Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
CAPITOLUL 2
ADN este molecula fundamentală a vieţii. Toate mecanismele prin care se realizează
structura şi funcţiile celulelor, asamblate în ţesuturi şi organe, precum şi răspunsurile lor la
acţiunea mediului intern sau extern - sunt codificate şi reglate de structura uimitor de simplă şi
elegantă a genomului uman. De aceea, înţelegerea structurii ADN şi a organizării sale în celule
este fundamentală pentru studiul geneticii medicale şi medicinei în general.
În anul 1865, MENDEL a formulat ipoteza genei potrivit căreia fiecare caracter este
detreminat de “o pereche de factori ereditari” (numiţi mai târziu gene) şi a stabilit legile
eredităţii. Astfel, el a pus bazele geneticii ca ştiinţă.
Iniţial, în ipoteza lui Mendel, gena era o entitate abstractă, ipotetică, şi natura sa chimică
era necunoscută. Ulterior, la începutul secolului XX, demonstrându-se rolul cromosomilor în
ereditate (Sutton, Boveri şi mai ales T.H.MORGAN), gena a devenit un element concret,
material, un segment dintr-un cromosom care determină un caracter specific, dar natura ei
chimică a rămas în continuare necunoscută.
La începutul deceniului patru s-a stabilit că în structura cromosomilor există proteine şi
acizi nucleici: ADN şi ARN; una din aceste componente trebuia să fie substratul chimic al
genei. Mulţi cercetători credeau atunci că genele sunt formate din proteine, cele mai complexe
substanţe chimice din celule; ADN era considerat o moleculă prea simplă pentru înmagazinarea
informaţiei ereditare şi transmiterea ei în succesiunea generaţiilor. Existau totuşi unele
argumente "indirecte" care pledau pentru rolul genetic al ADN: localizarea aproape exclusivă a
ADN în nucleu şi cromosomi, structuri cu rol important în ereditate; cantitatea sa constantă şi
caracteristică speciei, proporţională cu numărul cromosomilor (celulele sexuale au jumătate din
ADN-ul celulelor somatice); stabilitatea metabolică a moleculei de ADN. În 1944, Avery et al.
au demonstrat experimental că ADN-ul este substratul molecular al eredităţii.
B. STRUCTURA ADN
1
La unele virusuri materialul genetic este ARN; ele sunt numite "retrovirusuri" deoarece în timpul
infecţiei se integrează în genomul celular după ce ARN-ul lor a fost convertit în ADN, de către enzima
"revers transcriptază" (sau transcriptază inversă). Unele din aceste virusuri produc cancere şi alte
îmbolnăviri (SIDA).
21
determinate de către descoperirea structurii şi funcţiei ADN sunt şi vor fi atât de spectaculoase
încât nu vor avea egal în istoria medicinii.
CASETA 2.1.
2
Deşi legăturile de hidrogen sunt legături electrostatice slabe, multitudinea lor asigură "coeziunea"
?
catenelor.
23
Denaturarea şi hibridizarea ADN.
2. POLIMORFISMUL STRUCTURAL
ŞI FLEXIBILITATEA MOLECULEI DE ADN
3
Catena 3'5' se mai numeşte şi catenă antisens deoarece prin convenţie ARNm este considerat catena sens
25
În organism, în anumite regiuni ale moleculei de ADN (cu o anumită secvenţă
nucleotidică) se produc frecvent modificări (tranziţii) conformaţionale A B C. Aceste
modificări permit recunoaşterea segmentelor respective de către anumite molecule exogene,
care reglează expresia genelor.
În 1979, Rich şi Dickerson descoperă un tip particular de ADN-Z sau ADN-senestra. El
are o moleculă dublu elicală, orientată spre stânga, care îşi pierde simetria caracteristică formei
B, deoarece axul fosfo-glucidic ia o formă neregulată în zig-zag, producând deformarea şi
alungirea moleculei de ADN (figura 2.8). Conformaţia ADN-Z este o conformaţie normală,
există "in vivo" şi apare, în anumite condiţii fizico-chimice, în regiunile bogate în perechi de
baze G-C, prin tranziţia / conversia formei B (sub acţiunea unei topoisomeraze, prin rotarea
bazelor cu 180 ); tranziţia B Z este reversibilă.
ADN-Z intervine foarte probabil în inactivarea unor gene şi, deci, în controlul expresiei
informaţiei genetice. Conversia locală B Z (mai ales în situsurile de reglare a transcripţiei)
poate fi realizată prin fixarea mai intensă a histonelor sau a altor molecule ce produc represia
genelor sau prin metilarea citozinei din situsurile GC. Astfel, un "viraj la stânga" la începutul
unei gene determină stoparea activităţii ei.
Tranziţia B Z ar determina însă şi evidenţierea unor situsuri din ADN în care se
fixează mai facil agenţi mutageni sau cancerigeni. Pentru aceasta pledează faptul că mutaţiile
apar mai frecvent la nivelul secvenţelor G-C care iau conformaţia Z.
