Sunteți pe pagina 1din 49

CAPITOLUL 3

BAZELE MOLECULARE ALE EREDITII


Moto:
"Genetica molecular a luat natere cnd s-a recunoscut c
gena este subdivizibil"
Salvador Luria
"Structura ADN trebuie neleas n raport cu toate funciile
sale, aa cum nelegerea funciei necesit o cunoatere a
structurii. Fiecare funcie trebuie descompus, apoi
reconstituit n detaliile sale moleculare i, n final, orientat
n arhitectura i economia celular"
A. Kornberg

Progresele nregistrate n genetica clasic au ridicat, ulterior, numeroase


probleme legate de natura biochimic a materialului genetic, respectiv a genelor.
Identificarea i studierea aprofundat a materialului genetic ridicau
numeroase probleme, de aceea nu au putut fi rezolvate dect prin cercetri
interdisciplinare de genetic, biochimie, medicin, fiziologie, fizic, matematic
i altele. Aceste cercetri constituie realizrile cele mai importante ale tiinei
contemporane i au pus bazele geneticii moleculare, care studiaz ereditatea i
variabilitatea organismelor la nivel molecular.
Complexitatea structurilor macromoleculare, interaciunile de ordin
informaional dintre acizii nucleici i proteine, multitudinea tipurilor de proteine
ce alctuiesc organismele, au generat structuri supramoleculare care asigur
existena, variabilitatea i continuitatea materiei vii.
n urm cu trei decenii nimeni nu i-ar fi nchipuit c oamenii vor
cunoate structura genelor i modul lor de exprimare ntr-un sistem celular. ntr-o
perioad scurt de timp s-a demonstrat c moleculele de acid dezoxiribonucleic i
acid ribonucleic, att la organismele inferioare ct i la cele superioare, conin n
mod codificat informaia genetic pentru sinteza proteinelor. S-au descifrat
mecanismele intime care stau la baza complicatelor reacii prin care se
sintetizeaz o protein n organism, fenomene ce au fost reproduse apoi i n
laborator, aa cum se va vedea ntr-un alt capitol referitor la ingineria genetic.

3.1. PROTEINE I ACIZI NUCLEICI


Studiile de biochimie privind substratul material al ereditii pretind o
cunoatere temeinic a componentelor chimice din celul, precum i a proceselor
de transformare a acestora.
53

Din multitudinea de componente chimice ce intr n alctuirea celulei,


principalul substrat al materiei vii l constituie proteinele i acizii nucleici.
Proteinele sunt grupate n holoproteine, constituite numai din
aminoacizi i heteroproteine care, pe lng aminoacizi, mai posed o grup
prostetic. Din grupul heteroproteinelor fac parte: fosfoproteinele, glicoproteinele,
cromoproteinele, lipoproteinele i nucleoproteinele. Nucleoproteinele sunt
formate dintr-o protein i o grupare prostetic reprezentat de nuclein.
Se cunosc mai multe tipuri de holoproteine, unele aparinnd grupului
de polipeptide cu greutate molecular mic, denumite protamine, care conin pn
la 90% arginin i sunt lipsite de aminoacizi aromatici i cu sulf. Alte tipuri de
proteine cum ar fi histonele, conin lizin i arginin, aminoacizi aromatici i cu
sulf, leucin, alanin, glicin i acid glutamic. Ambele tipuri de proteine au
caracter bazic i formeaz sruri cu acizii nucleici, de tipul nucleoproteinelor. Un
alt tip de protein care conine i triptofan, l constituie proteina fibrilar care
intr n constituia fibrelor celulare. Proteinele sunt formate din aminoacizi care
sunt legai prin legturi peptidice, alctuind lanuri polipeptidice, avnd o
structur macromolecular. Datorit faptului c proteinele conin n molecula lor
lanuri i catene mari, cu structuri interne diferite, pot aprea n spaiu diferite
configuraii, grupate n mai multe niveluri de organizare: structura primar,
secundar, teriar i cuaternar.
Structura primar a proteinelor se refer la constituia chimic a
fiecrui lan polipeptidic ce intr n alctuirea lor. Specificitatea unei proteine este
dat de numrul lanurilor polipeptidice, iar specificitatea unui lan polipeptidic
este dat de numrul, felul i ordinea aminoacizilor ce l constituie. n lanurile
polipeptidice, particip mai frecvent 20 de tipuri de aminoacizi, dei numrul
aminoacizilor cunoscui se ridic la aproximativ 100. Faptul c fiecare protein se
caracterizeaz printr-o anumit secven de aminoacizi, orice schimbare a acestei
secvene va atrage modificri ale proteinei i ca atare i a fenotipului organismelor
vii.
Structura secundar se refer la orientarea spaial a aminoacizilor,
unii fa de alii n cadrul lanului polipeptidic. Datorit unor fore de atracie
necovalente sau covalente chiar, anumite poriuni din lanul polipeptidic se atrag,
rezultnd o serie de torsionri i orientri n diferite direcii a lanului polipeptidic,
dndu-i o anumit configuraie spaial.
Structura teriar se formeaz cnd ntre aminoacizi ndeprtai ai
aceluiai lan polipeptidic se formeaz legturi chimice, dnd moleculei proteice o
configuraie spaial foarte neregulat.
Structura cuaternar se ntlnete la proteinele formate din mai multe
lanuri polipeptidice, ce por fi identice sau diferite ca structur.
Din cercetrile efectuate de biochimiti se desprinde unul din cele mai
importante principii ale biologiei moleculare: structura secundar, teriar i
cuaternar a unei proteine este determinat de structura primar a lanului
polipeptidic. Acest principiu a fcut posibil cunoaterea modului cum se
realizeaz n celule sinteza enzimelor i a proteinelor.
54

Natura i structura proteinelor determin specificitatea biologic a


organismelor, a fiecrei specii n parte, a organelor i esuturilor. Numrul mare
de izomeri, succesiunea diferit a aminoacizilor din macromoleculele proteice
asigur tocmai individualitatea biochimic i genetic a organismelor.
Acizii nucleici i nucleoproteinele sunt componenii cei mai importani
ai celulelor vegetale i animale. Ei particip la procesele de diviziune celular, de
cretere i difereniere celular i determin specificitatea materiei vii.
Acizii nucleici au fost descoperii n anul 1871 cnd F. Miescher
identific n spermatozoizii petelui somon (Salmo salar) o substan denumit
nuclein, format dintr-o protein i un acid organic ce conine fosfor. Acest acid
organic a fost identificat pentru prima dat de ctre R. Altmann n anul 1899 i l-a
denumit acid nucleic. Biochimistul Kossel a demonstrat c nucleina este format
din doi acizi nucleici: acidul dezoxiribonucleic (ADN) i acidul ribonucleic
(ARN). Acidul dezoxiribonucleic se gsete n cea mai mare parte n nucleul
celulelor vegetale i animale, iar acidul ribonucleic se gsete att n nucleu, ct i
n citoplasm.
Acizii nucleici, respectiv nucleoproteinele, constituie, alturi de alte
proteine, substanele de baz din care este alctuit cromozomul.
Organismele cele mai simple, cum ar fi virusurile, sunt alctuite aproape
numai din nucleoproteine.

3.2. DOVEZI PRIVIND ROLUL GENETIC AL ADN


Descoperirile care au avut loc la nivelul celulei au permis o grupare a
structurilor care dein funcii ereditare. Ne referim la acele structuri care dein o
informaie ereditar i care au continuitate i stabilitate celular. Teoria
cromozomic a ereditii a atribuit cromozomilor i genelor rolul principal n
ereditate, dei nu se cunoteau nc prea multe despre structura chimic a
materialului genetic.
Identificarea materialului genetic constituie imperativul geneticii n
perioada de la mijlocul secolului nostru. Pentru aceasta trebuiau descoperite i
dovedite structurile chimice care dein caracteristicile de baz ale materialului
genetic: de a stoca i transmite informaia ereditar i de a-i menine stabilitatea
cantitativ i calitativ pe parcursul diviziunii celulare.
Cercetrile care s-au fcut la nceputul secolului XX privind proteinele
i enzimele, au demonstrat marea diversitate i complexitate a acestora,
considerndu-se c i genele ar fi tot de natur proteic.
Problema care se pune n aceast etap era dac genele, care ar avea o
natur proteic, pot s determine sinteza altor proteine i respectiv enzime.
Cercetrile au demonstrat c din punct de vedere chimic, un lan polipeptidic nu
poate servi pentru propria sintez, n primul rnd datorit faptului c aminoacizii
nu manifest atracie chimic pentru aminoacizi identici.
55

Prima ipotez a legturii dintre o gen i sinteza unei enzime a fost


elaborat n anul 1908 de ctre medicul englez Garrod care a studiat maladiile
ereditare umane ce afecteaz metabolismul intermediar al fenilalaninei.
Identificarea materialului genetic a fost posibil datorit descoperirii
unor fenomene ereditare de maxim importan:
- transformarea bacterian prin intermediul ADN;
- transformarea la eucariote prin intermediul ADN;
- recombinarea genetic n cursul reproducerii sexuate la bacterii;
- transducia bacterian cu ajutorul virusurilor;
- transmiterea informaiei ereditare de ctre ARN viral.

3.2.1. Transformarea la procariote


n anul 1928, bacteriologul englez F. Griffith a efectuat mai multe
experiene cu pneumococi (Diplococcus pneumoniae), o bacterie care produce la
mamifere boala numit pneumonie. Virulena ei este determinat de existena unei
capsule format din polizaharide care mpiedic fenomenul de fagocitoz.
Coloniile acestor bacterii sunt netede i vscoase, motiv pentru care s-au notat cu
S (engl. smooth = neted). Dup reacia imunologic, determinat de tipul de
polizaharide ce alctuiesc capsula, exist mai multe tipuri de pneumococi S: SI,
SII, SIII etc. Tipul S poate da natere prin mutaii spontane la forme lipsite de
capsul, a cror colonii au suprafaa rugoas, notat cu R (engl. rough = aspru,
rugos), care sunt nevirulente. Pneumococii de tip R pot fi: RI, RII, RIII, n funcie
de tipul S din care provin. F. Griffith a injectat la oareci pneumococi neviruleni
de tip RII mpreun cu pneumococi viruleni de tip SIII, ns acetia din urm
fuseser omori prin cldur. Surprinztor a fost faptul c oarecii au murit de
pneumonie, iar din acetia s-a separat att pneumococi de tip RII ct i
pneumococi de tip SIII. Concluzia care s-a desprins a fost c pneumococii de tip
RII s-au transformat n pneumococi de tip SIII. Mutaia este exclus n acest caz
deoarece tipul RII ar fi trebuit s muteze n tipul SII.
Cauza transformrii pneumococilor necapsulai i neviruleni n
pneumococi capsulai i viruleni a rmas necunoscut pn n anul 1944, cnd
un grup de cercettori americani, O. T. Avery, C. M. Mac Leod i M. Mc. Carty,
au reluat experienele fcute de Griffith cu scopul de a identifica substana
chimic ce induce transformarea. Ei au extras ADN de la pneumococii de tip SIII
i l-au introdus n mediul de cultur al pneumococilor de tip RII. n cultur, pe
lng pneumococii de tip RII au aprut i un numr mic de pneumococi de tip
SIII, dovedindu-se c agentul transformator este ADN de la tipul donor. Aceast
experien poate fi redat sintetic astfel:

RII + ADN de la SIII

in vitro
RII + SIII
24 ore

nsuirea de virulen sau nevirulen este legat de prezena sau absena


capsulei polizaharidice ce nconjoar pneumococul. ADN transformator a indus
56

pneumococilor neviruleni, acapsulai, nsuirea de virulen, de formare a acestei


capsule.
Cu ajutorul ADN s-au realizat transformri genetice i pentru alte
nsuiri la bacterii. Pneumococii sensibili la streptomicin (Sts) au fost
transformai n pneumococi rezisteni la streptomicin (Str) sub influena ADN
extras de la pneumococii rezisteni la acest antibiotic.
Fenomenul de transformare genetic s-a realizat i la alte specii de
bacterii: Bacillus subtilis, Hemophilus influenzae, Escherichia coli etc.
Transformarea genetic este posibil numai dac bacteriile receptoare
prezint o stare de competen, care le permite interaciunea cu un fragment de
ADN exogen, asigurnd nglobarea ireversibil a acestuia. Competena este o
stare fiziologic tranzitorie care variaz mult n cursul diferitelor faze ale ciclului
de multiplicare celular. Celulele bacteriene rmn incompetente dac sunt
cultivate la pH mai mic de 7,4, n prezena unor enzime proteolitice sau la
densiti celulare mici, condiii n care proteina activator, ce induce competena
nu este sintetizat sau este inactivat.
Proteina activator este un polipeptid endogen cu greutate molecular
mic, cationic, bogat n aminoacizi bazici i hidrofobi, sensibil la enzimele
proteolitice i extrem de aderent la toate suprafeele.
Starea de competen presupune o serie de modificri ale peretelui
celular bacterian. Proteina activator determin o serie de alterri de suprafa prin
aciunea murein-hidrolazei, peretele celular devenind mai poros i cu o suprafa
intens electropozitiv, ceea ce favorizeaz legarea fragmentelor de ADN exogen,
ncrcate electronegativ (Zarnea G., 1986).
n ceea ce privete mecanismul de transformare genetic se afirm c
ADN exogen ptrunde n celula bacterian printr-o regiune denumit mezozom.
Cromozomul bacterian este ataat de membrana celular tot n zona
mezozomului. Ptruns n celula bacteriei acceptor, ADN exogen realizeaz o
sinaps, cu o zon cu nucleotide complementare din cromozomul acesteia. n
final, ADN exogen, se integreaz n cromozomul bacteriei receptoare. ADN
exogen este o secven de 900 de nucleotide, n medie, reprezentnd, frecvent, o
singur gen, mai rar dou, trei gene. Integrarea ADN exogen n cromozomul
bacterian, formeaz un ADN heteroduplex, deoarece nu se realizeaz o
complementaritate perfect a nucleotidelor. n replicarea ulterioar a acestui
ADN, vor rezulta dou molecule, una de tipul ADN receptor i cealalt de tip
ADN transformat. (Raicu P., 1997).

3.2.2. Transfecia la procariote


Rolul genetic al ADN a fost pus n eviden i printr-o serie de
experiene cu bacteriofagi (virusuri ce atac i distrug bacteriile). Importante n
acest sens sunt experienele efectuate de A. Hershey i M. Chase (1952) privind
infecia viral, constituind i primele experiene de transfecie, care const n
introducerea de ADN exogen n celule receptor. Ei au folosit bacteriofagii din
57

seria T i n special bacteriofagul T2, unul din cei mai mari bacteriofagi (24002500 ). Bacteriofagul este constituit din cap i coad. Capul conine n interior
ADN iar nveliul (capsida) i coada sunt constituite din proteine (figura 3.1).
Fagii se reproduc numai n celulele bacteriene cu ajutorul aparatului enzimatic al
acestora.
Infecia viral are loc astfel: fagul se prinde cu filamentele codale de
membrana bacteriei. Enzimele fagului dizolv n acest punct membrana bacteriei,
iar ADN fagic este introdus prin coada acestuia n celula bacterian. ntr-un
interval de timp destul de scurt, n interiorul bacteriei se formeaz cteva sute de
bacteriofagi, bacteria fiind distrus (liza bacteriei) i fagii sunt eliberai putnd
infecta alte celule. Faptul c bacteriofagii se reproduc n interiorul bacteriei,
denot c ADN fagic are capacitatea de a se autoreproduce (funcia autocatalitic)
i n acelai timp deine informaia genetic necesar sintezei proteinelor proprii
necesare constituirii capsidei pe baza aminoacizilor liberi din celula bacterian
(funcia heterocatalitic).

Fig. 3.1. Structura fagilor de tip T

Se pune ntrebarea dac, pe lng


ADN fagic, n interiorul bacteriei nu
ptrund i proteinele virale. Pentru a
clarifica acest aspect A. Hershey i M.
Chase au folosit izotopii radioactivi P32 i
S35. Fosforul radioactiv marcheaz
molecula de ADN iar sulful radioactiv
marcheaz proteinele.
S-au cultivat bacterii E. coli pe un
mediu la care s-a adugat fosfor radioactiv
(P32). Dac se infecteaz cultura cu
bacteriofagi T2, vor rezulta bacteriofagi
marcai radioactiv, deoarece ADN fagic
incorporeaz izotopul P35. Cu aceti
bacteriofagi marcai s-au infectat alte
bacterii neradioactive.

