28 complementar, rezultnd modificri ale mobilitii pe electroferogram. Cohen i colaboratorii au artat ca absorbtia Southem se poate transfera de pe matrice de gel pe format de EC n gel, prin urmare reducnd cu mult timpul de analiz. n prima lor lucrare, rezultatele preliminare au fost anunate cu probe de ADN marcate cu vopsea fluorescent, Joe. Analiza fusese fcut cu detecie prin fluorescen indus prin laser, folosind un laser Ar-ion de 488nm. ntr-o lucrare ulterioar, (Vilenchik i colab., 1994), ADN antisens a fost quantificat la nu mai mult de 0.1 ng/mL, folosind probe marcate cu fluorescin. Dei s -a folosit i detectarea cu UV. detectarea cu fluorescen indus prin laser (laserul Ar -ion de 488nm) a dovedit un grad superior de precizie. n plus, ADN-ul de fond din detector sau din mostr, care ridic probleme n detectare cu UV, nu afecteaz detectarea prin fluorescen indus. Preparate de mostr coninnd diferite cantiti de prob de ADN int (mentinut constant aici) au fost injectate n dou capilare; una n condiii de non - denaturare de EC n gel (setul A), alta n condiii de denaturare de EC n gel (set B). (Figura 30). Electroferogramele arat trei vrfuri de amplitudine: vrful ADN-ului antisens int (GEM), vrful ADN-ului prob (COM), i vrful hibridului (duplex). n timp ce concentraia GEM s-a mrit, vrful de amplitudine al duplexului a crescut i el, iar mrimea vrfului de amplitudine COM a sczut. n setul de electroferograme de denaturare, vrful de amplitudine al duplexului, dup cum era de ateptat, nu se observ. Ordinea migraiei ADN -ului int i prob este diferit fa de cea din condiii de non-denaturare, cel mai probabil datorit diferenelor secundare de structur dintre cele dou tipur i de ADN.

Figura 30. Separarea GEM, COM i duplex prin EC n gel. Electroferogramele 1, 2 i 3 arat cantiti diferite de GEM cu concentraie constant COM. A) condiii de non -denaturare. B) Condiii de denaturare. Condiii: A) 9%T coloan de poliacrilamide lineare, lungime efectiv 20cm, cmp electric aplicat 200Vcm; B) l3% poliacrilamide lineare, lungime efectiv 15c,. cmp electric aplicat 400 V/cm. Detectarea prin fluorescen indus (LIF) a ADN-ului antisens s-a dovedit a fi cantitativ i linear n trei ordine de magnitudine. Folosind bromur de etidium (0,04 p.M) drept vopsea intercalant, s -a putut realiza creterea separrii suficient de mult pentru a face posibil analiza cantitativ. EC poat fi folosit ca instrument pentru a studia reaciile biomoleculare non-covalente. Termenul de EC de afinitate (ACE) a fost format pentru a descrie interaciunile receptor -ligant, inclusiv cele antigen-anticorp (imunoteste). Un numr de lucrri recente au demonstrat potenialul ACE pentru studiul ADN-ului. Spre exemplu,

52

Heegaard i Robez (1993) au folosit ACE pentru a studia interaciunile oligonucleotide -peptide. Folosind ca probe peptide dimere, s-a descoperit c legtura depinde i de mrimea oligonucleotidelor i de specificul interaciunii. Interaciunile ADN-protein au fost i ele studiate cu ajutorul EC. Aceste interaciuni sunt implicate n controlul proceselor de replicare, recombinare, modificare, reparare i transcripie. Metodele de a studia interaciunile dintre ADN i protein includ i teste de modificare a mobilitii, unde electroforeza pe matrice de gel este folosit pentru a detecta o modificare n mobilitatea ADN-ului cnd este legat de o protein. EC poate fi aplicat acestor tipuri de teste de modificare a mobilitii. aa cum este prezentat de Masche i colab.,(1993), pentru legarea unei endonucleaze, EcoRI, cu oligonucleotide. S-a folosit un sistem de EC n soluie liber cu detecie prin fluorescen indus (laser AR-ion, 488cm). Oligonucleotide marcate cu vopsea fluorescent Joe, cu zona de recunoatere EcoRL GAATTC, interacioneaz cu proteina; complexul este detectat sub forma unui vrf de amplitudine fluorescent cu vitez mai mare de migrare. Adugarea n exces a unor probe nemarcate duce la desprinderea probei marcate din complex, avnd ca rezultat dispariia semnalului fluorescent. Tehnica de transfer southern Identificarea unui fragment de ADN cu o anumit secven se poate face prin tehnica de transfer care cuprinde urmtoarele etape: 1. separarea fragmentelor de dimensiuni variabile, rezultate prin aciunea enzimelor de restricie asupra ADN genomic, prin electroforez n gel de agaroz; 2. gelul, coninnd fragmentele de ADN separate, este imersat ntr -o soluie de NaOH 0,5N, care produce denaturarea acestuia, i apoi este neutralizat; 3. ADN-ul monocatenar rezultat ester transferat de pe gelul fragil pe un fil tru de nitroceluloz sau naylon, care are calitatea de a fixa ferm monocatenele ADN. Acest transfer se realizeaz prin capilaritate la for ionic mare, gelul acoperit cu filtru de nitroceluloz, peste care se adaug un teanc de hrtii absorbante, este plasat pe o hrtie care este i ea absorbant, imersat ntr-o soluie salin concentrat. Hrtiile absorbante trag soluia din gel odat cu ADN. ADN-ul eluat din gel se fixeaz pe nitroceluloz, ca replic exact a acestuia. Monocatenele ADN, legate la nitroceluloz exact n poziia n care se aflau pe gel, sunt fixate prin iradiere n ultraviolet sau prin creterea temperaturii (~80C); 32 4. se incubeaz replica nitrocelulozic cu o sond radioactiv ( P) de asemenea monocatenar, n condiii care favorizeaz hibridarea; 5. prin splare se ndeprteaz excesul de sond radioactiv i se realizeaz prin autoradiografiere, poziia heteroduplexurilor. 6. se comparatternul de hibridizare cu gelul original i se definesc secvenele de ADN de interes. (Figura 3 1). Aceast tehnic ingenioas, permind detectarea unui fragment de ADN cu o anume secven, poate pune n eviden numrul de copii n care se gsete o gen, n ADN genomic al unui esut, posibile alterri ale materialului genetic, exprimate n polimorfismul fragmentelor de restricie. Hibridarea acizilor nucleici, imobilizai pe membrane solide, se practic i n cazul detectrii moleculelor de ADN recombinant n colonii bacteriene, dup transferal lor din mediul de cultur. Metoda de transfer a ADN, de pe geluri pe membrane nitrocelulozice a fost extins i la ARN, fiind denumit tehnica de transfer Northern. 7. imobilizarea pe filtru nitrocelulozic este posibil numai dac electroforeza n gel de agaroz se efectueaz n condiii de denaturare (incluznd n gel formaldehida) care previne adoptarea unor structuri secundare. (Dinu V. i colab.,1996).

53

Tehnica de transfer Southern

4.3. SECVENIEREA ADN Pn la jumtatea anilor 1970 nu se cunoteau metode prin caqre molecula de ADN se putea secvenia direct. n 1977 s-au publicat dou metode diferite prin care se putea realize secvenierea ADN : metoda degradrii chimice Maxam-Gilbert i metoda enzimatic Sanger. Ultima metod a devenit mult mai utilizat datorit aplicabilitii sale n secvenierea automat i utilizarea n sevenierea genomului.

4.3.1. METODA MAXAM-GILBERT Maxam i Gilbert au dezvoltat metoda secvenierii monocatenelor de ADN realizate printr -un process catalitic de degradare chimic n dou trepte pe baza piperidinei i a altor dou substane care atac selective purinile i pirimidinele. Purinele reacioneaz cu dimetil sulfatul i pirimidinele cu hidrazina, asfel nct mai nti sunt ndeprtate zaharurile (etapa1) i apoi sunt eliminate bazele azotate cu ajutorul piperidinei (etapa 2). Guaninele sunt ndeprtate de piperidin i dimetil sulfat, ns n combinaie cu scidul formic ndeprteaz att guanina ct i adenina.La fel i hidrazina i piperidina ndeprteaz timinele dar i citozinele, iar mpreun cu NaCl 1,5M ndeprteaz numai citozin.

54

Reacia de secveniere de tip Maxam -Gilbert

Monocatenele care trebuie secveniate se marcheaz radioactive la captul 5i sunt repartizate n 4 amestecuri de reacie n care se vor crea populaii de produi ADN marcai la captul 5care au dimensiuni diferite, n funcie de nucleotidele ndeprtate, la care se cunoate nucleotide rmas la captul 3, n urma degradrii chimice. Amestecurile de reacie sunt ncrcate n gel de poliacrilamid i supuse electroforezei, f ragmentele de acizi nucleici migrnd n funcie de greutatea lor molecular. Dup incheierea electroforezei gelul este acoperit cu un film fotografic pentru impresionare, transferat ntr -o caset cu protecie raze X i inut n frigider cteva zile. Dup aceasta se realizeaz citirea autoradiogramei nterpretnd modelul de benzi, de exemplu o band ce corespunde atat liniei C ct i liniei C+T va fi interpretat ca Citozin, ns dac banda este prezent n linia C+T, dar nu i n linia pentru C aceasta va fi interpretat ca Timin. La fel se va face citirea i i n cazul adeninei i guaninei. Dac procesul de marcare radioactiv funcioneaz, dac reaciile de degradare au loc corect, dac se realizeaz o electroforez n condiii bune i gelul nu se distruge la transfer, se poate obine secvena a 200 -300 de nucleotide n cteva zile.(R.Coco i colab.,2006) Breathnach, Jeffries i Flavell au descoperit secvena genice pentru ovalbumina de de la gin i gena pentru betaglobulina de la oarece.

4.3.2. METODA SANGER Fred Sanger dezvolt o metod, optnd pentru utilizarea celei de -a treia forme de riboz n care sunt absente ambele grupri hidroxil, i care se numete dideoxiriboza. Sanger s -a gndit c ncorporarea acestei dideoxiriboze n amestecul de reacie va conduce la blocarea sintezei n mod ireversibil. Aceste molecule blocheaz selective elongarea lanului ADN deoarece nu pot forma punte fosfodiesteric cu urmtoarea nucleotid. Se prevedea realizarea a patru reacii n care erau ncorporate separate cele patru tipuri de dideoxinucleotide, fiecare amestec de reacie coninnd pe lng dideoxinucleotida (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP)special i un amestec format din cele patru deoxinucleotide (dNTP), n final obinndu -se o familie de fragmente ce coninea la un capt aceeai dideoxinucleotid. ADN polimeraza copie matria ADN monocarenar adugnd nucleotid dup nucleotid, elongarea fcndu-se ntotdeauna la captul 3 al primerului deja hibridizat. n loc de marcarea radioactiv a substratului, n cazul reaciei Sanger s-au marcat primerii specifici, iar identificarea secvenei genice sa fcut prin autoradiografiere. Singura diferen consta n faptul c secvena citit era cea complementar secvenei originale. n metoda Senger s-a eliminat folosirea reactivilor periculoi precum hidrazina.n cazul secvenierii enzimatice, ADN polimeraza adaug aproximativ 500 de baze pe minut spre deosebire de degradarea chimic ce ndeprteaz 25- mer n aproape dou ore. Tehnica a fost din ce n ce mai utilizat au nceput s se acumuleze din ce n ce mai multe informaii legate de secvena genic la diverse organisme.

4.3.3. SECVENIEREA AUTOMAT O realizare important n domeniul secvenierii ADNo reprezint introducerea secvenierii automate cu dideoxiterminatori marcai fluorescent. n 1986 se nlocuiete marcarea radioactiv, autoradiografia, i citirea manual cu marcarea fluorescent,detectarea fluorescenei cu laser citirea computerizat. Primerul este marcat cu unul din cei patru marcatori fluoresceni diferii i apoi introdus ntr-un amestec de reacie cu una din cele patru dideoxinucleotide i toate cele patru deoxinucleotide. Cele patru mixuri diferite de reacie se amestec i se ncarc ntr-un godeu de electroforez. Pe msur ce fiecare fragment migreaz n gel fluorescena sa este detectet i analizat de computer. Mai trziu metoda a fost mbuntit nlocuind primerii marcai fluorescent cu dideoxi terminatori marcai fluorescent.Primul set de colorani era bazat pe succinilfluoresceina. Toi cei patru dideoxiterminatori marcai fluorescent pot fi excitai de un laser cu argon la

55

488nm i fiecare produce o emisie cu o lungime de und cunoscut, care este identificat de un detector. Acest system a permis ca ntreaga reacie s se desfoare ntr-un singur tub n prezena tuturor celor patru terminatori marcai i a produsului de analizat. Coloranii fluoresceni au fost nlocuii cu derivai rodaminici. n 1980 se anun utilizare de capilare pentru obinerea secvenei de ADN. Capilarele avnd un diametru mic, cldura format n cursul migrrii fragmentelor de ADN se poate disipa eficient i sistemul bazat pe capilare poate fi automatizat. Acest sistem putea fi supus unui voltaj crescut scurtnd astfel timpul de migrare. n 1993 se utilizeaz un matrix de separare cu vscozitate redus ce putea fi pompat n capilare la presiune joas, nlocuind capilarele cu poliacrilamid ce nu puteau fi reutilizate. Polimerul nou cu vscozitate joas putea fi migrat i apoi nlocuit automat fr a schimba capilarul. Se realizeaz astfel toate elementele necesare automatizrii. Materiale necesare secvenierii i protocol de lucru Ca materiale sunt necesare urmtoarele: ABI PRISM Genetic Analyser, care este un secveniator automat pentru analizare fragmentelor marcate fluorescent; thermal cycler; micropipette;secvena ADN de interes; ADN polimeraza Amphi Taq Gold; ADN Sequencing Big DyeTM Terminator cycle sequencing pentru ABI Prism; ap distilat steril; tampon PCR 10 X ; 100 mM Tris - HCl; primer 1 (forward) i primer 2 (reverse), diluai la 20 M; formamid. Protocol de lucru n vederea realizrii protocolului de secveniere, se realizeaz iniial o reacie de PCR normal. Se recomand amestecarea componentelor chiar nainte de reactia PCR, enzima fiind ultima introdus n mixul de reaie. Produsul rezultat n urma amplificrii este supus purificrii utiliznd colane de purificare. Purificarea se face prin centifugare 10 minute la 8000 rpm. Purificatul se utilizeaz direct n ciclul de secveniere. Se prepar mixul de secveniere conform tabelului: Produs PCR purificat Primer Apa Mix de secveniere 1,5 l 0,5l 6,5 l 2 l

Se utilizeaz unul din cei doi primeri utilizai iniial n reacia de PCR. Mixul de secveniere este supus ciclului de secveniere: 25 cicluri : 1 minut 95C, 1 minut 55C, 1 minut 72C. Se repurific cu coloane de purificare i se prepar placa de secveniere prin introducerea a cte apte l produs al ciclului de secveniere cu 17 l de formamid. Se denatureaz placa 10 minute la 95 C i se introduce placa n secveniator. Secveniatoarele ADN sunt instrumente automate pentru analizarea fragmentelor marcate fluorescent. ABI PRISM 3100 Genetic Analyser este un instrument automat ce permite analizarea electroforetic c u 16 capilare. (Figura 33).

4.3.4. PIROSECVENIEREA ADN Pirosecvenierea este o metod foarte rapid de secveniere bazat pe sinteza ADN si reprezint o alernativ la principiul secvenierii clasice. Ea este aplicat la ora actual n special pentru genotipare, resecvenierea mutaiilor i determinarea secvenei structurilor ADN secundare dificil de secveniat. Moleculele analizate pot fi att molecule de ADN ct i de ARN. Tehnologia utilizeaz interrelaia dintre patru enzime diferite si fenomenul de bioluminescen pentru a monitoriza ncorporarea nucleotidelor n ADN. Amestecul de reacie const n utilizarea a 4 enzime ( ADN polimeraza, ATP sulfurilaza, luciferaza i apiraza), substanelor deja cunoscute pentru ciclul de secvenierii (primeri, adjuvani), substratul reprezentat de adenozin 5fosfosulfat (APS) i a unei nucleotide monocatenar de ADN. Una din cele 4 nucleotide dNTP este adugat n mixul de reacie. ADN polimeraza catalizeaz ncorporarea deoxinucleotrifosfailor n catena ADN aflat n elongare. Dac nucleotide adugat este complementar cu baza din catena ADN ea este ncorporat i n acelai timp este eliberat pirofosfatul anorganic. Acesta este convertit n ATP de enzima ATP sulfurilaza n prezena adenozin 5fosfosulfatului. ATP furnizeaz energie luciferazei care oxideaz luciferina i aceasta genereaz lumina vizibil. Lumina este detectat cu o camer CCD i este vizualizat sub forma unei pirograme. Resturile de dNTP nencorporate i excesul de ATP sunt degradate de apiraz, nainte ca urmtoarea nucleotid s fie introdus n mixul de reacie. Timpul scurs de la polimerizare i pn la detectarea luminii este de 3 -4 secunde la temperatura camerei.

56

Exist dou strategii de pirosecveniere: n faz solid i n faz lichid. Prima utilizeaz ADN imobilizat i necesit doar 3 enzime ADN polimeraz, ATP sulfurilaza i luciferaza care necesit ns la fiecare reacie de adiie de nucleotide o etap de splare pentru ndeprtarea excesului de substrat. n pirosecvenierea n faza lichid, este introdus cea de a patra enzim, apiraza ce degradeaz continuu nucleotidele n exces.(Ronaghi M., 2001)

4.3.5. SECVENIEREA PRIN ELECTROFOREZA CAPILAR Mai multe echipe de cercetare experimenteaz folosirea electroforezei capilare ca o alternativ la electroforeza n gel pentru determinarea automat a secvenelor de ADN (Pentoney i colab., 1992). Raportul mare suprafa/volum a capilarelor permite folosirea unor cmpuri mai mari dect n cazul electroforezei n gel (datorit disiprii mai eficiente a cldurii) rezultnd o separaie mult mai rapid a produilor de secveniere. Acest format permite de asemenea ncrcarea automat si colectarea de date on -line. O dat secventiate, determinarea fragmentelor de ADN se face prin LIF (LAser Induced Fluorescence = Fluorescena Indus prin Laser).

Dispozitiv CE-LIF Sensibilitatea deteciei LIF permite reaciilor de secveniere s fie fcute pe acelai ablon si scal cu secvenierea manual a ADN-ului prin metoda deteciei autoradiografic. Identitatea bazei terminale a fiecrui fragment secveniat este codat n lungimea de und i/sau n intensitatea emisie fluorescente. Automatizarea procesului de preparare al probelor, reaciile de secveniere (inclusiv electroforeza) i interpretarea datelor sunt necesare pentru a se ajunge la obiectivul ambiios, acela de secveniere a ntregului genom uman (~3 miliarde pb). n cazul EC probele sunt ncrcate una cte una. Pe de alt parte, gelurile pot fi ncrcate simultan cu 24 pn la 36 de probe. Instrumentele ce ar permite funcionarea mai multor capilare n paralel, mpreun cu automatizarea procesului de ncrcare ar micora cu mult timpul de analiz. Secvenierea ADN a fost deja demonstrat ntr -un sistem de capilare multiple (20-100). Se poate deduce cu uurin c aceste metode pot fi ncorporate i n alte aplicaii. Un impediment major n dezvoltarea secveniatoarelor de ADN prin EC l constituie stabilitatea capilarelor multiple cu gel. Cu toate c acestea furnizeaz o rezoluie foarte mare, gelurile funcioneaz numai cteva ture, dup care ntreaga coloan trebuie nlocuit. Descoperirile acestea n tehnologia coloanelor CGE (n special gelurile ce pot fi nlocuite) ar trebui s elimine procedurile laborioase de preparare i aliniere a ca pilarelor. (Ruiz-Martinez i colab.,1993). n cazul matricei nlocuibile este posibil ncrcarea unor reactivi de secveniere, separarea rapid a fragmentelor de ADN i apoi rencarcarea capilarului cu gel pentru urmtoarea utilizare. Un laser cu dioda "roie" a fost folosit pentru excitarea fragmentelor de ADN etichetate cu fluor-(Cy-5). Vscozitatea sczut (6% T) a matricei de gel a acestui tip de capilar furnizeaz separarea rapid i reproductibil a fragmentelor de ADN pe o distan de pn la 400 pb. Pentru aplicaiile ce conin secvenierea ADN-ului se folosete o soluie-tampon ce conin formamid i/sau uree. O soluie-tampon capabil de denaturare ce conine 30% formamid 3,5 M uree este mai avantajoas pentru folosirea n CGE. n plus, se observ o decompresie mai mare a secvenelor cu structur secundar. (Maschke H. i colab., 1993).

4.3.6. ADN FOLOSIT N CRIMINALISTIC

57

Electroforeza capilar-fluorescent indus de laser (CE-LIF) a fost recent aplicat n analizarea markerilor genetici pentru identificarea indivizilor umani. Deoarece de cele mai multe ori sunt investigate cantiti extrem de mici de substan, LIF ar trebui s fie metoda de detecie folosit. Astfel, mai muli cercettori au studiat diverse sisteme polimer matrice-culoare fosforescent pentru a optimiza eficiena separrii i detectabilitatea. Analiza numere variabile repetate n tandem (variable number tandem repeat = VNTR) al locusului amplificat D1S80 (300 700 perechi de baze) repetiie de 16 perechi de baze. Colorantul EnhanCE a fost folosit n soluia tampon. Srinivasan i colab., (1993) au comparat 2 colorani pe baz de cianina TOTO -1 si YOYO-1 n laserul AR-ion la 488 nm. Sisteme de markeri genetici (apolipoproteina-B, 700-1000 pb cu o repetare de 14 pb; locusul D1S80 VNTR, 300-700 pb cu o repetiie de 16 pb si ADN mitocondrial, 130 -140 pb cu o repetiie de 2 pb) au fost investigate pentru aplicabilitate n criminalistic prin amplificare PCR. Produii PCR au fost colorai n prealabil cu vopsea fluorescent (ADN-ul a fost adugat la colorant ntr-un rapot molar de 5:1 si incubat 20 de minute nainte de analiz). Capilarele ce conin soluii uor de folosit, nlocuit, de polimeri n reea (0,5% metilceluloza) au demonstrat c sunt superioare gelurilor poliacrilamidice interconectate (3% C, 3% T). McCord i colab.,(1993) au analizat alte sisteme de markeri genetici n interese criminalistice, de exemplu, gene ce codific mielina, gene ce codific factorul von Willenbrand i gena HUMTH01 de pe cromozomul 11. Alelele rezultate n urma VNTR cu o repetiie de 4 pb ntr-un interval de 100-250 pb au fost amplificate prin PCR i separate cu soluii de polimer n reea. S-a adugat un colorant cu aciune asimetric YO-PRO-1 (Molecular Probes, Eugene, OR) n soluia de polimer 1% hidroxietilceluloza i n fiecare prob de ADN folosit la analiza CE -LIF. Studiile ulterioare ale acestui grup s-au concretizat pe aspectele cantitative ale metodei CE-LIF utilizat n criminalistic. S-au fcut deasemenea comparaii cu alte metode existente. Cu un standard intern, precizia n timp a migrrii peak -ului a fost <0,1% RSD. Precizia suprafeei peak-ului folosind injectarea sub presiune a fost ~ 3% RSD. Un gradient de voltaj ntr -o singur etap a condus la obinerea unor timpi mai mici pentru analiza alelelor HUMTH01 (<10 minute), meninnd n acelai timp o rezoluie de ~ 3 pb n regiunea de interes.(Camilleri P., 1993)

4.3.7. PFGE I FIGE. SEPARAREA MOLECULELOR MARI DE ADN Aplicaiile PFGE sunt numeroase i diverse. Acestea includ clonarea unei mari varieti de ADN al plantelor folosind cromozomi artificiali (YAC) i vectori clonai P1; identificarea polimorfismului fragmentelor de restricie; detectarea in vivo a cromozomilordeteriorai i determinarea numrului i mrimii cromozomilor di n drojdii, ciuperci i parazii ca Plasmodium,Tryponosoma. Teoria pulsului cmpului n electroforeza n gel este o problem de dezbatere i aproximri. Calitativ acestea pot fi fcute asupra micrii ADN-ului n gelul de agaroz n timpul PFGE. Pe durata cmpului electroforetic, ADN-ul peste 30-50 kb se mic cu aceeai uurin n funcie de mrime. Acest lucru a fost vzut n gel ca unica band difuz. Dac AND -ul este forat s-i schimbe direcia n timpul electroforezei, fragmente de diferite mrimi se pot separa unele de altele.Cu fiecare reorientare a cmpului electroforetic n gel,se micoreaz mrimea ADN-ului i se va mica mai repede ca celelalte fragmente de ADN. Majoritatea instrumentelor folosite n PFGE sunt fcute ct mai simplu pentru lucrul n gelul electroforetic. (Gemmill R.M.,1991). PFGE i CFGE Mai multe sisteme au fost dezvoltate pentru pentru separarea moleculelor mari de ADN cele pn la 7 MB. Caracteristica comun este modul de a conduce molecula de ADN n direcii diferite n funcie de alternanele pulsului. Multe aparate obin acest lucru prin schimbarea a dou sau a mai multor seturi de electrozi. O metod alternativ este folosirea unui set de electrozi i micarea lui prin gel ntr-un unghi prestabilit. Legtura dintre mrime i mobilitate este complex ceea ce conduce la instabilitatea gsit i n FIGE. Ca i FIGE, PFGE i CFGE are efecte foarte mici asupra fragmentelor care se mic sub limita de mobilitate n gelul obinuit de electroforez. Efectul acestui procedeu este asupra moleculelor care se mic foarte ncet, i de a mri viteza celor mai mari. Pentru o separare optim este bine s se cunoasc caracteristicele i sistemul folosit pentru separare. FIGE Atracia lui FIGE este reprezentat de un procedeu de separare a moleculelor mari de ADN i necesit o aparatur foarte simpl care poate fi construit din echipamentul obinuit. In forma cea mai simpl este nevoie doar de un ntreruptor care s schimbe perioadele polaritii electrozilor. Inversarea cmpului poate fi mai lung dac intensitatea voltajului este mai mare i mai deas i duce la extinderea razei de separare. FIGE are un efect mic asupra separrii moleculelor care ar rezulta din cmpul electroforetic constant. Cel mai mare effect l are asupra moleculelor mai grele care vor circula cu minimul de mobilitate. Legtura dintre mrime i greutate pe durata FIGE este complex. Exist o posibilitate ca mobilitatea s scad odat cu mrimea, ns exist

58

un punct critic de unde moleculele mai lungi circul mai repede ca cele mici. Aceast legtur complx face ca rezultatele obinute s nu fie prea precise n cazul FIGE, dei dou molecule de mrimi diferite pot avea aceeai mobilitate i de aceea muli prefer PFGE. FIGE funcioneaz prin inversarea periodic a polaritii electrozilor n timpul electroforezei. n FIGE ADN-ul este supus la o schimbare de 180. ADN -ul petrece o mare parte micndu-se n mod invers. Doar un cmp electric este necesar pentru orice cutie de gel orizontal sau vertical i prin contr olul temperaturii se poate comtrola gelul. Cea mai important extensie a modelului aplicat n FIGE este aceea c atunci cnd cmpul este inversat, orice molecul de ADN care se mica nainte, va nceta i se va mica n sensul opus. Cele dou capete nu sunt legate ntre ele i se pot deplasa n direcii diferite, iar ADN-ul dintre cele dou capete va deveni repede un mototol de fibre formnd un crlig. Forma acestui crlig depinde de lungimea moleculei i de mobilitatea acesteia. Ca i alte tehnici, FIGE are posibilitatea de inversiune, n care moleculele mari de ADN se pot muta n faa celor mai mici n timpul electroforezei. (Figura 35). (Monaco A. P., 1995).

