CURS GENETIC III.

Structura i organizarea adn n celul

ef.L.dr. Oana DARAB 2010

CUPRINS
3.1. ADN - SUBSTRATUL MOLECULAR AL EREDITII 3.1.1. EVOLUIA CONCEPIILOR DESPRE NATURA GENEI 3.1.2. DEMONSTRAREA ROLULUI GENETIC AL ADN 3.2. STRUCTURA ACIDULUI DEOXIRIBONUCLEIC 3.2.1. STRUCTURA PRIMAR A ADN-ului 3.2.2. STRUCTURA SECUNDAR A ADN-ULUI 3.3. PARTICULARITILE STRUCTURII ADN LA EUCARIOTE 3.3.1. CANTITATEA DE ADN 3.3.2. ETEROGENITATEA SECVENELOR NUCLEOTIDICE ALE ADN-ULUI 3.3.3. ASOCIEREA ADN PROTEINE
3.4. STRUCTURA SUPRAMOLECULAR A CROMATINEI I A CROMOSOMILOR

3.1. ADN - SUBSTRATUL MOLECULAR AL EREDITII 3.1.1. EVOLUIA CONCEPIILOR DESPRE NATURA GENEI
ADN este molecula fundamental a vieii. Toate mecanismele prin care se realizeaz structura i funciile celulelor, asamblate n esuturi i organe, precum i rspunsurile lor la aciunea mediului intern sau extern - sunt codificate i reglate de structura uimitor de simpl i elegant a genomului uman. n 1865, MENDEL a formulat ipoteza genei potrivit creia fiecare caracter este detreminat de o pereche de factori ereditari (numii mai trziu gene) i a stabilit legile ereditii.

Iniial, n ipoteza lui MENDEL, gena era o entitate abstract, ipotetic, i natura sa chimic era necunoscut. Ulterior, la nceputul secolului XX, demonstrndu-se rolul cromosomilor n ereditate (SUTTON, BOVERI i mai ales T.H.MORGAN), gena a devenit un element concret, material, un segment dintr-un cromosom care determin un caracter specific, dar natura ei chimic a rmas n continuare necunoscut.

Cea de-a treia nestemat a gndirii umane a fost produs de mintea clugrului Augustin Gregor Johan Mendel, cel care, dup o dinuire de 2000 de ani a ideii anticului filozof grec Anaxagora, potrivit creia caracterele ereditare se transmit direct, prin intermediul fluidelor, de la prini la copii, a demonstrat ca transmiterea ereditar de caractere se realizeaz indirect, prin intermediul unor factori ereditari care, ulterior, aveau s se numeasc gene.

 De la nucleu, la nuclein, i de la aceasta, la acizii nucleici

La 22 de ani, studentul german Fr. Miescher, a decis s mearg n Elveia pentru a-i desvri studiile n Anatomie uman. n anul 1869, i-a propus s analizeze ce substane se formeaz n rnile purulente, n care se ngrmdesc milioane de cellule albe leucocitele. Din nucleele acestor leucocite n descompunere Miesher a reusit s izoleze o substan pe care a denumit-o nuclein. Spre sfritul secolului XI, chimistul german Altmann constata c nucleina este bogat n acid fosforic i o numete acid nucleic. La nceputul secolului XX se stabilete existena a dou categorii de acizi nucleici: timonucleic (extras din timus de vitel) i zimonucleic (extras din drojdia de bere). Ulterior acidul timonucleic va fi numit deoxiribonucleic sau ADN, pe cnd acidul zimonucleic va fi denumit acid ribonucleic sau ARN. Curnd s-a stabilit c n toate celulele se afla att ADN, ct i ARN, dup cum, n anul 1924, s-a dovedit c ADN-ul se afl n coromosomi, purttorii genelor. Numai c, pn la a se dovedi c, de fapt, genele sunt ADN, a trebuit s treaca mult timp i s se nfierbnte multe mini.

La inceputul secolului XX, Paul LEVENE, un emigrant rus n America, lucra n institutul Rockeffeller, din New York. El a descoperit c ADN este o substan macromolecular, adic un polimer natural, alctuit din niruirea unor monomeri numii nucleotide. Fiecare nucleotid este alctuit dintr-o baz azotat, o pentoz deoxiriboza i un radical fosfat.