În finalul acestei prezentări este important de subliniat faptul că tranziţia ADN BZ ca
şi modificările conformaţionale A B C care apar în anumite regiuni ale ADN (cu o
secvenţă specială a nucleotidelor), demonstrează elocvent faptul că molecula de ADN nu are o
structură fixă, rigidă, încremenită. În funcţie de condiţiile de mediu, moleculele ADN sînt
flexibile, într-o permanentă stare dinamică, deformându-se neîncetat; pe drept cuvânt se poate
spune că molecula de ADN (simbolul vieţii) "pulsează sau respiră".
Termenul de genom a fost creat (Winkler, 1920) pentru a denumi setul haploid de
cromosomi din gameţii eucariotelor. Ulterior el a fost folosit pentru a desemna ansamblul
genelor unui organism dar descoperirea ADN necodant, diferitelor clase de ADN repetitiv şi
altor elemente de „anatomie”, au dus la semnificaţia actuală a genomului, conceput ca
ansamblul complex al secvenţelor de ADN a unui individ sau specii.
Cunoştinţele despre genomul uman au fost dependente în timp de metodele folosite.
Descoperirea tehnologiei ADN recombinant a marcat începutul unei perioade revoluţionare
pentru biologie în general şi medicină în special. În 1980 a apărut ideea Proiectului Genom
Uman, care treptat a început să prindă contur, devenind în 1990 un important proiect
internaţional destinat să stabilească harta fizică şi genetică a genomului uman şi, în final, să
determine întreaga secvenţă a ADN uman dar şi altor organisme (veyi capitolul 3.D.4).
Coordonarea cercetărilor a fost realizată de Human Genome Organization (HUGO), care după
descoperirea hărţii genetice a omului (1995) a propus descifrarea întregii secvenţe a
genomului uman. Proiectul demarează însă abia în 1999 şi doi ani mai tîrziu, la 15 februarie
2001, International Human Genome Sequencing Consortium (IHGSC) precum şi compania
privată Celera Genomics au publicat prima schiţă (ciornă) a secvenţei genomului uman, ce
acoperă 96% din partea eucromatică (activă) a genomului uman; heterocromatina este greu de
clonat datorită structurii sale repetitive şi se consideră că nu are sau are doar câteva gene. Deşi
mai sunt multe de făcut până la finalizarea completă (în 2003) a proiectului (stabilirea unei
secvenţe continue, unice, pentru cei 24 de cromosomi umani şi a poziţiei precise a tuturor
genelor) iar unele detalii se vor schimba, există multe puncte clare. De aceea, în prezentarea
organizării genomului uman, vom ţine cont în special de aceste elemente certe.
26
1. DATE GENERALE.
Cantitatea totală de ADN din celulele umane diploide a fost apreciată la 7 picograme
sau 3,5 picograme per genom haploid, ceea ce corespunde teoretic la circa 3,3 miliarde de
perechi de baze (pb). Mărimea genomului haploid este constantă la fiecare specie şi se mai
numeşte valoare C; ea prezintă evident variaţii în cursul ciclului celular: 2C la sfârşitul
diviziunii şi faza G1, 4C după replicarea ADN în faza S şi în G2.
Mărimea totală estimată a genomului uman, apreciată de IHGSC în 2001, este de 3,2
Gb (gigabaze = miliarde de baze); din acestea 2,95 Gb reprezintă eucromatina, segmentul
„funcţional” al genomului, iar restul heterocromatina inactivă. Surprinzător este că secvenţele
codante reprezintă mai puţin de 5% din genom (numai 1,1% -1,4% sunt secvenţe ce codifică
proteine) iar numărul prognozat de gene este cuprins între 30.000 şi 35.000, jumătate faţă de
estimările anterioare (din acestea numai 26.000 au fost identificate, deşi la multe încă nu se
cunoaşte cu precizie rolul, efectul lor). Deci genele, ce conţin ADN "codant", sunt pur şi simplu
nişte "insule" într-un "ocean" de ADN necodant; acestă dispoziţie este nu numai surprinzătoare
(prin logica "economiei" sau "rentabilităţii") dar şi misterioasă. Cert este că genomul nu poate fi
considerat o succesiune de gene pe cromosomi ci o structură cu arhitectură complexă în care
genele (fragmentate) sunt dispersate pe cromosomi şi separate prin largi regiuni intergenice,
necodante. Acest ADN necodant (numit uneori şi "egoist", deoarece nu participă la formarea de
proteine) nu este probabil în totalitate "inutil": evidenţierea unor secvenţe perfect organizate, din
care unele sunt chiar transcrise, sugerează că cel puţin o parte din acest ADN ar putea juca un rol,
pentru moment necunoscut.
Genomul uman este alcătuit dintr-un genom nuclear complex, ce conţine marea
majoritate a ADN-ului celular (3,2 Gb) şi un genom mitocondrial simplu şi mic (16,6 Kb).
