ANALIZA ADN

Autor: Pop Alexandra-Ioana

Coordonator tiinific:Conf.Dr. Coier Viorica

CUPRINS:
INTRODUCERE......................................................................................................................3

STRUCTURA SI FUNCTIA ADN-ULUI...............................................................................3

SURSE DE PROBE SI EXTRACIA ADN............................................................................4

SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS (SNP)............................................................5

METODA DIDEOXI................................................................................................................5

MINISATELII SAU (VNTR).............................................................................................6

MICROSATELII SAU (STR)..............................................................................................6

RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISMS (RFLP)..............................7

REACIA N LAN A POLIMERAZEI (PCR).....................................................................7

ELECTROFOREZA...............................................................................................................10

TEHNICI DE BLOTTING.....................................................................................................11

ANALIZA ADN CU NUMAR SCAZUT DE COPII............................................................11

AMPRENTAREA ADN SINGLE CELL...............................................................................12

ADN-UL MITOCONDRIAL (MTDNA)...............................................................................13

FENOTIPIZAREA ADN N SCOP MEDICO-LEGAL.......................................................14

Y ANALIZA CROMOZOMIALA........................................................................................16

BIBLIOGRAFIE....................................................................................................................17

INTRODUCERE:

2
Majoritatea celulelor care alctuiesc atat corpul uman cat si cel animal sau vegetal sunt celule
diploide care poart ADN identic, cu excepia gameilor haploizi (oul i sperma) i celulelor roii
din snge (care nu au nici un nucleu). Mai multe tipuri de probe biologice sunt frecvent utilizate
n domeniul tiinei n scopul analizei ADN-ului, inclusiv snge, saliv, sperm, piele,tesut
vegetal , urin i pr, dei unele sunt mai utile dect altele. Utilizarea probelor biologice in
analiza ADN-ului si analiza genetica variaza, cu zone de studiu incluzand dactilografierea de
snge, determinarea sexului pe baza analizei cromozomiale (cariotipare), crearea de profiluri
ADN i, mai recent,fenotipul medico-legal al ADN-ului. De la apariia profilului ADN n anii
1980, acesta a fost utilizat cu succes n cauzele penale, identificarea victimelor dezastrelor i
pentru teste de paternitate pentru a numi doar cteva. Cu toate acestea, n ciuda meritelor lor,
amprentele digitale ADN nu sunt utilizate n mod ideal, ca unic element de prob ntr-un caz, i
n anumite ri, cum ar fi Regatul Unit, amprentele digitale ADN trebuie s fie prezentate n
combinaie cu alte elemente de prob.

STRUCTURA SI FUNCTIA ADN-ULUI:

Este esenial s se neleag structura i funcia ADN-ului i modul n care acest lucru se refer la
analiza ADN-ului n domeniul tiinei. ADN-ul, acidul dezoxiribonucleic, este o molecul
aranjata ntr-un dublu helix, structura descris pentru prima dat de ctre James Watson i
Francis Crick n 1953. Aceasta este compus din molecule de nucleotide trifosfat, denumite n
continuare "elementele constitutive" ale ADN-ului. Aceste molecule constau dintr-un grup
trifosfat, o glucid, dezoxiriboz i una dintre cele patru baze azotate. Cele patru baze implicate
ntr-o molecul de ADN sunt adenina si guanina (purine) i timina i citozina (pirimidine).
Guanina i citozina formeaz legturi la dezoxiriboz i una dintre celelalte baze se implic
pentru a forma perechi , cu adenin i timin lipirea realizdu-se prin dou legturi de hidrogen,
iar guanina i citozina lipindu-se cu trei legturi de hidrogen.

ADN-ul este, n esen, molecula care deine toate informaiile genetice i "instruciunile" pentru
un organism. Genomul uman este compus din peste 3 miliarde de perechi de baze de informaie
organizate n 23 de cromozomi. Genele sunt regiunile din ADN care codific i regleaz sinteza
proteinelor, dei acest lucru implic doar 1,5% din ntregul genom. O cantitate semnificativ a

3
genomului uman, de aproximativ 75%, est format din ADN extragenic, care conine regiuni care
nu conin de fapt secvene de gene cunoscute. Aproximativ 50% din ADN-ul extragenic este
format din ADN repetitiv, care este de o utilitate special n analiza ADN-ului. ADN-ul repetitiv
este n continuare reluat i sub-divizat n repetiii n tandem (inclusiv ADN satelii, microsatelii
i minisatellii) i (alternat SINE, LINE, LTR i Transposon). Repetarea n tandem a ADN-ului i
variaia dintre molecule (polimorfisme) este punctul central al multor tehnici de profilare.
Aceasta se datoreaz numrului i localizrii acestor polimorfisme, fiecare individ avnd ADN-ul
unic, care produce un model de band distinct atunci cnd este analizat.