La nceputul deceniului patru s-a stabilit c n structura cromosomilor exist proteine i acizi nucleici: - ADN - ARN, iar una din aceste componente trebuia s fie substratul chimic al genei. Muli cercettori credeau atunci c: genele sunt formate din proteine, cele mai complexe substane chimice din celule; ADN era considerat o molecul prea simpl pentru nmagazinarea informaiei ereditare i transmiterea ei n succesiunea generaiilor. Existau totui unele argumente "indirecte" care pledau pentru rolul genetic al ADN: localizarea aproape exclusiv a ADN n nucleu i cromosomi, structuri cu rol important n ereditate; cantitatea sa constant i caracteristic speciei, proporional cu numrul cromosomilor (celulele sexuale au jumtate din ADN-ul celulelor somatice); stabilitatea metabolic a moleculei de ADN. n 1944, AVERY et al. au demonstrat experimental c ADN-ul este substratul molecular al ereditii.

Gena (din gr. genos descenden) reprezint unitatea elementar a ereditii. Noiunea de gen a fost propus de W. I. JOHANNSEN (1909) pentru a desemna unitatea ereditar de baz, care este localizat n cromozomi si nu prezint subdiviziuni. Genele sunt redate prin simboluri din 1-5 litere, care desemneaz succint caracterul afectat n limbile latin sau englez. Tipul normal (slbatic) al caracterului respectiv se noteaz cu semnul +. T. H. MORGAN si colaboratorii si (1910), n rezultatul investigaiilor efectuate cu musculiele de oet, au stabilit c genele sunt localizate n cromozomi i sunt particule materiale, aranjate liniar de-a lungul cromozomului, iar fiecare gen ocup un loc bine definit, care se numeste locus. Gena are trei caracteristici de baz: unitate funcional (determin caracteristicile ereditare); unitate mutaional (structura chimic a genei se schimb prin mutaie, ceea ce duce la apariia caracterului nou); unitate de recombinare (n cadrul procesului de crossing-over are loc un schimb de gene corespunztoare ntre cromatidele nesurori ale cromozomilor omologi).

n anul 1941 concepia clasic despre gen s-a completat cu ipoteza o gen o enzim, formulat de G. W. BEADLE si E. L. TATUM. Constatarea, dup anul 1944, a faptului c genele sunt molecule complexe, constituite din acizi nucleici (ADN i ARN la unele virusuri), a determinat schimbarea vechii concepii despre gen. S-a stabilit c gena corespunde unui segment de acid nucleic format dintr-o secven liniar de nucleotizi n care este nscris un mesaj chimic sau informaia ereditar. Dup apariia geneticii moleculare, n anii 50-60, gena este definit drept un segment de ADN sau ARN care conine informaia genetic necesar sintezei unei catene polipeptidice. Gena este alctuit dintr-o secven de codoni care codific succesiunea aminoacizilor ntr-o caten polipeptidic. Conform concepiei o gen o caten polipeptidic, unele proteine sunt sintetizate pe baza informaiei genetice din dou sau mai multe gene.

Conform concepiei moderne: gena constituie unitatea funcional a informaiei ereditare; gena prezint segmentul de ADN (sau ARN viral) format n medie din 1000-1500 de nucleotizi dispusi liniar; n cadrul genei pot avea loc recombinri i mutaii; exist gene structurale i reglatoare; genele structurale codific sinteza proteinelor.

Structura genei bacteriene i a genei eucariote

3.1.2. DEMONSTRAREA ROLULUI GENETIC AL ADN n 1928, microbiologul englez F. GRIFFITH a fcut o observaie remarcabil. El a studiat morfologia i patogenitatea diferitelor tulpini de pneumococus. Unele tulpini aveau o capsul polizaharidic i cultivate pe agar formau colonii "netede", fiind numite S (de la "smooth") iar altele erau necapsulate i formau colonii "rugoase", fiind numite R (de la "rough"). GRIFFITH a observat c oarecii injectai cu pneumococi S au murit iar cei injectai cu tulpina R au supravieuit; deci pneumococii S erau patogeni, producnd septicemie i moarte. Patogenitatea, deteminat de prezena capsulei, se transmite ereditar. n mod surprinztor, un amestec de pneumococi R (nepatogeni) vii i pneumococi S (patogeni) inactivai prin cldur a avut un efect letal. De la animalele moarte s-au izolat pneumococi S vii. Explicaia posibil a acestui fenomen era transformarea tulpinilor de pneumococi R vii n tulpini S vii, sub influena unor componente din structura pneumococilor S omori;