2. GENOMUL NUCLEAR
4
Subunitatea mare a ribosomului conţine ARNr 28S, 5,8 S şi 5S iar subunitatea mică ARNr 18 S.
5
Denumirile Alu, Kpn, The - provin de la enzimele cu care aceste secvenţe sunt "decupate" din genom.
6
ADN satelit (sau alphoid) este specific fiecărui cromosom şi poate fi evidenţiat, chiar în nucleul interfazic, cu
sonde centromerice specifice
28
caracteristică remarcabilă a genomului uman este duplicaţia segmentală a unor porţiuni/blocuri (1-200kb,
majoritatea >10kb) din secvenţa genomică în una sau mai multe locaţii, pe acelaşi cromosom (duplicaţii
intracromosomice7, mai ales pericentromerice) sau pe cromosomi diferiţi (duplicaţii intercromosomice 8). Ele
alcătuiesc circa 5% din genomul uman. Interesant este faptul că multe duplicaţii s-au produs foarte recent în
evoluţia spre om, lipsind la specii apropiate.
Secvenţele repetitive au fost considerate „deşeuri” neinteresante. Şi totuşi ele s-au dovedit a fi
markeri paleontologici valorosi pentru a înţelege evoluţia populaţiilor umane, selecţia şi
mutaţiile. Au permis înţelegerea structurii şi dinamicii cromosomilor. Mai mult, ca agenţi
activi, repetiţiile au remodelat genomul uman, producând rearanjamente care au modificat
genele existente (producând mutaţii) sau au creat gene noi. Dacă menţionăm, în final, şi
valoarea lor ca instrumente de testare / diagnostic în genetica medicală 9 atunci cu siguranţă nu
le vom considera „un gunoi” si va trebui să le acordăm atenţia necesară.
7
Pe cromosomul 17 există trei copii a unei secvenţe de circa 200kb, separate prin 5 Mb; copiile sunt atât de
similare (99%identitate) încât generează prin recombinare paralogă sindroamele cu microdeleţii Smith-Magenis
şi Charcot-Marie-Tooth 1A;
8
un segment de 9,5kb din Xq28 ce conţine şi locusul pentru adrenoleukodistrofie, se găseşte duplicat, lângă
centromer, pe cromosomii 2,10,16 şi 22
9
Din cauza gradului înalt al polimorfismului de lungime dintr-o populaţie microsateliţii sunt markeri genetici
valoroşi în testările genetice.
29
2.4. ADN EXTRAGENIC
ADN extragenic (75%) este alcătuit din secvenţe inactive transcripţional, unice sau
repetitive. Secvenţele repetitive au fost clasificate (Strachan si Read, 1999) în două categorii:
− ADN repetat în tandem şi grupat în “blocuri” cu difertite localizări cromsomice; această
categorie de ADN înalt repetitiv se numeşte generic ADN satelit şi se subîmparte în patru
clase: megastelit, satelit, minisatelit şi microsatelit;
− ADN repetat şi dispersat în numeroase situsuri în spaţiul dintre gene; este reprezentat de
scvenţele SINEs şi LINEs.
3. GENOMUL MITOCONDRIAL.
Genomul mitocondrial este definit printr-un singur tip de ADN circular, bicatenar
(figura 2.10), format din 16.569 pb. Secvenţa sa nucleotidică a fost complet descifrată
(Anderso et al, 1981) şi se caracterizează printr-o mare densitate de secvenţe codante. Cele
două catene ale ADN mitocondrial au o compoziţie bazică diferită: o catenă "grea" (H) este
mai bogată în guanină iar cealaltă catenă "uşoară" (L) în citozină. Într-o mică regiune, bucla
D, ADN este alcătuit din trei catene, prin sinteza unei piese scurte adiţionale la catena H,
cunoscută ca ADN 7S.
Fiecare celulă umană conţine câteva mii de copii ale ADN mitocondrial (ADNmt) şi
de aceea cantitatea lui totală, raportată la ADN unei celule somatice, poate reprezenta până la
0.5%. În cursul diviziunilor celulare mitotice, moleculele de ADN mitocondrial ale celulei
iniţiale segregă la întâmplare în celulele fiice.
Trebuie subliniat că genomul mitocondrial al zigotului provine exclusiv de la ovul,
deci de la mamă, fapt ce determină un tip particular de transmitere maternală a genelor
mitocondriale: de la mamă la toţi copiii săi.
Genomul mitocondrial mai prezintă cîteva elemente particulare, diferite de genomul
nuclear: NU este asociat cu proteine histonice sau nehistonice şi nu conţine ADN repetitiv
(tabelul 2.1). Genomul mitocondrial este extrem de compact: circa 93% din ADN esre format
din secvenţe codante (absente doar în bucla D), ce formează 37 de gene (28 pe catena H şi 9 pe
catena L): 13 gene codifică polipeptide (constituienţi ai sistemului de fosforilare oxidativă), 22
gene codifică ARNt şi 2 gene ARNr (figura 2.13). Restul proteinelor mitocondriale sunt
codificate de gene nucleare, sintetizate în citoplasmă şi importate în mitocondrii. Genele
mitocondriale sunt aproape totdeauna contigue iar unele chiar suprapuse; ele nu conţin introni.