ADN fagic radioactiv a ptruns n interiorul bacteriilor, n timp ce


capsida fagilor, nemarcat, a rmas la nivelul peretelui celular bacterian.
Dac bacteriile au fost infectate cu bacteriofagi marcai cu S35, bacteriile
nu devin radioactive pentru c n acest caz izotopul S35 s-a localizat numai la
nivelul proteinei din capsid. i ntr-un caz i n altul capsidele au rmas aderente
de suprafaa bacteriei, putnd fi izolate prin agitare. n interiorul bacteriei
ptrunde numai ADN fagic, care realizeaz procesul de transfecie.
La eucariote, transfecia s-a realizat prin mai multe metode: adiia de
cromozomi metafazici la suspensii celulare, cu ADN exogen purificat sau prin
folosirea unui vector retroviral care poart o anumit gen. Introducerea ADN
exogen realizeaz modificri ale genomului receptor, n urma crora se realizeaz
58

organisme modificate genetic, respectiv plante i animale transgenice sau


nlocuirea unor gene defective cu gene normale, ceea ce reprezint terapia genic.

3.2.3. Transformarea la eucariote


Transformarea genetic la organismele superioare a evideniat rolul
genetic al ADN. Primele experiene de transformare genetic la eucariote au fost
realizate n anul 1959 de J. Benoit, P. Leroy, R. i C. Vendrely. S-a extras ADN
din spermatozoizii i eritrocitele masculilor din rasa de rae Khaki Campbell i s-a
introdus intraperitoneal la bobocii de rae din rasa Pekin. Adulii din rasa Pekin,
rezultai din bobocii tratai au prezentat o serie de modificri morfologice privind
culoarea penajului, a ciocului i picioarelor, a taliei, realizndu-se o nou ras
denumit Blanche-neige.
n anul 1971, C. R. Merril i colab. au transferat gene de la Escherichia
coli n celulele umane. Astfel, gena ce metabolizeaz galactoza la E. coli a fost
preluat de fagul lambda i apoi transferat de acesta n celulele fibroblastice
umane ce proveneau de la un bolnav de galactosemie (nu putea metaboliza
galactoza).
Fenomenul de transformare a fost realizat i la alte organisme
superioare: Drosophila melanogaster, Bombyx mori, Petunia hybrida, Hordeum
vulgare .a.
La noi n ar, P. Raicu i colab. (1963), au introdus prin vacuum
infiltraie ADN de la Triticum durum n boabe de gru de la specia Triticum
aestivum. Plantele rezultate din boabele tratate cu ADN exogen prezentau
modificri privind culoarea i ritmul de cretere.

3.2.4. Materialul genetic al ribovirusurilor


Astzi se consider c virusurile constituie sisteme complexe alctuite
din dou componente: nveliul proteic care nu are rol genetic i ADN sau ARN
ce dein mesajul genetic. nveliul proteic denumit i capsid conine uniti mai
simple denumite capsomere.
Exist dou categorii de virusuri, unele au ca material genetic ADN i
sunt denumite dezoxiribovirusuri, iar altele conin ARN i sunt denumite
ribovirusuri. Ribovirusurile cele mai cunoscute sunt: virusul mozaicului tutunului
(VMT), virusul poliomielitei, al encefalitei, bacteriofagul F2, virusul gripal,
virusul sarcomului Rous (RSV), multe virusuri tumorale etc.
Rolul genetic al ARN a fost pus n eviden la virusul mozaicului
tutunului de H. F. Conrat i R. Williams (SUA, 1955) i A. Gierer i G. Schramm
(Germania, 1956). Virusul mozaicului tutunului conine aproximativ 6% ARNv i
94% proteine. Ei au izolat ARNv de proteina viral i au fcut infecii cu ambele
componente pe frunze sntoase de tutun. S-a constatat c boala denumit
mozaicul sau arsura frunzelor de tutun s-a manifestat numai la frunzele infectate
59

cu ARNv. Se poate afirma c la ribovirusuri, ARNv stocheaz informaia genetic


necesar sintezei proteinelor virale care vor constitui capsida viral.

3.3. ACIZII NUCLEICI I ROLUL LOR GENETIC


3.3.1. Structura molecular a acidului dezoxiribonucleic
(ADN)
Studii detaliate asupra structurii moleculare a acizilor nucleici au fost
efectuate mai ales dup descoperirea rolului genetic, prin experienele de
transformare genetic efectuate la organismele procariote i eucariote.
Structura molecular a acidului dezoxiribonucleic (ADN) a fost
descoperit n anul 1953 de cercettorii J. D. Watson i F. H. C. Crick care au
studiat structura ADN prin difracie n raze X. Cei doi cercettori au studiat ADN
"in vitro" netiindu-se dac structura lui corespunde cu cea existent n materia
vie. Tot n anul 1953, M. Wilkins i colab. au efectuat cercetri asupra ADN "in
vivo" confirmnd structura stabilit de Watson i Crick.
n anul 1962, cei trei cercettori Watson, Crick i Wilkins au fost
distini cu premiul Nobel pentru medicin i biologie, pentru contribuiile aduse
la elucidarea structurii moleculare a materialului purttor al informaiei genetice.
Structura chimic a moleculei de ADN
Molecula de ADN este format din uniti simple denumite nucleotide.
n componena unei nucleotide intr urmtoarele tipuri de molecule: o baz
azotat, un zahar i un radical fosforic (figura 3.2.).

Fig. 3.2. Bazele azotate, zaharurile i radicalul fosforic din acizii nucleici
60

Bazele azotate ce intr n alctuirea de ADN sunt de dou tipuri: baze


purinice i pirimidinice.
Purina este o baz azotat alctuit dintr-un heterociclu ce cuprinde
cinci atomi de C i patru atomi de N, iar pirimidina este o baz ce deriv din
inelul benzenic, cuprinznd patru atomi de C i doi atomi de N.
Bazele azotate purinice care intr n constituia moleculei de ADN sunt
adenina (A) i guanina (G), iar bazele pirimidinice sunt citozina (C) i timina (T).
Zaharul component al dezoxiribonucleotidului se numete dezoxiriboz
( - D - 2 dezoxiribofuranoz), fiind o pentoz.
Radicalul fosforic are trei hidroxili liberi care pot fi esterificai. n cazul
acizilor nucleici se esterific doi hidroxili, deci acizii nucleici sunt fosfodiesteri:
OH
O=P
OH
OH
Radical fosforic

O=P

OH
OR2
OR1
Fosfodiester

Prin unirea unei baze azotate purinice sau pirimidinice cu un zahar


rezult un dezoxiribonucleosid iar prin ataarea la acesta a unui radical fosforic
rezult un dezoxiribonucleotid. Ataarea radicalului fosforic se face n mod
obinuit prin intermediul carbonului 5' al dezoxiribozei, prin pierderea unei
molecule de ap.
Radicalul fosforic al unui nucleotid, prin gruprile acide libere, poate s
se lege fie cu ali radicali fosforici, fie cu alte nucleotide prin carbonul 3' al
dezoxiribonucleotidului. Dac gruprile libere ale radicalului fosforic se leag de
ali radicali fosforici, dezoxiribonucleotidele pot apare sub form de monofosfat,
difosfat sau trifosfat, purtnd urmtoarele denumiri: adenozin 5'-fosfat (AMP),
guanozin 5'-fosfat (GMP), citidin 5'-fosfat (CMP), timidin 5'-fosfat (TMP), ADP,
GDP, CDP, TDP, ATP, GTP, CTP, TTP.
Cnd nucleotidele (dezoxiribonucleotidele) se leag unele de altele,
aceast legtur se realizeaz astfel: un nucleotid se leag de nucleotidul vecin
inferior prin C 3', iar de nucleotidul vecin superior prin C 5'. Se realizeaz un lan
polidezoxiribonucleic, cu o form de zig-zag, ce constituie structura primar sau
monocatenar a moleculei de ADN.
La majoritatea organismelor molecula de ADN este constituit din dou
lanuri (catene) polinucleotidice complementare, aceasta fiind structura secundar
a ADN stabilit de ctre J. D. Watson i F. H. C. Crick. Una din premisele
importante pentru stabilirea structurii secundare a ADN a fost deducerea
experimental a regulii lui E. Chargaff (1951), conform creia pot fi definite
urmtoarele reguli cantitative: A+G = T+C; A+C = T+G; A = T i C = G sau
exprimat altfel, A/T = G/C = 1. Aceste relaii dintre nucleotide a dus la concluzia
c ADN este alctuit din 2 catene. Rsucirile pe care le sufer o caten sau
61

molecula bicatenar alctuiesc structura teriar iar interaciunea dintre dou sau
mai multe molecule bicatenare alctuiesc structura cuaternar a acizilor nucleici.
Watson i Crick au stabilit c macromolecula de ADN este alctuit din
dou catene polinucleotidice, paralele, nfurate elicoidal n jurul unui ax comun
imaginar, o caten avnd un sens ascendent (3' 5') iar cealalt un sens
descendent (5' 3').
Distana dintre dou nucleotide succesive este de 3,4 iar pasul elicei
este de 34 , ceea ce corespunde la 10 nucleotide. Diametrul macromoleculei de
ADN este de 20 (figura 3.3.).
Molecula
de
ADN
are
dimensiuni foarte mari fiind cea
mai mare molecul biologic, cu o
mas molecular ce poate ajunge la
12-16 x 106 daltoni (1 dalton =
1/12 din masa atomului de C).
Cele dou catene din molecula
de ADN se leag ntre ele prin
puni de hidrogen ce se realizeaz
ntre o baz azotat purinic de pe
un lan i o baz azotat
pirimidinic de pe cellalt lan.
Prin urmare, n macromolecula
de ADN exist urmtoarele tipuri
de legturi: adenin-timin (A-T),
timin-adenin (T-A), guanincitozin (G-C) i citozin-guanin
Fig. 3.3. Modelul structurii bicatenare a
(C-G).
moleculei de ADN
Cele dou catene polinucleotidice din molecula de ADN sunt
complementare, n sensul c ordinea nucleotidelor de pe o caten determin
ordinea nucleotidelor de pe cealalt caten. Legturile de hidrogen dintre bazele
azotate, duble, ntre adenin i timin (A = T) i triple ntre guanin i citozin
(G C), dei sunt legturi slabe, sunt destul de numeroase de-a lungul
macromoleculei de ADN pentru a-i asigura stabilitatea i coeziunea. Legturile
chimice slabe, cum sunt cele de hidrogen, sunt eficiente numai n cazul
moleculelor complementare, cum este ADN i anume cnd o protuberan a unei
molecule intr ntr-o cavitate a altei molecule.
Luate separat, moleculele pirimidinice sunt mai mici dect cele purinice
ns cuplurile purin-pirimidin sunt de aceeai dimensiune, conferind
macromoleculei de ADN regularitate i stabilitate. Macromolecula de ADN este
stabil la temperaturile fiziologice, datorit numrului mare de legturi chimice i
faptului c moleculele de baze azotate se gsesc n interiorul moleculei contactul
lor cu apa fiind limitat.
62

3.3.2. Alte tipuri de ADN


Arhitectura molecular a ADN stabilit de Watson i Crick a fost
confirmat printr-un mare numr de msurtori fizice. Modelul propus de cei doi
autori presupune mperecherea A-T, C-G i o rsucire a celor dou catene n
sensul acelor de ceasornic, deci o dubl elice de dreapta (dextrors) (ADN - D).
Cercetrile recente bazate pe perfecionarea metodelor de analiz
(difracia n raze X) i a celor de sintez "in vitro" a unor fragmente scurte de
ADN, au dus la descoperirea mai multor tipuri conformaionale de ADN,
determinate de mperecheri "nelegitime" dintre bazele azotate (C-C, A-G),
nlocuirea bazelor azotate cu analogi ai acestora sau schimbarea modului de
rsucire a dublei elice. Tipurile de ADN ce au la baz dubla elice de dreapta, dar
se deosebesc prin unele proprieti fizice au fost notate cu A, B, C i D, iar tipul
de ADN ce posed dou catene cu rsucire spre stnga s-a notat cu Z.
ADN de tip A se apropie mult de structura ADN originar, bazele
azotate avnd ns o nclinaie ntr-un unghi de 20 fa de axul moleculei, ceea ce
determin modificarea pasului elicei (2,8 n loc de 3,4 ) i a numrului de
baze pe tur de elice (11 baze n loc 10).
ADN de tip B este aproape identic cu modelul originar. Cea mai mare
parte din ADN celular este de tipul B.
ADN de tip C este tot o dubl elice de dreapta n care forele de
"mperechere" a bazelor azotate sunt mult mai slabe, ceea ce modific
conformaia moleculei de ADN n lungime. Este ntlnit n unele genomuri
virale.
ADN de tip D mai puin cunoscut, este o dubl elice dextrors cu un
unghi mare de rsucire (45).
ADN-Z a fost descris de Rich i Itakura n 1980 (Zarnea, G., 1986).
Acest ADN posed dou catene care afecteaz o rsucire elicoidal spre stnga,
datorit att unor legturi ntmpltoare ntre G-C, ct unei frecvene mai mari n
molecul a acestui cuplu de baze.
Diferenele dintre ADN-B i ADN- Z nu sunt fixe, fiind posibil
transformarea reversibil a celor dou tipuri.
Forma Z a ADN bicatenar a fost descris la un numr mic de specii: n
cromozomii gigantici de la Drosophila melanogaster, Chironomidae i n
cromozomii umani.
Analizndu-se fragmente de ADN s-a putut constata c ntr-un ADN-Z
pot exista scurte fragmente de ADN-B, diferenele dintre fragmente fiind uor de
depistat prin mijloace adecvate, de nalt rezoluie, datorit modificrii pasului
elicei, nclinrii bazelor azotate i a ordinii de succesiune a acestora. Aceasta face
posibil recunoaterea acestor zone de ctre sistemele enzimatice implicate n
reglajul activitii genelor: schimbarea direciei de rsucire a ADN la nceputul
unei gene ar determina ncetarea activitii genei respective, controlul activitii
genelor fiind foarte riguros.
63

Exist i ipoteza c n aceste zone de tranziie se pot ataa cu o mai mare


frecven substanele mutagene i cancerigene, fapt ce ar putea explica baza
molecular a mutagenezei cu o frecven mai mare.
n celulele eucariote, pe lng ADN nuclear, exist n organitele
citoplasmatice ADN specific acestora: ADN mitocondrial (ADN-mt) i ADN
cloroplastic (ADN-cl).
ADN - mitocondrial (ADN - mt) este bicatenar i de form circular,
asemntor ntr-o mare msur cu ADN bacterian. ADN-mt nu este complexat cu
histone, n electronografii aprnd ca nite fibrile cu un diametru de 25-30 .
ADN-mt al metazoarelor este de tip A-T, coninutul n G-C fiind variabil. Dublul
helix de ADN-mt are o caten grea, bogat n resturi de A i o caten uoar
bogat n resturi de T. ADN-mt este singurul tip de ADN circular ce are n
secvena sa ribonucleotide covalent integrate, ceea ce-l face sensibil la uree i
ribonucleaz, modificnd forma moleculei i oferind locuri speciale de
recunoatere pentru polimeraze.
Mrimea moleculei de ADN-mt variaz n funcie de specie la
organismele inferioare avnd n medie o greutate molecular de 107 daltoni, ceea
ce corespunde la 15.000-17.000 perechi de baze.
La plantele superioare ADN-mt are o greutate molecular mult mai
mare 60-140 x 106 daltoni, iar coninutul n G-C este uniform (45-47%).
Informaia genetic din ADN-mt este foarte compact, neexistnd secvene
repetitive (introni). Se pare c pe parcursul evoluiei intronii au fost eliminai din
ADN-mt.
ADN - cloroplastic (ADN-cl). Fiecare cloroplast conine cel puin o
molecul de ADN-cl localizat n stroma cloroplastului (zona genofor).
Pot exista mai multe molecule de ADN-cl separate spaial, formnd
zone genofore separate, ataate de un loc (situs) specific al membranei interne a
cloroplastului.
Cercetrile efectuate la plantele superioare i inferioare au artat c
plastomul acestora este format din molecule de ADN-cl, dublu catenare, circulare,
cu un perimetru de 40-50 corespunznd unei greuti moleculare de 92 x 106
daltoni, respectiv 130 Kilobaze. Un cloroplast are n medie aproximativ 10-14g
ADN, ceea ce nseamn aproximativ 50 copii ale plastomului (Sitte P. i colab.,
1991, dup Toma N. i Anghel I., 1985). Prin studii de denaturare i renaturare
sau analiz biochimic direct, s-a constatat c la plantele inferioare coninutul n
G+C este inferior celui de A+T, n timp ce la plantele superioare coninutul de
G+C poate fi egal sau puin mai ridicat fa de cel de A+T. Experienele de
hibridare molecular ADN-ADN au demonstrat c ntre ADN nuclear i cel
cloroplastic exist un anumit grad de omologie.
n ceea ce privete replicarea ADN-cl, are loc dup modelul
semiconservativ, bidirecional, independent de replicarea ADN nuclear. ADN-cl
se replic o singur dat, att n timpul gametogenezei, n gametul femel, n timp
ce ADN-cl coninut de gametul mascul nu se replic. n dezvoltarea ontogenetic,
ADN-cl provenit de la genitorul matern se replic i este deci meninut, n timp ce
64

ADN-cl de provenien patern (n cantiti foarte mici) este degradat enzimatic;


n acest fel se explic transmiterea pe linie matern a genelor din ADN-cl.
ADN-cl cuprinde cteva sute de gene, genomul cloroplastic fiind mult
mai mare dect cel mitocondrial, avnd i un rol mult mai complex n formarea i
metabolismul cloroplastului i a celulei, existnd i o cooperare complex ntre
acesta i nucleu.
ADN-satelitic (ADN-S). Acest tip de ADN formeaz blocuri de uniti
repetitive (cteva milioane) n zona centromerului i a satelitului. Numrul de
secvene repetitive variaz de la o specie la alta de la 1% pn la 5% per genom.
ADN-satelitic deine funcia de reglare a replicrii ADN cromozomic, replicare ce
presupune participarea proteinelor histonice.
ADN-bicatenar-circular este caracteristic cromozomului bacterian i
unor plasmide prezente n celulele procariote, cum ar fi plasmidele F, R sau Col.
Dimensiunile acestui ADN sunt variabile de la o specie la alta. Avantajele
structurii circulare nu sunt cunoscute. Se presupune c aceast structur asigur
protecia moleculei de ADN fa de degradarea enzimatic prin exonucleaze care
acioneaz asupra extremitilor libere ale moleculei.
ADN monocatenar. Exist unele virusuri a cror material genetic este
reprezentat de un ADN monocatenar. Astfel, la virusul x174, molecula de ADN
monocatenar are o greutate molecular de 3 x 106 daltoni, are o form circular
i nu liniar. Ulterior s-au descoperit i ali bacteriofagi a cror material genetic
este reprezentat de un ADN monocatenar: bacteriofagul S13 i bacteriofagul F1.
Structura monocatenar a ADN de la aceste virusuri constituie o
excepie reprezentnd o adaptare la viaa specific parazitar a acestora.