n 1944, AVERY, Mac LEOD, Mc CARTY (de la Rockefeller Institut) au reluat experienele lui GRIFFITH i au demonstrat experimental c ADN-ul este factorul transformant. Autorii au artat c transferul ADN extras de la o tulpin de pneumococi S capsulai, patogeni, la pneumococi R necapsulai, nepatogeni, determin transformarea lor n pneumococi patogeni (R S); mai exact, un segment de ADN-S ce conine gena pentru capsul a fost ncorporat n ADN-ul pneumococilor R. Aceast modificare nu era realizat de proteine sau de alte componente din structura pneumococilor S i era inhibat de ADN-az; odat produs, modificarea se transmite la generaiile urmtoare, fiind deci ereditar. Pe aceast baz s-a presupus c ADN este materialul genetic.

n 1952, HERSHEY i CHASE (Premiul Nobel, 1969) au demonstrat c transferul exclusiv al ADN de la bacteriofagi la Escherichia coli transform aceast bacterie n celule productoare de particule fagice, cu o structur complet, inclusiv capsula proteic. Autorii au marcat proteinele capsulare ale bacteriofagilor cu sulf radioactiv (32S) iar ADN cu fosfor radioactiv (35P); cnd bacteria E. coli a fost infectat cu bacteriofagi "marcai", se observ c numai 35P (deci ADN) ptrunde n celul (32S - proteinele capsulare rmn la exterior). Formarea ulterioar a unor particule fagice noi, complete, demonstreaz clar c ADN era unicul purttor al informaiei ereditare. Introducerea unor segmente de ADN n celule cultivate "in vitro" (transfecie) sau n zigoi / embrioni ("animale transgenice") st la baza ingineriei genetice. Mai mult, ea reprezint principiul de baz al terapiei genice, cea mai extraordinar realizare a medicinei ultimilor ani.

3.2. STRUCTURA ACIDULUI DEOXIRIBONUCLEIC 3.2.1. STRUCTURA PRIMAR A ADN-ului Descoperirea rolului genetic al ADN a concentrat atenia cercettorilor asupra structurii sale, ntruct descifrarea ei reprezent singura cale pentru nelegerea naturii i funciei genei. Una din contribuiile cele mai importante le-a adus Rosalind FRANKLIN (1920-1958) de la Kings College din Londra care printre altele a obinut i imaginile de difracie ce au fundamentat modelul helicoidal al moleculei de AND. Din motive obscure a fost marginalizat, i cum a murit foarte tnr a fost foarte nedreptit de colegiiei. I s-a spus Te Dark Lady of DNA (Doamna din ntuneric al ADNului) (Brenda Maddox). Fotografiile pe care le-a fcut cu privire la difracia razelor X prin moleculele de ADN i care i-au fost luate fr permisiune au ngduit lui WATSON i CRIK s realizeze modelul helicoidal al ADN-ului.

Rosalind Franklin

Astfel, n anul 1953, James WATSON i Francis CRICK au propus un model al moleculei de ADN alctuit din dou catene polinucleotidice, legate complementar prin bazele azotate, nfurate ntr-o elice dubl, rsucit spre dreapta.
James Dewey Watson Francisc Harrzy Compton Crick

Watson i Crick erau fizicieni iar lipsa lor de cunotine chimice (cu care de altfel se ludau) a impresionat, n cursul unei reuniuni tiinifice, negativ pe marele chemist E. CHARGAFF care i-a numit clovni ai tiinei.

Modelul WATSON-CRICK al structurii ADN reprezint, probabil, cea mai mare descoperire a biologiei moderne (Premiul NOBEL, 1962). Acest model, universal valabil n lumea vie, corespunde funciilor materialului genetic, deoarece explic modul n care se stocheaz, se transmite i se exprim informaia ereditar.

Grupul de majuscule ADN este binecunoscutul acronim pentru acidul dezoxiribonucleic. Noiunea de acid dezoxiribonucleic desemneaz una dintre cele mai complexe molecule organice, substan care se gsete n fiecare celul a unei fiine vii i care este esenial pentru identitatea oricrui organism, de la Euglena viridis, micua fiin unicelular aflat la grania dintre plante i animale, la Homo sapiens sapiens, omul contemporan.
ADN este un macropolimer de "deoxiribonucleotide". Lungimea i greutatea sa molecular sunt foarte mari, permind stocarea unei cantiti uriae de informaie. Cantitatea de ADN variaz de la specie la specie (la om g.m.=3,5 x1012 daltoni) dar este constant la indivizii aceleiai specii, precum i n toate celulele somatice (diploide) de la acelai individ.