4.3.8. ADN ANTISENS Medicamentele bazate pe molecule antisens sunt oligonucleotide sintetice care au o secven complementar bazelor unei molecule de ARNm ce codific proteine cauzatoare de afeciuni sau o secven complementar a ADN-ului dublu catenar de pe care ARN-ul a fost transcris. Natura complementar a moleculei antisens i permite s formeze legturi de hidrogen i s inactiveze mesajul genetic, inhibnd expresia genic. Oligonucleotidele "normale" cu o caten fosfodiesteric sunt susceptibile degradrii de ctre endonucleaza celular. De aceea, exist mult interes n moleculele analoage ADN-ului cu catena fosfodiesteric ce prezint rezisten sporit la aceste nucleaze. Un alt tip de compus antisens, numit acid nucleic peptidic (PNA) n care catena deoxiribozo -fosforic este nlocuit de o caten peptidic compus din uniti (2 -aminoetil) glicina, prezint interes n utilizarea ca agent terapeutic puternic care poate fi analizat prin CGE (Rose, 1993). Deoarece pot fi folosite ca medicamente, se cere o puritate excepional a acestor ageni ADN antisens. CGE cu coloana eCAP ssADN 100 a lui Beckman a relevat rezultate excelente, cu rezoluie mare a deleiei secvenelor unui produs antisens 20 -mer fosforotioat. Figura 36 arat electroferograma unui amestec de n-mer si (n-1)mer. Cu toate acestea, CGE nu poate extrage fosforotioaii din fosforodiesterii corespondeni (aici se folosete cromatografia cu schimb de anioni) deoarece mecanismul separaiei n CGE este bazat pe mrimea molecular. Folosind kitul eCAP ssDNA 100, Srivatsa i alii (1994) a demonstrat validitatea CGE pentru analiza de rutin a medicamentelor. Metoda CGE este potrivit pentru analizele de rutin a medicamentelor.

Figura 36. Electroferograma a unui produs antisens 20-mer fosforotionat, folosind coloana eCAP ssADN 100.

Bibliografie

59

1. Abersold R., Morrison H. D., 1990 - Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis, Journal of Chromatography, 516, 79. 2. Alberts, Bray, Johnson, Lewis, Raff, Roberts - " Use of PCR in Forensic Science ", 2004, http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/ecb/pcr_in_forensic_science.php 3. Andrews A. T.,1996 - Electroforeza. Teorii, tehnici i aplicaii biochimice i clinice , Editura Tehnic, Bucureti, pag. 3, 139-162. 4. Ardelean A., Lupea A. X., 2007 - Biochimie (Fotosinteza. Reglajul hormonal. Informaia genetic ), Editura Academiei Romne, Bucureti, pag. 175-178. 5. Bimal D. M. i Rapley R., 2002 - PCR Mutation Detection Protocols, Editura Humana Press, Totowa, N.J., pag. 125-135. 6. Brown, W. M., Prager, E. M., Wang, A. and Wilson, A. C. Mitochondrial DNA sequences of primates: tempo and mode of evolution. Journal of Molecular Evolution 18: 225239, 1982. 7. Camilleri P., 1993 - Capillary Eelctrophoresis: Theory and Practice, Editura Boca Raton, CRC Press, pag. 25. 8. Centrul de Diagnostic i Tratament "Dr. Victor Babe" - " Informaii publice despre bioterorism ", 2007, http://www.cdt-babes.ro/cercetare/bioterorism_info.php 9. Centrul European de Excelen pe Probleme de Mediu, Universitatea " Dunrea de Jos " Galai - " Bioterorismul, o ameninare potenial la nivel mondial ", 2004, http://www.ecee.ugal.ro/looknou/bioterorismweb.PDF 10. Church GM, Gilbert W, 1984 - Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci USA 81: 19911995. 11. Coco R., Bohlea L. i colab., 2006 - Metode i principii n genetica molecular, Editura Medical, Bucureti, pag. 22-29. 12. Cristian Vntu " Ereditatea culorilor: Alela ", 1999, http://www.geocities.com/Heartland/Acres/4334/ereditatea.html 13. Delia Petrescu - " Bioterorismul : o ameninare real ", 2005, Department of Biology, Davidson College, Davidson - " Real Time PCR: The Taq Man Method ", 2003, 14. Dinu V., Truia E. i colab., 1996 - Biochomie medical, Mic Tratat, Editura Medical, Bucureti, pag. 253255. 15. Drghici C., 2002 - Electroforeza capilar. Principii i aplicaii n analize de mediu , Editura Universitar Transilvania, Braov, pag. 4, 7, 28. 16. Dumitru Murariu " Tehnica PCR RAPD ", 2003, http://frf.cncsis.ro/documente/671Raport_de_Cercetare_MNINGA.doc 17. Everaerts F. M., Beckers, i colab., 1976, - Isotachophoresis: Theory, Instrumentation and Applications, Amsterdam, Elsevier, pag.35-37. 18. Felsenstein J., 1981 Evolutionary trees from DNA sequences: A maximum likeli-hood approach, n J. Mol. Evol. nr. 17, p. 368 376. 19. Felsenstein J., 1981 Numerical methods for inferring evolutionary trees . Quart. Rev. Biol., Nr. 57, p. 379 404. 20. Freeland J. R., Molecular Ecology, John Wiley & Sons Ltd., 20, 32, 2005. 21. G. Borsaru, R. Colesniuc, H. Bumbea, D. Barbu, S. Predoi - " Importana Reaciei de Polimerizare n Lan in diagnosticul prenatal ", 2000, http://www.materno-fetala.ro/pagini/importanta-reactiei-de-polimerizare-in-l-1.php 22. Gavril Lucian - "Genomul Uman", Bic All, Bucuresti, 2004 23. Gemmill R. M., 1991 - Pulsed field gel electrophoresis, In Advances of Electrophoresis , vol.4, VCH, Weinheim,Germany, pag. 1-14. 24. Grossman, P. D., Soane D. S., 1991 - Experimental and theoretical studies of DNA separations by capillary electrophoresis in entangled polymer solutions. Biopolymers. 31:12211228. 25. Guttman A.,1994 - Handbook of Capillary Electrophoresis, Editura Boca Raton, CRC Press, pag. 129. 26. Higgins D. G., 1994 Clustal V: Multiple alignment of DNA and protein sequences . n Methods Mol. Biol., Nr. 25, p. 307 318 27. Hillis D. M., Larson A., Davis S. K., Zimmer Elizabeth, 1996 - Nucleic Acids III: Sequencing, n Molecular systematics, 2nd ed., Sinauer Assoc., Sunderland MA, Chapter 9, p. 318 370. 28. Huang, M., Liu, S., Murray, B. K. and Lee, M. L., 1992 - High resolution separation and quantitation of ribonucleotides using capillary electrophoresis Anal. Biochem. 207, 231235. 29. Huber K. R., Bittner J. i colab., 1998 - Restriction digest PCR for the analysis of gene mutations: Application to Ki-ras, Clin Chem Lab Med, pag. 593-598. 1. In Hillis, D.M.C. Moritz, B. K. Mable - " Molecular Systematics, Chapter 7 Nucleic Acids II: The polymerase Chain Reaction, Stephen R. Palumbi ", Editia II, Sinauer Assoc., Sunderland, MA 30. Jercan E.,1984 - Electroforeza, Editura Tehnic, Bucureti, pag. 9-13, 82-84, 92, 106,110.

60

2. John M. S. Bartlett, David Stirling - " Methods in Molecular Biology, vol. 226: PCR Protocols " , Ediia II, Humana Press, 2002 31. Katz E. D., 1993 - Methods in Molecular Biology, Editura Humana Press, Totowa, N. J, pag. 63. 32. Kenshi Hayashi - " PCR - SSCP: A Simple and Sensitive Method for Detection of Mutations in the Genomic DNA " ,1991, http://www.genome.org/cgi/reprint/1/1/34 33. Kirstin Edwars, Julie Logan, Nick Saunders - " Real - Time PCR An Essential Guide ", Editia I, Horizon Bioscience, U.K. Londra, 2004 34. Kobilinsky L., Levine L., Nunno-Margolis H., Forensic DNA analysis, 11-71, 2007. 35. Lucian Gavrial - " O reacie n lan, o "sond" molecular i un buletin de id entitate molecular ", 2005, http://www.stiintasitehnica.ro/index.php?menu=8&id=32 36. Maria Angela C. Dani, Sergio U. Dani, Silmara P.G. Lima, Alfredo Martinez, Benedito M. Rossi, Fernando Soares, Marco A. Zago, Andrew J.G. Simpson - " Less mtDNA than normal in various types of tumors suggests that cancer cells are essentially free of this mutation : In Situ PCR " , 2004, 37. Maschke H. E., Frenz J. i colab., 1993 - Fifth International Symposium on High Performance Capillary Electrophoresis, Orlando, FL. 38. Monaco A. P., 1995 - Pulsed field gel electrophoresis: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, pag. 4, 11. 39. National Center for Human Genome Research, National Institutes of Health. " New Tools for Tomorrow's Health Research." Bethesda, MD: Department of Health and Human Services ,1992.- " Polymerase Chain Reaction Xeroxing DNA ", http://www.accessexcellence.org/RC/AB/IE/PCR_Xeroxing_DNA.php 40. Octavian Henegariu - " PCR and Multiplex PCR: guide and troubleshooting " , 1997, http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/PCR.html 41. Parker R. C., Watson R. M., Vinograd J., 1977 -Mapping of closed circular DNAs by cleavage with restriction endonucleases and calibration by agarose gel electrophoresis . Proc Natl Acad Sci U S A. Mar; 74(3):851 855. 42. Pentoney S. L., Sweedler J. V., 1994 - Handbook of Capillary Electrophoresis, Editura Boca Raton, CRC Press, pag. 147. 43. Pino R. M, Hart T. K., 1984 - Isoelectric focusing in polyacrylamide-agarose. Anal. Biochem.; 139:77-81. 44. Raymond Tellier, Jens Bukh, Suzanne U. Emerson, Roger H. Miller, Robert H. Purcell - "Journal of Clinical Microbiology: Long PCR and It's Application to Hepatitis Viruses ", 1996, http://jcm.asm.org/cgi/reprint/34/12/3085.pdf Referine Internet: 45. Richards E. G., Lecanidou R., 1971 - Quantitative aspects of the electrophoresis of RNA in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 40:43. 46. Ronaghi M., 2001 - Pyrosequencing Sheds Light on DNA Sequencing , Editura Genom Research, pag. 3, 11. 47. Rose D. J., 1993 - Characterization of antisense binding properdes of peptide nucleic acids by capillary gel electrophoresis, Anal. Chem. 65, p. 35453549. 48. Ruiz-Martinez M. C., Berka J., Belenkii A., Foret F., Miller A. W., Karger B. L., 1993 - DNA sequencing by capillary electrophoresis with replaceable linear polyacrylamide and laser-induced fluorescence detection, Anal Chem. 1993, 65(20):28512858. 49. Schomburg G., 1993 - Capillary Electrophoresis: Theory and Practice , Editura Boca Raton, CRC Press, pag. 255. 50. Schwartz H., Guttman A., 2006 - Separation of ADN by Capillary Electrophoresis, Editura Beckman, Fullerton, California, pag. 40-43. 51. Southern E.M., Detection of specific sequences among DNA fragments separated by Gel Electrophoresis, Journal of Molecular Biology 98, 503-517, 1975. 52. Subbu Dharmaraj, " RT-PCR: The Basics ", 2008, http://www.ambion.com/techlib/basics/rtpcr/index.html 53. Takara Shuzo - " Long PCR Protocols " , 2003, http://www.hawaii.edu/microbiology/MO/longpcr.html 54. Thompson J.D., 1994 Nucleic Acids Research, Vol 22, p. 4673 - 4680. 55. Tofan L., Toma O., i colab., 2007 - Biochimie analitic, vol.1, Metode chimice de analiz, Metode de separare i concentrare a biomolelor, Casa Editorial Demiug, Iai, pag. 192-197, 202-204. 56. Wheeler W., 2001 Homology and the optimization of DNA sequence data, n Cladistics, Nr. 17, p. 5 11. 57. Wilson A. C., Carlson S. S., White T. J., 1977 Biochemical Evolution. Annu. Rev. Biochem., Nr. 46, p. 573 639.\ 58. Wilson, A. C., Cann, R. L., Carr, S. M., George, M., Gyllensten, U. B., Helm-Bychowski, K. M., Higuchi, R. G., Palumbi, S. R., Prager, E. M., Sage, R. D. and Stoneking, M., Mitochondrial DNA and two perspectives on evolutionary genetics. Biological Journal of the Linnean Society 26: 375 400, 1985. 59. www.geocities.com 60. www.wikipedia org.com

61

61. *** " Hystory and Development of PCR ", 2006, http://www.molecularstation.com/pcr/history-ofpcr/#pcrtoday 62. *** " Long PCR ", 2007, http://www.fermentas.com/catalog/pcr/longpcr.htm 63. *** " PCR - Polymerase Chain Reaction ", http://www.pcrstation.com/ 64. *** " Polymerase Chain Reaction ", 2008, http://www.biologydaily.com/biology/PCR 65. *** " Polymerase Chain Reaction ", http://en.wikipedia.org/wiki/PCR 66. *** " Principle of the PCR " , 1999, http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html 67. *** " RAPD PCR " , 1998, http://avery.rutgers.edu/WSSP/StudentScholars/project/archives/onions/rapd.html 68. *** " Real Time PCR Vs. Traditional PCR ", 2003, http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr.pdf

62

BIOLOGIE JUDICIARA (Indicatori biologici ai degradrii cadavrului uman) SRBU VASILE Universitatea AL.I.Cuza Facultatea de Biologie, Iasi sirbu.vasile@email.ro Cuprins

Cap. 1. Introducere 1.1. Biologia judiciar, definiie i principalele subramuri 1.2. Scurt istoric 1.3. Indicatorii biologici ai degradrii cadavrului uman Cap. 2. Variabilitatea organismului uman 2.1. Noiunea de variabilitate 2.2. Principalii parametri ai variabilitii organismului uman Cap. 3. Etapele descompunerii cadavrului uman 3.1. Caracteristici anatomo structurale ale cadavrului uman 3.1.1. Stadiile descopunerii cadavrului uman 3.1.2. Factori care afecteaz viteza de descompunere a cadavrului Cap. 4. Leziuni intra i extra celulare 4.1. Leziuni intra i extracelulare 4. 2. Necroza 4.3. Reacia inflamatorie Cap. 5. esutul animal postmortem 5.1 Autoliza celular postmortem 5.2. Autoliza postmortem n gaze toxice sau asfixie 5.3. Factorii care influieneaz autoliza postmortem 5. 4. Tehnici histologice pentru evidenierea autolizei postmorte m Cap.6.Microorganisme descompuntoare 6.1. Rolul miroorganismelor n descompunerea cadavrelor Cap. 7. Plantele inferioare i superioare cu rol n degradarea cadavrului 7.1. Fito i zooplanctonul 7.2. Plantele superioare Cap. 8. Insecte necrofage 8. 1. Caracterele morfologice generale ale insectelor 8.2. Ciclul de dezvoltare la insecte 8. 3. Caracterele generale morfologice ale dipterelor 8.4. Biologia Calliphoridaelor 8.5.Caracteristici ecologice ale mutelor verzi (Lucillia ) 8.6.Sarcophagidae 8.7.Principalele specii de gndaci de pe un cadavru 8.8.Succesiunea generaiilor de insect pe un cadavru 8.9.Colectarea insectelor de pe cadavru 8.10. Calcularea PMI Cap. 9. Vertebrate necrofage 9.1. Cinii i pisicile Cap. 10. Prezentarea probelor n faa instantei 10.1. Fotografia judiciar 10.2. Conservarea insectelor 10.3. Efectuarea preparatelor microscopice cu diatomee 10.4. Efectuarea unor preparate cu alge verzi 10.5. Efectuarea unor preparate cu fungi

63

Capitolul 1. Introducere Obiective - definirea obiectului Biologiei judiciare i a subramurilor sale, - scurt istoric, - direcii de dezvoltare, - principalele categorii de indicatori biologici ai degradrii cadavrului uman. 1.1. Biologia judiciar, definiie i principalele subramuri Biologia judiciar este un ansamblu de tiine care bazndu -se pe cunotinele de Biologie, le folosete pentru descoperirea cauzelor, locului sau a altor argumente legate de existena unei crime. Principalele categorii ale Biologiei judiciare se pot constitui din tot attea ramuri ale Biologiei, pn acum desprinzindu se Antropologia judiciar (recuperarea i identificarea cadavrelor), Botanica judiciar (studiul vegetalelor pentru a furniza dovezi ale crimei), Odontologia judiciar (stabilirea identitatii c adavrului), Biologia moleculara a crimei (tehnici moleculare de identificare), Entomologia judiciar (studiul insectelor care se dezvolta pe cadavre), Microbiologia judiciar (studiul micoorganismelor necrofage)etc. Entomologia judiciar este implicat n mai multe segmente ale cercetrilor criminalistice: stabilirea timpului exact cnd a survenit moartea individului, infestarea cu parazii ai unei persoane naintea morii, prezena pesticidelor n depozitele de alimente, folosirea pesticidelor n bitopuri diferite, etc. Principalele cunotine pe care trebuie s le posede un specialist n Entomologie judiciar se refer la componena faunei de insecte (n special Ordinul Diptera, fam. Calliphoridae, Sarcophagidae si Muscidae) din ar i zona n care-i desfoar activitatea, n zone urbane i rurale i n diferite biotopuri (Leeccese A. 2004). 1.2. Scurt istoric Studiul tiinelor care se ocup de multiplele aspecte pe care o crim le implic, poate fi datat nc din timpul vechiului Egipt. Primul om cu preocupri de medicin legal a fost Imhotep, pe care faraonul Zozer l -a desemnat s se ocupe de morile n condiii suspecte (2668IC)(fig.1).

Fig.1. Imhotep, (www.wikipedia.org) Prima autopsie confirmat, executat de un medic, Antistius, a fost pentru Iulius Cezar (102/100-44DC). Primele date legate de rolul pe care l are procurorul n observarea unui cadavru aparut n circumstane deosebite, n care se intrezrete o crim, sunt din Marea Britanie, din timpul lui Alfred cel Mare (871 -899DC). n timpul lui Riceard I (1189-1199DC) se stabilesc principalele ndatoriri ale procurorului, legate de prezena unui cadavru

64

uman. Dei procurorul era chemat s observe cadavrul, el nu practica autopsia, aceasta fiind considerat un pcat i permis numai n circumstane deosebite. Prima disecie este menionat n 1240, cnd impratul roman Frederic al II lea, decide ca o dat la cinci ani, la Universitatea din Napoli, un cadavru poate fi disecat pentru a permite studenilor mediciniti, observarea morfologiei interne. Au urmat apoi alte decrete prin care se prevedea legalitatea diseciilor (1540 Henry al II lea). Prima disecie postmortem pentru a determina cauza morii, a avut loc la Bologna n 1302. Medicul Azzolino a fost chemat de familia unui cetean, pentru a cerceta cauza decesului survenit instantaneu, n timpul mesei i despre care se credea c este otravire (fig.2).

Fig.2. Sala de disecii, Teatro Anatomica, Bologna, Italia (Sirbu Vasile, arhiva personala) Cel mai vechi text, din nefericire pierdut, cu referire la autopsie este din China secolului VI i aparine lui Hsu Chich Ts. In 1247, un alt chinez, Sung Tz scrie The Washing Away of Wrongs, considerat primul text de criminalistic. Autorul este considerat i primul care face referiri la noiuni de entomologie, cnd determin autorul unei crime dup modul n care mutele erau atrase de mirosul degajat de minile nesp late ale criminalului. n Europa, medicina legal a avut o evoluie lent i s -a separate de medicina legal abia spre 1700. Medicul Francois-Emanuel Fodere (1764-1835) a publicat n trei volume lucrarea Les lois e claire es par les sciences physiques: ou Traite de me dicine- le gale et hygi ne publique, recunoscut ca lucrare de baz n domeniul medicinii legale. La Universitatea din Edinburg, n 1802, se infiineaz prima catedr de Medicin legal, iar Sir John Gordon Smith scrie in 1821, prima carte de medicin legal din Anglia, intitulat The Principles of Forensic Medicine . Astzi se face distincia ntre medicina legal, patologie i patologie criminalistic, ultima reprezentnd studiul schimbrilor care survin n esuturi i organe cauzate de boli, traume, toxine, etc. n cazul morii ca rezultat al aciunii criminale. Autopsia n zilele noastre poate fi efectuat n principal de orice medic, dar se prefer cei cu experien n acest domeniu. n Marea Britanie exist la nivel naional o list cu medicii care pot execut autopsii si la cererea procurorilor i cu acordul rudelor este chemat oricare dintre acetia, sau cel responsabil de o anumit regiune. Dei autopsia poate aduce date importante despre deces, numai 20-30% din cadavre sunt autopsiate. Antropologia criminalistic este o alt ramur biologic care confer date importante despre sexul, etnia, tipul de moarte sau vrsta cadavrului. Antropologii criminaliti conlucreaz cu anatomopatologii, odontologii i criminalitii. Munca lor const n identificarea rmielor scheletale ca rezultat al proceselor naturale, al arderii sau aciunii unor substane (acizi) (Samuel S. Adebisi si col.2009). Date despre aciunea unor ali factori biologici inplicai n actul criminal s -au acumulat n lungul timpului. Exist numeroase cazuri n care animalele au fost acuzate de tribunale i executate, deoarece au prilejuit moartea unor persoane. Astzi deintorii de animale sunt responsabili de aciunile acestora i judecai, dac exist urme de violen animal. Cele mai vechi date despre Entomologia criminalistic sunt din secolul XIV. n lungul istoriei o serie de cercettori au contribuit la dezvoltarea ramurei Entomologiei i n ultimii 30 ani ai Entomologiei criminalistice. Printre acetia Song Ci avocat i medic legist care a trit n China secolului XIII. n lucrrile sale el descrie cum are loc fenomenul morii i cum trebuie investigat un cadavru, precum i cum trebuiesc interpretate probele adunate pentru a stabili cauza morii. Scrierile sale sunt considerate piatra de temelie pentru Entomologia criminalistic. Francesco Redi, fiziolog italian, a elaborat teoria generaiei spontanee prin care explic apariia larvelor pe o bucat de carne din insi componentele acesteia. Aceast teorie a modificat viziunea asupra modului n care oamenii gndeau despre descompunerea cadavrelor.

65

Bergeret d Arbois medic fiziolog francez, este primul care a aplicat cunotinele de Entomologie criminalistic pentru depistarea cauzelor i locului din care provenea un cadavru. Chinezii foloseau prezena mutelor i a altor insecte, ca parte a probelor n interpretarea unei crime, nc din sec. X. Dou sunt evenimentele care au dus la statuarea Entomologiei criminalistice ca diviziune de sine stttoare n domeniul Entomologiei. Primul se refer la descoperirea generaiei spontanee a lui Francesco Redi (1668) i a doua, clasificarea animalelor introdus de Linnaeus (1775). Jean Pierre Megnin (1894) n lucrrile La Faune des Cadavres: Application de l Entomologie a la Medicine Legale i Faunes des Tombeaux descrie opt stadii n descompunerea cadavrului uman i insectele care colonizeaz cadavrul n acest timp. El observ c stadiile variau n timp i se aflau sub influiena unor factori de mediu. Se incearc asocierea descompunerii cadavrelor diferitelor specii animale i succesiunea stadiilor insectelor, ceea ce devine un element de baza n estimarea PMI. n secolul al XIX lea, n Frana s-au fcut numeroase observaii asupra nevertebratelor care populau un cadavru n descompunere. Dei la nceput sporadic, aceste date au reprezentat o importan deosebit n elucidarea crimei dup 1980. ncetineala cu care s-a procedat n introducerea acestor date n cercetarea criminalistic, este din cauza aplicabilitii cu greu a cercetrii n practic. Este greu s faci experiene pe obolan i apoi s le aplici la un cadavru uman, din cauza puinelor asemnri dintre aceste organisme. n SUA animalul de experien pentru criminaliti a fost porcul, i n special fetuii proveniti de la acesta. n Europa, practica acestor experimene vine n contradicie cu Reglementarile privind Creterea Animalelor, al cror cadavre trebuiesc imediat incinerate sau ngropate. Cercetrile privind indicii folosii de la plante au progresat si mai lent. Abia in 1959, s -a folosit analiza unor gruncioare de polen, pentru stabilirea condiiilor unei crime. Biologia molecular prin analiza ADN ului i a proteinelor, din esuturi i secreii este arma secret a criminalisticii viitorului i a evoluat spectacular n ultimii ani. Desigur probele biologice ca parte a procesului de elucidare al unei crime, au partea lor de indoial, deoarece n toate tiinele exist i o zon de incertitudine. Care sunt principalele intrebri pe care trebuie s le pun un bun specialist cnd este n faa unui cadavru 1. care este cauza morii, 2. de ct timp a murit, 3. a murit imediat sau dup ct timp, 4. a murit n locul n care se gsete sau n altul, 5. a murit de cauze naturale, accident sau crim, 6. dac a fost omort cine este responsabil. Testele care se aplic pentru a rspunde la aceste intrebri trebuie s aibe i ele cteva caracteristici 1. acurateea rezultatelor trebuie s fac fa intrebrilor din instan, 2. sensibilitatea se refer la ct de mic trebuie s fie cantitatea de material analizat 3. specificitatea reactanilor care trebuie s reactioneze numai cu un anumit tip de material, far a interactiona cu alte tipuri, 4. rapiditatea n investigaiile criminale, timpul lucraz n defavoarea aprtorilor, 5. simplitatea cu ct mai complicat cu att pot interveni greeli, 6. de incredere i repetabil s poat fi repetat de un alt specialist ntr -un alt laborator, 7. costuri rezonabile s poat fi de rutin, 8. echipamentul i consumabilele s fie deaja existente. 1.3. Indicatorii biologici ai degradrii cadavrului uman Prin indicator biologic inelegem toate categoriile de animale (micoorganisme, nevertebrate i vertebrate) i plante (inferioare i superioare), care pot afecta ntr-o msur sau alta degradarea cadavrului uman, sau chiar apariia acestuia. Indicatorii biologici sunt categorii ale presupusei crime, integra i n mediul n care aceasta s-a comis. De aceea, pentru crimele comise ntr-un anumit teritoriu este necesar cunoaterea indicatorilor biologici din acel teritoriu sau din teritoriile vecine, deoarece cadavrele pot fi mutate de la locul comiterii faptei. La analiza indicatorilor biologici, nu trebuie uitat, c n lumea vie exist numeroase interaciuni (trofice, de imperechere, marcarea teritoriului, etc.), care pot influiena dispunerea geografic a organismelor. Deasemenea interaciunile dintre organismele vii sunt multiple, manifestndu-se ntre diferitele categorii sistematice (clas, gen, familie, specie etc.) i sunt legate de: - hran n funcie de care se pot stabili succesiuni ale dezvoltrii indivizilor unor comuniti, - mperechere i locuri pentru depunerea pontei,

66

eclozarea i dezvoltarea noilor indivizi.