3.3.3. Acidul ribonucleic (ARN)


Structura chimic a moleculei de ARN. Acidul ribonucleic (ARN) are
o structur chimic asemntoare cu cea a acidului dezoxiribonucleic (ADN). n
structura chimic a ARN intr trei componente: bazele azotate, zaharul i
radicalul fosforic. Bazele azotate sunt: purinice, adenina (A) i guanina (G) i
pirimidinice, citozina (C) i uracilul (U). Deci o prim deosebire structural ntre
ADN i ARN este prezena uracilului n locul timinei. Uracilul are o structur
destul de apropiat de cea a timinei.
Zaharul care intr n structura moleculei de ARN este riboza, care are o
form ciclic. Combinarea unei baze azotate cu zaharul d natere unui
ribonucleosid, iar prin adugarea unui radical fosfat rezult un ribonucleotid.
O alt deosebire important ntre ADN i ARN este faptul c
macromolecula de ARN este monocatenar, fiind format dintr-un singur lan
poliribonucleotidic. Acest fapt face ca bazele azotate purinice s nu fie n cantitate
egal cu cele piridimice.
innd seama de rolul pe care l ndeplinete ARN se apreciaz c sunt
dou categorii: acidul ribonucleic viral (ARNv) i acidul ribonucleic celular,
implicat n sinteza proteinelor.
65

Acidul ribonucleic celular este de trei tipuri: acidul ribonucleic mesager


(ARNm), acidul ribonucleic de transport sau solubil (ARNt) i acidul ribonucleic
ribozomal (ARNr).
Acidul ribonucleic viral (ARNv) constituie materialul genetic al unor
ribovirusuri cum ar fi: virusul mozaicului tutunului (VMT), virusul gripal, virusul
poliomielitei, virusul stomatitei veziculare, bacteriofagii F2, R17, QB i altele.
Studiindu-se molecula de ARNv de la virusul mozaicului tutunului s-a
determinat c este alctuit din aproximativ 6.000 ribonucleotide, ntr-o anumit
ordine, determinnd coninutul mesajului genetic. La mai multe virusuri molecula
de ARNv este format din dou catene complementare nfurate elicoidal n jurul
unui ax imaginar. Molecula de ARNv este n general liniar, cu excepia virusului
encefalomielitei oarecilor, la care molecula de ARNv este circular.
Aa cum s-a artat ntr-o experien anterioar, n momentul infeciei
virale, n interiorul celulei infectate ptrunde numai molecula de ARNv, care are
capacitatea de a se multiplica, avnd rolul de matri pentru formarea unor
molecule noi, deinnd i informaia genetic necesar sintezei proteinei virale.
Acidul ribonucleic mesager (ARNm). A fost descoperit n celulele
bacteriene infectate cu bacteriofagi, apoi n toate celulele organismelor. A. D.
Hershey i colab. (1953) au ajuns la concluzia c sinteza ARNm este dependent
de ADN. Ei au identificat ntr-o celul bacterian infectat, pe lng ADN i o
mic cantitate de ARN, care era complementar ADN. Acest tip de ARN are rolul
de a copia informaia ereditar de pe o poriune din molecula ADN i de a o
transmite n citoplasm la ribozomi, organite citoplasmatice la nivelul crora are
loc sinteza proteinelor. De aceea acest tip de acid ribonucleic a fost denumit ARN
mesager (messenger ARN), prescurtat ARNm (F. Jacob i J. Monod, 1961).
Acidul ribonucleic mesager se sintetizeaz n procesul de transcripie a
informaiei genetice.
Cercetrile genetice au stabilit c ARNm are o durat foarte scurt, fiind
foarte repede sintetizat, dar i foarte repede distrus. Molecula de ARNm se
asociaz cu ribozomii i formeaz complexe denumite poliribozomi. Se afirm c
n perioada asocierii ARNm cu ribozomii, molecula nu este supus degradrii.
Lungimea catenei de ARNm este foarte variabil, deci i masa
molecular este variabil, n funcie de lungimea segmentului de ADN de pe care
este copiat informaia genetic.
Acidul ribonucleic solubil sau de transfer (ARNs sau ARNt). Acest
tip de acid ribonucleic are o structur chimic asemntoare cu a celorlalte tipuri
de ARN. Are o greutate molecular mic i anume 25.000 daltoni, avnd 75-90
nucleotide, este solubil n soluie de NaCl, de aceea i s-a dat numele de ARN
solubil.
Rolul ARNs este de a transporta aminoacizii din citoplasm la ribozomi,
n procesul de sintez a proteinelor.
Molecula de ARNs are la un capt tripleta citozin-citozin-adenin
(CCA), iar la cellalt capt are un nucleotid ce conine guanina (G). Molecula
66

ARNs este monocatenar, dar are i poriuni bicatenare datorit legturilor de


hidrogen dintre A-U i G-C, dndu-i forma caracteristic a unei frunze de trifoi.
R. W. Holley de la Universitatea Cornell (SUA) a determinat, n anul
1965, ordinea nucleotidelor unui ARNs care transport alanina la ribozomi, la
drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae) (fig. 3.4.):

Fig. 3.4. Structura ARN-s ce transport alanina la ribozomi


la drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae)

Spre deosebire de celelalte tipuri de ARN, acidul ribonucleic solubil are


o serie de particulariti chimice: conine o serie de nucleotide neobinuite, baze
ce au gruparea metilic cum ar fi: 1-metilguanina, N-dimetilguanina, 1metilhipoxantina, hipoxantina, pseudouracilul i altele.
Macromolecula de ARNs are trei regiuni distincte pentru recunoaterea
moleculelor sau structurilor celulare:
a) Regiunea pentru recunoaterea aminoacidului este situat pe braul cu
codonul CCA de la un capt al moleculei. Aminoacidul se fixeaz de aceast
regiune cu ajutorul enzimei aminoacil - ARNs - sintetaza, care are o structur
foarte variat de la un organism la altul, existnd cte o enzim pentru fiecare
aminoacid.
b) Regiunea anticodonului este format dintr-o triplet de nucleotide
complementar unui codon din ARNm. Numrul anticodonilor este egal cu cel al
codonilor.
c) Regiunea pentru recunoaterea ribozomului este alctuit dintr-o
secven de cinci nucleotide: G-T-P-C-G (P-pseudouracilul). Aceast regiune
realizeaz legtura cu ribozomul n timpul procesului de sintez a proteinelor.
67

Sinteza ARNs este determinat de genele din cromozomi, gene care se


gsesc ntr-un numr mare de copii. Teoretic ar trebui s existe attea tipuri de
ARNs cte tipuri de codoni exist, dar n realitate numrul lor este mai mic
deoarece sunt i codoni care servesc pentru punctuaie sau sunt sinonimi.
Acidul ribonucleic ribozomal (ARNr). Acidul ribonucleic ribozomal
(ARNr) reprezint aproximativ 85% din cantitatea total a ARN din celul, fiind
localizat numai n ribozomi. O caracteristic important a ARNr este aceea c se
gsete ntotdeauna asociat cu proteinele. ARNr a fost izolat din ribozomii
purificai de Escherichia coli i s-a stabilit c are o greutate molecular de 5 x 106,
nefiind purttor al informaiei genetice. Ribozomii sunt structuri submicroscopice
celulare, fixate pe reticulul endoplasmatic, constituind locul sintezei proteice.
Structura ribozomului este foarte complex, fiind alctuit la procariote
din dou subuniti: o subunitate mare de 50 S i o subunitate mic de 30 S.
Subunitatea mare este alctuit dintr-o molecul foarte mare de ARNr, format
din aproximativ 3200 nucleotide, dintr-o molecul mai mic cu 120 nucleotide i
34 proteine diferite. Subunitatea mic este format dintr-o molecul mare de
ARNr compus din 1600 nucleotide i 21 proteine diferite.
La eucariote, ribozomul este mai mare i anume 80 S, subunitatea mic
(40 S) are o molecul de ARNr i 30 de proteine diferite, iar subunitatea mare (60
S) are dou fracii de ARNr i 37 proteine.
Acidul ribonucleic ribozomal are o structur bicatenar n proporie de
60-70% iar restul are o structur monocatenar.
Sinteza ARNr se realizeaz prin genele din ADN specializate n acest
sens i a cror numr este foarte mare datorit necesitii de a se sintetiza o
cantitate mare de ARNr ntr-un timp scurt. Astfel, la Drosophila melanogaster
exist 130 de gene ce rspund de sinteza ARNr, la Xenopus laevis 450, la Zea
mays 5200, la Triticum aestivum 12700, la Hyacinthus orientalis 32000 gene.
Numrul de ribozomi din celulele procariotelor este de aproape 15000
iar la eucariote chiar mai mare, explicndu-se astfel necesitatea unui numr mare
de gene ce rspund de sinteza unor fracii de ARNr.

3.3.4. Denaturarea i renaturarea ADN


nclzirea unei soluii de ADN la temperaturi de peste 65C, determin
ruperea legturilor de hidrogen dintre bazele azotate, cele dou catene se separ
rezultnd un ADN monocatenar, iar fenomenul se numete denaturare.
Temperatura la denaturare variaz de la o specie la alta, de exemplu la
Drosophila melanogaster este de 86C, la Escherichia coli 90C, Mycobacterium
phlei 97C. Dac soluia respectiv este rcit brusc, ADN rmne monocatenar,
fiind numit ADN denaturat. Dac soluia se rcete treptat, legturile de hidrogen
se refac, rezultnd un ADN renaturat, iar fenomenul se numete renaturare.
Aceste dou fenomene au o importan deosebit pentru realizarea de
hibrizi moleculari ADN-ADN sau ADN-ARN.
68

Hibrizii moleculari ADN-ADN, dar de la specii diferite, ne dau


informaii despre gradul de nrudire al speciilor respective. Hibridarea ADN-ARN
permite localizarea pe cromozomi a genelor ce intervin n sinteza diferitelor tipuri
de ARN.

3.3.5. Specificitatea ADN


n urma determinrii cantitii de ADN din nucleul procariotelor i
eucariotelor s-a putut observa c acesta variaz foarte mult de la o specie la alta.
n general, procariotele au o cantitate mai mic de ADN fa de eucariote,
deoarece organismele superioare au nevoie de o cantitate mai mare de informaie
genetic pentru cretere, dezvoltare i reproducere.
n molecula de ADN raportul dintre bazele azotate purinice i bazele
azotate pirimidinice A/T i G/C este constant i egal cu 1 (E. Chargaff, 1951).
Deosebirile ce exist ntre ADN de la diferite specii const n faptul c raportul
dintre A+T/G+C este foarte variabil. La plantele i animalele superioare acest
raport este n favoarea bazelor A+T. La speciile nrudite i raportul A+T/G+C
este apropiat, ceea ce arat c la acestea succesiunea nucleotidelor este
asemntoare. Diferenele privind secvena de nucleotide asigur deosebirile
genetice dintre specii.

3.3.6. Replicaia ADN


Una dintre nsuirile de baz ale macromoleculei de ADN este cea de
replicaie sau autoreplicaie, constituind funcia autocatalic a materialului
genetic. La eucariote, replicarea ADN i deci a genelor care nu sunt dect
segmente de ADN, are loc n timpul diviziunii mitotice, asigurndu-se
transmiterea exact de la o generaie la alta a caracterelor ereditare.
Studiul ciclului mitotic a relevat existena unei variaii regulate a
cantitii de ADN iar pe aceast baz ciclul celular a fost mprit n urmtoarele
etape: M - mitoza, G1 - perioada anterioar sintezei de ADN (gol sintetic), S perioada sintezei de ADN i G2 - perioada de postsintez. Dup telofaz n G1
cantitatea de ADN rmne constant i egal cu 2C (dou catene).
Biosinteza proteic ce are loc n aceast perioad determin creterea
celulei, are loc sinteza de ADN i deci a unor proteine specifice ce declaneaz
mitoza. n perioada S se produce replicarea ADN, care se ncheie prin dublarea
cantitii de ADN, egal cu 4 C (patru catene). n timpul profazei i metafazei
mitotice, cantitatea de ADN rmne constant iar n anafaz, cnd cromozomii
migreaz spre cei doi poli, se mparte n dou, fiecare celul avnd o cantitate de
ADN egal cu cea din celula mam.
Diviziunea meiotic determin o reducere la jumtate a cantitii de
ADN n gamei. Cantitatea dubl de ADN se reface n momentul fecundrii
gameilor, cnd rezult zigotul diploid.
69

J. D. Watson i F. H. Crick (1953) n urma elaborrii modelului


structural al moleculei de ADN au emis i ipoteza replicrii acestuia dup tipul
semiconservativ. Acest tip de sintez const n ruperea punilor de hidrogen
dintre cele dou catene complementare. Fiecare caten servete ca matri pentru
sinteza unei catene noi. n final, dintr-o molecul veche de ADN vor rezulta dou
molecule, dar care sunt noi numai pe jumtate.
Au mai fost emise i alte ipoteze de replicare a macromoleculei de
ADN. Un asemenea tip ar fi cel conservativ conform cruia molecula veche de
ADN servete ca model pentru sinteza unei molecule complet noi.
O alt ipotez consider c replicarea ADN se realizeaz dup tipul
dispersiv. Conform acestui model, molecula de ADN se desface n prile
componente i mpreun cu nucleotidele din celul particip la formarea a dou
molecule de ADN, care vor conine att nucleotide vechi ct i nucleotide noi.
Modelul replicrii dup tipul semiconservativ propus de Watson i
Crick, asigur o mare fidelitate n sinteza noilor molecule de ADN. Termenul de
replicaie deriv de la faptul c n acest proces fiecare caten servete ca matri
pentru catenele noi sintetizate, informaia genetic fiind transmis fidel noilor
molecule.
Sinteza ADN dup tipul semiconservativ se realizeaz astfel: la o
extremitate sau ntr-un punct oarecare al macromoleculei de ADN, punile de
hidrogen se rup, fenomen ce continu pe toat lungimea moleculei, asemntor
desfacerii unui fermoar. Fiecare caten se rsucete n spaiu cu 180, prin rotirea
nucleotidelor n planul exterior, n jurul radicalului fosforic. n citoplasm se
gsesc sintetizate cele patru tipuri de nucleotide care conin bazele azotate
purinice i pirimidinice: adenin, guanin, citozin i timin.
Pe baza fenomenului de complementaritate
dintre bazele azotate purinice i pirimidinice, o
nucleotid care conine adenin se va lega prin
puni de hidrogen de una ce conine timin, iar
una ce conine guanin se va lega de una ce
conine citozin. n final, paralel cu catenele
vechi s-au sintetizat dou catene noi, rezultnd
dou molecule fiice, identice cu molecula mam
(fig. 3.5.). Replicarea macromoleculei de ADN
se realizeaz n trei etape: n prima etap are loc
sinteza precursorilor nucleotidelor ce intr n
alctuirea ADN de tipul acidului uridilic i
acidului inosinic; n etapa a doua are loc sinteza
nucleotidelor propriu-zise ce intr n structura
ADN: dezoxiadenozintrifosfat,
dezoxiguanozintrifosfat, dezoxicitidintrifosfat i
dezoxitimidintrifosfat; n etapa a treia are loc
polimerizarea nucleotidelor sub controlul
Fig. 3.5. Modelul replicrii
enzimei ADN-polimeraza.
semiconservative
a un diametru de circa 65 , mult mai mare dect a moleculei
Enzima are
demacromoleculei
ADN (20 )de iADN
este format din circa 1000 aminoacizi. Enzima ADN70

polimeraza determin esterificarea oxidrilului de la carbonul 3' al catenei


polinucleotidice de ctre fosfatul ce esterific oxidrilul de la carbonul 5' al
nucleotidei, aa nct dac catena veche are polaritatea 5 3', catena nou
sintetizat va avea polaritatea invers 3' 5'.
S-au descoperit mai multe tipuri de polimeraze (I, II, III), unele din ele
intervenind n procesul de reparare a macromoleculei de ADN, atunci cnd unele
nucleotide au fost ncatenate n mod eronat.
Pentru desfurarea procesului de replicaie este necesar o anumit
cantitate de energie. Aceast energie provine din hidroliza acidului
adenozintrifosforic (ATP) n acidul adenozindifosforic (ADP) i un radical
fosforic (P). O parte din energia rezultat se pierde sub form de cldur.
Pentru ca pierderile s fie ct mai mici, n celul exist un grup de
enzime denumite transferaze, care au rolul de a transfera grupe funcionale de la
o molecul la alta. Astfel ATP transfer energia sa ctre GTP care este un
precursor n sinteza acizilor nucleici, devenind o molecul activat.
n celule exist o enzim puternic denumit pirofosfataz, care rupe
legtura de nalt energie dintre radicalii de fosfor (P P) elibernd-o (P P P
+ P + 7 kcal/mol). Pentru unirea a dou nucleotide se consum 0,5 kcal/mol,
restul de 6,5 kcal/mol rmne ca energie liber ce pstreaz echilibrul
termodinamic al macromoleculei de ADN.