Dogma Central a geneticii moleculare

DNA

Acid dezoxiribonucleic

Propus de ctre Francis Crick n 1958 pentru a descrie fluxul informaiei genetice n celul. Informaia depozitat n ADN este transferat ARN-ului, care mai departe o transfer proteinelor. Dogma Central propus de Crick a suferit numeroase revizii n ultimii 47 de ani.

RNA

Acid ribonucleic

Protein

Dogma Central Revizuit

Recombinarea= rearanjarea materialului genetic Mutaii/Reparare = lezarea ADN cu alterarea informaiei genetice/ corectarea leziunilor ADN Revers-transcrierea = transferul informaiei genetice de la ARN la ADN

Recombination Mutation/Repair

Structura primar a ADN-ului este reprezentat de succesiunea Compus chimic ADN ARN nucleotidelor pe catena de ADN Baze azotate (informaia genetic codificat). a) Purinice Adeninia, Adeninia, Fiecare nucleotid este constituit Guanina Guanina din trei elemente: b) Pirimidinice Citozina, Citozina, Uracil baz azotat (N), Timina un rest de deoxiriboz (dR), Pentoza 2-Dezoxiriboza Riboza i un rest de acid ortofosforic (P). Structura fiecrei catene de ADN Acid fosforic Radical Radical poate fi scris prescurtat n urmtoarea form: (P-dR-N)n
Compozitia chimica a acizilor nucleici

Deoxiriboz este o pentoz, o glucid cu cinci atomi de carbon. n molecula de ADN este prezent forma furanozic a monozaharidei. Bazele azotate sunt heterocicluri cu atomi de azot. n structura ADN-ului pot fi identificate dou tipuri de baze azotate: purinice - conin dou heterocicluri cu azot, fiind reprezentate de adenin (A) i guanin (G). pirimidinice - conin un singur heterociclu cu azot, fiind reprezentate de timin (T) i citozin (C).

Prin urmare, fiecare caten de ADN este: liniar, neramificat, polarizat electric i constituit din succesiunea nentrerupt a nucleotidelor.

Structura primar i legturile de hidrogen dintre catenele moleculei de ADN A - Adenin; G - Guanin; C - Citozin; T - Timin; P - Acid ortofosforic; dR - Deoxiriboz; ------ legturi de hidrogen; legturi covalente

3.2.2. STRUCTURA SECUNDAR A ADN-ULUI Structura secundar a moleculei de ADN este reprezentat de modul de asociere al celor dou catene (structura bicatenar).

Replicarea dublui helix ADN

Dublul helix al ADN ( structura secundar)

1. Stabilitatea ADNdc este asigurat de: - interaciunile hidrofobe dintre bazele azotate suprapuse (stivuite) de pe aceeai caten - legturile de hidrogen ce se stabilesc ntre bazele azotate de pe o caten i cele complementare de pe cealalt caten.

2. Cele dou catene de ADN sunt antiparalele.

ADN dublu helix (structura secundara)

3. G-C are 3 legturi de H. A-T are 2 legturi de H. Cele dou catene sunt complementare Nr. A = Nr. T Nr. G = Nr. C

4.

5.

Dublu helix ADN (structura secundar)

6. Exist mai multe confomaii ale ADN; Conformaia B: descris de Watson i Crick are orientare dreapt, pasul dublu helixului este 34 (3,4nm), diametrul de 2nm, iar nr. perechi baze per tur este 10; cea mai rspndit. Conformaia A: dublu helix de dreapta dar mai compact, pasul elicei este de 2,8nm, nr. perechi baze per tur este 11. Conformaia Z: dublu helix de stinga, pasul elicei 4,56nm i nr. perechi baze per tur este 12.

Analizele chimice ale ADN-ului de la specii diferite au evideniat c raportul A+T/G+C este diferit de la o specie la alta, dar caracteristic speciei respective. La om acest raport este de 1,7, dar suma bazelor purinice (A+G) este ntotdeauna egal cu suma bazelor pirimidinice (T+C) iar rapoartele A/T i G/C sunt unitare, indiferent de specie. Pe baza acestor date, WATSON i CRICK au stabilit c cele dou catene sunt ataate una la cealalt prin puni de hidrogen (legturi electrostatice slabe) formate ntre bazele azotate ale celor dou catene. ntotdeauna, adenina se fixeaz la timin prin dou legturi de hidrogen, iar citozina la guanin prin trei puni de hidrogen - legea complementaritii bazelor. A=T GC Datorit acestor particulariti de asociere, cele dou catene sunt complementare i codeterminate, n sensul c prezena unei baze azotate pe una din catene impune prezena pe cealalt caten a bazei azotate complementare.