Capitolul 2. Variabilitatea organismului uman Obiective - definirea noiunilor de variabilitate uman, - principalii indici ai variabilitii normale ale organismului uman, - precizarea importanei distinciei dintre caracteristicile legate de variabilitatea individual normal i cele produse prin crim. 2.1. Noiunea de variabilitate Toi oamenii care populeaz Terra aparin la aceeai specie, Homo sapiens, dar nu putem spune c avem doi indivizi perfect identici, chiar cnd ne referim la gemeni monozigoti. Aceasta face ca de la natere si pn la moarte s apar diferene n ceea ce privete anumite variabile . Variabilitatea anatomiei i histologiei fiinei umane, aflate n atenia criminalitilor biologi, se refer la vrst, ras, sex, cultur, boal, mutaii, dezvoltarea fetal, poluare, educaie etc.. Lund n considerare aceti parametri, diferenele dintre indivizi pot fi minore sau importante, voluntare sau involuntare, permanente sau trectoare, achiziionate sau motenite, legate de un anumit climat cultural etc. n analiza unei crime, ei sunt parametri care pot conduce la soluionarea corect a cazului. Samuel S. Adebisi i col.(2009) facnd un rezumat al rolului Antropologiei criminalistice precizeaz caracteristicile variabilitii individuale n legtur cu scheletul. Astfel unele caracteristici ale feei pot indica etnia: negrii au deschiderile nazale mai largi, indoamericanii i asiaticii au torusurile proeminente i caracteristici ale dentiiei, indicii biometrici ai craniului sau capului humeral caracteristici etc. Aceeai autori sumeaz literatura care aduce dovezi cu privire la caracteristicile scheletului privind sexul. n general, oasele femeilor sunt mai subiri i mai puin robuste, iar regiunile de ataare a muschilor mai puin proeminente. Dimensiunile oaselor scheletului cutiei craniene i ale bazinului sunt diferite la cele dou sexe, bazinul fiind mai larg la femeie. Vrsta poate fi determinat urmrind unele caracteristici ale oaselor. La tineri, oasele sunt mai puin osificate ca la adult, att n centrii de osificare ct i n plcile epifizare de cretere. Legat de vrst, Garamendi Pedro M. i col (2010) propune estimarea acesteia apreciind gradul de osificare al claviculei i al epifizelor primei perechi de coaste. Aproape toi factorii amintii sunt controlai prin informaia genetic. Numai civa sunt controlai de o anumit gen, majoritatea sunt controlai de un complex de gene i factori de mediu, care acioneaz majoritar n etapele vieii intrauterine. Multe diferene genetice au un efect mic asupra sntaii sau capacitii de reproducere a fiinelor umane, dar din punct de vedere statistic pot distinge o populaie de alta. Cercetatorii din domeniul genticii, folosesc studiul acestor diferene pentru a stabili migraiile populaiilor umane vechi i legturile dintre diversele grupuri umane. Un alt set de caracteristici individuale sunt cele legate de grupele de snge i tipurile imunologice . Aceasta este foarte clar cnd este nevoie de transfuzii de snge sau transplanturi de organe. Variabilele legate de morfoanatomia individual, au avut n lungul timpului, un impact diferit n societate. De exemplu indicii legai de culoarea pielii, grsimea subcutanat, prezena sau absena pilozitii trunchi ului etc. au asigurat omului un anumit loc n societate i anumite atribuiuni. Din acest motiv muli indivizi au apelat la chirurgia plastic, tratamente hormonale, sport pentru a indeprta surplusul i a le ncadra trsturile corpului, grupului predominant n care triau. Un specialist n criminalistic trebuie s cunoasc aceste variaii individuale i s le intercaleze ca atare n studiile de caz avute. Variaiile tegumentului i ale produciilor sale se poate ilustra urmrind culoarea tegumentului i tipul prului din zona scalpului. Culoarea tegumentului este dat de cantitatea de pigment produs de melanocite i nu de numrul acestora. Cu ct ne indeprtm de zona ecuatorului, cu att cantitatea de pigment produs n piele scade. Cercettorii au cre eat o scar de culoare dup care au incadrat diferitele rase umane: tip celtic, foarte deschis; tip european, deschis, tip caucazian, nchis european; tip mediteraneean, nchis; tip maron i tip negru (fig.3).

67

Fig.3 Tipuri de piele, a. piele de tip caucazian, b. piele de tip negru Exist i indivizi care aparin tipurilor rasiale amintite, la care pigmentul lipsete, acetia numindu -se albinoi. Culoarea i forma prului se poate ncadra n urmtoarele grupe: asiatic, caucazian i african. n aceste grupe prul are o morfologie de la lnos (africal) la drept (asiatic i caucazian). n general, variaiile individuale, se ncadreaz n modele matematice, de ex. nlimea legat de un anumit sex, variaz n limitele distribuiei Gaussiene (fig.4). Alte caracteristici ca de ex. culoarea pielii, variaz continuu n populaie, dar pot aprea diferene legate de mici grupuri. Alte caracteristici au o variaie binomial (ex. orientarea sexual a viitorului copilsex ratio).

Fig.4 Reprezentarea grafic a distribuiei binomiale Aceste variaii, au produs n lungul timpului discuii in societate, cu privire la aspectul normal al unui caracter. n unele societi imperfeciunile fizice au dus la excluderea indivizilor de la viaa social. Dac o variaie motenit este destul de puternic, este cuprins n noiunea de boal genetic. n unele cazuri, maladiile genetice pot fi considerate un avantaj, n timp ce la altele nu. De exemplu anemia produs de defecte ale structurii hematiilor (talasemie), la persoanele homozigote este un dezavantaj, pe cnd la cele heterozigote, confer protecie mpotriva malariei, iar mutaia este meninut la populaii n special n zonele afectate de aceast boal. 2.2. Principalii parametri ai variabilitii organismu lui uman Ciiva parametri ai variaiilor organismului uman sunt: - sexul (mascul, femel, intersexual, transsexual), orientarea sexual (heterosexual, homosexual, bisexual, pansexual, asexual), monogam, poligam. - ras (culoarea pielii, forma prului, a buzelor, a feei etc.) - forma i mrimea corpului , nlimea (scund, nalt, gigant, pitic), esutul adipos (obez, slab) - aspecte ale corpului (culoarea ochilor, a prului, a pielii, hirsutismul) - atribute reproductive (modificri sau mutilri ale apara tului genital- circumcizia feminin sau masculin; castrarea; vaginectomia; inversiunea de sex), virginitatea, fertilitatea - disabiliti fizice (inexistena unui membru, orb, surd, daltonist, alte boli). n funcie de aceti parametri, oamenii se pot diferenia individual ntre ei sau pe grupe etnice. Orict de mari ar fi variaiile individuale, ele nu pot clasa omul n alt grup dect cel uman, dar pot da indicaii preioase criminalitilor.

68

Capitolul 3. Caracteristici morfologice ale descompunerii cadavrului uman

Obiective - principalele stadii ale descompunerii cadavrelor i caracteristicile fizico chimice ale acestora, - viteza de descompunere i principalii factori care o afecteaz (modul n care a survenit moartea i mediul fizico-biologic n care aceasta s-a produs), - condiiile n care are loc formarea adipocerelor i a mumificrii, - stabilirea PMI, - diferite tehnici prin care se poate localiza geografic un cadavru, - potenialul i limitele analizei datrii materialului osos cu radiocarbon i izotopi n stabilirea vrstei oaselor i a originei geografice a acestora.

3.1. Caracteristici anatomo structurale ale cadavrului uman Perioada de timp scurs naintea morii este perioada ante mortem, iar cea dup moarte, perioada post mortem. Punctul temporal n care are loc moartea se denumete perioada de agonie. Sunt importante de punctat, evenimentele care au loc in aceste perioade, pentru a stabili dac moartea a survenit n urma unei crime sau nu. De asemenea este important de stabilit du rata perioadei post mortem, numit i intervalul post mortem (PMI), deoarece cunoscnd momentul precis al morii se poate implica sau nu, un anumit suspect. tiina care studiaz aspectele morfologice ale cadavrului, se numeste tafonomie, iar factorii care afecteaz rmiele, procese tafonomice (arderea, hranirea larvelor de insecte, canibalismul, etc.). 3.1.1. Stadiile descopunerii cadavrului uman Dup moarte corpul sufer transformri fizice i chimice, ale cror valori stadiale reprezint indicaii n stabilirea intervalului post mortem. n intervalul post mortem unele dovezi ale modului n care organismul a murit se pot distruge, sau se pot aduga artefacte care pot influiena negativ gsirea PMI. Stadiile descompunerii unui cadavru n mediul terestru sunt: proaspt, umplut cu gaze, putrefacie, ramie uscate putrefiate (Alen Gunn 2009, Iftenie V. 2006, Belis V. 1998). Stadiile se interptrund i sunt greu de separat ca stadii de sine stttoare, foarte bine delimitate. Un cadavru, foarte rar se descompune ntr-o manier uniform, regiuni ale cadavrului gsindu-se n diferite sadii de descompunere. Stadiul I (proaspt). Datorit opririi circulaiei sngelui i a localizrii acestuia n anumite regiuni ale cadavrului, pielea i mucoasele membranoase, apar de culoare pal, imediat dup moarte. Fetuii care mor nainte de a se nate, nu putrezesc, ei trec prin procesul de macerare, datorat lichidului amniotic. Oprirea circulaiei sngelui i lipsirea de oxigen i factori nutritivi ai celulelor, face ca acestea s moar. Rata morii celulelor este diferit dup tipul celular considerat i organ. De exemplu: neuronii din creier mor dup trei -sapte minute, n timp ce celulele epidermului, dup 24 ore se pot preleva i pot fi meninute n culturi celulare. Contrar credinei populare, prul i unghiile nu continu s creasc dup moarte. Creterea lungimii lor se datoreaz contraciei esutului din jur prin deshidratare. Deoarece metabolismul corpului se oprete dup moarte, temperatura sa ncepe s scad. Aceast rcire se numete algor mortis, sau raceala morii (algor, lat.=temperatura). Pentru o bun perioad de timp, msurarea temperaturii corpului, a reprezentat o modalitate de apreciere a PMI. Tehnica are numeroase puncte slabe. Astfel pielea se rcete mai repede i luarea temperaturii sub bra reprezint un handicap. Gura rmne n general deschis i mucoasa bucal se rcete mai repede. Luarea temperaturii n rect presupune micarea cadavrului, ndeprtarea hainelor i poate aduce numeroase artefacte n cercetarea la locul prezenei cadavrului. De aceea s-a sugerat msurarea temperaturii n canalul auditiv (Rutty, 2005).

69

Pentru a stabili PMI n funcie de temperatura luat n momentul investigrii, trebuie considerat c n momentul morii, corpul avea temperatura de 37C. n realitate temperatura corpului poate fi mai mare (infecii, efort muscular intens), sau mai mic (hipotermia determinat de pierderile masive de snge). Pierderile de temperatur depind de: 1. Factori care grbesc rata pierderii temperaturii - marimea mic a corpului, - coninutul sczut n grsimi, - integritatea corporal, - pierderile masive de snge, - lipsa hainelor, - hainele ude, - condiii meteo nefavorabile (cureni puternici de aer, temperatura mediului ambiant scazut, p loaie, grindin sau uscciune,) - substrat (mlastin, sol argilos, nisip, etc.) 2. Factori care micoreaz pierderea temperaturii - mrimea mare a corpului, - coninutul crescut n grsimi, - poziia fetusului, - prezena i tipul hainelor, - acoperirea cu alte materiale, - protecie mpotriva uscciunii, - temperatura ambiental ridicat, - microclimatul cu temperatur ridicat (cadavrul lng un radiator) - substrat termoizolator, - umiditatea mare (Gunn A. 2009). Exist numeroase formule prin care s-a dorit stabilirea PMI, dar majoritatea erau prea simpliste. Clauss Henssge a conceput o monogram complicat care ia n calcul greutatea corpului i temperatura mediului i permite aplicarea unui factor de corecie, dup caz (Gunn A. 2009). O monogram are de obicei trei scale, dou nregistreaz valori cunoscute, i a trei ofer valori rezultate. Din pcate dac cadavrul a stat la soare sau a fost mutat, datele obinute sunt eronate, deoarece la mutarea cadavrului pirderile au avut loc n dou medii cu temperaturi diferite. Metodele de evaluare a temperaturii corpului, se denumesc ca fcnd parte din metodele estimative, n care evenimentele iniiale s-au oprit la un anumit timp i se poate doar estima i nu preciza succesiunea lor. Datorit lipsei oxigenului, dup moarte, procese le celulare trec de la aerobice la anaerobice, iar rezultatul reprezint o schimbare dramatic a substanelor din celule i esuturi. Mai mult pierderea integritii membranare, duce la o redistribuire a metaboliilor n esuturi, ceea ce are ca rezultat, o schimbare a chimismului zonei. Aceste procese nu sunt uniforme n intregul corpul. De exemplu, metabolismul energetic descrete mai repede n snge, dect n umoarea vitroas a ochiului. Unii cercettori au urmrit stabilirea PMI, prin msurarea schimbrilor chimice din esuturi dup moarte. Din pcate, puine studii exist ntre diferiii componeni chimici ai esuturilor, sau ntre aceste msurtori i alte tehnici. Cea mai cunoscut i folosit tehnic pentru indicarea PMI este determinarea valorii ionilor de potasiu n corpul vitros, dei exist i puncte de vedere adverse (Lynnerup N., 2008). ntre 20 i 120 de minute dup moarte, la nivelul cadavrului uman, se poate observa lividitatea. Aceasta este o colorare a zonelor pielii n albstrui, datorat stagnrii sngelui n venele i capilarele din regiunile mai joase ale corpului (livor lat.=albstrui). Plasma sanguin se adun n regiunile inferioare ale corpului ceeea ce detrmin edemul (acumularea apei n esuturi) i formarea blisterelor (mici buzunare pline ale tegumentului) (fig.5). Dac persoana este ntins pe spate, lividitatea se va dezvolta pe spate, n timp ce dac cadavrul va atrna spnzurat, lividitatea se dezvolt n membrele superioare i inferioare. Apare ca mici pete care cu timpul se mresc i cuprind zone mai ntinse i mai profunde ale tegumentului. Initial sngele rmne n vase, apoi hematiile hemolizeaz i pigmentul difuzeaz n esutul nconjurtor, unde poate fi metabolizat la sulfhemoglobina, ceea ce d culoarea verzuie esutului. n sngele normal sulfhemoglobina nu exist, ea se poate forma la organismul viu n urma consumului de droguri (ex. sulfonamide).

70

Fig.5. Cadavru cu zone de hemoliz n tegument Presiunea exercitat de hainele strnse pe corp, sau alte accesorii de imbrcminte (curele, bijuterii, earfe etc.) pot impiedica umplerea cu snge a vaselor, ceea ce face ca zonele de tegument din vecinatatea lor s fie mai puin colorate. Zonele sunt denumite ca zone de paloare prin contact sau zone de paloare prin presiune. Cnd cadavrul este proaspat, este posibil de distins ntre vntile ante mortem i lividitatea post mortem, deoarece vntile rezult prin scurgerea sngelui n afara vasului afectat, n esutul nconjurator, cu formarea unui cheag. n cazul lividitii post mortem, sngele rmne n vasele de snge care se dilat, iar pe msur ce trece mai mult timp de la deces i esutul se degradeaz, sngele se scurge n afara vasului, rezultatul referitor la culoarea tegumentului fiind cam acelai, ceea ce face greu de precizat care fenomen a acionat. Initial, dup moarte sngele rmne lichid n vasele de snge i o mic parte din el se coaguleaz, prin eliberarea fibrinolisinului, din pereii capilarelor de snge. Aceast substan distruge fibrinogenul i mpiedic formarea chegului de snge. Oricum rnile deschise, dup moarte nu sngereaz abuziv, deoarece inima nu mai bate i presiunea sngelui nu mai exist (sau aproape). Sngele, chiar din arterele mai, curge n exterioar mai degrab din cauza gravitaiei, dect ca rezultat al presiunii sistolice (fig.6).

71

Fig.6 Nou nscut, abandonat la o groap de gunoi, recuperat a doua zi. Se pune ntrebarea la persoanele care cad de lo o nlime mare, n momentul contactului cu solul, persoana era sau nu decedat? Este important de tiut aceasta, deoarece un criminal poate ncerca s mascheze rnirile cauzate prin contact direct cu victima, aruncnd-o de la o nlime mare. Mai mult, dac victima sngera abundent, nainte de a fi aruncat de la nlime, pete mari de snge s se gseasc lng locul n care a czut. n cazul n care cadavrul cu rni serioare, a fost aruncat ntr -o ap, o cantitate mare de snge se pierde prin acestea, disipindu-se. Dup ce s-a scufundat, cadavrul are tendina de a se ridica la suprafa, datorit acumulrilor de gaze, ca rezultat al proceselor de putrefacie. Imediat dup moarte, muchii devin flasci i articulaiile se relaxeaz, nct nlimea persoanei crete cu civa cm (aproximativ trei). Mai mult, poziia corpului poate fi ciudat, deosebit de poziiile normale din timpul vieii. O dat ce individul pierde cunotina, acesta nu mai poate face micrile necesare pentru a -i menine o anumit poziie (de ex. statul pe scaun). n consecin cadavrul poate capta n cdere rani noi. Relaxarea musculaturii duce la deschiderea sfincterelor, eliminarea fecalelor, a urinei sau regurgitarea coninutului tubului digestiv, la momentul sau la scurt timp dup moarte. n cazul sufocrii, victima poate urina involuntar, dar procesul poate avea loc i natural n momentul morii. De aceea, nu este nelept s tragem unele concluzii din observaii ca acestea, dect dac ele se coreleaz i cu alte indicii, care arat c avem de a face cu o crim. n aceast ordine de idei, trebuie luat n considerare, c atunci cnd o persoan este n com, cantitatea de urin din vezica urinar este mult mai mare ca deobicei, deoarece aceste persoane nu rspund la stimulii obinuii. n consecin, o vezic urinar relaxat, poate fi indiciul c persoana era n com, cu cteva ore naintea morii. Aproximativ la trei-patru ore dup moarte (rigor lat.=rigid), rigiditatea membrelor i a muchilor se instaleaz. ntregul corp devine rigid dup 12 ore. nsa dac se trage puternic de membrele afectate, acestea pot fi micate. Rigiditatea apare mai nti n muchii mici ai feei i n cei care au fost folosii mai intens nainte de moarte. Ea afecteaz att muculatura neteda ct i musculatura scheletic. Dac afecteaz muchii firului de pr, are ca re zultat poziia erect a firelor de pr din regiunea scalpului i de pe suprafaa corpului. Tegumentul capat aspectul de piele de gin (Kobayashi M. 2002). Rigiditatea muscular se datoreaz acumulrii n celulele musculare a ionilor de Ca, prin oprirea p ompelor ionice de la nivel membranar, ca urmare a opririi metabolismului. Troponina i tropomiozina se dispun anormal, miofilamentele de actin i miozin se apropie, fibra se scurteaz. Apropierea are loc deoarece miozina poate pstra la capete ATP, nc naintea morii, ceea ce permite legarea ei de actin. O dat realizat, legatura nu se mai poate desface, deoarece ea necesit ATP, care din cauza intreruperii metabolismului celular nu se mai produce. Actina i miozina rmn legate prin puni intermoleculare, iar rigiditatea se instaleaz. Ea dispare pe msur ce proteinele ncep s se degradeze, dup 36 ore de la deces. Viteza cu care apare i dispare rigiditatea este influienat de temperatura ambiental, dac aceasta este mai ridicat, ea se instaleaz i dispare mai repede. La temperatur constant de 4C poate dura i 16 zile, parial pn la 28 de zile. La copii rigiditatea se instaleaz mai repede dect la adult, iar debutul este mai trziu dac moartea a survenit prin asfixie sau otrvire cu monoxid de carbon. Gradul de rigiditate nu poate oferi date de acuratee asupra PMI. Stadiul II (umplut cu gaze). Acest stadiu se instaleaz dup patru-ase zile, dar exist variaii n funcie de condiiile de mediu. La organismul viu, intestinul gros est e plin cu microorganisme, care nu mor o dat cu moartea organismului. Dup moartea organismului, unele dintre ele distrug celulele moarte din peretele intestinului, iar altele invadeaz esuturile vecine (Clostridia sp., Enterobacter sp.). n acelai timp la aciunea destructiv a populaiilor de microorganisme scpate de sub control, mai particip i feneomenele de autoliz, care prin enzimele eliberate din organism, distrug esuturile. esuturile care se descompun elibereaz substane de culoare verde i gaze, care dau tegumentului, ncepnd din zona de deasupra cecumului, o culoare pal i un aspect bicat. Sub piele apar zone care conin un amestec de plasma i gaze. Epiderma tinde s se separe de derm, pe msura creterii cantitii de gaze. Regiunea anterioar a corpului se ncovoaie, limba poate iei din cavitatea bucal. Lichidul din plmni se revars prin nri i gur. Fenomenele sunt nsoite de un miros puternic de hidrogen sulfurat i mercaptan. Un alt gaz, fr miros, produs n urma proceselor nutriiei micoorganismelor este metanul. Acumularea de gaze, duce la mrirea volumului cavitii abdominale, iar peretele, a crui rezisten a sczut prin autoliz, cedeaz. Rnile produse n urma acestor fenomene, nu trebuie confundate cu cele produse prin moartea organismului. Stadiul III (putrefacia). n acest stadiu cadavrul se gsete ntr-o avansat stare de degradare. Peretele corpului nu mai pstreaz forma iniial, tegumentul este parial distrus, insectele i alte organisme invadeaz suprafaa i interiorul cadavrului. Cadavrele provenind de la oameni obeji, tind s se descompun mai repede, datorit cantitii mai mari de lichide din esuturi, reinut de stratul adipos. Aceasta favorizeaz dezvoltarea miroorganismelor.

72

Adipocerele (ceara de cadavru) se formeaz n timpul descompunerii cadavrelor dac sunt ntrunite anumite condiii. Adipocerele au fost descrise ca substane grase, de culoare albicioas, glbuie sau verzuie i de consisten variabil. Ele cuprind un complex de substane rezultate prin degradarea lipidelor corpului. Dup moarte, autoliza i activitatea de descompunere a trigliceridelor de ctre bacterii, duce la formarea glicerolului i a acizilor grai liberi. Ultimii sunt formai dintr-un amestec de forme saturate i nesaturate, n care, pe msura formrii adipocerelor, predomin cei saturai. Se produce o scdere a ph -ului din regiunea n care acizii grai liberi se gsesc, ceea ce reduce activitatea descompuntoare a miroorganismelor. Adipocerele dau un miros specific, care se schimb cu timpul, folosit n antrenarea cinilor pentru gsirea cadavrelor. Din cauza formrii adipocerelor, forma tegumentului se schimb, ea putnd pstra urmele hainelor sau a diferitelor obiecte tari cu care cadavrul a venit n contact, dar n acelai timp astupnd unele orificii. Formarea adipocerelor, duce la ncetinirea procesului de descompunere pentru perioade foarte mari (ani). Este un proces folositor cercettorilor n criminalistic, dar duntor celor care ngrijesc cimitirele, deoarec e incetinesc refolosirea terenurilor pentru alte cadavre. Cadavrele ngropate direct n sol, tind s formeze adipocere mai rapid ca cele ngropate n sicrie. Mumificarea are loc cnd cadavrul este expus condiiilor de clim uscat, n special legat de o aerisire puternic, care produce evaporarea apei. Se ntilnete la cadavrele descoperite n camere foarte bine nclzite, couri de fum, zone din Sahara sau Tibet. De obicei este mai ntlnit la copii, din cauza suprafeei mari a tegumentului raportat la volumul mic, ceea ce produce o vitez de pierdere mare a apei. O dat mumificat, cadavrul poate rmne un timp ndelungat n aceast stare, dac condiiile de mediu nu se schimb. Stadiul IV (rmie uscate putrefiate). Dup ce tegumentul i prile moi au fost distruse, rmn oasele, tendoanele, ligamentele, prul i unghiile. Unele organe (prostata i uterul) sunt foarte rezistente procesului de descompunere. Rmiele au nc miros de putrid. Diageneza este procesul de descompunere a oaselor. Acesta ncepe la scurt timp dup moarte, sub aciunea miroorganismelor, i afecteaz microstructura i compoziia lor chimic. Cele mai puternice transformri au loc la oasele situate cel mai aproape de cavitatea abdominal, locul siturii miroorgamnismelor descom punatoare. Nu se recomand folosirea acestor schimbri pentru stabilirea PMI, dar se consider c prezena ligamentelor asociate cu oasele dau vrsta cadavrului de cinci ani, iar prezena petelor de snge n structura osului de 10 ani. 3.1.2. Factori care afecteaz viteza de descompunere a cadavrului Descompunerea cadavrului nu poate fi desprit de locul n care se produce. De aceea vom enumera i caracteriza pe scurt civa din factorii care influieneaz descompunerea cadavrelor: - localizarea geografic, influieneaz abundena i numrul speciilor de mircoorganisme i organisme care acioneaz asupra cadavrului, - anotimpul, descompunerea are loc mai repede ntr-un anotimp cald i umed. Oraele mari pot influiena prin creearea unui micoclimat, - expoziia geografic, dac cadavrul este nclzit de razele soarelui, activitatea bacteriilor va fi favorizat, dimpotriv la cureni puternici i umiditate sczut va fi ncetinit, - hainele, alte inveliuri textile sau sicriul, - solul, cadavrele ngropate se degradeaz de patru ori mai repede ca cele lsate la suprafa, ele fiind influienate direct de natura solului i indirect de efectul acestuia asupra abundenei i activitii microrganismelor, - apa, cadavrele imersate se degradeaz de dou ori mai ncet dect cele ingropate, datorit temperaturii mai sczute i lipsei de oxigen, - rnile, perimit ptrunderea aerului i a diferitelor organisme n cadavru mai uor dect dac corpul ar avea tegumentul ntreg, - infeciile preexistente (septicemia, rni infectate), pot mri viteza de descompunere, deoarece ele conin colonii de microorganisme, - arsurile i temperaturile mari (1000C, 2-3ore), folosite la arderea cadavrelor, las n urma lor resturi, unii factori asociai arderii cadavrelor grbesc descompunerea, alii o ncetinesc (pielea ars de la suprafaa corpului sterilizeaz zona i o deshidrateaz, schimbarea caracteristicilor substanelor cadavrului care influieneaz dezvoltarea miroorganismelor i a insectelor) (Gunn A., 2009).