Transcripţia începe în promotorii (PH şi PL) aflaţi în bucla D, este continuă (deci
multigenică) şi se desfăşoară în direcţii diferite pe cele două catene, generând un transcript
multigenic mare (ce va fi ulterior secţionat în mai multe molecule de ARN). Codul genetic
mitocondrial diferă puţin de cel nuclear. El are patru codoni stop (nonsens) din care doi sunt
codoni sens în ADN nuclear; codonul stop UGA din ADN nuclear este codon sens în ADN
mitocondrial. Replicarea este unidirecţională şi începe în puncte diferite de origine (O) p
entru cele două catene10.
Diferenţele dintre structura şi funcţia lor sunt prezentate sintetic în tabelul 2.1
10
ADN mitocondrial, prin particularităţile sale structurale, net diferite de ADN nuclear, se aseamănă foarte mult
cu ADN procariotelor ancestrale; de aceea si consideră că mitocondriile îşi au originea din includerea unei
particule asemănătoare bacteriilor de cître primele celule eucariote apărute în evoluţie.
30
ADN diferite celulele XY)
Număr total de molecule 23 în celulele haploide şi 46 în Câteva mii de
de ADN per celulă celulele diploide
Asocierea cu proteine Mai multe clase de histone şi Neasociat cu proteine
proteine nehistonice
Procentul de ADN codant 5% 97 %
Număr de gene 35.000 gene 37
Densitatea genelor Mică ( 1 la 40 kb) Mare ( 1 la 0.45 Kb)
Introni Prezenţi în cele mai multe gene Absenţi
ADN repetitiv 30 – 40 % Foarte puţin
Transcripţie Deobicei individuală Transcripţie continuă a genelor
multiple
Repararea leziunilor ADN Mecanisme multiple, eficientă Unele mecasnisme de reparare
absente; mutaţiile se acumulează
rapid.
Recombinare Cel putin una pentru fiecare Absentă
pereche de cromosomi meiotici
Ereditate Mendeliana pentru genele de pe Exclusiv maternă
autosomi şi cromosomul X;
paternală pentru secvenţele de pe Y
ADN mitocondrial poate suferi mutaţii 11 producând o serie de boli degenerative (vezi
capitolul 8), care sunt transmise într-un mod specific, de la mamă la toţi descendenţii; bărbaţii
bolnavi nu transmit boala. Atunci cînd se produce o mutaţie în ADN mitocondrial rezultă în
mitocondrie un amestec de molecule mutante şi normale, numit heteroplasmie. Cînd o celulă se
divide ADN mitocondrial mutant va fi împărţit la întâmplare între celulele fiice şi astfel, în timp,
procentajul de ADN mit mutant între diferite linii celulare şi ţesuturi va fi diferit, fenomen numit
segregare replicativă. Studiul familiilor în care există heteroplasmie cu ADN mitocondrial
mutant, relevă că procentajul ADNmt mutant creşte şi producţia de energie scade treptat, până
sub un prag minimum necesar funcţionării normale a ţesutului, moment în care manifestările
clinice devin evidente. De aceea bolile mitocondriale au un debut tardiv şi o evoluţie progresivă.
S-a demonstrat că ADN mitocondrial poate suferi mutaţii somatice, în celulele corpului
după naştere, care se acumulează rapida datorită absenţei unor mecanisme de reparare. Astfel,
aceste mutaţii somatice au probabil un rol important atât în debutul şi progresia bolilor
mitocondriale, a unor boli degenerative precum şi în procesul de senescenţă.
1. APARATUL GENETIC
Structurile celulare care conţin ADN (nucleul şi mitocondriile), precum şi cele care
intervin în realizarea funcţiilor sale (ribosomii şi centriolii) alcătuiesc aparatul genetic.
Nucleul este elementul principal al aparatului genetic, centrul de comandă şi control al tuturor
activităţilor celulare. El conţine circa 99.5 % din toată cantitatea de ADN a celulei.
Structura nucleului diferă în interfază şi diviziune, cele două etape importante ale ciclului
de viaţă al celulei. Fără a intra acum în detalii (vezi capitolul 5.B.1) vom preciza că interfaza este
alcătuită (figura 2.11) din: faza G1 – presintetică, în care cromosomii despiralizaţi sunt
monocromatidieni şi au au o singură moleculă de ADN iar conţinutul total al ADN este 2C;
faza S – în care se produce sinteza ADN, prin replicare semiconservativă, şi cantitatea de
ADN a celulei se dublează la 4C; faza G2 – postsintetică, în care cromosomii sunt
bicromatidieni, fiecare cromatidă fiind alcătuită dintr-o singură moleculă de ADN. Prin
diviziunea (mitoza) se produce, prin disjuncţie (separare) cromatidiană, distribuţia
(segregarea) egală şi totală a materialului genetic dublat în faza S.