Legturile de hidrogen se pot rupe experimental prin nclzire sau sub aciunea unor baze sau acizi, proces numit denaturare. Prin refacerea lent a condiiilor fiziologice, punile de hidrogen se refac, proces numit renaturare. Din motive de ordin steric, cele dou catene sunt antiparalele. De aceea, ele vor avea o polarizare invers, una fiind polarizat 5'3', n timp ce cealalt este polarizat 3'5'. Cele dou catene sunt nfurate plectonemic, formnd o dubl spiral ("elicea vieii"). n celulele umane, ADN-ul reprezint o spiralizare dextrogir (de la dreapta la stnga). Datele de microscopie electronic au artat c spirala moleculei de ADN are un diametru de 20 (20 x 10-10 m) pasul spiralei fiind de 34 . Pe parcursul unui pas (distana dintre dou elemente identice alturate, msurat n direcia n care se repet elementele) se gsesc niruite 10 nucleotide. Fiecare nucleotid are circa 3,4 i este rotit cu 36 n raport cu nucleotidele adiacente. Organizarea moleculei de ADN este de aa natur nct cele dou axe fosfoglucidice se gsesc la exterior, n timp ce la mijloc sunt localizate bazele azotate ataate prin puni de hidrogen.

La nivelul dublei spirale a fost posibil identificarea a dou anuri sau incizuri, cu dimensiuni diferite. n anul mare (22 ) se fixeaz factorii proteici ce regleaz transcripia i translaia, iar n anul mic (12 ) se fixeaz histonele, proteine bazice, implicate n stabilizarea moleculei de ADN, prin structurare supramolecular. Dogma central a geneticii postuleaz urmtoarea transformare: ADN ARN proteine sau O GEN UN ARN MESAGER O PROTEIN.

Exist 3 procese eseniale n manipularea informaiei genetice pentru orice celul vie: 1. Replicarea ADN - reprezint procesul prin care cantitatea de ADN dintr-o celul se dubleaz i se regsete practic neschimbat n fiecare dintre celulele fiice. 2.Transcripia - reprezint procesul prin care o parte din informaia de pe ADN este copiat pe ARN (o genun ARN mesager). 3.Translaia reprezint procesul prin care informaia din ARN este folosit la sinteza unei proteine n ribozomi.

Replicarea ADN-ului

3.3. PARTICULARITILE STRUCTURII ADN LA EUCARIOTE Eucariotele sunt organisme superioare, cu o organizare celular complex, datorit prezenei nucleului i organitelor citoplamsatice (mitocondrii, reticul endoplasmatic, aparat Golgi, centrioli) care lipsesc la procariote. La eucariote structura ADN-ului prezint urmtoarele particulariti: - cantitate mare, - heterogenitatea secvenelor nucleotidice, - asocierea obligatorie cu proteine i organizarea supramolecular n fibre de cromatin i cromosomi.

3.3.1. CANTITATEA DE ADN La eucariote cantitatea de ADN din celul este foarte mare. De exemplu, genomul uman diploid conine aproximativ 6 miliarde p.b. (p.b. -perechi de baze), de peste 10 ori mai mult dect ar fi necesar pentru codificarea tuturor proteinelor. ADN-ul nuclear este fragmentat n mai multe molecule, care sunt asociate cu diferite tipuri de proteine i, prin organizare supramolecular, formeaz cromatidele cromosomilor. Acetia pot conine o singur cromatid (cromosom monocromatidian) sau dou cromatide surori identice (cromosom bicromatidian). Numrul de cromosomi constituie o caracteristic de specie. La om celulele somatice conin 46 de cromosomi, numr ce se menine constant indiferent de etapa cilcului celular.