Capitolul 4. Structura i ultrastructura celulelor i esuturilor necrotice Obiective

73

definirea termenul de leziune, leziuni intra i extra celulare, definirea noiunii de necroz, principalele tipuri de necroz, caracteristici structurale i ultrastructurale ale necrozei.

4.1. Leziuni intra i extracelulare Termenul de leziune include totalitatea modificrilor morfologice i functionale care apar n celule, esuturi i organe ca rspuns la o agresiune. Agresiunile pot fi stimuli fiziologici, dar care au intensitatea sau durata de aciune ce depeste limitele normale i ageni patologici : fizici (termici, electrici, radiaii, mecanici), chimici, biologici (virusuri, bacterii, protozooare, fungi, etc.), imuni (reacii antigen -anticorp), endocrini, nutriionali, ischemici, genetici. Muli dintre aceti factori induc doar modificri adaptative la nivel celular, dar dac stressul celular este de intensitate sau de durat prea mare, depind capacitatea de adaptare a celulei, apar leziunile i moartea celular. Iniial, modificrile sunt la nivel ultrastructural (vizibile doar cu microscopul electronic), apoi, pe msur ce leziunile progreseaz, ele devin vizibile i n microscopia optic (Hanna P. , 2011). n funcie de intensitatea factorului nociv, leziunile celulare pot fi reversibi le acute-degenerescena vacular (hidropic), cronice-adaptari ale creterii i diferenierii celulare (hipertrofia i hiperplazia, atrofia i involuia, metaplazia), acumulri intracelulare lipidice (steatoza, colesteroloza) ,acumulari de pigmeni (lipofuscina, melanina, hemosiderina, pigmenii biliari), acumulri extracelulare de proteine (hialinoza, amiloidoza), calcificri patologice (metastatice i distrofice) i ireversibile : acute -degenerescena vacular (hidropic), cronice (adaptri ale creterii i diferenierii celulare- hipertrofia i hiperplazia, atrofia i involuia, metaplazia, acumulri intracelulare lipidice steatoza, colesteroloza, acumulri de pigmeni lipofuscina, melanina, hemosiderina, pigmenii biliari, acumulri extracelulare de proteine-hialinoza, amiloidoza, calcificri patologice (metastatice i distrofice), apoptoza i necroza(fig.7).

Fig.7 Leziuni celulare, schem (www. ePathology.ro) 4. 2. Necroza Moartea la un organism viu cuprinde dou aspecte: moartea somatic prin care organismul nu mai interactioneaz cu mediul i moartea celular prin care activitile metabolice ale celulelor sau esuturilor au fost intrerupte. Exist dou tipuri de moarte celular: necroza i apoptoza (moartea celular programat). Necroza este moartea violent a unui grup de celule din organismul viu sau din organismul mort. Rezultatul acestei mori este apariia n esuturi a unor produi finali de degradare, malonil dialdehida i lipofuscina. Necroza poate fi cauzat de numeroi factori (fizici-temperaturi sczute sau foarte crescute, degerturi, iradieri, mecanici, biologici- toxinele unor microorganisme), ischemie.

74

Ischemia este factorul cel mai ntlnit, i este produs de privarea alimentrii cu snge a unui anumit teritoriu. Principalele etape ale necrozei la nivel celular sunt: 1. prenecroza, caracterizat prin leziuni celulare distrofice reversibile, 2. necrobioza caracterizat prin leziuni celulare distrofice ireversibile, n care predomin procesele celulare catabolice, 3. necroza propriu-zis caracterizat prin ntreruperea proceselor vitale ale celulei, 4. postnecroza n care celulele se autolizeaz, i se genereaz un rspuns inflamator din partea organismului. Din punct de vedere biochimic, necroza reprezint blocarea pompelor ionice (eflux de K, influx de Na i apa). Celula se umfl, se sparg lizozomii cu eliberarea enzimelor hidrolitice. Modificrile care au loc se refer la proteine care trec din structura secundar n cea teriar i digestia enzimatic (heterolitic prin enzime provenite de la celulele care realizeaz rspunsul inflamator i autolitic prin enzime care provin din lizozomi). Exist dou tipuri de necroz: umed (de colicvaie) i uscat (de coagulare).Cele dou tipuri apar n caz de boal. Necroza de coagulare apare n organe fr caviti (solide) i la care circulaia este de tip terminal. Macroscopic dup 12-24 de ore, esutul necrozat are o culoare alb -glbuie, are consistena dens, masa necrozat are aspect colapsat i rsucit. Perinecrotic apare o culoarea roiatic, datorat reaciei inflamatorii. Activitatea enzimatic a succinat dehidrogenazei se pierde, predomin digestia proteic. La nivel celular, nucleii devin picnotici (cariopicnoza), deni, n funcie de timpul observaiei se fragmenteaz (cariorexis) i n final se dizolv (carioliza) n circa dou-trei zile. n citoplasm proteinele se coaguleaz, citoplasma se fragmenteaz (plasmorhexis) i n final lizeaz (plasmoliza). Are aspectul ca de sticl, celulele se pot calcifia (mineraliza) (Bouvenot G.2006) Exist semnalate cazuri n care datorit necrozei, prin tromboz arterial sau hipersecreie enzimatic a pancreasului, a avut loc moartea individului (Williams G. 1954). Necroza de colicvaie (umed), apare n esuturi bogate n ap i lipide (esutul nervos), n infecii bacteriene. n creer, zona afectat devine foarte moale, se formeaz un chist plin cu un lichid tulbure, structura normal se dezorganizeaz, din cauza lipsei rspunsului de fibrogenez. Predomina digestia enzimatic. Gangrena este o form special de necroz n care n zona afectat se stabilete o microflor anaerob care produce enzime ce afecteaz esuturile nvecinate (putrefacie), extinzndu -se n tot organismul (oc toxic i deces). Ea poate fi uscat, umed sau gazoas. n gangrena umed esuturile sunt moi, fr linie de demarcaie. n gangrena uscat esuturile sunt dense, negricioase, precis demarcate. n gangrena gazoas, culoarea esuturilor este cenuie-verzuie, aspect emfizematos i miros putrid. Gangrena gras se localizeaz n special n abdomen sau esutul gras subcutanat. Rezult un esut numit grsime de saponificare. Zona are aspect albicios, tare, ca de calcr i un bogat esut de inflamare n jur. Escara este un tip special de necroz i apare la bolnavii imobilizai la pat, prin comprimarea vaselor de snge pe planuri osoase. esuturile devin moi, de coloraie albstrui-negricioas. 4.3. Reacia inflamatorie Denumirea de inflamare provine de la latinescul inflama care nseamn a fi n flcri i desemneaz culoarea roie care apare la locul afectat de procesul inflamator. Acest aspect se observ mai uor la epitelii. Reacia inflamatorie reprezint reacia de aprare a organismului la modificarea condiiilor biochimice locale, ca urmare a aciunii unor factori strini (micoorganisme, virusuri) sau substane interne (Manolescu N. 1999). n esuturi primul semn al reaciei inflamatorii este afluxul sanguin crescut, creterea permeabilitii pereilor vaselor de snge i migrarea din sngele periferic al unor tipuri celulare spre locul afectat. Celulele rspunsului imun se aglomereaz i se prind de celulele endoteliale ale vaselor de snge. Se observ un eflux vascular de plasm (fig.8).

75

Fig.8 Gangrena picior diabetic, reacie inflamatorie, tricromic Masson, mox20 Neutrofilele sunt primele care ajung la esutul afectat i manifest o puternic aciune fagocitar. n al doi-lea val sosesc monocitele, macrofagele i alte celule din linia limfocitelor. Exist mai multe tipuri de reacii inflamatorii dup caracteristicile structurale: - inflamaia granulomatoas caracterizat prin formarea n zona afectat a granulaiilor. Apare n sifilis, lepr, tuberculoz, etc. - inflamaia fibroas n care fibrina trece din vasele de snge n spaiile intercelulare i formeaz cicatrici. Se observ de obicei in cavitile seroase. - inflamaia purulent este caracterizat printr-o cantitate mare de puroi (abces) n regiunea afectat i apare n cazul infeciilor bacteriene cu stafilococi. - inflamaia ulcerativ apare lng un epiteliu i poate duce la necroza esutului vecin.

Capitolul 5. esutul animal postmortem Obiective s defineasc autoliza celular postmortem, factorii care influieneaz autoliza postmortem, caracteristici celulare ale autolizei postmortem, stabilirea PMI folosind modificri celulare structurale, tehnici histologice pentru evidenierea autolizei postmortem.

5.1 Autoliza celular postmortem Dei este foarte greu de precizat la un cadavru, care sunt traumele antemortem i post mortem, vom ncerca s prezentm cteva caracteristici ale autolizei postmortem. Autoliza postmortem este moartea celular asemntoare necrozei, dar care survine o dat cu moartea intregu lui organism. Autoliza postmortem este degradarea organismului de ctre substanele care se gsesc n interiorul acestuia (enzimele celulare) sau n diferitele compartimente ale acestuia. Pentru a funciona, organismul foloseste ATP - ul ca surs energetic. O dat cu ncetarea circulaiei sngelui, i a aportului de oxigen, celulele ncep respiraia anaeroba, consumnd rezervele tisulare de ATP pn la epuizare. n urma acestui proces se acumulez acidul lactic, care produce inhibarea enzimelor, colapsarea nucleului i n final a ntregii celule. Modificrile legate de autoliza postmortem sunt diferite n funcie de sistem. Unele organe (oasele, prul, unghiile, dinii), sunt mai rezistente la aciunea enzimelor celulare sau a factorilor extracelulari. Organele mai bogate n vase de snge, vor fi primele afectate (ficatul, rinichii, pancreasul, muchii), altele vor fi afectate mai greu (corneea). Yukari T.si col. (2004) ntr-un studiu efectuat pe obolani enumer principalele modificri imediate care au loc n celula postmortem: edem celular, depozite amorfe n mitocondrii, scderea granulelor de glicogen, dilatarea

76

cisternelor reticulului endoplasmatic, dispunerea perinuclear i n grmazi a cromatinei i/sau condensarea acesteia (fig.9). Acetia precizeaz c modificrile ultrastructurale sunt dependente de organul observat. Cel mai timpuriu aceste modificri apar n rinichi, muchiul inimii, i ficat. Cel mai trziu modificrile apar n muchii scheletici. n unele organe, de exemplu pancreas, modificrile amintesc att autoliza ct i apoptoza(fig.10). n rinichii organismelor moarte, exist o dependen a instalrii autolizei postmortem, n funcie de condiiile de mediu. Zdravkovic M. Si col. (2006), a examinat un lot de 112 obolani, pe care i -a omorit i le-a colorat cortexul renal cu PAS. Au observat mezangiul glomerular, membrana bazal a glomerului, stratul parietal al capsulei Bowman, membrana bazal i regiunea apical a celulelor epiteliului tubului renal. Dup omorre, animalele au fost inute la temperaturi de 10C, 20C si 30C. disecia nimalelor s -a fcut ntre una i 72 ore dup sacrificare. Colorarea seciunilor s-a fcut cu PAS. Experimentul a demonstrat c exist o dinamic a schimbrilor n structura rinichilor influienat de temperatur, ceea ce determin o anumit succesiune a stadiilor autolitice. Rinichii i schimb culoarea mergnd pn la negru, iar demarcaia dintre cortex i medular se pierde. n stadii avansate ale descompunerii devin moi si periferia ia aspect bulbucat. Macroscopic pe ficatul postmortem se observ zone mai deschise la culoare, datorit sngelui care a fost forat s ias din parenchim, datorit presiunii executate de intestinele ce sunt pline cu gaze i datorit presiunii coastelor. Aceste zone decolorate se pot observa i datorit aciunii postmortem a unor bacterii (Hanna P. www. people.upei.ca). Ficatul i pierde culoarea roiatic i devine glbui, nu mai este turgescent, iar epiteliul vezicii bilare se poate desprinde uor. n unele studii s-a observat c dup eutanasierea animalelor de experien, grautatea ficatului a crescut semnificativ. n hepatocite i n celulele epiteliale se acumuleaz vacuole cu un coninut asemntor celor din sinusoide (Xiantang Li si col. 2003)

Fig.9 Microscopie optic A. Ficat mascul 25 minute dup eutanasiere, PAS, vacuole intracitoplasmatice slab pozitive (sgeat), S sinusuri, b. Ficat, mascul, 10 minute dup eutanasiere, vacuole intracitoplasmatice colorate pentru albumin (sgeat), c. Ficat, mascul, 25 minute dup eutanasiere, coloraie pentru beta-catenina, membranele plasmatice puternic colorate, d. Ficat, mascul, 5 minute dup eutanasiere, coloraia pentru adipofilin n vacuole puternic negativ (sgeat), lipidele intracitoplasmatice puternic pozitiv ( Xiantang Li si col. 2003).

77

Fig.10 Microscopie electronic A. Ficat, mascul, 10 minute dup eutanasie, plasma produce distensia capilarelor sinusoidale (S) i a spaiilor Disse (D), formeaz vacuole intracitoplasmatice n hepatocite i celulele epiteliale(V), picturile de lipide (L), au o consisten omogena n timp ce coninutul vacuolelor este asemntor celui din sinusoide. B. aceeai poriune la o mrire mai mare, C. Ficat, mascul, dup 10 minute eutanasiere, plasma produce distensia sinusoidelor (S), a spaiilor Disse (D) i a spaiilor intracelulare (I), membrana unui hepatocit este rupat (sgeat), D. Ficat, mascul, 10 minute dup eutanasiere, resturi celulare ntr -o vacuol intracelular (sgeat)( Xiantang Li i col. 2003) Shimizu M i col. (1990) au studiat autoliza care are loc n pancreas i au constatat c exist cel puin 12 factori care influieneaz acest proces (PMI., modul n care a decedat persoana, neoplazii existente, istoricul interveniilor chirurgicale la nivel de cavitate abdominal, etc.). Pancreasul este organul n care schimbrile postmortem au loc rapid. Pierde lobulaia, devine moale i translucid. ntr-un stadiu avansat al descompunerii cadavrului, pancreasul devine ca un sac cu un coninut lichid roiatic, sau poate s dispar, locul su fiind luat de o structur membranos. Rspunsul la procesele autolitice legate de moartea organismului, este asemntor la esuturile care conin aceleai substane, exemplu esutul muscular. Yamamoto A. i col. (1993), a analizat fibrele musculare cardiace i cele provenite de la un muchi scheletic i au constatat procesul degradrii este fundamental acelai, ceea ce difer sunt substanele cu rol de inhibitori. n acelai esut muscular, aparinnd diafragmului de la persoane cu boli respiratorii, Reid i col. (2007), a observat c esutul necrozat prezint zone care se comport diferit fa de restul esutului (vacuolizare, fibre hialine, lipofuscin) i este caracteristic persoanelor cu boli respiratorii cronice. ntre muchii scheletici, n stadii avansate ale degradrii, apar pungi cu aer. Unii autori (Hayat M.A. i col. 2000 ) au constatat c moartea organismului duce la pierderea ordinii de aciune a enzimelor, mai mult dect la micorarea cantitii acestora. n tractul gastro-intestinal modificrile sunt rapide, datorit prezenei sucurilor digestive, florii bacteriene i substanelor nutritive provenite din alimente, care constituie suport pentru deyvoltarea bacteriilor. Glandele salivare submaxilare sufer modificri n intervalul 6-12 ore postmortem, caracterizate prin alterarea nuclear i pierderea progresiv a structurii celulelor acinoase (Nery L. R si col. 2010). La nivelul mucoasei intestinale se observ, imediat dup moarte, contracia vililor, i apariia unui strat mai gros d e mucus la suprafaa epiteliului. Sub presiunea gazelor peretele intestinului se poate rupe.

78

Splina se decoloreaz spre gri i negru, iar parenchimul se lichefiaz. Creierul se vacuoleaz prin ptrunderea lichidului cefalorahidian, iar membranele mening eale se rup. Corneea devine opac datorit absorbiei umorii apoase, globul ocular se colapseaz datorit descreterii presiunii interne i retina se dezlipete. n esutul sanguin se observ o transvazare a plasmei din vase n spaiul intercelular. esutul rmas n vas formeaz cheagul sanguin. Recoltarea esutului sanguin se face din inima, artera i vena femural sau vasele subclaviculare. O parte a sngelui se conserv la -20C pentru analize moleculare. Principalele modificri intracelulare postmortem n unele organe ale corpului, se pot sintetiza n: Rinichi 1or nu sunt modificri, 3 ore mitocondrii usor rsucite, microvili cu dispoziie neregulat, 5 ore cromatina nuclear uor condensate, 10 ore cromatina mai condensat, mici vacuole n citoplasm, microvili dilatai, 24 ore microvili dilatai, cromatina condensat, mitocondrii cu material dens. Pancreas 1or uoar dilatare a RE, uoare depozite amorfe mitocondriale, 15 ore degenerarea accentuat a mitocondriilor, 24 ore dispariia organitelor, contorsionarea celulei. Ficat 1ore edem celular, pierederea cristelor mitocondriale, condensarea cromatinei nucleare, 10 ore slab depozit amorf n unele mitocondrii, 15 ore depozit amorf puternic n mitocondrii. Muchi scheletic 1ore contracia fibrelor, 24 ore dispunerea marginal a cromatinei nucleare, depozit amorf dens n mitocondrii. n figurile de mai jos am ilustrat aspectele structurale ale autolizei postmortem, la nivelul principalelor organe: splin, rinichi i stomac. Seciunile provin de la un cadavru dup cinci zile de la deces, inut la temperatura de 4C (fig. 11, 12 si 13).

79

b
Fig.11 Splina, zone de autoliz, hemalaun eosina, mo. a. X 10, b.x 90

80

b
Fig.12 Rinichi, a. zone de necroz pe schelet normal,b.autoliza e piteliului tubului renal, hemalaun eozina, mo a. X10, b.x 90

81

b
Fig.13 Stomac, zone de congestie pasiv, hemalaun eozina, mo.ax10, b.x40 5.2. Autoliza postmortem n gaze toxice sau asfixie Persoanele care au decedat prin lips de oxigen, din cauze d iferite, pot prezenta unele caracteristici morfologice, astfel: - gaze inerte (azot, metan) sau viciate (cantitate scazut de oxigen). Concentraiile de CO2 ntre 20 - 30%, pot provoca moartea la persoane cu boli de inim, iar concentraii de 40% sunt letal e pentru orice persoan. Regiunile terminale ale tegumentului membrelor superioare sunt colorate n rou (fig.14).

Fig.14 Colorarea n rou a tegumentului extremitilor la un asfixiat n atmosfer cu CO2 n conjunctiv, n asfixia mecanic (strangulare), apar hemoragii care se pot observa macroscopic (fig.15). Dei nu sunt caracteristice, aceste semne se pot corela cu vtmarile din tegumentul gtului sau al osului hioid.

82

Fig.15 Asfixie mecanic cu hemoragia conjunctivei n asfixia intrapartum, lichidul amniotic ptrunde n cile respiratorii i se regsete n cile respiratorii mari (fig.16 si 17 ).

Fig.16 Seciune plmni, ft mort intrapartum (caz I), sgeat -ci respiratorii pline cu lichid amniotic, hemalaun eosina, mox60

83

b
Fig17. Seciune plmni, ft mort intrapartum (caz II), a. sgeat -ci respiratorii pline cu lichid amniotic, celule scvamoase, hematii, b. bronii cu epiteliul descuamat (sgeat), autoliz la nivelul broniilor, staz cronic, alveolit amniotic n context de hipoxie fetal, hemalaun eosina, mox60 n figurile 18-20 se pot observa modificrile celulare produse de autoliz in asfixia intrapartum.

Fig.18 Seciune creier, ft mort intrapartum, arii de ramolisment cerebral, hemalaun eosina, mox60

84

Fig. 19 Seciune inim, ft mort intrapartum, autoliza celulelor miocardice, hemalaun eosina, mox60

Fig.20 Sectiune intestin, ft mort intrapartum, autoliza total a mucoasei, hemalaun eosina, mox60 5.3. Factorii care influieneaz autoliza postmortem Autoliza postmortem este influienat de o serie de factori: 1. temperatura este un factor cheie care influieneaz viteza de reacie a enzimelor din corp, 2. timpul scurs de la deces, produce modificri n viteza din ce n ce mai mic a proceselor autolitice postmortem, 3. cauza i modul n care a survenit decesul, (purttoarii de infecii bacteriene au o rat mai mare a descompunerii), 4. tipul de esut, (creierul se distruge mai repede dect oasele), 5. mediul n care a avut loc moartea.

85

Totalitatea acestor factori, sau aciunea lor separat, determin o animit vitez de descompunere a cadavrului uman.

5. 4. Tehnici histologice pentru evidenierea autolizei postmortem n executarea preparatelor de histologie provenite de la cadavre trebuie inut cont c cel mai adesea acestea sunt degradate i descompuse. Majoritatea timpilor tehnicilor de histologie se execut astzi cu ajutorul aparatelor automatizate )(fig.21-26).

Fig.21 Aparat pentru includerea automat a esuturilor (www. Laboratoryeqipmentworld.co).

Fig.22 Microtom manual (www. Laboratoryeqipmentworld.co)

86

Fig.23 Procesor esuturi (www. Laboratoryeqipmentworld.co)

Fig.24 Aparat colorare automat esuturi (www. Laboratoryeqipmentworld.co)

87

Fig.25 Incint depozitare esuturi prelevate (www. Laboratoryeqipmentworld.co)

Fig.26 Hote (www. Laboratoryeqipmentworld.co) esutul animal se poate observa la microscopul optic pe preparate proaspete (preparate extemporanee sau vitale) sau fixate (preparate permanente ) (Srbu V. 2008). Executarea preparatul proaspt se poate face: prinznd esutul ntre lam i lamel ntr-un mediu lichid, folosind o lam care are o camer umed, prin ntinderea esutului ntr-un strat subire pe lam. Este cea mai simpl modalitate de observare a esutului animal. Executarea preparatului permanent. Principalele etape n pregtirea preparatului histologic animal permanent sunt: 1. recoltarea materialului care trebuie fcut fr lezarea structurii, n caz contrar putnd apare artefacte. Recoltarea se poate face o dat cu fixarea esutului sau dup omorrea animalului. Recoltarea se poate face cu truse standard, care sunt puse la dispozitie prin institutiile acredutate (http://medicinalegalahd.ro/ ).

88

2.fixarea stabilizeaz structurile ntr-o form apropiat de starea vie. Prin fixare volu mul structurii se reduce cu aproximativ 70%. Un fixator bun are urmtoarele trsturi: inhib autoliza ( reduce degradarea celular ), reduce deformrile probei n timpii urmtori de prelucrare. Pentru microscopul optic exist dou clase de fixatori: -fixatori coagulani care fixeaz esutul prin coagularea proteinelor plasmatice. Dup aciunea fixatorilor coagulani permeabilitatea membranar crete favoriznd micarea substanelor din i nspre celul. Exemple de fixatori coagulani: etanolul, metanolul, acetona ( gradul de deformare +++ ), acid picric, clorur mercuric ( gradul de deformare ++ ), acidul triclor acetic ( gradul de deformare + ). -fixatori necoagulani care prin aciunea lor fixatoare se inser n structura proteinelor i stabilizeaz leg turile ncruciate ( la nivelul grupelor amino libere ). Fixatorii necoagulani pstreaz structurile proteice, ns puterea de micare a substanelor din i nspre celul este mic. Exemple de fixatori necuagulani: aldehida formic, glutaraldehida, acidul osmic. Grupele de fixatori enumerate se pot combina, rezultnd mixturi fixatoare cu proprieti superioare ( Bouin acetic, Helly, Zenker). Fixarea se poate realiza si prin procedee fizice cu microunde, pentru preparatele care vor fi colorate cu argint. 3. deshidratarea duce la ndeprtarea apei din esuturi i se practic naintea infiltrrii cu parafin, deoarece aceasta nu este miscibil cu apa. Pentru microscopia optic ca agent de deshidratare se folosete etanolul n concentraii cresctoare 50%, 70 %, 95 %, 100%. Pentru micoscopia electronic se folosete acetona deoarece este miscibil cu rinile epoxinice. 4. clarificarea nlocuete agentul deshidratant cu un solvent organic miscibil cu mediul de includere. Solventul trebuie s fie volatil pentru a grbi ptrunderea mediului de includere. Pentru microscopia optic ca substane clarificatoare se pot folosi: xilenul, benzenul, toluenul. Pentru microscopia electronic substana cu rol de deshidratare se folosete i pentru clarificare ( etanolul, oxidul de propilen ). 5. includerea este nlocuirea agentului de clarificare cu o substan care se ntrete i permite secionarea esutului. Includerea este precedat de infiltrare (trecerea esutului prin amestecuri gradate formate din soluii de clarificare i mediu de includere). Pentru microscopia optic se folosete parafina cu puncte diferite de topire ( 58-60 C, 55-58C ). Cu ct punctul de topire al parafinei este mai nalt cu att duritatea blocului este mai mare. Pentru microscopia electronic se folosesc rinile epoxinice. Infiltrarea are loc la temperatura laboratorului, blocurile se obin prin polimerizare la 40-60 C. 6. secionarea blocurile se taie n felii subiri. Pentru microscopia optic se folosete un microtom cu cuite de metal, grosimea seciunilor variind ntre 2-20 microni. Seciunile se lipesc de lama de sticl cu albumin sau amidon. Pentru microscopia electronic seciunile se fac cu ultramicrotomul la care se folosesc cuite de sticl, grosimea seciunilor fiind de 500-600A. Seciunile se prind prin aderen la o gril metalic. 7. colorare crete contrastul structurii. Coloranii folosii n microscopia optic conin duble legturi care absorb specific radiaiile luminoase. Cei mai muli colorani formeaz legturi electrostatice cu structurile din esut. Dup ph coloranii sunt: acizi ( anionici ) formeaz legturi electrostatice cu proteinele citoplasmatice i ale matrixului celular i bazici ( cationici ) formeaz legturi electrostatice cu structurile ncrcate negativ. 8. seciunile de microscopie electronic nu se pot examina fr s fie contrastate. Pentru contrastare se folosesc metalele grele citrat de plumb, acetat de uranil, care produc deflexia electronilor. Pe ecranul microscopului structura apare ntunecat. 9. montarea se folosete pentru a pstra contrastul seciunilor un timp ndelungat. Majoritatea preparatelor se monteaz n balsam de Canada, rina obinut de la coniferul Abies balsamea. Capitolul 6. Micoorganisme descompuntoare Obiective - rolul mircoorganismelor n procesul descompunerii cadavrelor, - factorii care influieneaz aciunea microorganismelor descompuntoare,

6.1. Rolul miroorganismelor n descompunerea cadavrelor Putrefacia este degradarea cadavrului de ctre microorganisme exogene. Multe dintre bacteriile prezente din timpul vieii, pe sau n interiorul corpului nostru, sunt importante n procesul descompunerii cadavrului. Exist relativ puine studii de microbiologie, efectuate pe sau n jurul cadavrelor n descompunere, care s ofere date despre timpul la care a survenit decesul. Schimbri n abundena, diversitatea i distribuia microbilor de pe un cadavru, reprezint indicii n stabilirea cauzei i a locului n care a avut loc decesul.