Nucleul interfazic este delimitat la exterior de o membrană dublă, cu pori (prin care
se realizează schimburile nucleo-citoplasmatice); în interiorul nucleului se află: un
nucleoschelet sau matrice nucleară (formată din ARN şi proteine, în special actină),
cromatină, nucleoplasmă şi nucleol(i) (cu rol esenţial în formarea ribosomilor).
În nucleu, fiecare moleculă de ADN se asociază cu pro teine histonice, nehistonice şi
mici cantităţi de ARN, formând un complex nucleo-proteic numit cromatină. Interacţiunile
dintre ADN şi proteine au un rol structural fundamental în organizarea supramoleculară a
ADN, precum şi un rol funcţional în mecanismele complexe care reglează expresia şi
replicarea genelor. Relaţiile complexe dintre ADN şi proteine nu sunt încă complet elucidate.
CASETA 2.2
Proteinele histonice şi nehistonice
Histonele sunt proteine bazice prezente la toate eucariotele, cu mare afinitate pentru
ADN, fixându-se pe mica incizură şi neutralizând sarcinile acide. Raportul ADN - histone
este egal cu 1. Genele care codifică histone au o structură particulară (fără introni), se
află în mai multe exemplare (peste 20), localizate pe cromosomii 1, 6, 12. Se exprimă în
faza S a ciclului celular, sincron cu replicarea ADN. După numărul şi tipul de aminoacizi
se deosebesc cinci tipuri de histone prezente la toate eucariotele: H1, H2A, H2B, H3 şi
H4. Cu excepţia histonei H1, celelalte tipuri (şi mai ales H3 şi H4) au o structură stabilă,
bine conservată în evoluţie. Acest lucru relevă rolul structural important pe care îl au
aceste proteine în organizarea supramoleculară a ADN şi compactarea lui în nucleu. Ele
intră în alcătuirea nucleosomilor, particule fundamentale din structura fibrelor de
cromatină. Histonele au însă şi roluri funcţionale, fiind implicate în reglarea expresiei
genelor (transcripţie): acetilarea histonelor determină activarea unor gene, iar metilarea
33
lor produce represia genică. Fosforilarea histonei H1 provoacă condensarea fibrelor de
cromatină interfazică în cromosomi şi declanşează mitoza. O dovadă recentă a rolului
funcţional al histonelor este descoperirea histonei H10 (numită şi H5) care lipseşte în
celulele care se divid şi apare în celulele diferenţiate sau celule în faza G 0. Au fost
identificate şi alte variante funcţionale. Astfel histona H2AZ, cu rol important în reglarea
transcripţiei, este o variantă larg răspândită la nivelul cromosomilor, dar neumiform.
CENP-A este o proteină înrudită cu H3 care are rol major în activitate centromerilor.
Proteinele nehistonice sunt proteine acide şi neutre, numeroase, heterogene şi
puţin abundente; o excepţie face grupul proteinelor HMG ("high mobility group"). Unele
proteine nehistonice au un rol structural formând "matricea" cromosomilor dar majoritatea
au roluri funcţionale, intervenind specific în reglarea sau modularea activităţii genelor. Ele
se fixează la ADN în marea incizură laterală. Proteinele HMG participă probabil la
reglarea replicării ADN.
2. CROMATINA
Asocierea obligatorie dintre ADN nuclear şi proteine se numeşte cromatină. În diferite stadii
ale ciclului celular cromatina prezintă diferite grade de condensare şi se prezintă sub două tipuri
morfo-funcţionale distincte: eucromatina şi heterocromatina (tabel 2.2)
13
În laboratoarele cu dotari pentru FISH se folosesc sonde marcate fluorescent pentru X si Y care permit
evaluarea mai precisă a prezentei si numărului cromosomilor sexuali în nucleii interfazici.
36
anumite situsuri de ancorare din structura fibrei de ADN, la un "schelet" sau matrice
14
proteică (nonhistonică15) (figura 2.14), care are o formă identică cu cea a cromosomului
metafazic. Se consideră că fiecare buclă sau domeniu (ce conţine câteva gene) ar putea fi o
unitate funcţională de transcripţie şi replicaţie; buclele au deci atât o semnificaţie structurală
cât şi un rol funcţional important.
Fibra pliată în bucle laterală formează la începutul profazei, printr-o puternică
spiralizare şi condensare (grad compactare 20), cromatida unui cromosom (figura 2.14). Ea
atinge în metafază o grosime de 700 nm, fiind cel mai înalt grad de compactare a fibrei de
bază a cromatinei (30 nm). Fiecare cromatidă a unui cromosom conţine deci o singură
moleculă de ADN, organizată în mai multe structuri succesive şi ierarhizate de "împachetare".