3.3.2. ETEROGENITATEA SECVENELOR NUCLEOTIDICE ALE ADNULUI Eterogenitatea secvenelor nucleotidice ale ADN-ului este reflectat de prezena n genomul uman a mai multor "clase" de ADN, diferite prin dimensiunea i numrul de repetiii ale secvenelor nucleotidice. Studiile de cinetic a renaturrii ADN-ului au evideniat mai multe tipuri de ADN, diferite prin numrul de repetiii ale secvenelor de ADN: ADN nerepetitiv i secvene de ADN repetitiv. ADN-ul nerepetitiv - reprezint cea mai mare parte din genom (40%) i este alctuit din secvene unice per genom sau repetate n numr foarte mic de exemplare (familii multigenice). ADN-ul nerepetitv este localizat cel mai frecvent n regiunile cromosomice active transcripional, mai puin condensate, care formeaz eucromatina identificat prin studiile de microscopie optic. Totui, doar o mic parte (5-10%) din ADN-ul nerepetitiv alctuiete regiunile codante ale genelor (exonii). Aceste secvene au dimensiuni mai mari de 25 kb i sunt transcrise de ARN polimeraza II. Restul ADNului nerepetitiv este necodant i are funcii nc necunoscute, fiind localizat n interiorul genelor (introni) sau n regiunile intergenice. Secvenele repetitive formeaz aproximativ 50% din genom i sunt bogate n perechi de baze AT. Ele sunt mprite n 5 clase:

1. Secvenele repetitive derivate din transposoni reprezint circa 45% din secvenele repetitive, sunt alctuite din secvene scurte, de 300-1000 pb (rar mai mari), repetate de zeci sau sute de mii de ori i dispersate n genom. Majoritatea acestor secvene sunt transcrise n ARNm, dar nu sunt translate. 2. Pseudogenele sunt copii nefuncionale ale unor gene, fragmente genice sau a unor gene trunchiate, care au potenial de reactivare. Un exemplu l constituie, pseudogenele din familia genelor i globinelor, care uneori, n situaii patologice (hemoglobinopatii) se reactiveaz. 3. Secvenele repetitive simple reprezint 3% din genom, sunt alctuite din secvene foarte scurte (2-500 pb) repetate n tandem de milioane de ori. Ele nu sunt transcrise i formeaz unele fracii ale ADN-ului satelit. Unele secvene de acest tip ADN sunt aglomerate n regiunile cromosomice bogate n heterocromatina constitutiv (centromer, telomere, constricii secundare) i au un rol structural. Alte secvene, cu lungime de 14-500 pb, sunt repetate n tandem, fiind dispersate n toi cromosomii la nivelul telomerelor i peritelomeric, cu excepia cromosomilor X i Y. Aceste secvene constituie minisateliii hipervariabili. 4. Duplicaiile segmentare au rezultat prin duplicaia unor secvene genice i transferul lor sub form de blocuri de 1 - 200 kb n diferite zone din genom pe acelai cromosom sau pe un alt cromosom. 5. Secvenele repetitive n tandem sunt situate centromeric, paracentromeric, telomeric i pe braele scurte ale cromosomilor acrocentrici.

3.3.3. ASOCIEREA ADN - PROTEINE n nucleu, ADN-ul eucariotelor este asociat cu proteine histonice, proteine nehistonice i mici cantiti de ARN, constituind fibrele de cromatin. Histonele sunt proteine cu caracter bazic, prezente la toate organismele eucariote. Acestea au mare afinitate pentru ADN i se fixeaz specific la nivelul micii incizuri a dublei spirale de ADN. Caracterul bazic al histonelor contribuie la neutralizarea sarcinilor acide ale ADN-ului. Exist cinci tipuri de histone prezente la toate eucariotele: H1, H2A, H2B, H3 i H4. Histonele particip la organizarea supramolecular a ADN-ului, asigurnd compactarea materialului genetic n nucleu. Ele sunt componente de baz ale nucleosomilor. Histonele intervin i n reglarea expresiei genelor. Prin acetilarea histonelor sunt activate unele gene, n timp ce metilarea lor produce represie genic. Fosforilarea histonei H1 provoac condensarea fibrelor de cromatin interfazic n cromosomi i declaneaz mitoza. Proteinele nehistonice au caracter acid sau neutru. Ele sunt numeroase, heterogene, dar cantitatea prezent n nucleu este mic. Unele proteine nehistonice au un rol structural, formnd "matricea" cromosomilor, dar majoritatea au roluri funcionale, intervenind specific n reglarea sau modularea activitii genelor. Ele se fixeaz la ADN n marea incizur lateral.