89

De exemplu, exist cazuri n care nu se tie exact dac persoana a decedat n urma unei boli preexistente, sau a unei infecii aprut printr-o injecie, sau dac moartea a survenit natural sau este un act criminal. Pentru soluionarea acestor cazuri se practic izolarea miroorganismelor i a ADN-ului lor. De multe ori tehnicile pot fi viciate de exemplu, probele luate din plmni, ca urmare a contactului acestuia cu exteriorul. Colonizarea cadavrului ncepe de obicei cu intestinul, i plminii, care adapostesc n mod normal un mare numr de mircoorganisme (Escherichia sp., bacili, micrococi, etc.) (fig.27). Din acest motiv un corp tinde s se descompun din interior spre exterior. Dac cadavrul este conservat sub 0C i apoi readus la temperatura mediului, procesul are loc invers, dinspre exterior spre interior. Aceasta se explic prin decongelarea mai rapid a peretelui corpului, dect a interiorului, ceea ce permite o activitate mirobian mai rapid la exterior.

Fig.27 Escherichia coli, colonii Datorit schimbrii ph-ului prin autoliz celular i a consumrii oxigenului din esuturi, majoritatea bacteriilor dintr-un cadavru sunt anaerobe (Clostridium perfringens, Pseudomonas aeruginosa)(fig.28).

Fig.28 Psudomonas aeruginosa, colonii Proteinele sunt atacate de bacteriile de putrefacie, care transform azotul n compui amoniacali, iar bacteriile nitrificatoare transform amoniacul n nitrai (genurile Nitrococcus). Proteinele comlexe sunt degradate de ctre microorganismele heterotrofe n afara celulelor, prin eliminarea enzimelor proteolitice. Microorganismele conin i endoenzime proteolitice care pot fi extrase numai dup procedee de tipul nghe -desghe, vibraii ultrasonice sau liza chimic. Degradarea proteinelor are loc dup schema protein-peptid-aminoacizi Degradarea proteinelor este efectuat de dou categorii de enzime: proteinazele care atac lanul polipeptidic n interorul su i peptidaze care atac secvenial lanul polipeptidic la exteremiti. Microorganismele proteolitice care au capacitatea de a sintetiza cantiti mari de proteinaze exocelulare, formeaz grupul agenilor de putrefacie, care cuprinde bacterii strict anaerobe (Bacillus, Pseudomonas), anaerobe facultative (Proteus, Sarcina), anaerobe stricte (Welchia, Clostridium), etc..

90

Capitolul 7. Plantele inferioare i superioare cu rol n degradarea cadavrului Obiective fito i zooplanctonul, principalele specii de interes criminalistic, fungii, plantele lemnoase, polenul, fructele i seminele ca indicatori ai localizrii cadavrului i ai stabilirii modului n care a survenit moartea acestuia. 7.1. Fito i zooplanctonul Plantele inferioare sunt cuprinse n genul Protista i numai unele dintre ele au important n criminalistic, multe avnd rol n medicina legal. Dintre acestea, se poate enumera Entamoeba histolytica sau diferite specii de Plasmodium, care pot da informaii despre locul de origine al unui cadavru. Amoebele formeaz la cadavre adevarate nveliuri, care pot da indicaii pentru o anumit locaie geografic. De o mare importan criminalistic sunt i diatomeele i fungii. Algele. Grupul algelor este foarte variat, att ca rspindire (ape, locuri umede), ct i ca structur (uni sau pluricelulare). Dintre ele cele mai importante pentru criminaliti este grupul Diatomeelor. Acestea sunt alge unicelulare, aparinnd philumului Stramenopila (sau Bacillariophyta), la care peretele celular are un desen caracteristic. Sunt rspndite n apele dulci sau srate, n regiunile umede sau pe suprafaa altor soluri. n structura corpului, elementul cel mai rspndit este siliciul, ceea ce duce la consrvarea corpului dup moarte (diatomite). Corpul este acoperit cu dou valve, una mai mare ca cealalt. Preferinele distincte ale speciilor pentru anumite habitate, sau dezvoltarea lor n anumite perioade ale a nului, pot reprezenta indicii pentru localizarea cadavrului. Diatomeele n cazul unui nnecat.Diagnosticul de moarte prin innec este foarte dificil. Prezena diatomeelor n plmni, poate reprezenta un indiciu c persoana a fost nnecat. Uneori, diatomee le pot fi recuperate din stomac, indicnd c persoana a inghiit ap, din plmni, indicind c persoana a aspirat ap (datorit dimensiunilor mici ele pot sparge peretele subire al sacilor alveolari i se pot rspndi n snge), i din snge sau mduva oa selor (cel mai bun indicator al morii prin nnec), indicnd c apa a fost aspirat n timp ce victima nc mai tria. Comparnd speciile gsite n cadavru, cu cele din locul n care acesta a fost nnecat, se poate concluziona unde a fost nnecat cadavrul, sau dac acesta a fost mutat. Unii autori neag importana diatomeelor n diagnosticarea morii prin nnec. Unele diatomee pot proveni din produsele folosite de om (mnui de cauciuc), sau se pot prinde n mod accidental de piele, n timpul innotului. Pentru aprecierea aciunii diatomeelor asupra cadavrului se ncearc identificarea speciilor i abundena lor, se determin cantitatea de clorofil. Creterea algelor (msura n care acestea s-au dezvoltat pe cadavru) indic durata ct cadavrul a fost imersat. Aceasta depinde de adncime, substrat, anotimp i ali factori locali. Astfel primvara, ntr-o ap bogat n nutrieni de pe un substrat humos, numrul coloniilor va fi mai mare dect iarna i ntr-o ap de munte. Cianobacteriile reprezint un alt grup de plante inferioare care se dezvolt pe cadavre, i apar dup cteva sptmni pe materialul osos. Acest grup a fost puin studiat. Pentru colectarea materialului din locul n care a fost descoperit cadavrul, se recomand urmrirea i colectarea pe toat durata unui an a probelor, tiind c algele au perioade de nflorire puternic. De asemenea se recomand, colectarea de la suprafaa dar i din masa apei. n cazul unei ape curgatoare, colectarea de mostre se face att n aval ct i n amonte, deoarece curenii au putut transporta cadavrul. Colectarea se face cu ajutorul fileelor pentru colectarea planctonului, cu ochiuri fine (0,10,3mm). Dimensiunile foarte mici fac ca adesea sa fie necesar concentrarea probei prin centrifugare.Din cauza dimensiunilor foarte mici ale diatomeelor, la colectare se procedeaz cu mare acuratee, iar la prelucrarea probelor se folosete proba martor cu ap distilat. Dac proba conine i alte materiale organice, iar observatorul dorete numai diatomee, restul materialului e ste digerat cu acizi. Pentru observare se folosesc microscoape simple sau cu contrast de faz. Dac diatomeele se gsesc n esuturi, sol sau alt substrat se extrag cu ajutorul acidului nitric concentrat (se poate folosi i digestia ultrasonic), timp de 48 ore. Materialul digerat se centrifugeaz, supernatantul se arunc, ceea ce a decantat se spal n ap distilat, se centrifugheaz din nou i ce rmne se observ la microscop. Identificarea speciilor se face fie direct la microscop, sau folosind programe de calculator care au la baz morfologia cochiliei, analiza unuor gene sau spectroscopia Fourier (fig.29).

91

92

Fig.29 Fitoplancton i zooplancton (colecia Plavan Gabriel)

7.2. Plantele superioare Plantele sunt elemente importante n criminalistic, ele pot demonstra de exemplu direcia n care s-a deplasat o main dac aceasta s-a fcut pe o pajite, sau locurile prin care a trecut victima, dup plantele prinse n nbrcminte i nclminte. Rdcinile reprezint indicatori ai timpului la care s-a fcut ngroparea unui cadavru. La ngropare o parte a acestora poate fi tiat, ceea ce produce o cicatrice, care se poate citi n cercurile de cretere ale organului. Sau o dat cu cadavrul se pot ngropa semine care vor germina, vor continua un ciclu de dezvoltare, iar dup vrsta plantei se poate aprecia vrsta cadavrului. Cadavrele ngropate toamna, sau cele descompuse, vor avea n primvara urmtoare, i mai trziu, deasupra lor, o vegetaie abundent. La cadavrele ngropate recent, n anotimpurile din afara diapauzei, gradul de etiolare al esuturilor plantelor, poate fi dovada timpului scurs de la ngroparea cadavrului, deoarece prile platelor prinse la ntuneric pierd clorofila. Sporii sunt produi pentru nmulirea plantelor inferioare (muchi i ferigi). Sporii de la Lycopodium clavatum sunt folosii ca lubrefiant pentru prezervative, atunci cnd sunt ambalate. Ei rezist pn la patru zile n cile genitale femele i sunt folosii pentru a se constata dac victima a avut contact sexual naintea morii. Plantele superioare care produc semine, prezint gruncioare de polen, care sunt celulele sexuale brbteti. Grunciorul de polen este foarte rezistent la condiiile de mediu. nveliul su se numete exin i are un desen caracteristic, dup care se poate determina specia plantei creia aparine. Deoarece polenul este produs ntr-o anumit perioad a anului, el se poate asocia cu prezena persoanei ntr -un anumit loc i timp. De exemplu, izolarea polenului de pe mbrcmintea unui c adavru, poate furniza date despre locul de origine al acestuia. n general se folosete cnd acesta aparine unor plante sau asociaii de plante rare (fig.30).

Fig.30 Spori, a. Tilia cordata, b. Robinia pseudacacia, c. Picea abies (www. poleninfo.org)

93

Fructele, seminele sau frunzele multor specii de plante pot constitui parte a dietei. Deoarece organismul omului nu poate digera celuloza, aceasta trece aproape intact prin tubul digestiv. n consecin, analiza coninutului stomacal sau al materiilor din intestinul unui cadavru, poate aduce informaii preioase asupra a ceea ce a consumat ca alimente nainte de a muri i mai ales n ce loc. Segmentul din tubul digestiv, n care se gsesc resturile alimentare, ofer indicaii asupra timpului la care acestea au fost ingerate. n acest caz, se va ine cont dac fiziologia tubului digestiv a funcionat n condiii normale i nu au existat stri de vom sau alte maifestri naintea decesului. Multe plante produc flori ntr -o anumit perioad a anului i petalele lor se degradeaz ntr-un timp scurt, ceea ce face contaminarea mai dificil, dar se poate ntlni pe regiuni din mbrcminte mai ales nclminte. Deoarece fructele plantelor superioare sunt mari exist mai puine cazuri cnd acestea nsoesc cada vre.

Capitolul 8. Insecte necrofage Obiective - caracteristicile generale ale insectelor, - introducere n biologia insectelor necrofage, - caracteristicile stadiilor metamorfozei la insectele necrofage, - succesiunea speciilor de insecte n colonizarea unui cadavru, - tehnici de colectare i cretere n laborator a insectelor necrofage, - calcularea PMI folosind insectele necrofage, - principalele specii de insecte necrofage din Romania.

8. 1. Caracterele morfologice generale ale insectelor La corpul insectelor se disting trei regiuni: cap torace i abdomen. Exist ns insecte la care nu se face aceast distincie (ex. cocinae, strepsiptere, colembole simfipleone) (Crisan A. 1999). La adult, capul este ca o capsul cefalic unic cu dou deschideri, orificiile bucal i occipital. Pe suprafaa sa se gsesc doi ochi compui, 1-3 oceli i apendice reprezentate de o pereche de antene i piesele armturii bucale. Suprafaa capsulei cefalice are i linii de sutur, care despart diferitele sclerite ale capului. Cretetul (vertex) are pe linia median sutura epicraneal sau metopic, care se desparte n dou ramuri, delimitnd ntre ele fruntea (frons), desprit prin sutura frontoclipeal, de un sclerit asezat transversal (clipeus), care este separat de buza superioar (labrum) prin sutura clipeolabral. Sub ochi, lateral se gsesc segmentele care formeaz obrajii (gena), mai mult sau mai puin delimitate posterior de tmple (tempora), continuate posterior cu ceafa (occiputul) care poart foramenul occipital. Poziia capului n raport cu linia corpului este variat: ortognat capul face un unghi drept cu corpul, prognat cnd capul este n acelai ax cu corpul i hipognat cnd capul este n unghi ascuit cu axul corpului. Cnd sunt prezente, antenele sunt n numr de dou i au rol senzitiv. Ele se prind pe capsula cefalic, n fosetele antenare, la baza mandibulelor, ntre ochi sau anterior lor. Sunt formate din mai multe articule, primul (scapus sau articul bazal), al doi-lea (pedicel), i urmtoarele care formeaz flagelul. Antenele pot fi diferite: lamelate ultimele articule au o prelungire lateral n form de lamele, filiforme formate din articule alungite, de aproximativ aceeai dimensiune, moniliforme formate din articule scurte cam de aceeai dimensiune, clavate articulele se ngroa spre vrf, serate fiecare articul are o prelungire lateral, plumoase cnd fiecare articul are cte o prelungire lateral ceea ce d aspectul de puf, geniculate cu scapusul mai alungit i formeaz un unghi drept cu restul antenei etc.. n jurul orificiului bucal se gsesc piesele bucale, care reprezint apendici fuzionai la acron cu rol n prelucrarea hranei. Ele formeaz aparatul bucal diferit la grupele de insecte: pentru rupt i mestecat (Blatta, aproape toate larvele), rupt, subt i lins (himenoptere apoidee), nepat i subt de tip heteroptera (heteroptere, unele homoptere), nepat i supt de tip diptera (nematocere, diptere brahicere), pentru supt de tip maxilar (lepidoptere), pentru subt de tip labial (diptere brahicere). Toracele este format din trei segmente: protorace, mezotorace i metatorace, mai mult sau mai puin fuzionate. La fiecare segment se descrie o regiune dorsal (tergum sau notum), o regiune ventral (sternum) i regiunile laterale (pleure). Pe fiecare segment al toracelui, ntre sternum i pleure se gsesc cavitile coxale, locul de prindere al picioarelor, iar la mezo i metatorace cavitile alare pentru prinderea aripilor. Picioarele sunt trei perechi, formate din articule. Un picior este format din coxa prin care piciorul se prinde de corp, pe care se prinde al doilea articul mai scurt numit trochanter, apoi dou articule alungite (femurul i tibia). n partea distal a tibiei se prinde tarsul format din 1-5 articule subiri i scurte.

94

La insecte, picioarele au diferite adaptri pentru deplasare: agat (la insecte parazite, tarsul se termin cu o singur ghear), srit (coleoptere, ortoptere, sifonaptere etc., la care femurul este alungit i ngroat, tibia subire i lung), prins (insecte rpitoare etc., cocsa mult alungit, femurul alungit, ngroat cu un an n care se nchide tibia ca lama unui briceag n teac), etc.. Aripile sunt prezente la majoritatea insectelor (excepie apterigotele), dou perechi (a doua redus la balansiere, ex. diptere). Sunt apendice modificate, folosind pentru locomoia prin zbor, ca expansiuni ale tegumentului fixate pe mezo i metatorace. Aripa tipic are forma triunghiular, format din urmtoarele regiuni: basis zona de prindere la torace, apex vrful aripii, coasta regiunea anterioar a aripii, termen regiunea lateral a aripii i dorsum regiunea posterioar. La nivelul aripilor se observ nervuri, care conin traheei, nervi i hemolimfa. Nervurile delimiteaz ntre ele celule deschise sau nchise. n funcie de zona aripii celulele se numesc: longitudinale (costal, subcostal, radial, medial, cubital, anal i uneori jugal) i transversale se noteaz n ordine crescnd de la baza aripii spre regiunea terminal i poart denimire dubl n funcie de nervurile l ongitudinale pe care le unesc. Dup consistena lor, aripile sunt: membranoase (himenoptere, diptere, trichoptere etc.), pergamentoase (ortoptere), sclerificate-elitre ( coleoptere), pieloase (dermaptere), hemielitre (heteroptere). Abdomenul este regiunea cea mai voluminoas a insectei, format din 6-12 segmente fiecare alctuit din sternum, tergum i pleure. Forma abdomenului este diferit dup specie: cilindric, conic, semisferic, tronconic etc. Dup modul de prindere al abdomenului la torace acesta este sesil (prins cu baza larg la torace ex. ortoptere), suspendat (primul segment ngust posterior, al doilea ngust anterior, ex. albina) i pedunculat (are unul sau dou segmente care urmeaz propodeumului mult mai nguste dect restul segmentelor abdominale, formind un peiol, ex. ihneomonide, braconide, formicide). Segmentele genitale au apendice (gonapofize), care folosesc pentru mperechere i depunerea pontei. La multe grupe de insecte, la ultimul segment se gsesc cerci cu rol senzitiv. 8.2. Ciclul de dezvoltare la insecte Dezvoltarea insectelor este reprezentat de succesiunea stadiilor care se produc n cadrul unei generaii de la formarea oului i pn la moartea adulilor. Procesul cuprinde mai multe faze: dezvoltarea embrionar (are loc n ou), dezvoltarea postembrionar (de la ecloziune pn la adult) i dezvoltarea postmetabol (activiti ca adult) (Crisan A. 1999). Dezvoltarea postembrionar (metamorfoza). Din punct de vedere al Entomologiei criminalistice, insectele sunt importante din dou puncte de vedere: - al succesiunii stadiilor din dezvoltarea metamorfic, - al sccesiunii grupelor taxonomice de insecte pe cadavru. n ceea ce privete gradul asemnrii larvei cu adultul i de numrul stadiilor prin care trece insecta, exist dou grupe de insecte: cu dezvoltare heterometabol (metamorfoza incomplet) i dezvoltare holometabol (metamorfoza complet). Mutele i gndacii, au un ciclu de dezvoltare numit metamorfoz complet. La mute, ciclul ncepe cu oule depuse de femel i se continu cu stadii diferite sub aspect morphologic i structural. Oul. Dipterele tind s depun ouale n grmezi, n zone ale cadavrului oarecum protejate, umede i cu hran n apropiere. n general sunt depuse circa 150-200 ou ntr-o pont. Oule mutelor au coaja foarte subire, de culoare alb, cu lungimea variind ntre 0,9 -1,5 mm i limea 0,3-0,4 mm. nveliul extern al oului se numete corion. Are un aspect variat ca desen, reticulat sau cu pete, i poate fi un criteriu n identificarea speciei de la care provine. Captul oului are un orificiu numit micropil, locul de ptrundere al spermatozoidului n ou. Un an numit plastron, se ntinde pe toat lungimea oului. Este locul care pstreaz aer, cnd oul este acoperit de o picatur de ap sau este imersat. Ieirea larvei din ou, se numeste eclozare. Larva. La insecte larvele holometabole n funcie de prezena i gradul de dezvoltare a apendicilor toracice i abdominale, i a capsulei cefalice, se pot grupa n mai multe categorii 1. larve protopode exist la himenopterele parazite, apendicii toracici i cefalici sunt rudimentari, capsula cefalic bine dezvoltat cu mandibule, abdomenul rudimentar, 2. larve polipode exist la lepidoptere, himenoptere calastogastre, se caracterizeaz prin prezena de picioare abdominale false, pe lng cele trei perechi de picioare toracice. Se deosebesc trei subcategorii: omizi adevrate (lepidoptere), false (himenoptere tentredinidae) i cotari (lepidoptere geometride). 3. larve oligopode sunt lipsite de picioare abdominale, avnd numai c ele trei perechi de picioare toracale. Exist trei subclase: oligopode campodeiforme cu picioare lungi, de obicei prdtoare; oligopode

95

scarabeiforme au corpul gros, recurbat, picioare subiri i scurte; oligopode elaterioforme (viermi srm) corpul alungit, cilindric, picioare relativ subiri i scurte. 4. larve apode nu au picioare, i cuprind trei subtipuri: apode acefale nu au capsula cefalic (ex. mute), apode hemicefale capsula cefalic prezent dar retras n protorace (ex. diptere tipulide), apode euc efale capsula cefalic prezent i vizibil (ex. curculionide, cerambicide etc.). Larva are corpul format din 12 segmente, cu captul anterior ascuit, care devine zona cefalic, de culoare negricioas, conine mandibulele (scheletul cefalo-faringean). Regiunea posterioar este terminat drept i are dou zone circulare negre pe ultimul segment, numite spiracole posterioare. Larva are n dezvoltarea sa mai multe vrste larvare (stadii), delimitate prin nprliri. Mutele au trei stadii larvare (L1,L2,L3), fiecare stadiu poate fi recunoscut prin numrul de fante existente n fiecare spiracul posterior. La stadiul larvar I este prezent o fant, n stdiul II sunt prezente dou, iar n stadiul III sunt prezente trei fante. La mute cele trei stadii larvare sunt diferite i prin dimensiuni. Primul stadiu este mai mic de 2 mm, al doilea este cuprins ntre 2-9 mm iar al treilea ntre 9-22 mm. Oricum nu ne putem baza numai pe dimensiuni n stabilirea vrstei larvei, deoarece aceasta este dependent i de cantitatea i calitatea hranei. Marginea segmentului posterior al larvei este nconjurat de proieminene numite tuberculi. Spiracolele sunt localizate pe faa orizontal a segmentului posterior. Distana dintre tuberculi are rol n identificarea speciei. Pe segmental al treilea anterior (al doilea toracic), se gsete un spiracol anterior, asemntor cu o mn cu degetele deschise. Morfologia sa, poate fi folosit pentru determinarea speciei. Stadiul III cuprinde larvele cele mai voluminoase, la jumtatea stadi ului, larvele nu se mai hranesc, devin migratorii (pot migra 5-6 m), cutnd un loc pentru mpupare. n acest stadiu volumul corpului se reduce. De obicei pentru mpupare larvele se ngroap n sol, sau se ascund n locuri ntunecoase. Pupa. Pupa rezult dup ultima nprlire a larvei. n interiorul pupei au loc procese de histoliz i histogenez, din care va rezulta un adult. Dup aspectul extern, pupele sunt de trei tipuri: liber la care apendicele abdominale i toracice sunt desprinse de corp i se pot mica; obtec apendicele sunt vizibile exterior ns sunt lipite de corp prin lichidul eliberat la ultima nprlire; coarct se nchide ca un butoia n ultima exuvie larvar. Pupa are la nceput culoarea deschis, apoi se nchide la culoare, devenind cenuiu-maronie, sau neagr. Forma ei se aseaman cu a unui trabuc. Este posibil de identificat specia deoarece, stadiul pstreaz caracteristicile stadiului larval III. Au fost fcute ncercri de a data PMI folosind culoarea pupei, dar rezultatele sunt de acuratee numai n primele 24 ore de la mpupare. Eclozarea adultului (emergena) se face la sfritul metamorfozei prin mpingerea operculului pupei, pentru care larva folosete o regiune umflat cu snge de pe cap, ca o perna cu aer, numit ptilium. Acea sta se va reintegra mai trziu n structura facial, genernd sutura ptilinal. Scheletul cefalofaringean rmne n interiorul pupei i poate fi folosit la identificarea speciei. Deplasarea adulilor dup eclozare prin sol se face spre lumin crescut. O dat ce ajunge la suprafa musca elimin coninutul intestinului sub forma unui lichid verde (meconium). Musca i usuc aripile i se pigmenteaz. Viteza metamorfozei este influienat de temperatur, ceea ce are influien i asupra calculrii PMI. De ac eea se ine cont de media, maxima i minima duratei fiecrui stadiu de dezvoltare. La gndaci (coleoptere), metamorfoza este complet (holometabole), trecnd n ciclul de dezvoltare prin stadiile de ou, trei stadii larvare i pup. Oul la Coleoptere este de obicei oval, sferic sau sferoidal, i nu are caracteristici legate de familie. La formarea pupei, gndacii de obicei se ngroap. 8. 3. Caracterele generale morfologice ale dipterelor Pentru identificarea corect a grupelor de insecte pn la nivel de specie, se folosesc cheile de determinare. Mutele (Dipterele), sunt insecte la care aripile sunt foarte bine dezvoltate, n special prima pereche, a doua este redus la balansiere. Redm mai jos clasificarea modern a Dipterelor. Phylum Arthropoda Class Insecta Suborder Nematocera Suborder Brachycera Infraorder Muscamorpha Aschiza Infraorder Muscomorpha Schizophora Calyptratae Family e.g. Calliphordiae Genus e.g. Lucilia

96

Species e.g. Lucilia sericata Order Diptera

97

Subordinul Nematocere cuprinde insecte cu corpul alungit, antene lungi filiforme sau pulmoase, cu mai mult de ase segmente, i o nervaiune complex a aripii. Aripile i picioarele lungi. Palpii maxilari alungii, formai din 4 -6 articule, ochii bine dezvoltai. Larvele au o structur special a capului, cu aparatul bucal orizontal. Sunt apode eucefale, sau hemicefale i au mandibule bine dezvoltate. Pupele sunt libere, nu sunt encastrate (compacte) i mobile, balansierele sunt vizibile. Criteriul de clasificare l reprezint nervaiunea aripilor. Dintre ele Trichoceridaele conin specii care sunt importante n entomologia criminalistic. Ele sunt folosite pentru determinarea PMI iarna cnd majoritatea insectelor sunt inactive. Subordinul Brachycerae sunt mute mai robuste, au antenele mai scurte ca a Nematocerelor (opt sau mai puine segmente, ultimul cu o arist articulat lateral, fie un stil). Palpii maxilari sunt orientai n sus i formai numai din trei articule. Ochii sunt bine dezvoltai, uneori cotangeni pe vertex. Aripile sunt mai late, la unele lipsesc, nervaiunea aripilor este mai puin complex. Larvele sunt apode, hemicefale sau acefale, fitofage, saprofage, prdtoare sau parazite. Larvele au capul alungit i alipit la primul segment toracic (protorax). Mandibulele sunt divizate. Pupele se dezvolt n pupariu, care este ultima exuvie larvar. Armtura genital mascul este separat n dou pri. Adulii sunt bune zburtoare i sunt ntlnite n cele mai diverse biotopuri. Din acest subordin fac parte infraordinele Tabanomorpha, Asilomorpha i Muscomorpha (majoritatea speciilor din fostul Cyclorhapha). Insectele din grupa Muscophora, sunt foarte importante pentru entomologia criminalistic Au antene cu un pr, cu

trei stadii lervare n metamorfoz, fr distincie clar ntre capul i corpul larvei. Acest subgrup se divide n 1. Muscophora aschiza la care depresiunea i sutura peste anten fie este absent fie prezent. Unele segmente ale nervaiunii formeaz celula anal, foarte lung i nchis sau aproape inchis la aproape jumtatea sau trei sferturi din regiunea dinspre margine a aripii. Cele mai importante specii din acest grup sunt Phoridaele. 2. Muscomorpha schizophora are celula anal a aripii, ca toate insecte importante n entomologia criminalistic, scurt sau absent. Acest grup este subdivizat n dou, dup cum la baza aripilor se gsete un calipter. 3. Muscomphora schizomorpha acalyptratae sunt cele care emerg din pupariu folosind o pung cu aer sau ptilinum. Prezena sa este marcat de existena unui an situat sub ochi, numit sutura ptilinumului. Nu prezint separarea protoracelui de torace. De importan n entomologia criminalistic sunt Piophilidaele, Sphaeroceridaele i Sepsidaele. 4. Muscophora schizophora calyptratae are indivizi la care halterele sunt mascate de caliptere, prezint ptilinum iar pe antene o arist. Deosebit de importante n entomologia criminalistic sunt Calliporidaele, Sarcophagidaele, Fannidaele i Muscidaele. Caracteristicile morfologice legate de sex se refer la forma mai multor organe. Astfel ochii compui ai musculielor, au ntre ei un spaiu mai mare ca cei ai masculilor. O alt trstura este dilataia occipital a ochilor. Pentru aceasta