La sfârşitul diviziunii, în telofază, se produce despiralizarea/decondensarea cromosomilor.
Relaţia dintre ADN, fibrele de cromatină şi cromosomi se poate reda sintetic astfel:
Molecula de ADN suferă astfel o compactare de 10.000 de ori şi poate încape facil în
spaţiul mic, de câţiva microni, al nucleului. Acest fenomen favorizează distribuţia corectă a
materialului genetic în diviziune şi asigură funcţionarea ADN.
Înainte de a încheia prezentarea acestor fenomene vom sublinia un alt fapt important.
Buclele fibrei de 300 nm se fixează neregulat de scheletul proteic. Din loc în loc (în regiuni
de ADN în care predomină secvenţe cu p.b. A-T) ele formează mici aglomerări de bucle,
numite cromomere, separate prin zone mai laxe (figura 2.16). Pe măsură ce cromosomul
profazic se condesează cromomerele mici, vecine, se unesc într-o structură mai mare. Aceste
cromomere mari se adună în grămezi şi formează benzi intens condensate şi colorate (benzi
G); ele vor fi separate prin benzi mai puţin condensate şi mai clare (benzi R).
ADN care formează benzile G (sau Q) conţine mai multe puncte de ataşare, strâns apropiate, iar buclele
sunt mai dense, mai compactate; coloranţii (Giemsa, Quinacrină) care au afinitate pentru regiunile SAR
bogate în A-T vor da benzi G. In benzile R densitatea punctelor de ataşare este mai mică, buclele sunt
mai laxe.
Benzile cromosomice reflectă structura internă heterogenă a cromosomului şi
definesc regiuni din genom care au proprietăţi şi funcţii diferite .
3. CROMOSOMII UMANI
14
"Regiunile de ataşare la matrice" (prescurtarea în engleză, SAR) sunt bogate în AT
15
Printre proteinele matricei se află şi topoisomeraza II care are un rol esenţial pentru condensarea
cromosomilor.
37
comportament, tulburări de sexualizare şi reproducere, cancer). Orice medic practician trebuie să
aibă cunoştinţe precise despre metodele de studiu, indicaţiile şi limitele analizei cromosomice
precum şi priceperea de a interpreta corect rezultatele explorărilor citogenetice.
18
Fragmnetele acentrice sunt rezultatul unor rupturi cromosomice spontane sau induse de factori mutageni
39
situsuri fragile. Majoritatea situsurilor fragile sunt considerate markeri normali. Excepţie face
un situs fragil FRAXA situat pe braţul lung al cromosomului X (Xq27), asociat frecvent cu
debilitate mintală (sindromul X fragil). Studii recente sugerează că unele situsuri ar putea avea
un rol în progresia tumorală: rupturile în aceste situsuri produc inactivarea unor gene
supresoare de tumori.
c). Benzile cromosomice, elemente specifice fiecărui cromosom
Prin diferite tratamente (digestie enzimatică, denaturare termică etc) şi/sau
încorporarea unor coloranţi specifici pentru ADN (Giemsa, Quinacrină etc), cromosomii
metafazici apar alcătuiţi dintr-o serie continuă de benzi longitudinale, în care zone intens
colorate (benzi G) alternează regulat cu altele mai slab colorate (benzi R). Fiecare
cromosom are un model caracteristic al poziţiei, succesiunii, mărimii şi intensităţii benzilor,
ce permite identificarea sa precisă (figura 2.19). Acest model este identic în toate celulele
corpului şi la toţi indivizii speciei19. Mărimea benzilor este cuprinsă între 1-10 Mb.
Benzile sunt markeri citologici ai structurii interne heterogene a cromosomilor; ele
reflectă în primul rând gradul de compactare (condensare) a fibrei de cromatină în lungul
cromosomilor; Benzile se corelează în mare măsură şi cu organizarea funcţională a
cromosomilor, deoarece definesc o distribuţie alternativă a eucromatinei (benzi R) şi
heterocromatinei (benzi G), care posedă proprietăţi diferite (tabelul 2.3)
Benzile G şi Q sunt zone din cromosomi bogate în heterocromatină, mai compactate, ce conţin puţine gene
active şi se replică tardiv spre sfârşitul fazei S; ele posedă ADN bogat în A-T (55-60%) şi numeroase
secvenţe repetitive LINES.
Benzile R sunt arii cromosomice ce conţin eucromatină, puţin condensată, cu o mare densitate de gene
structurale, active; ADN lor se replică precoce, la începutul fazei S şi este bogat în perechi de baze G-C
(60%), cu numeroase secvenţe repetitive SINES (în special din familia ALU). De aceea anomaliile
cromosomice care implică benzile R au consecinţe clinice importante.
Benzile C, situate în regiunea centromerică, sunt alcătuite din heterocromatină constitutivă. Aceasta se mai
găseşte pe braţul lung al cromosomului Y, constricţiile secundare şi sateliţii cromosomilor acrocentrici.