3.4. STRUCTURA SUPRAMOLECULAR A CROMATINEI I A CROMOSOMILOR AND ul nuclear este localizat n cromatin i cromosomi. Asocierea obligatorie dintre ADN nuclear i proteine se numete cromatin. n diferite stadii ale ciclului celular cromatina prezint diferite grade de condensare i se prezint sub dou tipuri morfo-funcionale distincte: eucromatina i heterocromatina (constitutiv i facultativ).
Caracteristicile eucromatinei i heterocromatinei
Caracteristici Condensare Colorare Replicare n faza S Activitate genetic Compoziie chimic EUCROMATINA Fin dispersat Slab Precoce Activ Predomin p.b. C - G; ADN HETEROCROMATINA Puternic condensat (cromocentri) Intens Tardiv Inactiv Predomin p.b. A - T; ADN repetitiv; proteine histonice

nerepetitiv; proteine nehistonice

Eucromatina - are mai mult ADN nerepetitiv, n care predomin perechile de baze G-C, i proteine nehistonice; - este puin condensat i reprezint partea activ genetic (transcripional) a cromatinei; - se replic precoce la nceputul fazei S. Alctuiete benzile R pozitive din cromosomii cu marcaj n benzi.
Eucromatin

Heterocromatin

Nucleu celular cu hetero i eucromatin

Heterocromatina - are mai mult ADN repetitiv (n care predomin p.b. A-T) i histone - este foarte compactat (condensat sub form de cromocentri), inactiv genetic, cu replicare tardiv - stabilizeaz centromerul i telomerele cromosomului - intervine n desfurarea meiozei (n sinapsa cromosomilor omologi) i, probabil, n diferenierea celular. - este de dou feluri: constitutiv i facultativ.

Primul nivel de organizare supramolecular a ADN este filamentul cu nucleosomi, cu diametrul de 10 nanometri (nm). Nucleosomul este alctuit dintr-un complex de ADN i histone .

Cromatide surori

80 Mb de 80 Mb de ADN ADN
II

Centromer

Dublu helix 2 nm

Fiecare nucleosom conine un miez proteic, alctuit din 8 molecule de histone, cte dou molecule din clasele H2A, H2B, H3 i H4. n jurul acestui miez, o secven de ADN, alctuit din 146 pb se spiralizeaz, realiznd o tur i trei sferturi. Doi nucleosomi nvecinai sunt conectai printr-un segment de ADN liber, de circa 50-60 pb. Fibra cu nucleosomi are un diametru de 11 nm. Aceast spiralizare asigur o mpachetare a ADN-ului de circa 10 ori.

Fibre de cromatin pliate n bucle laterale (75 kb) 300 nm 30 nm Fibr de cromatin

Zon inter-nucleosomal

10 nm Filament cu nucleosomi

Modalitatea de organizare supramolecular a ADN-ului

Nivelele de organizare a cromatidelor(de la ADN la cromozom)

Urmtorul nivel de organizare a materialului genetic apare prin spiralizarea filamentului cu nucleosomi, rezultnd solenoidul. Fiecare pas al spiralei solenoidului conine 6 nucleosomi.

Diametrul solenoidului este de circa de 30 nm. Prin aceast nou spiralizare se asigur o compactare de 5 ori a fibrei cu nucleosomi. Al treilea nivel de organizare rezult prin plierea fibrei de cromatin n bucle laterale, care constituie domenii cromosomice cu autonomie funcional (de replicare i transcripie). Buclele au lungime care variaz n domeniul 10-90 kb. Stabilizarea structurii este asigurat de un "schelet", format din proteine acide (nehistonice) pe care se fixeaz bazele buclelor laterale de cromatin. Aceste puncte de fixare sunt specifice, constituind baza dispoziiei eucromatinei i heterocromatinei. Morfologia acestui schelet proteic este identic cu cea a cromosomului metafazic.
Relaia dintre ADN, fibrele de cromatin i cromosomi se poate reda sintetic astfel: ADN FILAMENT F I B R A F I B R A CROMATIDA CU DE PLIAT UNUI NUCLEOSOMI CROMATIN N BUCLE CROMOSOM ___________________________________________ ______________ INTERFAZA DIVIZIUNE

Morfologia cromosomilor umani - cel mai uor de analizat n metafaz, cnd cromosomii ajung la condensarea maxim, sunt bine individualizai i se gsesc n acelai plan la nivelul plcii ecuatoriale. Cromosomul metafazic este alctuit din dou elemente longitudinale, numite cromatide, identice ca mrime i form ("cromatide surori") unite ntr-o regiune mai slab colorat numit centromer. Orice cromosom are trei elemente caracteristice: centromerul, telomerele i secvenele cu replicare autonom, fr de care cromosomul respectiv nu poate funciona normal. n zona centromerului poate fi evideniat o ngustare cromosomic numit constricie primar. Cromatide