99

trebuie privit insecta din lateral. Tot din lateral se poate observa i gua. 8.4. Biologia Calliphoridaelor Mutele verzi sunt primele insecte care colonizeaz un cadavru. Primul indiciu al prezenei lor, sunt oule depuse pe suprafaa cadavrului sau n orificii (bucal, anal sau rni). Datorit ritualului de mperechere, depunerea oulor se face n timpul zilei, dei unele specii pot depune ou i noaptea. La temperaturi de 16-27 C, luminozitate slab (0,6-0,7 lux) i umiditate relativ, circa 65-70% din Calliforidae (Callifora vicina, Chrysomya megacephala, Crysoma rufifacies), depun ou seara din martie pn n septembrie. Numrul de ou depuse noaptea este mai mic ca cel depuse ziua (Leherer A. 1972). La depunerea pontei se iau n considerare i condiiile atmosferice. De obicei, mutele nu zboar cnd plou. Viteza vntului mai mare ca 0,7m/s inhib zborul la Calliphora vicina, iar temperaturile peste 30C i sub 12C sunt considerai factori limitativi ai activitilor insectei. Larvele insectelor contribuie la grbirea descompunerii cadavrului prin enzimele proteolitice pe care le produc n actul hrnirii. Deobicei locul n care acestea s -au hrnit pe cadavru las o zon glbui-roiatic (Presnell E. Si col. 2009). De aceea carateristicile atmosferice trebuiesc luate n considerare cnd apreciem PMI folosind indicii entomologice. Modelul dup care are loc comportamentul zilnic al mutelor este influienat i de zona geografic i anotimp. Astfel Calliphoridaele, n regiunea Finlandei, au maximul de activitate n jurul amezei. n Asia central, n anotimpul

100

rece, n timpul prnzului, iar n anotimpul cald, n timpul dimineii i a serii. La tropice activitatea mare este la nceputul i sfritul anotimpului ploios, cnd umiditatea i temperatura au valori ridicate, dar aversele sunt rare. De obicei mutele ierneaz n sol sub forma de stadiu larvar III. La aceeasi specie, Calliphora vicina, n regiunile nordice se poate ntlni diapauza, deoarece temperatura poate scdea sub 0C. Aceast specie poate tolera temperaturile sczute, oul este rezistent la frig. Strategiile de supravieuire trebuiesc cunoscute cnd se analizeaz speciile gsite pe cadavre, corelate cu anotimpul. Schimbrile climatice pot juca un rol important n distribuia i stadialitatea dezvoltrii diferitelor specii de Calliphoridae. Un exemplu este Phormina regina, specie caracteristic pentru SUA. n statele din nord, este specia dominant pe cadavre n lunile de var, iar pentru statele din sud, pentru lunile de iarna. Specia a fost sporadic semnalat n Finlanda i Marea Britanie, ceea ce demonstreaz c -i extinde teritoriul. O alt specie care este tot mai des semnalat n Europa este Protophormia terraenovae, specie Arctic, fiind prezent n special n aezrile urbane n lungul coastei Olandei i Marii Britanii. Depune oule foarte devreme i prezena unei larve pe cadavru indic c acesta a aprut foarte devreme, primvara. Chrysomya sp., este o specie tropical i subtropical, descris n Africa, Asia i Europa de sud. Recent a fost descoperit i n SUA. n aceste teritorii, a intrat n competiie cu Chrysomya albiceps i tinde s nlture din ecosistem specia Cochliomyia macellaria, nativ pe continentul American.

101

Chrysomya albiceps, este musca care colonizeaz inial un cadavru n regiunile Afro tropicale orientale, America central i de sud, Europa de sud. n Africa de Sud, este recunoscut ca fiind cea mai numeroas specie pe cadavre, n lunile de primavar i var. Unii cercettori consider c aceast specie este similar speciilor Calliphora i Lucilia din zonele temperate (Smith 1986). Caracteristici ecologice ale mutelor albastre (Calliphoridae). Comportamentul sexual al mutelor este legat de o anumit poziionare a corpului i prezentare a aripilor. Dup mperechere, depunerea oulor are loc innd cont de unii factori, din care lumina este principal. Depunerea oulor avnd loc n special ziua. Pentru locaiile situate aproape de surse de iluminat stradal, sunt semnalate cazuri de depunere a oulor n timpul nopii, ns numrul oulor depuse noaptea, este mai mic. Dm mai jos cteva din substanele care atrag insectele pe cadavre i speciile atrase. Calliphora sp. i Lucilia sp. sunt atrase de snge, materii fecale sau mirosul cadavrelor dup primele ore. Aceleai specii la care se adaug Muscidae, Fanniidae, Piophilidae i Sphaeroceridae sunt atrase de gazele eliminate de cadavru n stadiul al doi-lea i nceputul stadiului trei. Speciile Fannia sp. i Stratomydaeneoleria sp., sunt atrase de mirosul grsimilor putride. Mirosul fermentaiei butirice, atrage Piophiria casei, Sepsidae, Drosophilidae, Ephydriidae i Milichiidae. Stadiile de fermentaie ale amoniacului atrage Coleoptere, Sphaeroceridae i Phoridae. Un alt factor important cu influien asupra depunerii pontei, sunt condiiile meteorologice. Calliphoridaele nu zboar cnd este vnt. Viteza optim a vntului pentru zbor

102

la Calliphoridae este de 0,7m/sec., temperaturile peste 30C i sub 12C, inhib zborul mutelor din familia menionat. Cei doi factori, trebuiesc luai n considerare cnd se analizeaz proveniena unui cadavru. Comportamentul zilnic al calliphoridaelor este influienat de sezon i locaia geografic. n general, mutele albastre ierneaz n sol, sub forma de larv n stadiu III. Lucilia sp. are diapauza n acelai stadiu, indus prin caracteristicile oului. La Calliphora vicina, dac populaia este n regiuni nordice, are diapauz, temperaturile regiunii scznd foarte mult sub 0C. C. vicina este mai rezistent la frig. Cele dou specii au fost semnalate ca depunnd ponta n timpul iernii n marea Britanie, pe carcase de porc situate att n interior ct i n exterior. Oule depuse n interior au eclozat, cele depuse n exterior au trecut iarna fr eclozare. Calliphora vicina i C. Vomitoria, tolereaz un anumit grad de supranclzire. La specia Phormia regina, temperatura ridicat a grbit rata dezvoltrii, comparativ cu metamorfoza de la temperatura optim constant. Eclozarea n funcie de temperatur, la aceast specie, arat c la 25C se face dup 19 ore, iar la 30C dup 15,5 ore. Temperaturile de 35/45C produc perturbri n succesiunea stadiilor, adulii nu pot ecloza. De asemenea temperaturile constante de 40C i 10C, opresc metamorfoza. Protophormia terraenovae este o alt specie holartic de musc albastr, ntlnit pe cadavre n Olanda. Este o specie urban, fiind considerat din punct de vedere al abundenei, a doua dup C.vicina. O specie ntlnit n al doi-lea val de colonizare pe cadavre este Cynomya mortuorum, musca albastr/verzuie. n Finlanda, n condiii de cmp, ntreg ciclul dezvoltrii are

103

26,2 zile la o medie a temperaturilor de 15C. Specia a fost descris i n Norvegia, nordul Scoiei i Anglia. Caracteristicile morfologice ale genului Calliphora. Sunt mute de culoare sumbr, albastru-negru pe torace, cu reflexe violacee sau de oel, pe abdomen. Corpul este acoperit cu o pruinozitate cenuie-albastruie, ceea ce permite o dungaie longitudinal, mai mult sau mai puin vizibil pe torace. Capul este de obicei negru, acoperit cu un totem argintiu. Banda frontal este uneori evident, alteori liniar, la femela este foarte lat. Ceafa are o pruinozitate de culoare deschis, care se poate ntinde cel puin pn la marginea inferioar a capului. Antenele sunt colorate n rou-portocaliu la baz i pe marginea infero-proximal a celui de la trei-lea articol. Palpii sunt glbeni-portocaliu. Segmentele postabdominale la masculi, sunt negre, mai mult sau mai puin lucioase. Aripile sunt hialine, uor afumate la baz i pe partea anterioar. Solzii toracali sunt ntotdeauna ntunecai, doar marginea lor este alb. Balansierele sunt galben-cafenii sau galbene, picioarele sunt negre. Genul este prezent n toate regiunile geografice. La noi n ar sunt patru specii: Calliphora vicina, Calliphora vomitoria, Calliphora uralensis i Calliphora loewi (Leherer Andy, 1972). Calliphora vicina (Robineau-Desvoidy, 1830) sau (Calliphora erytrocephala) (Meigen). La mascul corpul este albastru-negru, mai lucios pe abdomen i mai mat pe torace, unde pruinozitatea cenuie atenuiaz luciul. Capul este bicolor, negru-cafeniu, n partea superioar i galben-portocaliu n partea inferioar. Banda frontal este neagr pe aproape toat ntinderea sa, devenind cafenie n regiunea lunulei.Articolele bazale ale

104

antenelor sunt negre-cafenii, al trei-lea articol este negru mat (fig.31).

Fig.31 Calliphora vicina, a. mascul, b. femela (www. nhm.ac.uk) Toracele este albastru-negru, i acoperit de o pruinozitate cenuie, care i d aspect mat, lsnd vizibil dungaia longitudinal. Abdomenul este albastru-nchis, cu reflexe violacee, mai ales pe primul segment preabdominal vizibil. Segmentele genitale i anale sunt negre. Aripile sunt puin fumurii, epoletul cafeniu deschis, nervurile cafeniu-inchis. Balansierele sunt galben-cafenii, cu capitulul galben.

105

Picioarele au femurele negre cu nuan cafenie i tibiile cafeniu-negricioase. Femela este asemntoare cu masculul. Uneori regiunea inferioar a capului este mai mult sau mai puin intunecat. La exemplarele mai mici pruinozitatea abdomenului este mai puin marcat, ceea ce duce la dispariia desenului. Sternitele preabdominale sunt bine dezvoltate, n special al doi-lea sternit, care este i cel mai mare. Oul are forma de banan, culoare alb i aproximativ 1,7mm lungime. Larva de stadiul I are trei benzi spinulate marginale anterioare complete pe segmentele II-VII i benzi spinulate marginale posterioare complete numai pe segmentele IXXI sau X-XI. Larva stadiul II are benzi mai late. Cele de pe partea anterioar a segmentelor II-IX sunt complete, dar uneori sunt foarte nguste sau lipsesc. Scheletul cefalo-faringeal are o mandibul puternic incovoiat n form de arc. Larva de stadiul III este alb-glbuie ajungnd pn la 19mm. Scheletul cefalo-faringean este foarte puternic pigmentat, cu excepia prii superioare a aripii dorsale. Segmentele IIIX sunt complet nconjurate de benzi spinulate la marginile anterioare, segmentele X-XI au benzi spinulate anterioare (fig.32).

106

Fig.32 Calliphora vicina, larva matura (www. nhm.ac.uk) Larvele pentru mpupare migreaz spre locuri ntun ecate. Pentru a demonstra sensibilitatea larvelor fa de lumin, Priscilla S. (1961) a facut un experiment n care un grup de larve adulte au fost supuse aciunii mai multor lungimi de und i au observat c larvele migreaz spre lungimea de und cea mai mic; la Calliphora vomitoria i Calliphora eritrocephala reacia a fost aceeai (lungimea de unda 402602mu); Pupariul are o form obinuit(fig.33).

107

Fig.33 Calliphora vicina, pupa (www. nhm.ac.uk) Adulii sunt atrai de mirosul puternic al materiilor organice n descompunere. Femela depune 550-750 ou n pachete de aproximativ 200 ou (muia). Eclozarea are loc repede, ntr-o zi sau chiar mai puin. n condiii obtime perioada larvar se scurteaz la 3-4 zile, iar cea de nimf la o sptmn. Durata ciclului de dezvoltare are carcteristici locale (Marea Britanie 29 zile, Texas 15zile). Este vectorul a numeroase mircoorganisme: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Aerobacter cloacae, Pneumococcus etc. Calliphora vomitoria (Linnaeus, 1758). Masculul are culoarea albastr-negricioas, puin lucioas din cauza pruinozitii cenuii care-l acoper. Capul este negru sau negru-cafeniu, pe alocuri portocaliu. Banda frontal median este neagr n partea posterioar i devine din ce n ce mai cafenie spre partea anterioar. Faa este neagr,

108

acoperit de totem argintiu. Lunula este cafenie negricioas. Primul articol al antenelor este negru, al doi lea cafeniu nchis, iar pe marginea distal i n special pe faa intern este portocaliu. Al treilea articol este portocaliu la baz i pe prile infero-interne. Toracele este albastr-negru mat. Pruinozitatea sa, las pe scutul dorsal, o foarte slab dungaie longitudinal. Abdomenul este albastru cu reflexe de oel, fiind acoperit de o pruinozitate uoar care, n funcie de lumin d impresia unor pete care se schimb. Aripile sunt uor ntunecate, mai ales n partea antero-bazal. Nervurile sunt negru-cafenii. Epoletul negru. Balansierele cafenii deschis, cu capitulul galben. Picioarele sunt negre, cu o uoar nuan albastruie n special pe femure. Ghearele negre -cafenii. Armtura ghenital are caracteristici foarte bune. Cerci i paralobulii sunt lungi i subiri, ultimii uor curbai, cu vrfurile rotunjite. Femela are fruntea tot att de lat sau mai lat dect o trime din limea capului. Celelalte caractere sunt asemntoare cu cele de la mascul, uneori culoarea portocalie de pe antene este mai redus. Larva stadiu I este asemntoare cu cea de la Calliphora vicina, dar nu are benzi spinulate marginale posterioare pe segmentele VI i VII. Larva stadiul II se aseamn cu larva de la Calliphora vicina dar banda marginal posterioar segmentului XI este foarte ngust. Larva stadiul III este de culoare alb-glbuie. Benzile spinulate marginale anterioare ncercuiesc segmentele IIIX. Scheletul cefalo-faringeal este foarte pigmentat, cu excepia prii superioare a aripii dorsale. Pupariul nu poate fi deosebit de cel al speciei Calliphora vicina.

109

Este o specie relativ comun n zonele muntoase, avnd larve necrofage, coprofage sau saprofage. Spre deosebire de Calliphora vicina, se pare c este asinantrop. Numai n Finlanda, n zona stejarului, are un caracter sinantropic ridicat, n timp ce n Europa se manifest fr o sinantropie real. Este agent patogen pentru Escherichia coli i Proteus vulgaris.

8.5. Caracteristici ecologice ale mutelor verzi (Lucillia ) Sunt dintre cele mai cunoscute mute verzi n Romania. Mutele verzi sunt printre primele care colonizeaz un cadavru. n Marea Britanie, Lucilia sericata poate produce trei/patru generaii pe an, i este ntlnit de obicei n biotopuri nsorite. n unele zone clduroase ale lumii, preferina speciei pentru zone calde, face imposibil colonizarea unor cadavre n anotimpurile foarte clduroase (ex. SUA, Africa). Prin contrast, Lucilia illustris este n Marea Britanie o specie de mlatini i pduri. n Finlanda sunt semnalate cinci specii de Lucilia sericata, caesar, illustris, richardsi i silvarum. Cea mai abundent este Lucilia illustris, urmat de Lucilia silvarum. n general, se remarc populaiile din cmp de Lucilia, care sunt puin numeroase. n Marea Britanie se estimeaz o populaie de Lucilia sericata de 2,5 indivizi/hectar. Exist variaii i n ceea ce privete distanele pe care se deplaseaz indivizii maturi. n Australia, Lucilia cuprina efectuiaz zboruri cuprinse ntre 0,7km i 3,5km, iar Lucilia sericata de circa 800m. distana pe care se deplaseaz femelele variaz n funcie de anumii factori. Astfel dac

110

femela este n perioada premergatoare depunerii oulor, sau dac este ntr/o perioad cu aport mic de proteine, poate rspunde la mirosurile de cadavru, executnd migraii pe distane mari. Lucilia caesar (L.) Corpul este de culoare metalic lucioas, verde, albastr i uneori armie. Banda frontal median de culoare cafenie-negricioas pn la neagr. Fruntea este ngust. Armatura genital foarte caracteristic, prin dezvoltarea mare a epandriului. Hipopigiul este proeminent, partea bazal a cercilor este mult lit i carinat median (fig.34). Femela nu se deosebete dect prin caracterele sexuale. Larva n stadiul III este ascuit anterior i de culoare crem.

111

Fig.34 Lucilia caesarea a. vedere lateral, b. vedere anterioar

112

Lucilia illustris (Meigen). Se poate foarte uor confunda cu specia Lucilia caesarea, deosebirea principal se face dup armtura genital mascul i structura ovipozitorului. Larva de stadiul III ajunge la maturitate pn la 13mm, de culoarea alb ca laptele. Larvele se dezvolt pe cadavre, excremente i gunoi menajer. n lume este foarte comun n zonele oreneti i rurale, pentru Europa prezentnd o sinantropie ridicat. Nu este cunoscut n regiunea mediteraneean. n Romania se gsesc n cantitate mic n judeele Brila, Tulcea, Sibiu, Cluj, Neam i Suceava. Protophormia terraenovae (Robineau-Desvoidy). Culoarea corpului este albastr-neagr lucioas, cu reflexe verzui pe abdomen. Banda frontal median este neagr-cafenie. Fruntea privit de sus i la locul mai ngust este egal cu o ptrime din limea unui ochi. Femela are aceleai caractere, n afara celor sexuale. Este o specie tipic citadin, cu indice de preferin citadin ridicat n zonele de stejar i conifere din nordul Europei. Este zoosaprofag i facultativ ectoparazit, cteodat semnalat miazigena. n ara noastr este puin frecvent, fiind semnalat mai ales n judeele din regiunea montan, Salaj, Bihor, Sibiu, Suceava, Harghita i Prahova. Cynomya mortuorum (L.). Caracterele genului sunt date de singura specie care este descris n ara noastr, Cynomya mortuorum. Corpul este de culoare neagr pe torace i metalic verzuie cu reflexe albstrui, uneori violacee, pe abdomen. Capul este galben portocaliu cu totem argintiu pe toat partea sa anterioar. Banda frontal median este galben-portocalie pe jumtatea posterioar, pn cnd ajunge s se contopeasc cu culoarea neagr a vertexului. Ceafa este neagr acoperit

113

cu o pruinozitate cenuie. Femela este asemntoare cu masculul. Poate fi ntilnit pe cadavre, este considerat saprofag . n ara noastr este rspndit peste tot, fiind mai abundent n zona fagului, ptrunznd i n subzona coniferelor. 8.6. Sarcophagidae Sarcophagidaele se numesc popular mutele de carne. Sunt de talie mare i de culoare cenuie. Abdomenul teselat este de culoare argintie, iar toracele are inferior trei dungi. Este un grup care astzi a fost mprit n alte subgrupuri, ceea ce a schimbat sistematica grupului. n general sunt specii greu de identificat i se recomanad prinderea indivizilor n acuplare, folosind masculul pentru identificarea femelei. Speciile de insecte din aceast familie apar pe cadavru dup circa o zi. Adulii care viziteaz cadavrul sunt vivipari, depunnd larve n interiorul cadavrului. Se crede c deplasarea lor spre cadavru nu este influienat de ploaie, de unde rezult c n condiii ploioase, aceste specii pot fi primele care populeaz cadavrul. Cea mai cunoscut specie care se dezvolt pe cadavre n SUA este Sarcophaga haemorroidalis. Fam. Phoridae. Speciile acestei familii apar n general n stadiile finale ale descompunerii cadavrului, cnd speciile de Diptere i Coleoptere sunt deaja n plin dezvoltare. Dac avem un cadavru ngropat, el mai des semnalat este Conicera tibialis, musca de sicriu, care poate avea numeroase generaii n pmnt, fr ca adulii s apar la suprafaa solului. Femela poate localiza cadavrele ngropate dup miros.

114

Alte specii din aceeai familie semnalate pe cadavre sunt Megaselia giraudii i Megaselia rufipes. Piophilidae. Una dintre cele mai cunoscute specii, legat de cadavre este Piophila casei. Se gsete i pe organismele vii unde produce miaze. Piophilidaele sunt mute mici, strlucitoare, cu aripile negre, lungi de 2,5-4,5mm. Nervaiunea costal a aripilor este rupt ntr-un anumit punct. Sepsidae. Sunt comune pe cadavrele ntr-un stadiu avansat de putrefacie i sunt asociate cu prezena materiilor fecale. Larvele se gsesc n materia organic n descompunere, n stadiul n care aceasta este lichefiat, fiind ncadrat de cercettori ntr-al patru-lea val de insecte care populeaz cadavrul. Trichoceridae. Dei nu au fost semnalate pe numeroase cadavre, ele se pot folosi n determinarea PMI. Se gsesc n toate perioadele anului, dar i n dup amiezile de iarn. Cel mai abundente sunt n zilele de primavar i var. 8.7. Principalele specii de gndaci de pe un cadavru Silphidae. Sunt gndaci cu corpul lit i marginile ascuite. Capul este relativ mic. Antenele pe msur ce ne apropiem de vrf, au articolele din ce n ce mai subiri. Distana dintre punctele de articulare a antenelor este mare. Sunt insecte mari, robuste. Ultimile segmente ale abdomenului depesc elitrele (ex. Nicrophorus vespilloides i Nicrophorus humator). Staphylinidae. Se recunoasc uor deoarece elitrele nu acoper dect jumtate din segmentele abdominale. Au mrimi diferite, de la mici la foarte mari. Sunt bune

115

zburtoare i au aripi pergamentoase puternice, acoperite de elitre scurte. Unele specii au obiceiul de a-i curba segmentele abdominale care depesc elitrele, lund un aspect amenintator de scorpion. Sunt insecte pradatoare i sunt atrase de cadavre unde se hrnesc cu Diptere. Histeridae. Sunt insecte de talie, relativ mic, negre, cu exoscheletul puternic i un desen caracteristic, de form mai mult sau mai puin oval. Antenele sunt geniculate, iar picioarele au tibia lit adaptat pentru spat. Ultimile dou segmente abdominale depesc elitrele. Sunt insecte prdtoare, att ca aduli ct i ca larve, pe cadavre. Dac sunt prinse, retrag capul i imping picioarele posterioare, lund poziia mortului. Trogidae. Sunt insecte de talie mic i culoare maronie, cu elitrele cteodat cu peri. Nu au picioarele adaptate pentru spat. Se gsesc pe cadavre mici, n locuri uscate, unde se hrnesc cu pr, piele, etc.. Dermestidae. Au dimensiuni de la mici la foarte mici i forma alungit. Au capacitatea de a-i ascunde toate apendicile sub corp, astfel nct cnd sunt prinse nimic nu rmne nafara proteciei chitinei corpului. Larvele care se gsesc pe cadavre sunt de culoare maronie sau neagr i sunt proase (ex. Dermestes maculatus i Dermestes lardarius). Cleridare. Au culoari strlucitoare pe cel puin o parte din corp. De form alungit sau cilindric, dau aparena c ar avea gt, deoarece prima parte a toracelui (pronotum) este mai ngust ca elitrele. Adulii pot fi proi. Necrobia rufipes se gsete pe cadavrele ntr-un stadiu avansat de descompunere. Este prdtor al larvelor. Nitidulinidae. Sunt specii care colonizeaz cadavrele n ultimile stadii ale descompunerii.