3.3.7. Replicaia acizilor nucleici la bacterii i virusuri


Celula bacterian conine un singur cromozom circular format dintr-o
macromolecul de ADN cu o lungime de aproape 1000 . n timpul replicaiei la
bacterii macromolecula de ADN i pstreaz forma circular. Geneticienii M.
Meselsohn i F. W. Stahl (1958) au elucidat mecanismul de replicaie al ADN de
la bacterii prin marcarea acestuia cu izotopi radioactivi. Eu au folosit izotopul
stabil al azotului N15, care se poate izola destul de uor de azotul obinuit N14, prin
ultracentrifugare.
Bacteria Escherichia coli a fost cultivat pe un mediu ce coninea
clorur de amoniu marcat cu N15. Dup prima diviziune a bacteriilor, au fost
trecute pe mediu ce coninea N14 i au fost lsate s se divid de 1-3 ori. Dup
numrul de bacterii din cultur se poate determina numrul de diviziuni.
Dup aceea bacteriile au fost lizate i introduse ntr-o ultracentrifug. Sa constatat c bacteriile crescute pe mediu cu N15 aveau ADN marcat numai cu
N15, iar dup ce au fost trecute pe mediu cu N14, dup prima diviziune exista o
fracie de ADN hibrid, avnd o greutate molecular intermediar. Dup cea de a
doua diviziune celular, 50% din ADN conine N14 i 50% N15, iar dup cea de a
treia diviziune 75% coninea N14 i 25% hibrid. Aceste rezultate au demonstrat c
replicarea cromozomului bacterian se realizeaz dup modelul semiconservativ.
Procesul de replicaie a cromozomului bacterian ncepe ntr-un punct al
acestuia denumit replicator, care este ataat de membrana celular ntr-o regiune
denumit mezozom.
71

La bacterii, fiecare diviziune a bacteriei este precedat de o singur


derulare complet a cromozomului circular.
La virusuri s-a constatat c acest proces de derulare a cromozomului se
repet de mai multe ori, rezultnd mai nti o formaiune liniar, lung, care apoi
se fragmenteaz i rezult cromozomi circulari.
Unele virusuri au ca material genetic o molecul de ADN monocatenar
(x174, S 13, F etc.). La aceste virusuri, procesul de replicaie decurge astfel: n
momentul n care ADN monocatenar notat cu (+) ptrunde n celula bacterian
infectat, servete ca matri pentru sinteza unei catene complementare notat cu
(-). n interiorul bacteriei infectate a rezultat un ADN dublu catenar, dar numai
catena (-) servete ca matri pentru sinteza catenelor (+) ale virusului.
Exist virusuri a cror material genetic este reprezentat de ARNv, care
are o structur monocatenar. Replicaia acestui ARN n cazul ribovirusurilor este
asemntoare cu replicaia ADN monocatenar de la virusul phi x 174.
Studiindu-se, de exemplu, ciclul de via al ribovirusului F2, s-a
constatat c dup ptrunderea ARNv monocatenar notat cu (+) n celula
bacterian, se ataeaz de ribozomi, pentru a declana sinteza enzimei necesare
desfurrii procesului de replicaie, ARN-polimeraza. Pe matria catenei (+) se
formeaz o caten complementar notat cu (-), iar pe matria acesteia se
formeaz un numr mare de molecule de ARNv (+). O parte din aceste molecule
de ARNv (+) se ataeaz de ribozomi, sintetizndu-se proteinele virale dup care
are loc unirea ARNv cu acestea rezultnd un numr foarte mare de fagi ce distrug
celula gazd (liza bacteriei).

3.3.8. Sinteza acizilor nucleici "in vitro"


Sinteza artificial a acizilor nucleici a fost realizat de A. Kornberg
(1954) i S. Ochoa i M. Grnberg-Manago (1955). A. Kornberg a fost distins cu
premiul Nobel (1959) pentru aceast realizare. Pentru realizarea sintezei "in vitro"
a macromoleculei de ADN sunt necesare urmtoarele componente:
dezoxiribonucleotidele celor patru baze azotate, sistemul enzimatic format din
ADN-polimeraza, ioni de magneziu (Mg2+) i o cantitate mic de ADN cu un grad
nalt de polimerizare folosit ca amors (primer) i matri pentru ADN nou
sintetizat. Ca amors poate fi folosit un ADN monocatenar sau un ADN bicatenar,
dar n al doilea caz, molecula bicatenar trebuie denaturat cu ajutorul cldurii.
n condiii favorabile de reacie s-a sintetizat o cantitate mai mare de 10
ori de ADN dect cea folosit drept amors. ADN sintetizat artificial este identic
cu cel folosit drept amors, n privina raportului dintre bazele azotate, ns aceste
molecule au fost inactive biologic. Lipsa activitii biologice a ADN sintetizat "in
vitro" este pus pe seama ADN-polimerazei, care conine mici cantiti de
dezoxiribonucleaz, enzim ce degradeaz parial molecula de ADN.
n anul 1968 A. Kornberg a reuit s sintetizeze "in vitro" ADN
monocatenar, activ biologic, i anume o molecul de ADN viral, identic cu ADN
monocatenar al virusului phi x 174. Pentru aceasta, n mediul de reacie s-au
72

introdus: ADN-polimeraza, ADN monocatenar izolat de la virusul phi x 174, ca


amors, precursorii dezoxiribonucleotidelor i polinucleotidligaza, enzim
necesar realizrii formei inelare a ADN viral. S-au obinut monocatene negative
(-) complementare catenelor iniiatoare (+), care formau un helix dublu, circular.
Prin utilizarea unor enzime s-au izolat o serie de catene (-), care au fost utilizate
apoi ca matrie pe sinteza unor catene (+) biologic active, cu nsuirea de a iniia
multiplicarea virusului.
n anul 1955 M. Grnberg-Manago i S. Ochoa, au realizat sinteza "in
vitro" i a macromoleculei de ARN, dup aceeai metod folosit pentru sinteza
ADN. Elementele mediului de reacie sunt: ribonucleotidele, enzima ADNfosforilaza i ioni de magneziu. Ca matri pentru sinteza ADN "in vitro" s-a
folosit o molecul de ADN monocatenar.
Sinteza artificial a acizilor nucleici deschide perspective mari n
nlocuirea unor "gene defecte", prin segmente de ADN nou sintetizate.

3.4. CODUL GENETIC


Dup descoperirea structurii macromoleculei de ADN i a nsuirii ei de
a se replica cu mare fidelitate, muli geneticieni i-au pus ntrebarea dac
informaia genetic nu este codificat ntr-un anumit fel prin secvena de
nucleotide, ce relaii se stabilesc ntre cele patru tipuri de nucleotide i
aminoacizii din lanurile polipeptidice.
Ciberneticianul G. Gamow (1954) este primul care a descoperit legtura
dintre secvena de nucleotide din ADN i ordinea aminoacizilor, emind ipoteza
c n macromolecula de ADN se gsete codificat biochimic informaia genetic,
necesar sintezei moleculelor proteice.
n general, prin informaie se nelege un mesaj, mai mult sau mai puin
cuprinztor, despre o serie de fenomene care au avut loc, au loc sau vor avea loc
ntr-un sistem biologic sau tehnic. Aceste informaii sunt nregistrate, stocate i
apoi transmise printr-un sistem de codificare. De exemplu, codul Morse, folosete
un sistem de linii i puncte pentru codificarea literelor i cuvintelor.
Proteinele sunt alctuite din lanuri polipeptidice formate din 20 de
aminoacizi a cror succesiune este specific pentru fiecare protein.
Prin schem teoretic a unui cod genetic a fost elaborat de G. Gamow
(1954). Potrivit concepiei acestuia, codificarea celor 20 de aminoacizi nu se
poate realiza de un singur nucleotid (41=4) i nici de grupe formate din cte dou
nucleotide (42=16), pentru c n ambele cazuri numrul total de combinaii este
mai mic dect numrul aminoacizilor. Ca urmare, el a considerat c numai
secvene de cte trei nucleotide (43=64) pot realiza codificarea celor 20 de
aminoacizi (tabelul 3.1.). Grupul de trei nucleotide care codific un aminoacid a
primit denumirea de codon. n cazul codului de tip triplet, numrul codonilor este
64, depind de trei ori numrul aminoacizilor, fapt ce confer o mare eficien i
plasticitate n recunoaterea aminoacizilor.
73

n perioada care a urmat, o serie de geneticieni au adus numeroase


dovezi experimentale privind codificarea informaiei ereditare, deci a relaiei
nucleotide-aminoacizi, culminnd cu descifrarea n totalitate a codului genetic.
Primele dovezi experimentale ale relaiei nucleotide-aminoacizi, au fost
aduse prin studiul unor mutaii, induse cu acid nitros, la virusul mozaicului
tutunului (VMT). La acest virus capsida este format din 2150 catene
polipeptidice identice, fiecare coninnd cte 158 aminoacizi. Acidul nitros induce
mutaii de tipul tranziiilor (nlocuirea unei baze purinice cu o baz purinic sau
nlocuirea unei baze pirimidinice cu o baz pirimidinic n catena acizilor
nucleici) i anume A G sau C U.
Tabelul 3.1.
Diferite tipuri teoretice de coduri
Codul
monotipic
(4 combinaii)
A
G
C
U

Codul cu dublete
(16 combinaii)
AA
GA
CA
UA

AG
GG
CG
UG

AC
GC
CC
UC

Codul cu triplete
(64 combinaii)
AU
GU
CU
UU

AAA
AGA
ACA
AUA
GAA
GGA
GCA
GUA
CAA
CGA
CCA
CUA
UUA
UGA
UCA
UUA

AAG
AGG
ACG
AUG*
GAG
GGG
GCG
GUG*
CAG
CGG
CCG
CUG
UAG
UGG
UCG
UUC

AAC
AGC
ACC
AUC
GAC
GGC
GCC
GUC
CAC
CGC
CCC
CUC
UAC
UGC
UCC
UUC

AAU
AGU
ACU
AUU
GAU
GGU
GCU
GUU
CAU
CGU
CCU
CUU
UAU
UGU
UCU
UUU

* codoni iniiatori ai sintezei unei catene polipeptidice


codoni nonsens, care nu codific nici un aminoacid reprezentnd
codonii terminali ai sintezei unei catene polipeptidice
Apariia acestor mutaii la nivelul nucleotidelor din ARNv al virusului,
care ndeplinete rolul de ARNm, apar modificri n secvena aminoacizilor din
catena polipeptidic. Aceste modificri sunt de tipul substituiei unor aminoacizi:
Prolin
Serin
Fenilalanin sau
Prolin
Leucin
Fenilalanin
S-a dedus c prolina este codificat de un codon, la care cel puin dou
nucleotide sunt fie A fie C. Tranziia A G sau C U a uneia din aceste
nucleotide genereaz codonul serinei i respectiv al leucinei. n codonul
fenilalaninei, ambele nucleotide trebuie s fie G sau U.
74

Studiile efectuate la mutantele induse cu proflavin la bacteriofagul T4,


n cadrul genei rIIB, au demonstrat c unitatea care codific un aminoacid este o
triplet de nucleotide (codon).
Descifrarea codului genetic a fost posibil i prin folosirea unor ARNm
sintetizai artificial, care conineau o secven cunoscut de nucleotide, pe baza
crora au fost sintetizate proteine. Experiene de acest fel au fost realizate de M.
W. Nirenberg i J. H. Matthaei (1961). Ei au reuit s sintetizeze o caten de
polifenilalanin, folosind un ARNm artificial care coninea numai nucleotide cu
uracil (U), dovedind c tripleta (UUU) codific aminoacidul fenilalanin. S-au
folosit apoi ARNm artificiali ce conineau o secven de dou nucleotide
cunoscute. De exemplu, ARN artificial ce conine secvena UGUGUG, determin
sinteza unui lan polipeptidic n care alterneaz cisteina i valina, deci cisteina
este codificat de codonul UGU iar valina de GUG (figura 3.6.).
Prima
nucleotid a
codonului 5'

U
UUU
UUC

A treia
nucleotid a
codonului 3'

A doua nucleotid a codonului

UUA
UUG
CUU
CUC
CUA
CUG
AUU
AUC
AUA
AUG
GUU
GUC
GUA
GUG

Fen
Leu

Leu

Ileu
Met
Val
fMet

UCU

UAU

UCC

UAC

UCA
UCG
CCU
CCC
CCA
CCG
ACU
ACC
ACA
ACG
GCU
GCC
GCA
GCG

Ser

Pro

Tre

Ala

Tir

UGU
UGC

UAA

Non 2

UGA

UAG
CAU
CAC
CAA
CAG
AAU
AAC
AAA
AAG
GAU
GAC
GAA

Non 1

UGG
CGU
CGC
CGA
CGG
AGU
AGC
AGA
AGG
GGU
GGC
GGA

GAG

His
Glu
Asp
Liz
Ac.asp
Ac.glu

Fig. 3.6. Codul genetic

75

GGG

Cis
Non
3
Tri
Arg

Ser
Arg

Gli

U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G

Problema cea mai grea ce a trebuit rezolvat a fost precizarea poziiei


nucleotidelor n cadrul codonului, pentru c cele dou nucleotide pot forma trei
combinaii: GUU, UGU i UUG. Exist mai multe ci pentru precizarea ordinii
nucleotidelor n cadrul codonului, cea mai folosit fiind studiul mutaiilor de
substituie a unor aminoacizi din unele proteine mai bine cunoscute: hemoglobina,
proteina virusului mozaicului tutunului, triptofan-sintetaza din Escherichia coli
.a.