Deoarece heterocromatina este lipsită de gene sau genele sunt inactive, modificări structurale în aceste zone
nu produc efecte fenotipice.
se adaugă ser uman sau de viţel (pentru a îmbogăţi conţinutul în proteine şi factori de creştere) şi
fitohemaglutinină (pentru a stimula multiplicarea limfocitelor T). Cu puţin timp înainte de terminarea culturii,
mitozele sunt blocate în metafază cu colchicină, substanţă ce inhibă formarea fusului de diviziune şi trecerea
în anafază. Apoi, mediul este înlocuit cu o soluţie salină hipotonă, care "umflă" celulele şi dispersează
cromosomii; Urmează fixarea celulelor, etalarea lor pe o lama microscopică şi colorarea (cu Giemsa).
Preparatele sunt examinate la microscop, se numără cromosomii (obişnuit 16 metafaze; 32 în cazul suspiciunii
unui mozaic cromosomic) şi se analizează morfologia lor; metafazele selecţionate sunt fotografiate.
Cromosomii, din fotografiile obţinute după mărire, sunt decupaţi, identificaţi şi apoi aranjaţi în cariotip, pe baza
criteriilor morfologice, în perechi de omologi şi grupe. Se analizează atent morfologia şi modelul în benzi a
fiecărui cromosom. Tehnica de analiză cromosomică este o metodă laborioasă, complexă şi costisitoare,
necesitând o pregătire şi o dotare specială. În condiţii obişnuite, un rezultat complet nu poate fi obţinut decât în 1-
2 săptămâni. Există însă şi sisteme de analiză computerizată a metafazelor care furnizează rapid şi corect
cariotipul celulelor analizate; sunt însă scumpe şi necesită un dialog permanent "om -maşină".
(2). Metodele speciale folosesc culturi din alte tipuri celulare: măduvă osoasă;
fibroblaste obţinute prin biopsie de piele; celule fetale recoltate prin amniocenteză sau biopsie
de trofoblast (placentocenteză); ele au dezavantajul prelevării mai dificile şi a unui timp mai
lung de cultură. Există deasemeni variante tehnice ce permit studiul cromosomilor în
prometafază, evidenţierea situsurilor fragile20 sau a sindroamelor cu rupturi cromosomice
(3) Metodele directe (fără cultură) se aplică, în anumite situaţii, ţesuturilor ce se
divid activ: măduvă osoasă în leucemii; tumori solide; vilozităţi coriale, în diagnosticul
prenatal. Aceste metode dau rezultate rapide (3-12 ore) dar numărul metafazelor analizabile
este variabil şi calitatea cromosomilor mediocră. Metodele directe se pot folosi şi pentru
studiul cromosomilor meiotici, mai ales din spermatocite, la bărbat.
b). Tehnici de analiză cromosomică.
Din 1956 şi până în prezent tehnicile de analiză cromosomică au evoluat permanent,
putându-se deosebi schematic patru generaţii de tehnici.
(1) Tehnicile de generaţia I-a (1956). Cromosomii obţinuţi prin metodele prezentate
mai sus şi fără alt tratament sunt uniform coloraţi ("solid staining") şi au puţine repere pentru
identificarea lor precisă (figura 2.20 a). Folosirea actuală a metodelor ce colorează uniform
cromosomii este limtată la diagnosticul aneuploidiilor şi mozaicurilor cromosomice,
investigarea situsurilor fragile, a rupturilor cromosomice şi polimorfismului cromosomic.
(2) Tehnicile de generaţia II-a (1970) sunt tehnici de marcaj cromosomic în benzi a
cromosomilor metafazici. Folosind o serie de tratamente şi/sau coloraţii speciale a ADN se
vizualizează pe cromosomii metafazici o structură specifică de benzi alternative intens
colorate şi puţin colorate. Se evidenţiază astfel 300-400 benzi pentru un set haploid de
cromosomi metafazici. Aceste tehnici permit identificarea precisă a fiecărui cromosom
(figura 2.20 b) şi caracterizarea majorităţii anomaliilor cromosomice (exceptând microdeleţiile).
Marcajul G se obţine prin digestie controlată cu tripsină, urmată de colorarea cu Giemsa. Tehnica
este relativ simplă şi larg folosită; are dezavantajul că nu colorează telomerele cromosomilor (figura
2.21)
Marcajul Q se obţine prin colorarea cromosomilor cu un fluorocrom ce se fixează preferenţial pe
regiunile ADN bogate în AT (ex. Quinacrina, DAPI, Hoechst 33258); benzile Q fluorescente
(observabile în UV) au aceiaşi distribuţie ca şi benzile G. Metoda are dezavantajul că preparatele nu
sunt permanente şi necesită un echipament special de microscopie. Este utilă în special pentru analiza
cromosomului Y.