116

Carabidae. Au corpul caracteristic pentru un gndac. Elitrele sunt uor sculptate, realiznd nou rnduri longitudinale, la unele bine fixate iar aripile pot fi nefuncionale. Larvele sunt lungi sau alungite, au maxilele ca un clete i au ase oceli pe fiecare parte a capului. Prezint zece segmente abdominale, al noua-lea are o pereche de cerci. Larvele sunt prdtoare nocturne. 8.8. Succesiunea generaiilor de insect pe un cadavru Pe un cadavru se pot distinge urmtoarele grupe de insecte 1. Necrofagii care constituie i cea mai important grup n stabilirea PMI. Dintre ei, cei mai comuni Diptera Calliphoridae, Sarchophaga haemorrhoidalis, Coleoptera Stapylinidae, specii pe oase 2. Prdtori i parazii ai speciilor necrofage, a doua categorie ca importan n criminalistic, Coleoptera Silphidae (unele), Staphylinidae, Diptera unele specii devin prdtoare n stadiile de sfrit ale metamorfozei. 3. Omnivore, viespi, furnici i unele Coleoptere Staphylinidae care se hrnesc att cu cadavru ct i cu alte insecte de pe el, 4. Specii adventice, care folosesc cadavrul ca o extensie a mediul lor obinuit. Collembola, Isotoma sepulchralis, paianjeni (Gennard D., 2007). Succesiunea generaiilor de insect pe un cadavru, a fost intens studiat, stabilindu-se c unele specii sunt prezente n mod accidental, altele fiind legate de un anumit stadiu

117

de descompunere a acestuia, i deci pot fi folosite n determinarea PMI. Succesiunea speciilor i a stadiilor de insecte este n legtur cu locul siturii cadvrului (la suprafa sau ngropat), pe un anumit tip de sol, etc. Diversitatea n specii a faunei de pe un cadavru ngropat este mai mic dect pe un cadavru situat la suprafaa solului. Succesiunea speciilor pe un cadavru ngropat. La cadvrele ngropate s-a indentificat specia Conicera tibialis, sau musca de sicriu. Prezena lor la suprafaa solului reprezint indicatori c n sol se afl ngropat un cadvru vechi de cel puin un an. Insecta poate trece prin mai multe generaii n sol pn ce adulii s ias la suprafa, deci nu poate fi folosit ca indicator PMI. Exist numeroase specii de gndaci, care sap n sol pentru a ajunge la cadavru (fam. Staphilinidae i Rhizophagidae). Astfel este semnalat Rhizophagus paralellocollis, care triete pe cadavre ngropate, mai vechi de doi ani i se hrnete cu fungi care se dezvolt pe cadavru. Succesiunea speciilor la nivel de familie, pe cadavre ngropate este urmtoarea Uropodidae, Acaridae, Phoridae, Scatopsidae, Cecidomyiidae, Drosophilidae, Cynipidae, Diapriidae, Lilichiidae, Sphaeroceridae, Carabeidae, Collembola (Gennard D., 2007). Succesiunea speciilor de insect pe un cadavru la suprafaa solului. Insectele care ajung primele pe cadavrele de la suprafaa solului sunt de obicei Dipterele i n particular, Calliphoridae i Sarchophagidae. Diferena dintre cele dou mute este c Sarchophagidaele depun larve (ou gata eclozate), datorit capacitii de a ecloza oule n uter. Viespile si bondarii sunt urmatoarele si consuma din carnea cadavrului, piele uscata sau par. Nu se poate asocia o anumit specie de insect, cu un anumit tip de cadavru

118

(om, oarece, pisic, etc.). majoritatea studiilor de Entomologie criminalistic au fost fcute folosind ca animal model porcul i prin analogie, de multe ori s -au tras concluzii i la om. Succesiunea speciilor de insect pe un cadavru n Europa poate fi 1. pe cadavre proaspete (nu emit mirosuri) Calliphora vomitoria, C. Erythrocephala, Musca domestica, M. Corvina, etc 2. cadavre care emit mirosuri larve ale genurilor Cynomia, Sarcophaga, Lucilia, 3. cadavre la care are loc descompunerea grsimilor insecte i larve ale genurilor Dermestidae, Pyralidae, etc. 4. cadavre la care are lor fermentaia caseic a proteinelor, larve de Diptere (Piophila casei, Eristalis sp.), Coleoptere, etc. 5. cadavre la care are loc fermentaia amoniacal larve de Diptere (Muscidae), Coleoptere (Silphidae, Histeridae)etc. 6. cadavru n faz avansat de uscare, acarieni, 7. uscarea total a cadavrului Dermestes sp, Attagenus sp., Tineola sp., 8. cadavre dup mai mult de trei ani de la deces, specii ale genurilor Ptinidae i Tenebrionidae (Gennard D., 2007). Dupa studiile facute in Franta s/a constatat ca Sarcophagidaelefac parte alaturi de Calliphoridae si Lucilia sp. din primul val de insecte pe cadavrele de la suprafata solului. Musca domestica poate fi un oaspete ocazional al cadavrului, nu intodeauna oblogatoriu. Este intilnit imediat dupa moarte, nu pentru a se hrani cu cadavru ci cu

119

secretiile sale (urina, materii fecale, etc.) (Albert M.Cruz, 2006). 8.9.Colectarea insectelor de pe cadavru Materiale necesare. Trusa entomologului criminalist se poate organiza ntr-un container din plastic pentru transportul alimentelor (are capac etan i tori) sau ntr -o geant mai ncptoare. n ea se vor depune borcane din plastic cu dop etan, pungi de plastic, foarfeci, un vas cu acetat de etil cu capac etan, etichete, pensoane de mrimi diferite, o baghet de metal, marcheri de grosimi diferite, un borcan cu ap clocotit pentru omorrea larvelor, soluii pentru conservarea insectelor (alcool etilic 70/80%, soluie Kahle), hrana pentru colectarea vie a lavelor (ficat de porc), termos, manui chirurgicale, mti de protecie, halate unic folosin, a diametre diferite, termometru (digital sau dac nu unul cu alcool calibrat), aparat foto (Gennard D., 2007). Materialul colectat trebuie inut la temperatur sub cea la care a fost colectat, pn se ajunge n laborator (pung frigorific cu un termometru ataat). Soluia Kahle: alcool etilic 95% 30ml, aldehida formic 12ml, acid acetic glacial 4ml, ap 60ml. Dac recoltarea se execut de un nespecialist, pungile vor trebui sigilate, pentru a le pstra integritatea pn n laborator. Pentru fixarea larvelor la maximul dimensiunilor, se folosete apa clocotit (30 minute), care este adus ntr-un termos. La colectare se noteaz condiiile n care este cadavrul, descrierea general a locului, dac este sau nu nvelit, ntr o incint sau n aer liber, unghiul de nclinare a substratului

120

pe care se afl, natura oricrui tip de vegetaie din ju rul cadavrului, expunerea fa de soare, temperatura, umiditatea, direcia din care bate vntul, se recomand i luarea de fotografii. Inspectarea cadavrului se face dup ce s-a obinut aprobarea din partea rudelor i a poliiei n custodia cruia se afl. Examinarea ncepe de la cap, apoi trunchi i membrele superioare (umr, bra, antebra i mn), membrele inferioare (old, coaps, gamb i tlpi). Se noteaz fiecare ran superficial. Dup ce cadavrul a fost examinat pe o fa, se ntoarce i se examineaz i pe cealalt fa. Cu permisiunea poliistului care rspunde de zona n care este cadavrul, se cerceteaz mbrcmintea acestuia, buzunarele, mnicile i fiecare cut n care se pot ascunde larve sau aduli. Deoarece culoarea insectelor este apropiat de cea a mediului, acestea pot fi mai greu observate, iar oule pot fi dispuse i individual, de aceea la colectare se cere o atenie foarte mare. De obicei oule mutelor se depun lng orificiile de culoare nchis i umede ale corpului (nas, gur, urechi, anus, pleoape sau genitalii). Se mai pot gsi n cutele pielii din jurul articulaiilor sau din alte regiuni, dup pavilioanele urechilor, sau pe mbrcmintea care a absorbit secreii. Oule. Oule individuale se colecteaz separat. n recipientul de colectare se aeaz o bucat de hrtie de filtru sau prosop de hrtie imbibat cu ap pentru a pstra umiditatea. Nu se adaug hran. Fiecare recipient poart o etichet, scris cu un marker rezistent. Eticheta cuprinde, numrul cazului, numele celui care a fcut colectarea, numele ofierului n sarcina cruia

121

este examinarea crimei, numrul eantionului colectat, data colectrii, descrierea locaiei. Se fac dou astfel de etichete, una se plaseaz n interiorul vasului (rulat pe un creion), alta cu adeziv se aplic pe vas. n cazul n care eticheta exterioar se desprinde rmne cea interioar, ceea ce permite indentificarea probei. Aceleai date se trec i n jurnalul personal al celui care examineaz cadavrul. Larvele. Localizarea i colectarea lor se face n paralel cu colectarea oulor. De obicei sunt situate n aceleai locuri descrise pentru ou. Se colecteaz n jur de 20-30 pe fiecare recipient, pentru a se evita supranclzirea sau acumularea amoniacului n timpul transportului. Pentru fiecare regiune a corpului poate fi nevoie de mai mult de un borcan. Larvele n primul stadiu se manipuleaz cu grij, din cauza fragilitii lor. Larvele sunt omorte ntr-un vas separat, turnnd ap clocotit circa 3mm i imersnd larvele. Aici sunt inute 30 sec, apoi apa este vrsat ntr-un alt container, care cnd se umple este vrsat la toalet sau ntr-un alt loc, departe de cadavrul inspectat. n stadiile trei i patru larvele formeaz aglomeraii, ceea ce ridic temperatura din interiorul grupului i grbesc stadiile dezvoltrii. Dac observm o astfel de aglomeraie, mai nti facem o fotografie a grupului, apoi lum temperatura i la final trecem la colectarea materialului. Pupele. Pentru mpupare larvele execut migraii (Singh Devinder si col. 2010). Pupele mutelor se gsesc la oarecare distant fa de cadavru (3-5cm n sol, diferite locuri pe mbrcminte). Dac pupele se gsesc totui pe cadavru, atunci fie a existat un obstacol care a impiedicat migrarea larvelor, fie indic o anumit specie de insect. Pentru recoltarea pupelor pe lng cadavru se verific i o

122

zon de 36 m n jurul acestuia, cu un caroiaj de 1m. La intersecia liniilor caroiajului se practic excavaii la o adncime de 10 cm. De remarcat c pupele i schimb culoarea n timp, fapt care le indic maturarea. Pupele recoltate se dispun n containere n care exist o bucat de hrtie umezit, i se eticheteaz. Se aduc n laborator i se in n condiii optime pn la eclozare, pentru identificarea adulilor. Prinderea insectelor zburtoare adulte la locul descoperirii cadavrului. Primele insect care se colecteaz la locul descoperirii cadavrului sunt insectele adulte zburtoare, deoarece prin activitile desfurate pot fi deranjate i dispar. Colectarea se face cu un fileu entomologic. Prinderea se face prin micarea fileului din spatele insectei spre n fa, i de jos n sus. O dat prins printr-o rsucire din incheietura minii, fileul se nchide. Cu mna liber se apuc captul fileului care are insecta, reducndu-se astfel posibilitatea de micare a acesteia. Se ia vasul pentru omort insecta, i printr-o micare ferm se trece insecta n vas. Aceast micare permite ca insecta s zboveasc n vasul pentru omort, fr a fi acoperit, suficient nct el care colecteaz s adauge lichidul de conservare. Dup omorre, insecta este trecut n vasul de colectare. Deoarece ntreaga cantitate de insecte este important pentru stabilirea PMI, este important ca operaiunea de colectare i depozitare a insectelor s se fac cu maxim acuratee. Dac locul n care a fost descoperit cadavrul este o main, atunci se recolteaz orice insect de pe radiator, tergtoarele de parbriz, sau parbriz. Temperatura din

123

interiorul mainii este ntodeauna mai maare, ceea ce face ca viteza de dezvoltare a insectelor s fie mai mare. Prinderea insectelor care se deplaseaz la nivelul solului. Gndacii care se observ deplasndu-se pe cadavru se colecteaz cu mna, n vasele de omorre. Aceasta deoarece unele specii sunt carnivore i pot consuma a lte insect. Dac cadavrul este n interior, atunci se verific toate crpturile din substrat, covoarele sau alte lucruri aflate n imediata apropiere a cadavrului. Pentru cadavrele din exterior, insectele din jurul cadavrului se pot prinde montnd capcane. La colectare se poate ntocmi o Fi de date Entomologice, dup modelul de mai jos. Fi date Entomologice

Data..Numrul cazului Localizare cadavru ZonaOra...Jude Date decedat Ultima semnalare n via.Data disprut.. Data gsit cadavru..Data recuperare Descrierea locaiei cadavrului Sat

124

Pdure....tufiuri..cmpmarginea drumului ...... .....apropiere construcii....................altele Ora Apropiere construcii........................loc viran.......................pavaj..........................containere gunoi..............altele.................. Loc umed Balt.........................lac............................ru......................... ....irigaii......................rm mare...........................ap srat..........................ap dulce.....................altele................. Expunere Aer liber...........................ngropat.......................mbarcat ntreg........................parial mbrcat...........descrierea imbrcminii............................tipuri de resturi pe mbrcminte........... Starea de descompunere Stadiul I.....................stadiul II..........................stadiulIII.........................stadiul IV.......................altele...................................... Urme de desmembrare........................................................................ .............................................. Date meteo Temperatura ambiental.............................................suprafaa corpului..........................sol.....................sub

125

cadavru....................................10cm....................20cm........ ....................... Umiditatea n aer.................................sub cadavru................................................... Date entomologice Numr ponte cadavru....................numr probe ou prelevate.........................numr probe larve prelevate.....................................numr aduli prelevai............................................................ Data, ntocmit, Semnatura, Transportul materialului spre laborator. Transportul materialului biologic colectat se face n incinte la o temperatur mai joas dect cea nregistrat la locul descoperirii cadvrului i ntr-un timp ct mai scurt. Atenie la transportul larvelor vii! Acestea sunt foarte inventive i pot scpa, ceea ce nseamn alterarea dovezilor. De aceea recipientele pentru transportul lor trebuie s fie cu guri pentru aerisire i dop bine fixat. Creterea n laborator a insectelor colectate. Condiiile de cretere sau pstrare a insectelor, indiferent de stadiul dezvoltrii n laborator, trebuie s permit o pstrare cu acuratee a materialului. De aceea larvele se vor crete fiecare separate. Dup colectare, oule sau larvele mutelor sau gndacilor trebuiesc crescute n laborator pn la eclozare, pentru a

126

putea face identificarea speciilor de la care provin. Creterea se realizeaz n condiii egale cu cele de la locul n care s-a gsit cadavrul. Pe msur ce se atinge un stadiu din dezvoltare, cte un exemplar, se procedeaz la omorrea materialului viu n ap clocotit i se conserv n soluia Kahle. Datele despre condiiile n care au fost obinute aceste stadii, se nregistreaz att n caietul de observaii, ct i pe eticheta fiecrui preparat, deoarece ele pot fi cerute ca probe n proces. n perioada de cultur a larvelor n laborator, hrana va consta din ficat de porc (Gennard D., 2007). Gajen K. i col. 2004, a studiat viteza de cretere a larvelor de Calliphora vicina crescute pe ficat de porc, comparativ cu viteza de dezvoltare a larvelor crescute pe plmni, inim i creier i a constatat o diferen de dou zile pl us, n cazurile din urm. Acest lucru are implicaii n calcularea PMI i ridic ntrebri n legtur cu acurateea folosirii modelelor de dezvoltare pe diferite organe provenind de la porc. Autorii recomand la calcularea PMI o perioad de siguran de +-dou zile (fig.35).

127

Fig.35 Calliphora vicina, dezvoltarea larvar, lungimea corpului, t=20C , oragne diferite, porc (Gajen K., 2004) Creterea n loborator a insectelor zburtoare . Insectele zburatoare sunt colectate cte 50 larve n containere din plastic, cu o felie de carne. Ele pot fi pstrate n incinte termostatate sau ntr-un loc ntunecos, pn ce larvele

128

ajung n stadiile n care nu se mai hrnesc. n acest timp se ncearc impiedicarea evaporrii apei, prin plasarea unui capac cu guri care s permit i schimbul de gaze. Borcanele se in n bi de ap care s asigure o umiditate relativ de 65%. Se asigur deasemenea i securitatea borcanului, ca larvele s nu se amestece. Adulii sunt inui n incinte mari, care s le permit acuplarea, i depunerea oulor. Din ou se vor urmri stadiile dezvoltrii, care se vor compara cu cele gsite pe sau n jurul cadavrului (Leccese A., 2004). Astfel de cuti sunt de dimensiuni 46/36/46cm, acoperite cu un material care s permit ptrunderea luminii i o bun circulaie a aerului, meninnd cultura de insecte ntr un numr constant de indivizi. Dac cuca este mic insectele nu pot executa zborul, i mperecherea nu poate avea loc. Accesul n cuc se face printr-o lateral, prevzut cu un fel de mnu, prin care se introduce hrana. Apa se asigur n cantitate suficient, astfel nct s nu nnece insectele (Petri cu pietre sau hrtie de filtru). Hrana adulilor este format din zahr i ap n proporie de 50/50%, la care se adaug i nutrieni pentru dezvoltarea ovariolelor (carne tocat, ficat de porcsau carne de oaie). Hrana se d ntr-un tub parial nchis, ceea ce va asigura umiditatea hranei un timp mai ndelungat i accesul resticionat la ea. Aceasta este un factor care determin insecta s depun ponta. Temperatura la care este crescut insecta este apropiat de cea de la locul descoperirii cadavrului sau dac dorim grbirea metamorfozei, mai mare (tabel 6.1). Condiiile optime sunt 26,5C, umiditate 50%, 16 ore lumin i opt ore ntuneric. Pentru mpupare se poate folosi un acvariu, cu substratul nisipos, sau cu rumegu, plasat ntr-o incint care

129

reproduce condiiile n care a fost gsit cadavrul. Substratul este locul ideal unde larvele se pot ngropa pentru mpupare. Creterea n laborator a gndacilor. Insectele care fac parte din grupele Silphidae, Cleridae, Histeridae, pot fi inute n vase cu pereii transpareni. De obicei se in cte un individ ntr-o incint, pentru a preveni canibalismul, cu excepia situaiei cnd se urmrete mper echerea. Substratul trebuie s permit ngroparea i mpuparea. Silphidaele (ex. Microspores sp. aduli), necesit condiii de T=20C, 16:8 ore regim zi-noapte. Se pot crete ca indivizi separai sau n grupuri de ase indivizi de acelai sex. Dac se urmrete mperecherea, aceasta se separ i se hrnete cu o bucic de carne de vit, porc sau pui. La speciile grupului Nicrophorus, hrana se va ngropa, ceea ce face ca oule s se depun n sol, n apropierea hranei. Dup depunere, oule se recolteaz pe o hrtie de filtru umectat i se in la T=20C pentru eclozare. n incinta n care eclozeaz larvele se pune un vas cu ap, la nivelul solului, astfel nct larvele s aibe acces uor la el. Cultura se ine ntr-o incint n ntuneric total. Dermestidele se cresc n laborator ntr-un acvariu la T=28C i umiditatea 80%, folosind drept hran carne sau alt diet artificial. Substratul este rumegu de lemn, poliester sau plut, acoperit cu cteva strate de hrtie, care vor mima mbrcmintea. n incint se pune ap, la dista de sursa de hran, pentru a impiedica dezvoltarea fungilor. Hrana insectelor trebuie s fie conform cu stadiul de dezvoltare al acestora, sex i specie. Femelele necesit mai multe proteine, vitamine i minerale, pentru a-i dezvolta ovariolele i a depune ouale. Silphidaele, Cleridaele, Histeridaele i Nitidulidaele, necesit carne proaspt, de aceea la 3 -4 zile se vor hrni

130

cu viermi mori. Aceeai hran o necesit i carabidele, la care se poate adauga ou de furnici, pupe. Larvele i adulii Dermestidelor se pot hrni cu cremvuti sau pete, pe care le pot consuma uscate sau proaspete. La toate grupele de insecte, hrana trebuie asigurat n exces i verificat pentru a nu intra n putrefacie, sau a nu fi acoperit de fungi. 8.10. Calcularea PMI Dup numrarea speciilor de organisme gsite pe cadavru, stadiile lor de dezvoltare, trebuiesc corelate cu condiiile climaterice de la locul n care a avut loc crima. Datele meteo pot fi obtinute de la statia meteo locala (Gennard D., 2007). Unii autori (Donovan S.E., 2006) sugereaz pentru aceeai specie, diferene n rata creterii, n funcie de proveniena geografic a speciei. Datele sunt corectate, folosind un factor de corecie, calculat folosind datele de la staia meteo i cele nregistrate timp de 3/5 zile la locul unde s-a descoperit cadavrul. Astfel se obine o estimare a temperaturilor din locul unde a stat cadavrul naite de a fi descoperit. Din aceste informaii se poate concluziona ct timp a trecut de la depunerea oulor pn la stadiul n care au fost colectate insectele i deci se poate concluziona asupra PMI. Insectele sunt organisme poichiloterme i nu-si pot controla temperatura corpului, care variaz dup cea a mediului ambiant. Energia folosit de temperatu ra extern, poate fi calculat i se folosete n anticiparea atacurilor insectelor n natur. Se exprim n grade pe zi, i suma lor reflect perioade din dezvoltarea insectelor. n

131

acest caz se numesc zile grade acumulate. Dac perioada luat n considerare este scurt i se exprim n ore, atunci avem ore grade acumulate. Tempreratura minim necesar dezvoltrii, temperatura de baz, variaz de la o specie la alta. Estimarea PIM se bazeaz pe viteza de dezvoltare a insectelor, care este deci influienat de temperatur. Dac temperatura este prea mare sau prea mic, dezvoltarea insectelor se oprete. ntre cele dou puncte de maxim i minim, se consider c dezvoltarea insectelor se face ca o funcie liniar de temperatur(Gennard D., 2007). Suma gradelor celsius pentru fiecare specie variaz. Se consider c pentru Calliphora sp. este 39C iar pentru Phormia sp. 45C. Pentru calcularea PMI, dezvoltarea insectelor la extreme, are o importan mic, oricum rmnerea la aceste extreme va afecta calcularea PIM. Temperatura bazal poate varia cu locaia geografic a speciei, astfel pentru Calliphora sp. crescut n nordul Marii Britanii, este de 3,5C, iar pentru locaia Londra 1C. Temperature bazal calculat greit, poate influiena negativ asupra PMI. Gradul de igien al locului n care are loc descompunerea poate influiena viteza de dezvoltarea a larvelor i calcularea PMI (Benecke M., 1998). Folosirea creterii n lungime a lavelor pentru estimarea PMI (diagrame isomorfe i isoegale). Dac cadavrul este descoperit ntr-o incint cu temperatura controlat (camer, peter, etc.), unde condiiile meteo nu variaz, relaia dintre cretere i temperatura ambiant se prezint altfel. n aceste condiii, lungimea larvei n momentul colectrii (imersarea n apa clocotit) poate fi corelat cu timpul scurs de la eclozarea ei. Exist grafice care fac

132

aceast corelaie i care servesc drept stasuri pentru interpretarea datelor. Aceste grafice se numesc diagrame isoegale i au fost calculate pentru Calliphora vicina, Lucilia sericata i Protophormia terraenovae. Exist i un alt tip de grafic, unde fiecare stadiu de dezvoltare n laborator, a fost descris la o animit temperatur. Fiecare linie din grafic indic o schimbare din ciclul de dezvoltare spre un alt stadiu. Zona cuprins ntre dou linii, reprezint caractere morfologice comune pentru cele dou stadii. Graficul n ntregime se numete diagram isomorfa i au fost calculate pentru aceleai trei specii menionate mai sus. Acest tip de diagrame se folosesc n special cnd de pe cadavru au fost recoltate stadii dup oprirea hrnirii. Calcularea PMI folosind stadialitatea dezvoltrii insectelor. Dac se investigeaz un cadavru mai vechi de trei luni sau mai mult, nseamn c pe acesta sau n interiorul su se vor gsi una sau mai multe generaii de insecte n stadii diferite de dezvoltare. De aceea se aplic o alt metod pentru calcularea PMI. Pentru aceasta se identific fiecare familie de la indivizii observai. Apoi se ncearc s se coreleze aceast faun cu succesiunea normal de pe un cadavru. Pentru aceasta specialistul trebuie s cunoasc fauna local i sezonier i astfel se va putea pune un diagnostic PMI corect. Mutarea cadavrului. Ansamblul faunei de pe un cadavru, poate oferi informaii dac acesta a fost sau nu mutat din locul producerii crimei. Dac se descoper o specie care de obicei nu se gsete n asociaiile cunoscute i care este caracteristic pentru o anumit zon geografic, atunci se poate concluziona c acesta a fost mutat. De aceea se recomand prezentarea n faa curii a dovezilor

133

entomologice existente n zona n care a fost descoperit un cadavru (informaii ale unor ONG-uri de profil, Fauna etc.). Infestarea cadavrului cu prdtori. Cu ct un cadavru rmne mai mult ntr-un spaiu deschis, cu att mai mult poate fi atacat i infestat cu prdtori ai insectelor care se dezvolt pe el. Acestea pot fi probe care s asigure fixarea corect a PMI. De exemplu furnicile, pot cra oule de mute sau gndaci, iar ca rezultat noile generaii s fie mai puin numeroase. Sau gndacii din familiile stafilinide i carabide se pot hrni cu stadii tinere sau aduli de pe cadavru, n timpul nopii, deci mai puin observabili, sau al zilei. n ambele cazuri se va produce o alterare n succesiunea speciilor sau a stadiilor insectelor, i unele specii pe care literature sau experiena le semnaleaz ca fiind necesar prezente s nu apar. Informaiile acestea, de aciune a prdtorilor sunt necesare cnd interpretm date care in de un cadavru foarte vechi. Capitolul 9.Vertebrate necrofage Obiective - identificarea speciilor de vertebrate care pot consuma sau desmembra cadavre; - distincia ntre traumele fcute de vertebrate pre i post mortem; - explicarea circumstanelor n care vertebratele pot produce rniri sau moartea; - cunoaterea tehnicilor care pot identifica un vertebrat ca autor al unei crime; vertebrate care folosesc drept surs de hran cadavre umane (cini, obolani, unele psri, peti, etc.).

134

9.1. Cinii i pisicile Cinii sunt principalele vertebrate care pot desmembra un cadavru, ascunznd prin ngropare regiuni ale membrelor n diferite stadii de putrfacie. Datorit aciunii lor asupra cadavrelor se poate concluziona greit c acesta a fost inta unor agresiuni nainte de moarte. Instinctual cinilor de a descoperi un cadavru, chiar ngropat este folosit pentru dresajul cinilor poliiti n criminalistic. Hrnirea ncepe de obicei din regiunea capului, prin consumarea laringelui i a osului hioid, ceea ce face imposibil stabilirea diagnosticului de moarte prin strangulare. Se continu cu membrele i organele genitale, ceea ce face imposibil diagnosticarea unor agresiuni sexuale. Semnele lsate dup mucturi, reprezint urme dup care se poate face recunoaterea speciei. Alturi de urmele de coli se pot gsi smocuri de pr, care pot folosi la identificarea animalului care a produs deteriorarea cadvrului. Aciunea cinilor asupra oaselor unui cadavru produce: nepturi de obicei la oasele subiri (omoplat) i sunt cauzate de canini sau mselele carnasiere i strpung osul, mrimea, forma i distribuia lor dau indicaii despre mrimea animalului care a produs agresiunea. - depresiunile sunt produse de orice tip de dinte cnd animalul roade osul i dre cnd acetia se deplaseaz pe suprafaa osului. - anurile sunt canale adnci dispuse n lungimea osului (n special la oasele lungi), cauzate de molari i premolari.

135

De obicei cinii i pisicile mestec oasele cu o singur parte a danturii, deoarece morfologia acestora face imposibil folosirea ambelor regiuni (dreapta i stnga) n acelai timp (fig.36 si 37).

Fig.36 Craniu Canis sp. (ciine domestic) (sursa: colecia Laborator Morfologie, Universitatea Al.I.CuzaIasi) Cinii i pisicile pot ingera i fragmente de mbrcminte o dat cu bucile de carne sau os, i acestea se pot regsi n materiile lor fecale. Tot aici se pot descoperi bijuterii, dini, alte fragmente de materiale caracteristic aparinnd omului.