3.4.1. Caracteristicile codului genetic


Informaia genetic este codificat n acidul dezoxiribonucleic (ADN)
sau n acidul ribonucleic viral (ARNv) la unele virusuri, sub forma unor secvene
de trei nucleotide (codoni). Informaia genetic este copiat prin procesul de
transcripie de ctre ARNm iar apoi tradus, prin procesul de translaie, ntr-o
secven de aminoacizi, n catena polipeptidic.
n prezent sunt cunoscui toi codonii din ARNm, care codific diferii
aminoacizi (fig. 3.6). Codul genetic cuprinde 64 de codoni. Doi codoni marcheaz
nceputul sintezei unei catene polipeptidice i anume AUG i GUG iar trei codoni
sunt nonsens: UAA (ocru), UAG (ambr) i UGA (azur). Aceti codoni au rolul
de a marca terminarea sintezei unei catene polipeptidice (codoni stop).
Codul genetic are urmtoarele caracteristici: este universal, degenerat,
lipsit de ambiguitate, neacoperit i fr virgule.
Prin universalitatea codului genetic se nelege faptul c un anumit
codon, codific acelai aminoacid la orice organism, indiferent de gradul su de
evoluie. Dovada cea mai evident a universalitii codului genetic a fost
urmtoarea: s-a izolat ARNm ce rspunde de sinteza hemoglobinei la iepure i s-a
injectat n ovocitele de broasc. S-a constatat c n ovocitele de broasc se
sintetizeaz hemoglobina, dei n mod normal, ovocitele nu sintetizeaz niciodat
hemoglobin.
Codul genetic este degenerat, n sensul c mai muli codoni codific
acelai aminoacid. De exemplu, arginina este codificat de urmtoarele triplete:
GGU, GGC, GGA, AGA i AGG.
n ceea ce privete importana nucleotidelor din codon s-a constatat c
primele dou sunt cele mai semnificative, n timp ce a treia poate fi uor nlocuit.
Dac cea de a treia nucleotid este o baz purinic ea poate fi nlocuit tot cu o
baz purinic sau dac este o baz pirimidinic, poate fi nlocuit tot printr-o baz
pirimidinic. Diferii codoni, care au primele dou nucleotide identice, pot
codifica acelai aminoacid. Numai metionina i triptofanul sunt codificai de cte
un singur codon (AUG i respectiv UGG). Caracteristica de degenerare a codului
genetic, prin care mai muli codoni diferii codific acelai aminoacid, poart
numele de redundan, termen preluat din informatic. Redundana const ntrun exces de informaie, ntr-un sistem, pentru a asigura transmiterea corect a
informaiei, chiar n cazul unor perturbri (Hartl D. L. i colab., 1989).
76

n mod obinuit fiecare codon (triplet) codific un singur aminoacid. Sa constatat, n unele cazuri, c un codon poate codifica mai muli aminoacizi. Aa
este cazul codonilor GCG care codific alanina i arginina; CGG-prolina i
arginina; GGA-glicerina i acidul glutamic; AGG-glicina i fenilalanina. Se
afirm c aceast nsuire reprezint un avantaj evolutiv, deoarece nlocuirea unui
aminoacid cu altul printr-o mutaie, ntr-o caten polipeptidic este mai puin
duntoare, dac cei doi aminoacizi au proprieti asemntoare.
Codul genetic este neacoperit n sensul c doi codoni vecini nu au
nucleotide comune i este fr virgule, ntre doi codoni nu exist spaii sau ali
codoni care s joace rolul unor semne de punctuaie.
S-a demonstrat c citirea mesajului genetic ncepe dintr-un punct fix, se
realizeaz ntr-un singur sens, astfel c, absena unui nucleotid (deleie) sau
adugarea altuia (adiie), schimb sensul mesajului.
Universalitatea codului genetic n lumea vie demonstreaz pe de o parte
vechimea sa i, totodat, constana sa n timp.

3.5. BIOSINTEZA PROTEINELOR


Proteinele au un rol esenial n metabolismul celular, nsi funciile
materialului genetic sunt condiionate de o serie de enzime sau proteine cu rol
structural.
Enzimele particip la replicarea ADN i ARN, la transcripia informaiei
genetice i la sinteza proteinelor.
Proteinele structurale intr n alctuirea cromozomului, a membranelor
celulare, a componentelor celulare, particip la asamblarea ribozomilor.
Procesul de biosintez a proteinelor este mult mai complex dect cel de
sintez a acizilor nucleici i cuprinde dou etape importante: transcripia
informaiei genetice i translaia informaiei genetice.

3.5.1. Transcripia informaiei genetice


Transcripia constituie fenomenul prin care informaia genetic de pe o
poriune din catena de ADN este transcris (copiat) ntr-o molecul de ARNm.
Transcripia mesajului genetic din molecula de ADN pe cea din ARNm se face
ntr-o form care servete ca matri pentru sinteza proteinelor. Sinteza ARNm
este catalizat de enzima ARN-polimeraza, enzim universal ce a fost
identificat n celulele bacteriene, vegetale i animale.
Mecanismul propriu-zis al transcripiei informaiei genetice din ADN n
molecula de ARNm se realizeaz astfel: enzima ARN-polimeraza se leag specific
ntr-o poziie a moleculei de ADN, ce corespunde cu nceputul unei gene.
Legturile de hidrogen se rup pe poriunea genei respective, segmentul respectiv
de caten se rotete cu 180 n spaiu, servind ca matri pentru sinteza catenei de
ARNm. ARN-polimeraza asigur ncatenarea corect a ribonucleotidelor existente
n nucleu. Odat cu naintarea ARN-polimerazei de-a lungul matriei ADN, se
77

elibereaz treptat noua caten n citoplasm, unde se asociaz cu ribozomii


formnd complexe denumite poliribozomi.
Dup ce s-a realizat transcripia, se refac legturile de hidrogen ntre
catenele moleculei de ADN.
De o foarte mare importan este descoperirea c procesul de
transcripie la nivelul unei gene se realizeaz pe o singur caten de ADN. Aa se
explic faptul c o gen deine informaia genetic necesar sintezei unei singure
proteine.
n ceea ce privete locul de pe catena de ADN unde se iniiaz procesul
de transcripie, J. D. Watson (1974) arat c ARN-polimeraza este cea care
recunoate codonii de iniiere.
Spre deosebire de ADN-polimeraza care este format dintr-un singur
lan polipeptidic, ARN-polimeraza este alctuit din cinci lanuri polipeptidice
notate cu ', , , 2 i W, fiecare cu o mas molecular diferit. Enzima poate s
catalizeze formarea legturilor dintre nucleotide, chiar dac lipsete lanul , deci
acest lan nu are rol catalitic, ci acela de a recunoate catena matri i secvena de
dezoxiribonucleotide, de unde se iniiaz transcripia. Poziia din molecula ADN
unde se leag ARN-polimeraza pentru a iniia transcripia se numete promotor.
ncheierea transcripiei ARNm este controlat de o protein specific numit factor
.
n sens mai larg, transcripia se refer i la sinteza celorlalte dou tipuri
de ARN implicate n procesul de biosintez a proteinelor.
Acidul ribonucleic solubil sau de transfer (ARNs) se sintetizeaz tot pe o
matri de ADN. Fiecare tip de ARNs este codificat de cte o singur secven de
nucleotide din ADN, deci de cte o gen. Acidul ribonucleic ribozomal (ARNr)
este produsul direct al mai multor gene. Detalii despre ARNs i ARNr au fost
precizate ntr-un paragraf anterior.

3.5.2. Translaia informaiei genetice


Translaia este mecanismul prin care secvena codonilor din ARNm este
tradus ntr-o anumit succesiune de aminoacizi ce intr n constituia unui lan
polipeptidic. Realizarea procesului de translaie implic participarea mai multor
componente celulare ce alctuiesc un aparat de translaie. Aparatul de translaie
cuprinde urmtoarele elemente: diferite tipuri de ARNs corespunztoare tipurilor
de aminoacizi, aminoacizii, ribozomii, enzimele activatoare ale aminoacizilor,
cofactorii energetici, ATP i GTP, factori de iniiere, alungire i terminare a
sintezei lanului polipeptidic.
Pentru sinteza celular a proteinelor este necesar o anumit cantitate de
energie, formarea unei singure legturi peptidice necesitnd 0,5 kcal/mol. Aceast
energie este asigurat de acidul adenozintrifosforic (ATP) care, prin hidroliz,
pune n libertate unul sau doi radicali fosforici elibernd energia corespunztoare:
AMP + P P + 8 kcal/mol

ATP + H2O
78

Sinteza proteic se desfoar concomitent cu hidroliza ATP n AMP i


doi radicali fosforici, rezultnd 8 kcal/mol, din care 0,5 kcal/mol sunt folosite
pentru realizarea legturii peptidice iar restul de 7,5 kcal/mol pentru meninerea
echilibrului reaciei n favoarea sintezei proteice i nu a hidrolizei.
O prim etap n sinteza proteinelor o constituie activarea
aminoacizilor i formarea complexului aminoacil-ARNs. Activarea aminoacizilor
se realizeaz cu ajutorul energiei rezultate din hidroliza ATP i n prezena
enzimei aminoacilsintetaza (E). Reacia de activare a aminoacizilor poate fi redat
astfel:
AA1 AMP E + P P

AA1 + ATP + E

Aminoacizii, dup ce au fost activai, se pot ataa de molecula unui


ARNs specific:
AA1 AMP E + ARNs1

AA1 - ARNs1 +
+ AMP + E

Cele dou reacii au loc succesiv, sunt catalizate de aceeai enzim


(aminoacilsintetaza) i ca atare se poate scrie reacia general:
aminoacilsintetaza
AA1 + ATP + ARNs1

AA1 - ARNs1 +
+ AMP + P P

n urmtoarea faz complexul aminoacil-ARNs se ataeaz de


poliribozomi, la nivelul crora are loc iniierea sintezei lanului proteic.
Ribozomul asigur de aa manier asocierea acestor elemente nct zona
anticodon a ARNs s poat recunoate codonul corespunztor din ARNm, ducnd
astfel la o descifrare corect a mesajului genetic. Dup fixarea aminoacidului,
ARNs devine liber putnd transporta alte molecule de aminoacid la nivelul
ribozomului. ncatenarea aminoacizilor se realizeaz de ctre enzima
peptidiltransferaza i const n realizarea legturilor peptidice ntre gruparea
carboxil a unui aminoacid i gruparea aminic a celuilalt (figura 3.7.).
Reacia de ncatenare a aminoacizilor poate fi redat astfel:
peptidiltransferaza
AA1 - ARNs1 + AA2 - ARNs2 + AA3 - ARNs3 +
AA1 - AA2 - AA3 + ARNs1 + ARNs2 + ARNs3 +

79

Fig. 3.7. Reprezentarea schematic a procesului de translaie


(dup Kimball, 1978)

ncheierea sintezei catenei polipeptidice se realizeaz cu ajutorul a doi


factori proteici care sunt activai n prezena codonilor de ncheiere UAA, UAG i
UGA. Ca urmare, catena polipeptidic se detaeaz de ribozomi i de ARNs care
a adus ultimul aminoacid.
n ceea ce privete viteza cu care se realizeaz biosinteza proteic, exist
o serie de date att la procariote ct i la eucariote. Transcripia genei ce
determin sinteza enzimei ce intervine n producerea triptofanului la Escherichia
coli are loc cu o vitez de 28 nucleotide/sec., iar translaia cu viteza de 7
aminoacizi/sec. O molecul complet de hemoglobin uman este sintetizat n 35
secunde (gena ce determin hemoglobina conine 670 nucleotide).
n prezent s-a reuit sinteza unor substane proteice ntr-un sistem
celular liber (populaii de celule la care s-a distrus membrana celular), folosind
ARNm artificial (M. W. Niremberg, 1961).

3.6. REGLAJUL GENETIC AL ACTIVITII GENELOR


Celula vie conine o cantitate mare de informaie genetic iar procesele
metabolice ce au loc funcioneaz cu o mare eficien, asigurnd economisirea la
maximum a energiei.
Cantitatea mare de informaie din celulele procariotelor i eucariotelor
permite funcionarea acestora n cele mai variate condiii de mediu. n timp ce
virusurile posed n programul lor genetic 3-4 gene, bacteriile 2.000-3.000 gene,
plantele i animalele superioare au un program genetic foarte complex, constituit
din cteva zeci de mii de gene.
Genele ce alctuiesc programul genetic al vieuitoarelor nu funcioneaz
toate deodat, ci intr n funcie n mod succesiv, n funcie de tipul i cantitatea
de enzime i proteine, pe msura dezvoltrii individului. Mecanismele de reglare
a activitii genelor sunt foarte complexe att la procariote ct i la eucariote.
Funcionarea celulei este dependent de cele dou laturi ale
metabolismului: catabolismul (dezasimilaia), prin care o serie de substane sunt
descompuse i se elibereaz i o anumit cantitate de energie i anabolismul
(asimilaia) n urma creia se sintetizeaz substane complexe din substane
simple. Fiecare etap a asimilaiei i dezasimilaiei este catalizat de o anumit
enzim, care la rndul ei este dependent de informaia uneia sau a mai multor
gene.
80

3.6.1. Reglajul activitii genetice la procariote


Teoria reglajului genetic la procariote a fost elaborat de geneticienii
francezi Francois Jacob, Andr Lwoff i Jaques Monod, n anul 1961, realizare
pentru care ei au fost distini, n anul 1965, cu premiul Nobel. n aceast lucrare ei
demonstreaz experimental i practic c sinteza proteinelor i a enzimelor variaz
n funcie de necesitile celulei i este controlat genetic. F. Jacob i J. Monod au
descoperit mai multe moduri de reglare genic a sintezei proteice:
- inducia enzimatic;
- represia enzimatic;
- retroinhibiia enzimatic.
Inducia enzimatic este fenomenul prin care celulele produc sistemul
enzimatic necesar pentru metabolizarea substanelor care de obicei nu sunt
prezente n mediu.
Proprietile enzimatice ale bacteriilor sunt influenate de mediul n care
cresc, fenomen denumit adaptare enzimatic, ceea ce confer acestor organisme
posibilitatea de a crete n medii diferite. Enzimele ce intervin n catalizarea
diferitelor laturi ale metabolismului au fost mprite n dou categorii: enzime
adaptive a cror cantitate i activitate variaz n funcie de condiiile de mediu i
enzime constitutive a cror cantitate nu depinde de mediu i se sintetizeaz
continuu.
J. Monod (1941) a descoperit fenomenul de diauxie prin care o bacterie
ce crete pe un mediu de glucoz i lactoz, crete i se nmulete pn ce
glucoza este epuizat, iar dup o perioad de stagnare, crete din nou i se
nmulete folosind ns lactoza.
Un exemplu de inducie enzimatic a fost descoperit la drojdia de bere
(Saccharomyces cerevisiae) care poate s fermenteze lactoza din lapte cu ajutorul
enzimei lactaza. Tulpinile de drojdie de bere, care au fost crescute mai multe
generaii pe mediu de lactoz, vor conine n cantitate mare enzima lactaza, iar n
acest caz, fenomenul de fermentaie ncepe foarte repede (aproximativ o or de la
incubaie). n cazul unor tulpini care nu au fost crescute n prealabil pe mediu de
lactoz, fermentaia nu are loc pentru c acestor tulpini le lipsete lactaza. Dac
aceste tulpini sunt inute n continuare n mediu de lactoz, dup aproximativ 14
ore, fermentaia se declaneaz, fapt ce arat c lactoza induce producerea lactazei
de ctre celulele drojdiei. n acest caz lactoza ce trebuie metabolizat acioneaz
ca un inductor.
Inducia enzimatic a fost ilustrat de J. Monod i colab. la bacteria
Escherichia coli, prin studierea sistemului lactoz. Acest mecanism va fi prezentat
mai pe larg n cadrul modelului Jacob-Monod de reglaj genetic.
n concluzie se poate afirma c inducia enzimatic este caracteristic
sistemelor de catabolism (dezasimilaie) fiind declanat de substane denumite
inductori.
Represia enzimatic este un fenomen opus induciei enzimatice, prin
care este inhibat sinteza unei proteine datorit unui produs final al unui lan
81

metabolic denumit represor.


Fenomenul de represie enzimatic a fost pus n eviden la bacteria
Escherichia coli. Astfel, s-a demonstrat c sinteza aminoacidului triptofan este
inhibat atunci cnd n mediul de cultur se adaug cantiti mici de triptofan sau
analogi ai acestuia. Represia enzimatic este caracteristic unor sisteme
enzimatice ce intervin n anabolismul unor constitueni cu rol esenial n organism
(aminoacizi, nucleotide). Represia enzimatic poate aciona asupra mai multor
proteine ce fac parte din acelai lan metabolic, prin intermediul represorului.
Dac un metabolit acioneaz asupra represorului suprimndu-i activitatea, se
deblocheaz sinteza tuturor enzimelor din acelai lan metabolic. Efectul genetic
al represorului const n blocarea uneia sau a mai multor gene prin aceasta
sistarea sintezei uneia sau a mai multor proteine specifice.
Substanele capabile s modifice efectul de represie al represorului se
numesc efectori. Efectorii pot fi inductori, cnd inhib activitatea represorului i
corepresori, cnd intensific activitatea de represie a represorului.
Retroinhibiia enzimatic denumit i inhibiia prin feed-back sau
inhibiia prin produs final este un sistem de reglare a sintezei proteice prin
cantitatea de produs final. n cazul unui lan metabolic, exist mai multe etape,
fiecare fiind catalizat de o anumit enzim, rezultnd un produs final. n cazul
retroinhibiiei enzimatice, produsul final, ntr-o cantitate mai mare dect cea
normal, acioneaz asupra enzimei din prima treapt a lanului metabolic i
ntreg lanul metabolic este oprit.
Fenomenul a fost studiat la bacteria Escherichia coli. Aminoacidul Ltreonin se transform ntr-un alt aminoacid, L-izoleucin n cinci etape, fiecare
fiind catalizat de ctre o enzim (figura 3.8.).