Marcajul R (de la ”Reverse”) are o dispoziţie inversă benzilor G şi poate fi obţinut prin denaturarea
termică controlată (85º) a preparatelor într-o soluţie salină, înaintea colorării cu Giemsa sau prin
folosirea unor coloranţi specifici pentru regiunile bogate în GC (ex., chromomicina A3); benzile
colorate se numesc benzi R (ele corespund benzilor G sau Q negative). Un subset de benzi R este
reprezentat de marcajul T în care capetele cromosomilor apar intens colorate. Realizează o foarte
bună diferenţiere a benzilor şi telomerelor, dar este laborioasă şi influenţată de o serie de factori ce
trebuie bine cunoscuţi şi standardizaţi. (figura 2.22)
Marcajul C evidenţiază heterocromatina Constitutivă, în special la nivel centromeric; se obţine după
20
Situsurile fragile se evidenţiază în culturi realizate într-un mediu fără ser uman sau tratate special cu
inhibitori ai timidinsintetazei (substanţe antifolice).
41
denaturarea cu o soluţie saturată de hidroxid de bariu, înainte de colorarea cu Giemsa.
Alte metode (NOR, pentru evidenţierea regiunilor organizatoare de nucleoli; studiul replicării, în special
a cromosomilor X, cu ajutorul bromodeoxiuridinei) etc. - sunt tehnici foarte speciale, utilizate doar pentru
caracterizarea unor remanieri cromosomice complexe.
Unele tehnici de marcaj (R şi G) sunt folosite curent pentru analiza morfologiei
cromosomilor, producând setul complet de benzi; alte tehnici (benzi Q, C, T, metodele de
marcaj al replicării cu BrdU, coloraţia NOR,ş.a.) se folosesc în analiză numai în anumite
situaţii, pentru a defini mai bine anumite subseturi de benzi precum şi tipul de aberaţii
structurale ale cromosomilor.
(3) Tehnicile de generaţia III-a (1977) sunt tehnici de marcaj de înaltă rezoluţie care
studiază cromosomii în primele faze ale diviziunii, când ei sunt mai puţin condensaţi. Fiecare
bandă din cromosomii metafazici poate fi astfel subdivizată în mai multe sub benzi (figura
2.23). Se pot identifica 550 sau 850 de benzi, corespunzător prometafazei sau profazei.
Fiecare bandă corespunde probabil la 20-30 de gene, aceasta fiind limita maximă de rezoluţie
în analiza citogenetică convenţională. Aceste tehnici permit evidenţierea unor modificări mici
(de ex. microdeleţii) din structura cromosomilor.
Marcajul de înaltă rezoluţie se obţine prin folosirea tehnicilor de marcaj G sau R pentru
procesarea cromosomilor aflaţi în primele faze ale diviziunii (prometafază, profază). Aceasta
necesită blocarea sintezei de ADN, pentru sincronizarea tuturor celulelor şi, apoi, reluarea
sintezei şi oprirea culturii într-un moment în care numeroase celule se află la sfârşitul
profazei. Datorită complexităţii lor tehnicile de înaltă rezoluţie nu sunt proceduri de rutină. Se
folosesc atunci când se suspectează o anomalie structurală fină (de ex. microdeleţia unei părţi
dintr-o bandă cromosomică).
(4) Tehnicile de generaţia IV-a (1991) sunt tehnici de citogenetica moleculară. Ele
folosesc "sonde" de ADN monocatenar, specifice unei anumit cromosom, regiuni
cromosomice (centromer sau telomere) sau unor gene cu localizare cunoscută în anumite
zone. Sondele se fixează (hibridizează) prin complementaritate în aceste situsuri "ţintă".
Pentru a fi evidenţiate după hibridizare, sondele sunt 'marcate' cu un fluorocrom (vizibil la
microscopul cu lumină UV). De aceea metoda se numeşte hibridizare fluorescentă in situ sau,
prescurtat, FISH (de la Fluorescence In Situ Hybridization). (caseta 2.3)
FISH este o metodă performantă (rezoluţia pe cromosomi metafazici este de câteva
megabaze) dar dificilă şi scumpă. Ea are indicaţii precise şi nu se substituie celorlalte tehnici
citogenetice. Se foloseşte pentru: suspiciunea clinică / citogenetică a unei microdeleţii (figura
2.24.a şi b) sau microduplicaţii, a unor translocaţii criptice sau deleţii telomerice; detecţia
sexului genetic sau a unor aneuploidii în nucleii interfazici (FISH “interfazic”; figura 2.24.c),
mai ales din celulele fetale (diagnostic prenatal); caracterizarea unor remanieri complexe sau
a unor cromosomi markeri, mai ales în celulele tumorale; detectarea unor secvenţe de Y la
bărbaţii XX; evaluarea unui mozaicism.
21
În acest caz se folosesc câteva semne: indică "de la...până la"; :: descrie reunire şi rupere. ; separă
?
INTERNET