Metacentric Submetacentric Acrocentric Morfologia diferitelor tipuri de cromosomi

Cromosomii genomului uman

La sfritul profazei, n regiunea centromeric a fiecrei cromatide este sintetizat o structur proteic specializat numit kinetocor. De la nivelul fiecrui kinetocor emerg o serie de microtubuli kinetocorici -proteine contractile - prin intermediul crora cromosomul se fixeaz pe microtubulii polari ce fac parte din fusul de diviziune. n cursul anafazei, contracia microtubulilor kinetocorici asigur traciunea cromosomilor monocromatidieni spre polii fusului de diviziune. Prile terminale ale cromatidelor sunt denumite telomere. Telomerele conin ADN i proteine i au trei finiii eseniale: 1. menin integritatea cromosomilor - n absena proteinelor ce nconjur secvenele telomerice, capetele cromosomice sunt foarte "lipicioase" i au tendina de a se ataa la alte secvene cromosomice, determinnd rearanjamente cromosomice (translocaii complexe); 2. intervin n replicarea secvenelor de ADN terminal - n absena telomerelor ADN-ul nu se replic, fiind blocat ciclul celular 3. contribuie la ataarea cromosomilor la membrana nuclear n cursul interfazei

Unii cromosomi au elemente morfologice particulare, cum sunt: Constriciile secundare - regiuni cromosomice relativ slab condensate i care, implicit, se coloreaz mai slab. - sunt localizate pericentromeric, pe braul lung al unor cromosomi, precum cromosomii 1, 9 i 16. Sateliii - sunt mici mase de heterocromatina localizate n continuarea braelor scurte ale cromosomilor acrocentrici, cu excepia cromosomului Y. La nivelul sateliilor sunt localizate copii multiple ale unor gene ce codific ARN ribosomal, fiind numite i regiuni organizatoare ale nucleolilor (NOR). Situsurile fragile - reprezint regiuni cromosomice la nivelul crora au fost identificate cu o frecven crescut rupturi cromosomice. Aceste situsuri pot fi evideniate prin tratamente speciale (folosirea unui mediu de cultur srac n elemente eseniale sau a unor substane care modific replicarea ADN-ului etc.) i uneori pot fi asociate cu boli specifice (de exemplu situsul FRAXA de pe cromosomul X este asociat cu o form de retard mental, caracteristic sindromului X fragil).

Benzile cromosomice, elemente specifice fiecrui cromosom

Prin diferite tratamente (digestie enzimatic, denaturare termic etc) i/sau ncorporarea unor colorani specifici pentru ADN (Giemsa, Quinacrin etc), cromosomii metafazici apar alctuii dintr-o serie continu de benzi longitudinale, n care zone intens colorate (benzi G) alterneaz regulat cu altele mai slab colorate (benzi R). Fiecare cromosom are un model caracteristic al poziiei, succesiunii, mrimii i intensitii benzilor, ce permite identificarea sa precis. Benzile sunt markeri citologici ai structurii interne heterogene a cromosomilor; ele reflect n primul rnd gradul de compactare (condensare) a fibrei de cromatin n lungul cromosomilor; Benzile se coreleaz n mare msur i cu organizarea funcional a cromosomilor, deoarece definesc o distribuie alternativ a eucromatinei (benzi R) i heterocromatinei (benzi G), care posed proprieti diferite.

Tabelul 2.3 Caracteristicile benzilor comosomice (modificat dup Miller O.J., 1996)

Caracteristici
Localizare Tip de cromatin Tip secvene ADN

Benzi - R
Brae cromosomice Eucromatin Unice, unele repetitive

Benzi - Q sau G
Brae cromosomice Heterocromatin Repetitive, unele unice

Benzi - C
Centromere, Yq Heterocromatin nalt repetitive - ADN satelit

Compotiia bazelor Secvene repetitive Replicare Transcripie Densitate gene

Bogate n GC SINEs Precoce Intens Numeroase

Bogate n AT LINEs La mijloc sau sfrit S Redus Puine

Bogate n AT, unele n GC ADN satelit Tardiv Absent Absente

Insule bogate n
CpG Tip de gene Gene comune Gene specific-tisulare Absente