Figura 3.8. - Represia enzimatic i retroinhibiia enzimatic


n cazul cii metabolice ce asigur sinteza izoleucinei.
82

n acest exemplu, cantitatea de izoleucin poate fi reglat att prin


retroinhibiie enzimatic ct i prin represie enzimatic. Prin retroinhibiie
enzimatic, izoleucina n cantitate prea mare blocheaz activitatea primei enzime
din lanul metabolic, treonin deaminaz i ntreg lanul metabolic este oprit. Prin
represie enzimatic, aminoacidul izoleucin blocheaz activitatea tuturor celor 5
enzime din lanul metabolic. Prin urmare sinteza izoleucinei este controlat printrun sistem dublu, cele dou sisteme fiind independente. Independena celor dou
sisteme a fost dovedit prin faptul c la E. coli s-au obinut dou mutante, una la
care izoleucina nu poate s inhibe enzima treonin deaminaz, iar cealalt la care
izoleucina nu inhib nici una din cele cinci enzime ale lanului metabolic. S-a
demonstrat c cele dou mutaii sunt situate n loci diferii pe cromozom.
n cazurile de mai sus, produii celulari sunt controlai numai de
produii finali ai liniei metabolice respective. Sunt ns i cazuri cnd unii produi
celulari sunt controlai de produii finali ai altei linii metabolice. De exemplu,
bazele azotate purinice i pirimidinice ce intr n alctuirea acizilor nucleici sunt
sintetizate de dou linii metabolice paralele, dar cele dou linii se regleaz
reciproc. Acest lucru are o mare importan deoarece cele dou grupe de baze
trebuie c fie ntr-un anumit raport n momentul replicrii acizilor nucleici.
Experimental s-a demonstrat c proporia bazelor pirimidinice este controlat de
produii finali pirimidinele, dar i de purine, astfel: pirimidinele n exces inhib
prima enzim din lanul metabolic al pirimidinelor, iar purinele n exces
stimuleaz activitatea aceleiai enzime. Prin acest proces, bazele azotate sunt
sintetizate economic, exact n cantitile necesare replicrii acizilor nucleici.
Modelul Jacob-Monod de reglare a activitii genelor
F. Jacob i J. Monod (1961), pe baza experienelor efectuate la
Escherichia coli asupra locusului lac (lactaz), privind fenomenele de inducie
enzimatic i represie enzimatic, au ajuns la concluzia c reglarea sintezei
proteice este de natur genic. n acest proces de reglaj sunt implicate trei
categorii de gene: gene structurale, gene reglatoare i gene operatoare.
Genele structurale sunt segmente din macromolecula de ADN i au
rolul de a determina secvena aminoacizilor n moleculele proteice sintetizate de
celul.
Genele reglatoare sunt localizate tot pe ADN i au rolul de a sintetiza
represorii specifici ce controleaz activitatea genelor structurale. Represorul nu
interacioneaz direct cu genele structurale, ci prin intermediul celui de-al treilea
tip de gene, genele operatoare sau operator. Operatorul este o gen adiacent
genelor structurale, care are posibilitatea de a se combina sau nu cu represorul,
inducnd sau blocnd funcionarea genelor structurale. Gena operatoare poate fi
considerat un receptor al represorului. Gena operatoare este un fel de comutator
chimic care declaneaz sau nu intrarea n activitate a genelor structurale. naintea
genelor operatoare i structurale este localizat promotorul care iniiaz procesul
de transcripie a informaiei genetice al genelor structurale. Ansamblul format din
promotor, gena operatoare i genele structurale se numete operon, ocup un
fragment de cromozom i funcioneaz coordonat.
83

Schema modelului Jacob-Monod privind reglarea sintezei proteice prin


inducie i represie enzimatic este dat n figura 3.9.
Interaciunile dintre represor i efector sau dintre represor i operator
(gena operatoare) are loc astfel: n sistemele represibile gena reglatoare determin
sinteza represorului R, activ, care interacioneaz cu gena operatoare i n acest
caz, gena operatoare blocheaz activitatea genelor structurale, fapt ce face ca
ARN-polimeraza s nu poat sintetiza ARNm i ca atare, nu se vor sintetiza
proteine.

Figura 3.9. - Modelul Jacob-Monod privind reglarea sintezei proteice

n sistemele inductibile, un efector negativ sau inductor reacionnd cu


represorul (R) l transform ntr-o form inactiv (R') care nu poate reaciona cu
gena operatoare (O), fapt ce face ca ARN-polimeraza s iniieze procesul de
transcripie a ARNm. n celule se pot forma molecule cu greutate molecular mic,
denumite efectori pozitivi sau corepresori, care poate transforma represorul
inactiv (R') ntr-o form activ (R), care reacionnd cu gena operatoare (O)
oprete transcripia ARNm.
n ceea ce privete modul de transmitere a informaiei genetice de ctre
genele structurale dintr-un operon pentru sinteza unei proteine, s-au emis dou
ipoteze: una aparine lui Jacob i Monod (1961) care susine c fiecare gen dintrun operon i transcrie un ARMm propriu (o gen - un mesager) iar a doua ipotez
formulat de S. Spiegelman i R. G. Martin (1963) (citai de C. Panfil, 1974),
susine c ntreaga informaie a unui operon este transmis ntr-o singur
molecul de ARNm (un operon - un mesager).
Un exemplu concret privind modul de funcionare al genelor n reglarea
procesului de biosintez a proteinelor l constituie cel al operonului lac de la
Escherichia coli (figura 3.10).
La aceast bacterie se apreciaz c exist ntre 100 i 200 de operoni,
dar numai activitatea unora este cunoscut. La bacteria E. coli utilizarea lactozei
84

din mediu se realizeaz cu ajutorul a trei enzime, a cror sintez este determinat
de trei gene structurale ce alctuiesc operonul 1ac. Genele respective se gsesc
dispuse alturat pe cromozomul bacterian: z+, determin sinteza enzimei galactozidaza, care se gsete liber n citoplasm i care desface lactoza n
galactoz i glucoz; y+ determin sinteza - galactozid permeazei, care este
localizat n membrana celulei bacteriene i permite intrarea lactozei n celul i
gena a+ ce determin sinteza enzimei galactozid trans-acetilaza a crei aciune este
necunoscut.

Figura 3.10. - Reglajul genetic al operonului lac la Escherichia coli

Dac lactoza lipsete din mediu, genele structurale ce determin sinteza


celor trei enzime sunt inactive. Cnd se adaug lactoza n mediu, n cteva minute
ncepe sinteza celor trei enzime, deci genele structurale sunt activate.
Activitatea celor trei gene structurale (z+, y+ i a+) este controlat de o
gen reglatoare prin intermediul unui represor. Cnd lipsete lactoza, gena
structural sintetizeaz represorul care se cupleaz cu gena operatoare ce se afl
naintea genelor structurale i activitatea celor trei gene este inhibat.
Prin testul cis-trans s-a constatat c gena reglatoare este independent de
operonul lac, plasat ntr-o alt regiune a cromozomului bacterian.
Operonul lac este alctuit din urmtoarele subuniti dispuse n
urmtoarea ordine: promotorul (P), gena operatoare (O) i cele trei gene
structurale z+, y+ i a+. Promotorul are rolul de a recunoate enzima ARNpolimeraza, determinnd iniierea procesului de transcripie, gena operatoare are
rolul de a se combina cu represorul sintetizat de gena reglatoare.
Cele dou regiuni sunt formate din secvene de cte 10-30 nucleotide
fiind regiuni ale operonului.
Operonul lac este, de obicei, nefuncional, ceea ce nseamn c n
absena lactozei represorul este activ i blocheaz activitatea genelor structurale.
85

n prezena lactozei represorul i modific structura i nu mai poate reaciona cu


gena operatoare i ca atare ntreg operonul devine activ, lactoza putnd fi
metabolizat.
n ceea ce privete mrimea diferiilor operoni i a genelor reglatoare
exist o serie de informaii la procariote, deoarece la eucariote nu au fost
evideniai operoni.
La E. coli operonul lactoz (lac) este alctuit din 5.113 perechi de
nucleotide, iar gena reglatoare din 1.020 perechi nucleotide, operonul triptofan
conine 6.600 perechi de nucleotide iar operonul histidinei de la Salmonella are
13.000 perechi de nucleotide.
Mrimea genei operatoare de la E. coli se pare c este alctuit din 30
perechi de nucleotide (cu o lungime de aproximativ 100 ). Nu se cunoate prea
bine modul de cuplare al genelor operatoare cu represorul, dar se pare c acesta
din urm nu se ataeaz dect de un ADN bacterian, deoarece denaturarea ADN
blocheaz activitatea represorului.
Represorul operonului lac este o protein format din patru catene
polipeptidice identice, cu o greutate molecular de 150.000 daltoni.

3.6.2. Reglajul activitii genelor la eucariote


Structura molecular a cromozomului la eucariote este mult mai
complex dect la procariote. Cromozomii eucariotelor sunt alctuii din: 13-16%
ADN, 12-13% ARN i 68-72% proteine histonice i nehistonice. La eucariote,
programul genetic este alctuit dintr-un numr foarte mare de gene (cteva zeci de
mii), gene care nu funcioneaz simultan, chiar mai mult, n unele celule
difereniate, majoritatea genelor sunt inactive. Toate aceste aspecte fac ca reglajul
genetic la eucariote s fie mult mai complex, reglajul sintezei proteice realiznduse la nivelul genei i nu la nivelul operonilor. Se poate spune c ARNm la
eucariote transcrie mesajul genetic al unei singure gene, deci pentru un singur lan
polipepidic. Acest fapt a fost demonstrat prin compararea mrimii poliribozomilor
angajai n sinteza miozinei, hemoglobinei sau gammaglobinei.
Funcionarea ADN al eucariotelor ca matri pentru sinteza ARNm este
dependent de conformaia spaial tridimensional a nucleohistonelor.
Superspiralizarea nucleohistonelor face ca ADN s nu poat funciona ca matri
pentru ARNm. Ca regul, cromatina condensat nu poate fi transcris, pe cnd
cromatina difuz permite ca ADN s funcioneze ca matri pentru ARNm, sinteza
acestuia realizndu-se n interfaz.
La eucariote, reglajul activitii genelor are loc la trei niveluri:
a) Reglajul la nivelul transcripiei, care const n cuplarea proteinelor
cromozomice cu un segment din macromolecula de ADN de pe care trebuie s se
transcrie informaia genetic i n acest caz se blocheaz sinteza ARNm.
b) Reglajul la nivelul translaiei, ce const n degradarea ARNm format
prin transcripie de ctre enzime denumite nucleaze, localizate de o parte i de alta
a membranei nucleare.
86

c) Reglajul posttranslaional ce se manifest la nivelul catenelor


polipeptidice, unde intervin o serie de factori ce mpiedic agregarea
monocatenelor pentru a forma stucturi cuaternare, tiindu-se c aceast structur
este funcional.
n realizarea reglajului genetic la eucariote, un rol deosebit de important
l au proteinele cromozomice, histonele i nehistonele, care mpreun cu catena
ADN i ARN cromozomic formeaz cromatina.
Histonele sunt proteine bazice deoarece sunt bogate n aminoacizii
bazici, arginina, lizina i histidina i complet lipsite de triptofan.
Histonele sunt lipsite de specificitate fiind grupate n cinci clase n
funcie de ponderea celor trei aminoacizi i n funcie de greutatea molecular.
Histonele ca i ADN sunt sintetizate numai n faza S a interfazei, de ctre o serie
de gene cromozomice. Histonele se caracterizeaz printr-o mare stabilitate n
cursul evoluiei i o mare uniformitate de o specie la alta. De exemplu, histona H1
de la mazre difer numai prin doi aminoacizi fa de aceeai histon de la
taurine.
Aa cum s-a vzut ntr-un capitol anterior, cromozomul eucariotelor este
constituit din uniti denumite nucleosomi, n care molecula de ADN este asociat
cu histone i nehistone, fapt ce explic sinteza simultan a celor dou substane n
faza S a ciclului mitotic.
Histonele asigur stabilitatea structurii cromozomului i sunt implicate
n transcripia mesajului genetic, n mod nespecific.
Nehistonele sunt proteine cromozomice foarte variate ca structur i
funcie, cu o greutate molecular cuprins ntre 10.000 i 15.000 daltoni. Din
grupul proteinelor nehistonice fac parte: ADN i ARN polimerazele, enzimele ce
intervin n sinteza i degradarea proteinelor, proteinele cu rol structural i reglator
din cromozom.
Proteinele nehistonice reacioneaz n mod specific cu molecula de
ADN, determinnd transcripia difereniat a genelor n funcie de esut i de
celule, determinnd ce gene vor fi transcrise, avnd un caracter reglator specific.
Modelul de reglaj genetic la eucariote este prezentat n figura 3.11.
Conform acestui model, proteinele nehistonice se ataeaz n mod specific la
nivelul unei gene, care n mod obinuit este represat de proteinele histonice. ntre
cele dou tipuri de proteine are loc o reacie de fosforilare, prin care se elibereaz
un radical fosforic, n urma creia complexul histon-nehiston rmne ncrcat
negativ. Acest complex este respins de molecula de ADN a crei sarcini electrice
sunt tot negative, n aceast zon, ADN eliberat de histone, putndu-se realiza
transcripia ARNm. n momentul n care gena respectiv nceteaz s mai
funcioneze, se refac moleculele de histone pe segmentul respectiv de ADN.
La organismele eucariote reglajul genetic se realizeaz nu numai la
nivelul genelor individuale ci la nivelul segmentelor cromozomice, a
cromozomilor sau chiar a genomului.
Astfel, reglajul genetic se poate realiza i prin heterocromatinizare.
Heterocromatina este de obicei localizat n jurul centromerului i n zona
87

satelitului cromozomului. n zona heterocromatic, cromatina este puternic


spiralizat iar ADN are o funcionalitate redus.
Heterocromatina este de dou tipuri: constitutiv i facultativ.
Heterocromatina constitutiv conine o cantitate mare de ADN repetitiv
(redundant) formnd de obicei gene nefuncionale. Heterocromatina facultativ
rezult din heterocromatinizarea unor regiuni eucromatice. Prin transferul unui
segment eucromatic n apropierea heterocromatinei constitutive, acesta se
heterocromatinizeaz i invers.
Un alt fenomen este heterocromatinizarea unuia din cei doi cromozomi
X de la sexul femel al mamiferelor, formnd cromatina sexual, astfel nct, la
ambele sexe funcioneaz numai cte un cromozom X din perechea de cromozomi
ai sexului. Acest fapt a fost demonstrat la multe organisme la care sexul femel
este homogametic.

Fig. 3.11. - Reglajul genetic la eucariote cu ajutorul proteinelor histonice


i nehistonice
88

La Drosophila melanogaster genele ce determin culoarea galben


deschis a ochilor este localizat pe cromozomul X, dar s-a constatat c ambele
sexe produc aceeai cantitate de pigment. La om, gena ce determin sinteza
enzimei glucoz-6-fosfat dehidrogenaza (G-6-PD) este plasat pe cromozomul X,
ns ambele sexe produc aceeai cantitate de enzim. Heterocromatinizarea unui
cromozom X se realizeaz numai n celulele somatice, n celulele sexuale ambii
cromozomi X sunt funcionali.
Se poate constata c, n cazul acesta, reglajul genetic se realizeaz la
nivelul ntregului cromozom, deoarece toate genele de pe cromozomul X sunt
inactive.
Reglajul genetic se poate realiza la unele organisme prin inactivitatea
ntregului genom sau cu ajutorul unor hormoni.
n ultim instan diferenierea celular la eucariote este tot un proces de
reglaj genetic celular, deoarece n unele celule sunt activate numai anumite gene
i anume n celulele specializate.

3.7. NOIUNEA DE GEN I EVOLUIA EI


Rezolvarea complexelor aspecte ale ereditii sunt legate n mod
permanent de elucidarea structurii i funciei genei. Pentru aceasta s-au efectuat
cercetri minuioase, care au implicat mai multe discipline: genetica, biochimia,
fizica, fiziologia, care formeaz o disciplin complex, biologia molecular.
Obiectivele biologiei moleculare fiind descifrarea proceselor de sintez a
produselor celulare i dependena acestora de informaia ereditar din molecula de
ADN, au dus la modificarea concepiilor despre gen, de-a lungul timpului.
Ideea de unitate ereditar este foarte veche, astfel, Maupertius (16981759) o denumete particul seminal, iar Buffon (1707-1788), molecul
organic (citai de C. Maximilian, 1984). Darwin (1868) denumete aceste
particule gemule, Ngeli (1884) le denumete micele, Hugo de Vries, pangene iar
A. Weismann, determinante.