136

Fig.37 Craniu Felis sp. (pisica domestic) (sursa: colectia Laboratorul Morfologie, UniversitateaAl.I.Cuza,Iasi) De obicei cadavrele de copii sunt mai puin rezistente fa de cele ale adultului, oasele lor sunt mai mici, au placa epifizar de cretere mai lung i mai puin rezistent, oasele n general sunt mai puin osificate i vor fi digerate de sucul stomacal al animalului care le-a consumat. Animalele de companie consum dup un timp ndelungat cadavrul nsoitorului i dac sunt n condiii de nfometare. Totui sunt semnalate cazuri n care acestea au fost consummate i dup o or de la deces. De aceea

137

dup ce se descoper c un animal de companie a consumat cadavrul nsoitorului, acesta trebuie inut sub observaie i analizat de unspecialist n comportamentul animal (Apostolidou C. i col. 2010). Roztoarele (obolani, hamsterul auriu) las urme caracteristice pe oasele consumate (de obicei paralele i de o anumit distan), dup care se poate identifica specia i mrimea roztorului. Unele roztoare adun n adposturile lor tot felul de obiecte care au aparinut unor cadavre, chiar dac nu exist semnalri ale aciunii lor asupra unui cadavru (veveriele). obolanii ndeprteaz regiunile moi, gene, ochi, buze, nas, pavilioanele urechilor, degete, de la cadavre sau oameni n situaii dificile. Dac o persoan este comatoas, obolanii n grup mare o pot omor. Porcii domestici nu reprezint o problem, deoarece sunt crescui n incinte nchise. La porcii slbatici sunt semnalate aciuni asupra cadavrelor descoperite. De obicei acetia folosesc oasele mici (vertebrele sau falangele). Psrile se hrnesc cu pri din cadavru (ochi sau limb) sau folosesc prul pentru cptuirea cuibului. De aceeia lipsa ochilor la un cadavru poate fi asociat cu prezena psrilor mai mult dect cu aciunea omului. Petii att cei de ap dulce ct i cei de ap srat, se hrnesc cu cadavre. Petii mici ncep hrnirea cu regiunile moi, buze, pleoape sau nas. Petii mari (rechinii) consum i alte regiuni mai mari ale cadavrului.

Capitolul 10 Prezentarea probelor n faa instanei

Obiective

138

fotografia n criminalistic, confecionarea unor preparate animale i vegetale i pregtirea pentru prezentarea lor n faa instantei.

10.1. Fotografia judiciar Fotografia judiciar reprezint un mijloc important de fixare a probelor. Pentru a putea fi util fotografia judiciar trebuie s respecte anumite reguli att judiciare ct i tehnice proprii. Fotografia judiciar poate fi: fotografia de orientare (servete la fixarea imaginii ntregului loc al faptei), fotografia-schi (este destinat redrii, n exclusivitate, a ntregului loc al faptei, cu tot ce are el mai caracteristic), fotografia obiectelor principale (fixarea imaginilor acelor obiecte care sunt n legtur sau care reflect urmele i consecinele faptei infracionale), fotografia de detaliu (specifice fazei dinamice a cercetrii la faa locului, n care este permis deplasarea sau modificarea poziiei obiectelor n vederea punerii n eviden a detaliilor caracteristice, a urmelor, precum i a localizrii lor pe suprafaa obiectului.), fotografia urmelor i msurtorile fotografice. Microfotografia este o metoda pentru fixarea probelor care provin de la orice tip de microscop (microscop comparator, microscop cu contrast de faza, microscop electronic, etc.). Pe fotografie, cu ajutorul riglei gradate, se poate face msurarea urmelor. n planul fotografiei se aeaz o rigl gradat sau un alt element etalonat, paralel cu suprafaa care trebuie msurat i se execut fotografia. 10.2. Conservarea insectelor

139

Se face pentru a fi prezentate drept dovezi n faa instantei sau se poate folosi drept colecie de insecte reprezentative din zona geografic n care trete entomologul criminalist. Pregtirea insectelor pentru conservare n laborator.Insectele se pot conseva prin uscare sau umede (Sirbu V. 2008). 1.conservarea insectelor prin uscare. Materiale necesare: prese pentru etalat, cutii insectar, poliestiren expandat, pense, cristalizor, ace entomologice. Dup ce au fost aduse n laborator insectele se neap cu un ac entomologic pentru a putea fi manevrate i apoi poziionate n insectar. neparea corect se face prinznd insecta cu mna stng, cu partea dorsal n sus i se nfinge acul cu mna dreapt, perpendicular pe insect. Acul se nfinge n insect nct s rmn deasupra insectei 4-5mm. Acele entomologice sunt confecionate din oel, au grosimi diferite exprimate prin numere ntre. 000 i 6. Locul de nepare al insectei este diferit, n funcie de ordiunul din care face parte. Coleopterele se neap la mijlocul elitrei dreapte sau n treimea anterioar, nct acul s strpung insecta ntre perechea a II i a III a de picioare. Heteropterele se neap n scutel puin lateral dreapta. Se caut s se pstreze scutelul ntreg deoarece acesta conine elemente care pot servi la determinarea insectei. Ortopterele cu aripi strnse se neap n aripa dreapt, formele fr aripi se neap n torace n regiunea posterioar pe linia median. Alte insecte ca: albine, viespi, bondari, libelule etc se neap n mijlocul toracelui, puin spre dreapta. Poziionarea insectelor se face dup ce acestea au fost prinse cu ajutorul acului pe o plac de poliestiren.

140

Antenele scurte se poziioneaz spre partea anterioar a corpului, iar antenele lungi spre partea posterioar, n lungul corpului. Aripile la coleoptere, heteroptere i ortoptere se poziioneaz nchise. La diptere i himenoptere se ndeprteaz uor de corp. Picioarele se poziioneaz cu ajutorul unui ac cu gmlie prima pereche spre anterior i urmtoarele dou spre posterior. Abdomenul se poziioneaz n continuarea capului i a toracelui. Dup poziionare, insectele se las la uscat cteva zile, dup care acele folosite pentru uscare se ndeprteaz. La insecta astfel pregtit se prinde eticheta. Etalarea este o etap n pregtirea insectelor care cere mai mult atenie. Pentru etalare se prefer materialul proaspt. Cu ajutorul unei pense se ia cte un exemplar i se prinde cu mna stng. Cu dreapta se neap insecta n abdomen, perpendicular pe acesta, nct 1/3 din lungimea acestuia s rmn deasupra. Insecta se neap n anul presei pentru etalat, dirijnd corpul i picioarele fluturelui n an i antenele spre anteriorul insectei. Aripile se sprijin iniial pe plcuele de etalat. Se fixeaz cu un ac captul anterior al unei uvie de hrtie de 5mm lime, la partea anterioar i intern a plcuei de etalat din partea dreapt a presei innd captul liber n mna stng. Se mpinge aripa superioar stng spre partea anterioar cu ajutorul unui ac fixat la baza nervurii superioare a aripii, pn cnd marginea ei inferioar ajunge n poziie perpendicular pe axul jgheabului. Se prinde aripa sub bucata de hrtie, dup care mpingem i aripa inferioar n sus, nct marginea ei superioar s intre puin sub marginea inferioar a aripii superioare. ntindem

141

bucata de hrtie peste aripa inferioar i o fixm cu ace. Etalm apoi i aripile din partea cealalt. Se in la pres 10 15 zile, dup care se eticheteaz i se trec n insectare. n acelai mod se pregtesc i lcustele, libelulele sau alte insecte pe care dorim s le conservm cu aripile ntinse. Tipuri de insectare. Cutiile de insectar sunt confecionate din lemn, carton sau materiale plastice. Dimensiunile pot varia 30x20cm, 35x25cm, 40x30cm, cel mai folosit fiind insectarul cu dimensiunea 25x35cm. nlimea cutiei este de 7cm. Cutiile sunt acoperite cu capace cu sau fr sticl. Atenie! Sticla nu se dispune tip sertar. Exist dou modaliti de prindere a capacului la cutie: cu nut i feder sau cu seminut i feder. Prin dispunerea sticlei si a celeor dau tipuri de balamale se mpiedic ptrunderea duntorilor n insectar. Pe fundul cutiei se pune un material moale polistiren, turba, fetru etc. n cutii insectele se aeaz dup diferit e criterii: n ordine sistematic, dup locul de colectare etc. Exist numeroase criterii dup care se pot confeciona insectarele. Insectarele sistematice cuprind insecte grupate pe categorii sistematice. Aceste insectare au un pronunat caracter tiinific. Insectarele morfologice sunt alctuite innd cont de anumite caracteristici morfologice ale insectelor: -tipul aparatului bucal, -dimorfism sexual (rdac i crbu) i polimorfism (albina lucrtoare, matca i trntorul) Insectarele ecologice grupeaz insectele dup mediul n care triesc. Insectarele tematice se alctuiesc dup necesitile programelor colare.

142

2. Conservarea umed a insectelor Conservarea umed se practic pentru insectele mari sau larve. Insectele mari se fixeaz pe o plac de sticl cu ajutorul unui fir de a, care se trece prin corpul insectei. Plcua se introduce n borcanul plin cu lichid conservant i se las descoperit cteva zile. Dac lichidul se tulbur se nlocuiete cu altul proaspt. Se etaneaz borcanul i se eticheteaz. Conservarea larvelor de insecte. Larvele diferitelor insecte se pot conserva prin metode umede i uscate (Sirbu V. 2008). Conservarea umed ncepe prin imersia larvei n ap clocotit, pentru a-i conserva culoarea. Timp de dou- trei zile se trateaz cu alcool etilic 65%. Conservarea definitiv se face n alcool etilic 70% sau formol 3-4%. Formolul pstreaz culoarea preparatului. Conservarea prin uscare se practic pentru larvele care nu sunt n perioada de nprlire sau nainte de transformarea n crisalid. Omorre se face cu aer cald, prin introducerea omizilor n eprubete astupate etan cu dopuri. Eprubetele se cufund n ap fierbinte. Dup omorre larva se golete de coninut. Pentru aceasta se ndeprteaz cu o lam nou regiunea anal i cu o baghet se preseaz uor dinspre cap spre coad corpul larvei pentru a o goli de viscere. Se pot folosi i ace entomologice sau pense fine. Larvele golite de coninut se prind n vrful unui pai prin care suflm aer pentru a reda forma iniial a larvei. Urmtoarea etap n conservarea larvei de insect const n uscarea ei. Pentru aceasta se introduce paiul cu larva ntr-o sticl de lamp care se ine deasupra unei flcri. Din

143

cnd n cnd suflm aer prin pai pentru a menine forma larvei. Dup uscare larva se monteaz lng insecta adult. Observarea oualor de insecte. O metoda simpl pentru observarea oulor de insecte este colorarea cu permanganat de potasiu. Pentru aceasta se colectecteaz oule care se spal n soluie salin normal i apoi se tratez cu permanganat de potasiu 1% pentru un minut. Deshidratarea se face n alcool etilic 90% i apoi se montaz sub lamel n balsam de Canada. n final se pot observa la microscopul optic. 10.3. Efectuarea preparatelor microscopice cu diatomee Un astfel de preparat poate fi realizat n urmtoarele etape: - recoltare materialului, - centrifugarea - supernatantul se decan teaz, iar din sediment se absoarbe cu pipeta o parte din material, - depunerea pe lamele a cte l-2 picturi de material concentrat cu diatomee, care se ntind pe ntreaga suprafa a acesteia, - evaporarea apei, - aranjarea lamelor cu material pe plcue de mic, apoi pe o sit de azbest (sau plac metalic), - arderea pe o plit ncins sau la flacra unui bec bunsen circa 4-6 (12) ore pn ntreg materialul organic este distrus, rmnnd numai tecile silicoase ale celulelor de diatomee, - montarea se face n balsam de Canada; se depun l -2 picturi de balsam, iar peste materialul de pe lamel l-2 picturi de xilen, care vor ndeprta aerul i vor facilita

144

penetraia balsamului printre tecile silicoase. Rapid lamela se aplic peste balsamul de pe lam, - examinarea preparatelor la microscop, trierea acestora reinndu-se cele corespunztoare, care vor fi puse la uscat n etuva termostat. 10.4. Efectuarea unor preparate cu alge verzi n linii generale, tehnica de ntocmire a preparatelor microscopice este similar cu aceea de la Cianoficee. Apar unele diferene cerute de particularitile materialului algal. Recoltarea - algelor verzi din ap, de pe sol, stnci sau de pe scoara arborilor se poate face prin metodele indicate anterior. Pentru unele observaii de tip special se poate apela la materialul din culturi pure, sterile, existente n laboratoare specializate. Concentrarea algelor unicelulare i coloniale, ca i a unor forme filamentoase se poate face prin centrifugarea probei recoltate Montarea- n glicerin sau gelatin glicerinat, fr nici un tratament preliminar (nefixat i necolorat). Pen tru evidenierea unor componente celulare este necesar s se parcurg o tehnic adecvat, care include fixarea i colorarea difereniat a materialului. Fixarea - se face difereniat n funcie de scop. Pentru preparatele care urmresc evidenierea unor caractere generale se va urmri o conservare fidel nu numai a structurii celulei algale ci i a culorii cromatoforilor; aceste rezultate sunt asigurate de lactofenolul-cupric a crei compoziie este urmtoarea: fenol - 20 g, acid lactic - 20 g, glicerin -40 g, clorur de cupru - 0,2 g, acetat de cupru 0,2 g, ap distilat - 20 ml

145

Algele la care se urmrete evidenierea unor detalii structurale vor fi fixate n amestecul cromo-acetic, care are urmtoarea compoziie: acid cromic - l g, acid acetic glacial - l ml, ap distilat - 100 ml Colorarea- materialul este inut n fixator circa 12 ore (peste noapte), dup care splat abundent n ap i colorat cu hematoxilin feric (pentru nuclei), rou de Congo, verde lumin su clorur de zinc iodat (pentru peretele celular), safranin sau verde de metil (pentru citoplasm i cromatofori Rezultate foarte bune, pentru evidenierea materialului genetic, prezin metoda rapid de colorare cu fuxin bazic i carmin acetic (fixare n Carnoy 2-24 ore; hidroliza n HCl n 12-16' n termostat la 60C ; colorare n fuxin bazic i supracolorare cu carmin acetic). Montarea - n glicerin, gelatin-glicerinat i n balsam de Canada, dup o prealabil deshidratare. 10.5. Efectuarea unor preparate cu fungi Majoritatea fungilor sunt organisme multicelulare, formate din filamente (hife) lungi care impreun formeaz corpul sau miceliul. n structura peretelui celulare este coninut chitina. Fungii formeaz spori, care pot fi rspndii n ap, aer sau se pot prinde de alte animale i au dup specie o nmulire sexuat sau asexsuat. Dup modul de nutririe, majoritatea fungilor sunt organisme saprofite, care prin enzime specifice descompun substanele organice moarte, absorbind substanele rezultate. Unii fungi sunt parazii pe alte animale sau plante.

146

Pe cadavre se gsesc n toate stadiile descompunerii, ncepnd cu cele timpurii i pn n cele avansate i pot afecta acurateea interpretrii datelor. De exemplu, Candida albicans care n mod normal triete n intestin, dup moarte se poate dezvolta n cantitate mare, producnd etanol, ceea ce poate induce n eroare cercetrile n accidentele de trafic, unde aceast substan este dozat pentru a stabili cauza accidentului. De aceea, la probele luate de pe un astfel de cadavru, este adugat fluorur de sodiu, pentru a preveni dezvoltarea ei. Cercetrile asupra rolului n criminalistic a fungilor sunt la nceput, fiind organisme mici, ele sunt greu de manipulat i determinat. Folosirea lor n determinarea PMI va fi n legtur, probabil cu dezvoltarea tehnicilor moleculare. De obicei pe un cadavru se gsesc n cantitate mare spori, care au caracteristici morfologici bine precizai i care se folosesc la identificarea speciilor. Deoarece unele specii de fungi au o localizare geografic precis, se pot folosi pentru identificarea locului de unde provine cadavrul sau anotimpul din an n care a fost produs. Fungii elimin toxine (micotoxine) care se rspndesc n esuturi i rmn i dup moartea organismului. Unele din aceste toxine provin din alimente contaminate i pot ajunge n corpul victimilor. Ciupercile mari conin substane otrvitoare care pot cauza moartea. Colectarea fungilor, n special a celor cu corpi de fructificare mari se face, mpreun cu rdcina n pungi de hrtie. Se evit pungile de plastic n care din cauza coninutului mare n ap acestea se pot deprecia. Ciupercile foliicole se preseaz i se usuc ntocmai ca plantele superioare, care de fapt reprezint gazda acestora.

147

Ciupercile crnoase, de regul, nu se introduc n herbare; ele se usuc i se conserv prin metode speciale i se pstreaz n colecii. Totui, se pot obine si exemplare care pot fi intercalate n herbare, dar acestea au numai valoare, didactic nu i tiinific, deoarece prin presare o serie de caractere taxonomice sunt alterate. Astfel de exemplare se obin prin secionarea central-longitudinal axial a carpoforilor cu ajutorul unei lame de ras. Prin fiecare jumtate se face cte o seciune longitudinal de circa 23 mm grosime, care apoi se poate presa. Seciunile trebuie cuprinse nainte de presare ntre dou coli de hrtie poroas pentru a evita aderarea acestora de colile presei. Materialul rmas se cur cu ajutorul unei lingurie de esutul stromatic, i se aranjeaz n pres. De la alte exemplare ale aceleiai specii se vor izola straturile externe ale carpoforului, prin ndeprtarea cu mult atenie a esutului stromatic i se vor presa ca mai sus. Determinarea ciupercilor superioare (Basidiomycetelor) adesea nu poate fi fcut fr analiza detaliat, a sporilor. ntruct acetia nu mai pot fi obinui de la exemplarele conservate, este necesar colectarea lor mai nainte, n acest scop se obin aa numitele sporograme. Sporograma reprezint imaginea circular-radiar pe care o formeaz sporii czui de pe stratul himenial al carpoforului pe o foaie de hrtie, de celofan sau o bucat de sticl. Principalii timpi pentru obtinerea unei sporograme: - se desprinde piciorul de plrie, se aeaz plria cu himenoforul n jos pe o bucat de hrtie (alb sau neagr, n funcie de culoarea sporilor), de celofan sau de sticl, se acoper ansamblul obinut cu un clopot de sticl pentru a menine o anumit umiditate; n

148

circa 24 ore, sporii se desprind de pe stratul himenial i se depun pe hrtie (celofan sau sticl), se fixeaz sporii n aceast poziie prin pulverizarea deasupra lor a unei soluii de colofoniu l - 2/o n alcool 95 % sau a unei soluii format din colofoniu (o parte) i terebentin (patru pri). Spodograma obinut se ambaleaz n plicule i se lipete pe aceeai coal de ierbar cu ciuperca creia i aparine. Ulterior se vor ntocmi i preparate cu spori, care vor servi la identificarea taxonului. Preparate microscopice cu mucegaiuri. Materialul necesar se obine prin cultivarea acestor taxoni pe medii naturale sau sintetice, sterile, n laborator (ex. Sabourand, Czapek, cartof, dextroz, agar .a.). . Recoltarea miceliului se face n faza fenologic corespunztoare (ex. n momentul sporulrii). Se trece de cteva ori prin alcool 70% pentru ndeprtarea apei, a bulelor de aer i parial a sporilor care mpiedic analiza miceliului dac sunt prea abundeni. Depunerea pe lame se face n l2 picturi de alcool, se depun cteva hife miceliene, care prin intermediul a dou ace spatulate se rsfir ct mai bine; Fixarea, clarificarea i conservarea materialului: nainte de evaporarea total a alcoolului se depun peste material l2 picturi de lactofenol Amann i se aplic lamela. Lactofenolul realizeaz concomitent fixarea, Colorarea, dac n lactofenol se dizolv un colorant adecvat (ex. bleu coton) Lutarea: se impune pentru a evita evaporarea lactofenolului, se poate face cu glicerol

149

Un procedeu mai eficient const n plasarea unei lamele sterile pe suprafaa mediului de cultur gelozat n imediata apropiere a unei colonii cu cretere activ. Miceliul prin cretere se va extinde i pe suprafaa lamelei. Lamela se ridic de pe suprafaa mediului i dup o prealabil examinare la microscop, se monteaz pe lam n lactofenol sau n bleu-coton n lactofenol. Preparate microscopice cu ciuperci foliicole. Miceliile ciupercilor endoparazite inter- i intracelulare pot fi puse n eviden prin secionarea i colorarea esuturilor plantei gazd cu colorani specifici. Seciunile se pot executa cu mna liber, la microtomul mecanic, dup includerea materialului n parafin, sau la criotom, urmnd tehnicile caracteristice histologiei vegetale. Seciunile de mn" i cele realizate la criotom sunt preferate naintea celor incluzionate n parafin deoarece conserv mai bine caracterele morfo-anatomice ale ciupercii. Materialul biologic poate fi proaspt sau conservat (fixatori micologici : B ui l e r, Carnoy, Fleming, acidul osmic). Coloranii utilizai n cito-histologia vegetal sunt ntrebuinai i pentru colorarea seciunilor cu material micologic. Dintre coloranii specifici-micologici menionm : bleu Coton n lactofenol, n acid lactic sau n acid acetic, albastru de tripan n lactofenol, fuxin acid, picro nigrozin n lactofenol (colorani n special citoplasmatici), verde de metil n glicerin-gelatinat, verde de Janus (colorani citoplasmatici, mitocondriali i ai membranelor celulare). Giemsa, carminul acetic i fuxin bazic (colorani nucleari). Seciunile colorate pot fi montate n unul din urmtoarele medii: lactofenolul A m a n n, cloral-lactofenolul, acid lactic, glicerina pur, ulei de parafin .a. Preparatele

150

montate n oricare din aceste lichide vor fi lutate. Montarea, se poate realiza, de asemenea, n gum arabic sau n balsam de Canada.

Bibliografie 1. Apostolidou C., Koletsa T., Chatzinikolaou F., Psaroulis D.,. Njau S. N and Kostopoulos I., Lethal Hemorrhage Induced by A Pet Cat Scratch on Varicose Veins The Open Forensic Science Journal, 2010, 3, 1-5 2. Belis Vladimir, Ghid de urgente medico-judiciare, Editura Scripta, 1998 3. Bouvenot G., Devulder B., Guillevin L., Queneau P., Schaeffer A., Patologie Medicala, Institutul European, 2006 4. Crisan Alexandru, Muresan Daniela, Clasa Insecte. Manual de Entomologie generala, Editura Presa Universitara, 1999,Cluj 5. Cruz Albert M., Crime Scene Intelligence. An Experiment In Forensic Entomology, National Defence Intelligence College, 2006 6. Gennard E.Dorothy, Forensic Enthomology. An Introduction, Wiley and Sons, West Sussex, 2007 7. Gunn Alan Essential Forensic Biology, Second edition, John Wiley&Sons, 2009 8. Iftenie Valentin, Medicina legala , Editura Stiintelor Medicale, Bucuresti 2006

151

9. Kobayashi Masahiko, Why does rigor mortis progress downwards?, Internet Journal of Forensic Medicine and Toxicology,vol.3, nr.2, December 2002, http//geradts.com 10. Krishan Kewal, Anthropometry in Forensic Medicine and Forensic Science-'Forensic Anthropometry' The Internet Journal of Forensic Science, www.ispub.com 11. Vass Arpad A., The elusive universal post-mortem interval formula, Forensic Science International, Volume 204, Issues 1-3, 30 January 2011 12. Leccese Annamaria, Insects as forensic indicators: methodological aspects, Aggrawals Internet Journal of Forensic Medicine and Toxicology 5(1) (2004) 2632 13. Lehrer Z Andy, Fauna Republicii Socialiste Romania. Insecta. Diptera. Familia Calliphoridae, 1972, vol.XI, fascicula 12, Editura Academiei Republicii Socialiste Romania 14. Lynnerup N, Kjeldsen H, Heegaard S, Jacobsen C, Heinemeier The Eyes Have It: Researchers Can Now Determine When A Human Was Born By Looking Into The Eyes Of The Dead, J ScienceDaily (Jan. 30, 2008) 15. Manolescu Nicolae, Aspecte de patologie celulara comparata, vol II, Editura Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1999 16. Sirbu Vasile,Elemente de Embriologie si Histologie animala, 2004, Editura Tehnopress, Iasi 17. Sirbu Vasile, Prepararea materialului didactic animal, 2008, Editura PIM, Iasi

152

18. Williams G., Acute pancreatic necrosis as a cause of sudden death, British Medical Journal, 1954, pp 1184/1185 19.Trusele standard de prelevare a probelor biologice un pas spre Europa http://medicinalegalahd.ro/ 20. Fiedler A., Jessica Rehdorf, Hilbers Florian, Leona Johrdan, Carola Stribl, Mark Benecke, Detection of semen (Human and Boar) and saliva on fabrics by a very high powred UV/ VIS light source, The open forensic science journal, 1, 12-15, 2008 21. Xiantang Li, Michael R. Elwell, Anne M. Ryan, Richardo Ochoa, Morphogenesis and postmortem hepatocyte vacuolation in liver weight icreases in sprague dawley rats , Toxicologic Pathology, 31, 682-688, 2003 22. Reid, W Darlene, Sharma, Anju, Elliott, W Mark, Davis, Jennifer E, Road, Jeremy D Diaphragm Morphology at Postmortem in People with Acute and Chronic Respiratory Disease Cardiopulmonary Physical Therapy Journal, Jun 2007 23. Paul Hanna Cellular pathology, General Pathology, VPM 152, Jan. 2011 24. Samuel S. Abedisi, Forensic anthropology in perspective: The current trends, The Internet Journal of Forensic Science, vol.4, nr.1, 2009 25. Zdravkovic M., Kostov M., Stojanovic M., Identification of postmortem autolytic changes on the kideny tissue ussing PAS stain method , Facta

153

Universitatis, Series Medicine and Biology, vol.13, nr. 3, 2006, pp 181-184 26. Garamendi M. Pedro, Landa I. Maria, Miguel C.Botella, Alemn Inmaculada Forensic Age Estimation on Digital X-ray Images: Medial Epiphyses of the Clavicle and First Rib Ossification in Relation to Chronological Age , Journal of Forensic Science, vol.55, supliment, pp S3-S12, 2011. 27. Leeccese Anna maria, Insects as forensic indicators: methodological aspects, Agrawal Internet Journal of Forensic Medicine and Toxicology 5(1), 2004, 26-32. 28. Sing Devinder, Bala Madhu, Studies on larval dispersal in two species of blow flies (Diptera: Calliphoridae) , Journal of Forensic Research, 1:102., 2010 29. Beneke Marck, Six Forensic Entomology case: Description and Commentary , Journal of Forensic Science, 43(4):797-805, 1998. 30.Yukari Tomita, Makoto Nihira, Youkichi Ohono, Shigeru Sato,Ultrastructural changes during in situ early postmortem autolysis in kidney, pancreas, liver, heart and scheletal muscle of rats, Legal medicine, vol. 6, nr.1, pp 25-31, 2004 31. Leticia Rodrigues Nery, Carla Ruffeil Moreira, Tania Mary Cestari, Rumio Taga, Jose Humberto Damante, Postmortem acinar autolysis in rat sublingual gland: a morphometric study, Journal of Applied Oral Science, vol. 18, nr.5, Bauru Sept./Oct. 2010 32. Gajen Kaneshrajah, Bryan Turner, Calliphora vicina larvae grow at different rates on different body tissue , Int. J. Med. 118:242-244, 2004 33. Priscilla H. Strange, The spectral sensitivity of Calliphora maggots, J. Exp. Biol. ,38:237-248, 1961 34. Donovan S.E., Hall M.J., Turner B.D., Moncrieff C. B., Larval growth rates of the blowfly, Calliphora vicina,

154

over a range of tenperatures, Medical and Veterinary Entomology, 20:106-114, 2006 *www. people.upei.ca, *www. ePathology.ro *www. Wikipedia.org. *www. Laboratoryeqipmentworld.co *www. emedicine. Medscape.com. * www. nhm.ac.uk

155