3.7.1. Gena n concepia geneticii clasice


G. Mendel arat c n celulele exist factori ereditari care determin
caracterele ereditare perechi, n celulele somatice i sub form simpl, n celulele
sexuale.
Termenul de gen (gr. genos = urma) a fost introdus de W. Johannsen,
n anul 1903, ns nu l consider ca pe o unitate fizic, ci pe un corespondent al
factorilor ereditari imaginai de G. Mendel.
n concepia clasic gena prezint trei caracteristici de baz: unitate
funcional, unitate mutaional i unitate de recombinare.
Ca unitate funcional, gena este cel mai scurt fragment dintr-un
cromozom, n interiorul creia orice modificare afecteaz acelai caracter, deci
89

gena este cea mai mic unitate care produce un anumit efect fenotipic.
Ca unitate mutaional, gena este cea mai mic parte dintr-un genom,
care prin mutaie d natere la alela sau alelele sale, cu caracter modificat.
Ca unitate de recombinare, gena este cel mai mic segment dintr-un
cromozom, care se poate transfera prin crossing-over pe cromozomul omolog i n
interiorul cruia nu are loc crossing-over (unitate indivizibil de crossing-over).
Acest mod de a defini gena s-a dovedit a fi simplificat, deoarece chiar la
nceputul secolului XX s-a demonstrat c gena este o unitate genetic mult mai
complex, format din sublocusuri sau subgene.
Existena subunitilor de gen a fost dovedit de E. B. Lewis n anul
1951 la locusul lozenge (lz) de la Drosophila melanogaster. Locusul lz se gsete
pe cromozomul X n poziia 27,7 uniti de recombinare i determin modificri
n pigmentaia ochilor, structura faetelor i fertilitatea femelelor.
Heterozigoii obinui n urma ncrucirilor dintre mutante ale locusului
lz, au avut fenotip mutant cu caractere intermediare. n urma analizei a peste
100.000 de indivizi, Lewis a gsit i 0,02% indivizi de tip normal (slbatic),
nemutani, desprinznd concluzia c ntre subgenele locusului lozenge a avut loc
un crossing-over. Locusul lozenge cuprinde cel puin trei uniti ntre care apare
un mic procent de recombinare.
Fiecare din cele trei subuniti, cnd apare singur n genom, este
lz + +
. Cnd individul
recesiv i determin un fenotip normal, cu genomul: 1
+++
heterozigot cuprinde doi factori (lz1 i lz2), ei pot fi pe acelai cromozom (poziie
lz 1 lz 2 +
lz 1 + +
sau cte unul de fiecare cromozom omolog
(poziie trans).
cis):
+++
+ lz 2 +
Fenotipurile sunt diferite, n primul caz este normal iar n al doilea caz este
mutant.
Acesta demonstreaz c locusul lozenge este un locus complex, alctuit
din mai multe subuniti.
Pe baza efectului cis-trans s-a ajuns s se stabileasc dac dou mutaii
foarte asemntoare aparin unei serii alelice ale aceluiai locus sau sunt nealele i
aparin la doi loci diferii.
Dou gene sunt alele, cnd aparin aceluiai locus i dac heterozigotul
n poziie trans are un fenotip normal, nseamn c genele respective sunt nealele.
Apogeul n concepia clasic despre gen, l-a constituit ipoteza "o gen
- o enzim" elaborat de G. W. Beadle i E. L. Tatum (1941). Conform acestei
ipoteze, sinteza fiecrei enzime este determinat de informaia unei gene, deci
ntre gene i enzime ar exista raportul de 1:1. Mutaia unei gene determin
blocarea sintezei unei enzime, care la rndul ei, determin oprirea ntregului lan
metabolic.
Elaborarea ipotezei "o gen - o enzim" a fost posibil n urma unor
experiene efectuate la ciuperca Neurospora crassa. La aceast ciuperc s-a
elaborat o metod rapid de identificare a mutantelor biochimice. Metoda const
90

n urmtoarele: se iradiaz conidii ale ciupercii n scopul obinerii de mutante


biochimice defective, care se cultiv apoi pe un mediu minimal, ns conidiile
mutante nu vor putea crete pe acest mediu.
Pentru ca mutantele s creasc pe mediu minimal trebuie adugat n
mediu substana pe care mutanta nu o poate sintetiza, deoarece la mutante s-a
declanat lanul proceselor metabolice care duc la sinteza acelui produs.
Dac se analizeaz schema de mai jos, a unei ci metabolice, ipoteza "o
gen - o enzim" demonstreaz c fiecare enzim care intervine ntr-un proces
metabolic este controlat de o gen:

Substrat

Gena A

Gena B

Enzima A

Enzima B

Produsul A

Gena C
Enzima C
Produsul B

Produsul C

Studiul mutantelor de Neurospora, a bacteriilor i algelor a dovedit c


blocarea unei etape dintr-un lan metabolic este legat de mutaia unei gene care
inactiveaz o enzim.
Dei ipoteza "o gen - o enzim" nu poate fi neleas n sensul strict c
o gen determin sinteza unei singure enzime, a constituit un pas important n
evoluia conceptului de gen i pentru elucidarea funciilor acesteia.

3.7.2. Gena n concepia geneticii moleculare


Studiile de genetic molecular, metodele moderne de cercetare,
folosirea intens a virusurilor i bacteriilor, au permis o analiz genetic foarte
fin a genei, n urma creia s-a constatat c gena este o unitate foarte complex,
alctuit din subuniti ntre care pot avea loc recombinri intragenice i pot fi
modificate prin mutaii.
Structura fin a genei a fost realizat de S. Benzer (1957) la gena rII a
fagului T4 ce infecteaz bacteria Escherichia coli. Gena rII este alctuit din dou
regiuni denumite cistroni i notai cu A i B. Mutaiile dintr-un grup sunt
complementare numai cu mutaiile din cellalt grup. Cnd ntre doi bacteriofagi
cu cte o mutaie n regiunile A i B are loc recombinarea, apar indivizi de tip
normal, r+, care produc distrugerea (liza) bacteriei. Metoda de detectare a
recombinrii este foarte sensibil deoarece d posibilitatea identificrii unui
recombinant, chiar dac a aprut cu o frecven de numai 0,0001%. Acest
fenomen permite identificarea recombinrilor chiar ntre regiuni extrem de
apropiate ale genei.
Cercetrile mai noi au demonstrat c unitatea mutaional este perechea
de nucleotide, care, n acelai timp este i cea mai mic unitate de recombinare
genetic.
91

Prin numeroase cercetri s-a ajuns la concluzia c secvena


nucleotidelor dintr-o gen determin secvena aminoacizilor din catena
polipeptidic, fenomen denumit colinearitate.
Gena, n concepia geneticii moleculare, este definit drept un segment
din macromolecula de ADN (sau ARN n cazul unor virusuri), format dintr-o
secven anumit de nucleotide, care acioneaz ca o unitate funcional i care
conine informaia genetic ce determin secvena nucleotidelor dintr-o molecul
de ARN (transcripie genetic) i, respectiv, a aminoacizilor ntr-o caten
polipeptidic (translaie genetic).
S. Benzer (1958-1961) a denumit muton, cea mai mic unitate a genei
n care poate avea loc o mutaie, independent de alta, recon cea mai mic unitate
n care are loc recombinarea genetic i cistron cel mai mic segment de ADN
(sau gen) care poate funciona unitar i ale crui limite pot fi stabilite prin testul
cis-trans (testul de complementaritate).
Se poate afirma c gena este identic cu cistronul.
n concepia geneticii moleculare, gena poate fi definit succint astfel: o
gen sau cistron - o caten polipeptidic.
Din punct de vedere funcional, genele pot fi clasificate dup Paigen i
Ganschow (1965) (citai de P. Raicu, 1980) n patru tipuri: gene structurale, ce
determin secvena aminoacizilor ntr-o caten polipeptidic; gene reglatoare, ce
controleaz sinteza proteinelor prin intermediul unui represor; gene
arhitecturale, care determin integrarea proteinelor sintetizate n structuri
celulare i gene temporare, care activeaz cele trei tipuri de gene, n timp, pe
baza unui program genetic, pentru realizarea fenomenului de citodifereniere.
Genetica molecular a adus noi elemente de detaliu i asupra structurii
genei. La eucariote gena este constituit dintr-o secven linear de nucleotide,
continu, ce codific o secven de nucleotide informaionale denumite exoni,
separate prin segmente noninformaionale (ADN silenios) denumite introni. De
exemplu, gena ovalbuminei la gin este format din opt exoni i apte introni
(figura 3.12).

Fig. 3.12. - Structura genei ovalbuminei, format din exoni i introni


92

Pentru a se realiza fenomenul de transcripie a ARNm, se formeaz mai


nti un ARN precursor care determin eliminarea segmentelor noninformaionale
(introni), sintetizndu-se apoi un ARNm care copie informaia genetic numai a
exonilor (R. J. Roberts i A. Ph. Sharp 1993).
Se pare c secvenele noninformaionale au un rol important n evoluia
materialului genetic.
n genomul eucariotelor numrul de gene este relativ mic, comparativ cu
cantitatea de ADN. La om, n funcie de mrimea genelor i de cantitatea de
ADN, ar trebui s existe un numr de 3 x 106 gene. n realitate numrul de gene
este mult mai mic, 5 x 104, ceea ce nseamn c o mic parte din ADN este
informaional, iar restul este noninformaional, ndeplinind alte roluri n genom.
Genele au dou funcii eseniale: funcia autocatalitic i
hetorocatalitic.
Funcia autocatalitic const n capacitatea genelor, deci i a
macromoleculei de ADN, de a se replica cu mare fidelitate, dup modelul
semiconservativ, aa nct celulele fiice vor moteni aceleai gene ca celulele
mam.
Funcia heterocatalitic a genelor, const n capacitatea acestora de a
determina, prin secvena de nucleotide ce o posed, sinteze specifice de proteine,
enzime, biomolecule, informaia genetic fiind deci decodificat i transformat
ntr-o secven de aminoacizi, n catene polipeptidice.
Cele dou funcii ale materialului genetic au dus la formularea dogmei
centrale a geneticii, care poate fi redat sintetic prin urmtoarea relaie:
ADN

ARN

proteine

n cazul unor ribovirusuri s-a descoperit c poate fi un transfer de


informaie de la ARN la ADN. Fenomenul a fost descoperit de Howard Temin
(1972) la virusul ce provoac sarcomul Rous la psri, care este un virus ARNADN, n sensul c ARNv se replic prin intermediul ADN.
Descoperirea fcut de Temin constituie o excepie de la dogma central
a geneticii, prin care s-a dovedit c ARN poate determina sinteza ADN.

3.7.3. Gene suprapuse i gene sritoare


n cadrul cromozomului bacterian i viral, genele sunt dispuse linear,
ntr-o anumit ordine, alctuind o singur grup de linkage.
Destul de recent, la fagul x174 s-au descoperit aa numitele gene
suprapuse, ceea ce nseamn c o anumit secven de codoni poate fi
decodificat de mai multe ori, realizndu-se sinteza a dou catene polipeptidice
diferite.
Structura genomului fagului x174 a fost descifrat integral, fiind
constituit din nou gene, deoarece s-a constatat c prin infecia bacteriei E. coli
93

sunt produse nou proteine diferite. Identificarea tuturor nucleotidelor din


genomul virusului a permis delimitarea celor nou gene ce au fost notate astfel: A,
B, C, D, E, J, F, G, H. Exist poriuni de ADN noninformaional care separ
aceste gene ntre ele.
Genele A i B determin sinteza a dou proteine diferite. S-a constatat
c gena B reprezint partea terminal a genei A care este mult mai mare, deci
genele A i B sunt suprapuse, gena B fiind translat dintr-un punct de iniiere
intern. Genele D i E sunt de asemenea gene suprapuse. Suprapunerea genelor
nseamn, pe de o parte economie de material genetic, dar pe de alt parte poate fi
i un dezavantaj, deoarece apariia unei mutaii ntr-o gen determin modificarea
i celorlalte gene suprapuse. Gene suprapuse s-au observat i la ali fagi: S13, G4,
SV40 etc.
Genele sritoare (jumping genes) sunt acele gene care se pot include n
diferite regiuni ale cromozomului. Fenomenul a avut la baz observaia c fagul
se poate integra ntr-un loc specific a cromozomului bacterian cu o frecven de
100%. Acest sistem s-a determinat i pentru unele segmente de ADN, care nu au
origine fagic. De exemplu, la bacterii s-au identificat segmente de ADN alctuite
din 800-2.000 nucleotide, care se pot insera n diferite regiuni ale cromozomului
i pot provoca mutaii. Aceste segmente au fost denumite segmente de inserie
(insertion sequences) i au fost notate: IS1, IS2, IS3 i IS4.
Factorul de fertilitate F, precum i unele plasmide, prezint n structura
lor normal fragmente IS. De exemplu, factorul de fertilitate F are segmentele de
inserie IS2 i IS3, ce determin capacitatea acestuia de a se integra n cromozomul
bacterian.
Unele segmente de ADN ce determin rezistena la antibiotice pot "sri"
dintr-un locus n altul, gsindu-se la nivelul unui plasmid, apoi n genomul
fagului, apoi n cromozomul bacterian i apoi iar n plasmid. Aceste gene sritoare
sunt denumite i transpozoni, fiind uniti independente, n funcie de rezistena
pe care o determin (streptomicin, penicilin, kanamicin, tetraciclin,
cloramfenicol etc.).
La eucariote, nc din anul 1951, Barbara Mc Clintock, studiind
culoarea boabelor de porumb de-a lungul mai multor generaii, a artat c anumite
structuri din masa genetic "sar" cte 1-2 generaii, ns observaia respectiv nu a
atras atenia oamenilor de tiin. Dup aproape dou decenii s-a descoperit c
este vorba de o gen structural ce deinea informaia genetic i alte dou tipuri
de gene ce controlau strict elementele de disociere la nivel cromozomic.
n anul 1983, Barbara Mc Clintock a primit laurii Premiului Nobel, iar
pe baza descoperirii sale s-au formulat noi ipoteze privind geneza cancerului.
n general, se consider c transpozonii (sau genele sritoare) determin
o mare frecven de rearanjamente moleculare la nivelul macromoleculei de ADN
(inversii, deleii, duplicaii, transpoziii, inserii etc.) cu un rol esenial n evoluia
i, se pare, c i n procesul de citodifereniere.

94

3.8. REPRODUCEREA I RECOMBINAREA GENETIC


LA PROCARIOTE
Procariotele (gr. pro = nainte, karyon = nucleu) sunt organisme
primitive extrem de simple, de obicei unicelulare, fr nucleu, cu o structur
genetic simpl, o singur macromolecul de ADN ce alctuiesc cromozomul.
Principalele tipuri de procariote sunt: viroizii, virusurile, micoplasmele, bacteriile
i cianoficeele.
Virusurile sunt ageni infecioi considerai fie organisme extrem de
rudimentare, fie molecule foarte complexe, de aceea, n mod obinuit, nu sunt
incluse n grupul procariotelor.
Pentru genetica molecular, bacteriile i virusurile au constituit
obiectele de studiu de mare importan, deoarece au o structur foarte simpl i se
reproduc ntr-un timp foarte scurt. Descoperirile structurii materialului genetic, a
mecanismului a informaiei genetice, au fost posibile datorit folosirii ca material
de cercetare a bacteriilor i virusurilor.

3.8.1. Reproducerea bacteriilor i virusurilor


Celula bacterian este alctuit din citoplasm nconjurat de o
membran citoplasmatic, care la exterior are o membran rigid, iar la unele
bacterii, de acest perete se ataeaz o capsul format din polizaharide sau
polipeptide. n citoplasm se gsete o regiune mai dens denumit nucleoid, un
numr mare de ribozomi (15-20.000), o formaiune denumit mezozom ce se
formeaz prin invaginarea membranei celulare, de care se ataeaz cromozomul
circular bacterian.
Dup J. D. Watson (1965) n celula bacterian ar exista ntre 3.000 i
6.000 substane chimice, de la cele mai simple la cele mai complexe, pentru
sinteza crora sunt necesare numeroase ci metabolice, ce alctuiesc
metabolismul celular al bacteriei.
Bacteriile posed un singur cromozom circular, format din ADN dublu
catenar, cu o lungime de 700-900 , care formeaz un singur grup de linkage.
Bacteriile se reproduc amitotic, deci prin simpl fisiune sau prin alte
forme de reproducere asexuat, uneori i prin nmulire sexuat. Ciclul celular
cuprinde trei perioade: de pregtire (cretere) pentru iniierea procesului de
replicaie a ADN, de replicaie propriu-zis, urmat de diviziunea celulei.
Bacteriile sunt haploide numai n stadiul de spori, n rest sunt parial
diploide datorit procesului de replicaie, deoarece, uneori, naintea terminrii
unui ciclu de replicaie ncepe un al doilea ciclu de replicaie sau chiar al treilea.
Pe lng cromozomul bacterian exist i un alt material genetic
reprezentat prin plasmide, alctuite tot din ADN, dar mult mai mici dect
cromozomul propriu-zis. Principalele tipuri de plasmide sunt: factorul de
fertilitate (F) ce creeaz deosebiri de sex ntre indivizi, factorul colicinogenic
95

(Col), care se gsete la unele bacterii (Col+) ce elaboreaz o substan toxic,


colicina, un grup mai mare de factori ai transferului de rezisten (RTF). Se
consider c originea plasmidelor ar fi exogen i anume virusuri, care au
dobndit un nalt grad de echilibru cu celula bacterian, pe care nu o mai pot
distruge.
Virusurile sunt alctuite dintr-un nveli proteic denumit capsid,
constituit dintr-un numr variabil (dar caracteristic pentru fiecare tip de virus) de
uniti mai mici denumite capsomere. n interiorul capsidei se gsete
macromolecula de ADN (dezoxiribovirusuri) sau ARN (ribovirusuri).
Virusurile pot fi definite ca macromolecule nucleoproteice, care au
capacitatea de a se autoreplica ntr-un sistem reprezentat de celula vie.
Ciclul de via al virusurilor cuprinde urmtoarele etape: adsorbia la
suprafaa celulei, infectarea celulei prin ptrunderea acizilor nucleici virali n
celul, faza de eclips n care virusul este descompus n elementele sale devenind
provirus. n faza de eclips ADN al celulei gazd este depolimerizat cu ajutorul
dezoxiribonucleazei produs de virus. ncepe sinteza acizilor nucleici virali i a
proteinelor virale, are loc asamblarea lor pe baza aparatului enzimatic al celulei
gazd, iar faza se numete virus vegetativ. n faza de virus matur, particulele
virale prsesc celula infectat n mod activ, prin strbaterea porilor membranei
celulare sau n mod pasiv, prin distrugerea sau liza celulei gazd. Ciclul de via
descris mai sus se numete ciclul litic.
La bacteriofagi, virusuri ce infecteaz celulele bacteriene, pe lng
ciclul litic, determinat de aa numiii bacteriofagi viruleni, exist i un ciclu
lizogenic, produs de bacteriofagi temperai. n ciclul lizogenic materialul genetic
al bacteriofagilor temperai se integreaz n cromozomul bacterian, se replic
sincron cu acesta i celula bacterian nu mai este lizat. Materialul genetic al
fagului integrat n cromozomul bacteriei poarte numele de profag.
Ciclul lizogenic poate s se transforme n ciclul litic fie spontan, fie
artificial prin iradieri cu raze X, ultraviolete sau tratamente cu azot-iperit.
Fenomenul de lizogenie prezint urmtorul avantaj: celula bacterian ce posed
un profag integrat n cromozomul su nu mai este distrus de o nou infecie a
fagului respectiv. Acest fenomen a dus la descoperirea unui tip de recombinare
genetic la bacterii, realizat cu ajutorul bacteriofagilor temperai, denumit
transducie.

3.8.2. Recombinarea genetic la bacterii


Recombinarea genetic la bacterii se realizeaz pe urmtoarele ci:
transformare, conjugare, sex-ducie i transducie.
Transformarea. Prin transformare se nelege transferul intracelular al
unui segment de ADN de la o bacterie donor, n genomul unei bacterii receptor.
Frecvena cu care se realizeaz transformarea este foarte redus, sub 1%, iar
dimensiunea minim a segmentului de ADN transformant este de 450 perechi de
nucleotide.
96

Procesul de transformare se realizeaz atunci cnd este o cantitate mare


de ADN implicat n proces i n starea de competen a celulelor bacteriene
(modificri ale membranei ce permit ptrunderea ADN).
Dup ce ADN exogen de la tipul donator a ptruns n bacteria
receptoare are loc un fenomen de sinaps ntre cele dou molecule de ADN, n
zona complementar, apoi ADN exogen se integreaz n cromozomul bacteriei
receptor, n procesul de replicaie al acestuia.
Transformarea realizeaz de obicei transferul unei singure gene, iar n
cazuri mai rare, dou sau trei gene linkage, n cel din urm caz dovedindu-se c
genele respective sunt dispuse alturat pe cromozom.
Transformarea genetic se realizeaz cu o frecven mai mare la sue
diferite ale aceleiai specii de bacterii i mai rar ntre specii diferite, dar nrudite.
Transformarea genetic poate oferi informaii privind gradul de nrudire
filogenetic a unor specii. Tot cu ajutorul transformrii genetice s-au putut
localiza unele gene pe cromozomul bacterian.
Conjugarea. Fenomenul de conjugare a fost descoperit n anul 1946 de
J. Lederberg i E. L. Tatum, fiind considerat un fenomen de parasexualitate,
similar oarecum cu reproducerea sexuat de la organismele eucariote. Conjugarea
se realizeaz numai ntre dou bacterii de sex opus, iar sexul este determinat de o
plasmid, denumit factor de fertilitate sau sex factor, notat cu F. Celulele care
posed acest factor sunt "mascule", notate cu F+ iar cele ce nu posed acest factor
sunt "femele", F-. Factorul de fertilitate se poate gsi liber n citoplasm i n acest
caz se replic independent de cromozomul bacteriei, dar n acest caz fenomenul
de conjugare se produce cu o frecven destul de redus, i anume de 10-5. n
unele cazuri, factorul de fertilitate poate fi integrat n cromozomul bacterian, iar
aceste celule mascule au fost notate cu Hfr (high frequency of recombination).
ntre celulele Hfr i celulele F-, conjugarea are loc cu o frecven mult mai mare,
i anume 10-1.
Factorul de fertilitate are o serie de caracteristici structurale i
funcionale:
- are o form circular, coninnd n jur de 100.000 perechi de
nucleotide, fiind deci mult mai mic dect cromozomul bacterian;
- factorul F are capacitatea de a se replica mai repede dect cromozomul
bacterian, astfel c, dac ntr-o cultur de celulele F- se introduce o singur celul
F+, ntreaga cultur devine ntr-un timp scurt F+;
- prin conjugarea ntre celulele F+ i F- se transmite de obicei numai
factorul F+, dar frecvena conjugrii este redus, n timp ce conjugarea ntre
bacterii Hfr i F- are loc cu o frecven mare, iar ntre cele dou celule poate avea
loc i un transfer total sau parial al cromozomului de la bacteria donatoare;
- n urma conjugrii, factorul de fertilitate este cel care se transfer
ultimul n celula receptoare, el orientnd direcia de transfer al cromozomului, n
funcie de locul unde este integrat.
97

Conjugarea a fost studiat la microscopul electronic, descoperindu-se c


bacteriile Hfr i F+ posed un apendice filamentos, denumit F-pilus care este
absent n celulele femele (F-). Aceti F-pilus (sau sex-pili) realizeaz legtura
dintre dou bacterii de sex opus, fiind un fel de tuburi prin care materialul genetic
al unei bacterii (F+ sau Hfr) trece total sau parial n celulele F-.
Fenomenul de conjugare a fost studiat i printr-o alt tehnic: procesul
de transfer al materialului genetic este ntrerupt prin agitare. Prin aceast metod
s-a putut determina poziia linear a genelor pe cromozomul bacterian, precum i
corelaia precis ce exist ntre frecvena recombinrilor i timpul ct dureaz
conjugarea.
F. Jacob i E. L. Wollman (1961) studiind conjugarea la dou sue de E.
coli, au determinat timpul necesar pentru transferul fiecrui locus n parte,
ajungnd la concluzia c ntregul cromozom bacterian este transferat n 89
minute. Pe aceast cale s-au alctuit la unele bacterii, harta genetic, deoarece
lungimea cromozomului poate fi msurat n uniti de timp, n care o unitate este
egal cu 1 minut.
Fenomenul de conjugare este strns legat de sinteza ADN.
Replicarea ADN bacterian ncepe ntr-un anumit locus pentru o anumit
su. Dup ce celulele Hfr i F- vin n contact, n celula Hfr ncepe sinteza ADN,
astfel c, n celula F- migreaz un ADN dublu catenar, format dup modelul
semiconservativ. Ambii cromozomi ai bacteriei donator (Hfr), cel care rmne n
celula Hfr i cel care se transfer sunt ataai de membrana bacterian ntr-un
punct denumit mezozom. n cursul transferului de material genetic, cromozomul
circular de la bacteria Hfr devine linear i migreaz n aceast form. Ruperea
cromozomului bacterian n vederea conjugrii se realizeaz ntr-un punct denumit
replicator, care de cele mai multe ori este locul unde este inserat factorul de
fertilitate F. La bacterii existnd diferite sue Hfr, ruperea cromozomului se
realizeaz n diferite puncte, acest lucru constituind un avantaj n alctuirea
hrilor genetice, avnd n vedere c genele localizate n jurul factorului F sunt
transferate ultimele.
Sex-ducia, denumit i F-ducia sau transducia F-mediat, este o alt
cale de recombinare genetic la bacterii, descoperit de F. Jacob i E. L. Wollman
(1960).
Cercetrile care au dus la descoperirea acestui tip de recombinare s-au
fcut la E. coli, la o su Hfr, care avea factorul de fertilitate inserat lng gena
lac+. n procesul de conjugare dintre o bacterie Hfr lac+ i alta F-lac- ar fi trebuit s
apar recombinani pentru gena lac+, foarte trziu, aproape de sfritul transferului
de material genetic. S-a constatat c au aprut civa recombinani lac+, foarte
devreme. Concluzia a fost urmtoarea: factorul F este eliberat din cromozomul
bacterian dar printr-un proces de crossing-over, ntre cromozom i factorul F are
un schimb de material genetic, rezultnd un factor de fertilitate recombinat, notat
cu F' (figura 3.13).
Prin trecerea factorului F' ntr-o celul F-, el poate fi inclus n
cromozomul bacterian ntr-o regiune omoloag cu regiunea cromozomic pe care
o poart, orientnd procesul de conjugare la fel ca n cazul bacteriei Hfr iniiale.
98

Sex-ducia poate fi definit ca fiind procesul prin care gene ale


cromozomului bacterian sunt ncorporate n factorul de fertilitate F i pe care le
transfer la celulele F- prin procesul de conjugare.

Fig. 3.13. - Formarea factorului de fertilitate recombinat F'

n factorul F pot fi incluse diferite gene, deoarece factorul F poate fi


integrat n diferite regiuni ale cromozomului.
Celulele bacteriene ce prezint factorul F' pot fi transformate n celule
Hfr, prin inseria factorului F' n cromozomul bacterian.
Fenomenul de recombinare prin intermediul sex-duciei s-a realizat i
ntre specii diferite de bacterii. Astfel, factorul F este absent la speciile de
Salmonella, Shigella, Pasteurella, dar poate fi transferat la acestea de la E. coli.
Transducia este procesul prin care bacteriofagii temperai realizeaz
transferul de informaie genetic de la o bacterie la alta. Acest fenomen a fost
descoperit de N. D. Zinder i J. Lederberg n anul 1952, la bacteria Salmonella
typhimurium, cu ajutorul bacteriofagului P32. Experiena efectuat de cei doi
cercettori a constat n urmtoarele: ntr-un tub Davis, separat la mijloc printr-un
filtru de sticl poroas ce permite trecerea bacteriofagilor, dar nu i a bacteriilor, a
introdus n cele dou brae dou sue bacteriene diferite (figura 3.14).

Fig. 3.14. - Evidenierea transduciei bacteriene


99

Sua LA22 este auxotrof, dar cu genotipul fen-tri-met+hia+, deci prezint


concomitent dou mutaii biochimice, neputnd sintetiza aminoacizii fenilalanin
i triptofan, iar sua LA2 este tot auxotrof, dar cu genotipul fen+tri+met-hispentru alte dou gene, neputnd sintetiza aminoacizii metionin i histidin. Sua
LA22 este lizogen, n sensul c, n cromozomul su era integrat profagul P22. Unii
bacteriofagi sunt eliberai din cromozomul bacteriei i produc liza acesteia.
Bacteriofagii pot trece prin filtrul de sticl, produc liza bacteriei LA2, apoi pot
reveni n tubul n care se gsete bacteria LA22 cu care pot stabili din nou relaii
lizogene n urma crora pot apare indivizi recombinai prototrofi (de tip slbatic)
pentru toate cele patru gene, fen+tri+met+his+.
Explicaia acestui fenomen este urmtoarea: bacteriofagul P22 producnd
liza bacteriei LA2 include, cu o mic frecven, 1 la 105-107, segmentul de
cromozom cu genele fen+tri+ de la aceast su. Stabilind relaii lizogene cu sua
LA22, bacteriofagul P22 transfer acest segment n cromozomul acestuia rezultnd
recombinani genetici de tip slbatic (fen+tri+met+his+).
Cercetrile privind transducia au artat c de obicei se transfer o
singur gen, n cazuri rare dou gene i niciodat trei gene. n cazul transferului a
dou gene, se demonstreaz c cele dou gene sunt foarte apropiate pe
cromozomul bacteriei, servind la stabilirea precis a locilor acestora, deci la
alctuirea hrilor genetice cu ajutorul transduciei.
Transferul concomitent a dou gene prin fenomenul de transducie a fost
denumit cotransducie.
Transducia este de dou tipuri: transducie specializat, cnd un
bacteriofag transfer numai o anumit gen i generalizat cnd un bacteriofag
poate transfera oricare gen dintr-un cromozom bacterian.
Transducia specializat a fost observat la bacteriofagul ce infecteaz
E. coli. Acest bacteriofag este inclus sub form de profag n cromozomul bacteriei
numai alturi de locusul gal (gena ce determin metabolizarea galactozei).
Bacteriofagul poate transfera numai gena gal+ de o su bacterian la alta. Dac
o cultur lizogen cu bacteriofagul este tratat cu raze UV, bacteriofagul se
elibereaz din cromozomul bacterian i produce liza bacteriei, putnd infecta apoi
bacterii gal-, care se transform cu o anumit frecven n bacterii gal+.
n cazul transduciei generalizate se poate realiza transferul oricrei gene
de la o bacterie donor la o bacterie receptor, deci bacteriofagul transductant poate
ncorpora oricare gen i o transfer altei bacterii.

3.8.3. Recombinarea genetic la virusuri


Recombinarea genetic la virusuri se realizeaz n cazul unor infecii
mixte, cu dou sau mai multe tipuri de bacteriofagi. n urma lizei bacteriei pot
apare fagi recombinai.
Primele cercetri care au pus n eviden recombinarea genetic la
virusuri au fost realizate de A. D. Hershey i R. Rothman (1940) la bacteriofagul
T2 de la E. coli.
100

S-au folosit dou caractere ale acestui fag: forma plajelor de liz (r) i
irul de gazde (host range) notat cu h. Bacteriofagii de tip slbatic (r+) n
momentul n care infecteaz bacteria formeaz zone sau plaje mici ce au un halou
difuz. Apariia acestui halou se datoreaz suprainfeciei provocate de generaiile
succesive ale bacteriofagului T2, existnd un numr mare de bacterii
suprainfectate, dar nelizate, formnd pe marginea plajei un halou difuz.
Bacteriofagii mutani r- determin o liz rapid a bacteriilor, fr ca
suprainfecia s inhibe sau s ntrzie liza, astfel c, aceste plaje sunt mai mari i
fr halou, cu marginile clare.
Tipul slbatic h+ poate liza sua B de E.coli, dar nu poate liza sua B2.
Dac un amestec de bacterii B i B2 sunt infectate cu bacteriofagi h+ ntreaga
cultur apare tulbure din cauz c unele bacterii au fost lizate iar altele nu.
Mutanta h- a bacteriofagului T2 lizeaz ambele sue B i B2 ale bacteriei,
producnd plaje de liz obinuite, cu halou.
Dac se fac infecii mixte cu dou sue ale bacteriofagului T2, cu
genotipurile h-r+ i h+r- s-a constatat c n cultur apar i bacteriofagi recombinai
h-r- i h+r+ datorit unui schimb de material genetic ntre genomurile fagilor.
Dac n experiena respectiv se introduce i o a treia mutant, poate fi
stabilit ordinea i distana dintre genele bacteriofagului pe baza procentului de
recombinare.

101