Prin studiul extensiv al genomului,amprentarea ADN-ului a fost produs ca o tehnic util i de

ncredere n domeniul tiinei.

SURSE DE PROBE SI EXTRACIA ADN

n ceea ce privete analiza ADN, exist o varietate de surse posibile de probe. Sursele mai utile
includ snge, sperm, lichid vaginal, secreii nazale i secuini de pr cu rdcini. Teoretic este
posibil s se obin ADN din probe, cum ar fi urina, fecalele i celulele moarte ale pielii, dei
acest lucru este adesea considerat ca o surs slab din cauza lipsei de celule intacte i niveluri
ridicate de contaminani care mpiedic o analiz de succes. Astfel de probe vor fi colectate n
funcie de tipul de prob.

nainte de analiz, va fi necesar extragerea ADN-ului din prob. Acest lucru se realizeaz n
general prin urmtoarele etape simplificate.

Celulele de prob sunt lizate (defalcate) ntr-o soluie tampon.

proteinele i grsimile denaturate sunt peletizate prin centrifugare.
Lizatul curat este apoi trecut printr-o coloan, adesea coninnd un mediu ncrcat
pozitiv care se leag de ADN.
Proteine, grsimi i sruri contaminante sunt apoi ndeprtate prin mai multe splri.
ADN-ul este recuperat ntr-o soluie tampon / ap.
Cantitatea de ADN este adesea apoi cuantificat folosind tehnici spectrofotometrice.
Diferite metode de extracie au fost concepute pentru diferite tipuri de prob.

4
Mostrele de ADN pentru comparaie sunt, n general, colectate de la pacieni care utilizeaz
tampoane bucale, n care un tampon steril este purtat de-a lungul interiorului obrazului pentru a
colecta celulele epiteliale utilizate apoi n producerea unei amprente ADN. Sir Alec Jeffreys este
adesea descris ca printele amprentrii ADN-ului.

SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS (SNP)

Utilizarea analizei ADN-ului n domeniul tiinei se bazeaz pe o varietate de tehnici axate pe

polimorfisme, care se refer n mod esenial la variaia n secvene. Secvene diferite sunt
studiate in diferite tehnici, inclusiv polimorfisme unice de nucleotide, minisatellii (se repet un
numr variabil n tandem), microsatelii (se repet scurt n tandem) i ADN-ul mitocondrial,
fiecare diferit n ceea ce privete lungimea i repetiia.

Single Nucleotide Polymorphisms sau (SNPs) sunt cele mai simple i mai frecvente tipuri de
variaie genetica, compunnd aproximativ 90% din variaia genetica la om. Ele apar n timpul
meiozei cnd ADN-ul este replicat, fiecare SNP reprezentnd o diferen ntr-o singur
nucleotid. De exemplu, un SNP poate nlocui citozina cu o timin ntr-o poriune de ADN, iar
acest lucru nu va schimba lungimea ADN-ului. Exist aproximativ 10 milioane de SNPs in
genomul uman, cu unul gsit la fiecare 100-300 perechi de baze. Acestea pot aciona ca markeri
biologici.

n analiza SNPs, care poate consta din cele patru alele, trebuie s fie stabilit baza specific
prezent n SNP. Acest lucru se realizeaz utiliznd tehnici de secveniere ADN.

METODA DIDEOXI

De asemenea, cunoscut sub numele de metoda Sanger, aceast form de secveniere a ADN-ului
a fost dezvoltat de Fred Sanger n 1975. Un primer marcat este utilizat pentru a iniia sinteza
ADN-ului. Se adaug patru nucleotide dideoxi i se antreneaz sinteza aleatorie. Fragmentele
sunt produse i ulterior separate, folosind electroforeza sau n sisteme automate mai moderne,
electroforeza capilar. Un software specializat este apoi folosit pentru a transforma modelele de

5
band ntr-o secven ADN. Iniial au fost utilizate etichete radioactive instabile i periculoase, n
curnd nlocuite cu colorani fluoresceni. Cu toate acestea, varierea mobil a acestor colorani de
diferite culori nseamn c ordinea benzilor nu reprezint n mod necesar ordinea secvenei de
nucleotide.De asemenea, coloranii uneori se comport imprevizibil, ceea ce le face nedemni de
ncredere i nu n special ideali pentru utilizarea n cazuri medico-legale. n cazul n care
condiiile au fost nepotrivite pentru matria de ADN sau nucleotide dideoxi, reacia nu va avea
succes. Software-ul de calculator n sine a fost problematic, cu vrfuri care de multe ori se
suprapun, ceea ce face dificil stabilirea ordinii corect de nucleotide.

MINISATELII SAU NUMRUL VARIABIL DE REPETRI N TANDEM (VNTRS)

Numrul variabil de repetri n tandem (VNTRs) sunt secvene extrem de polimorfe n regiunea
exonului ADN-ului repetat la diferite puncte de-a lungul cromozomului, 4-40 ori. Ele sunt de
aproximativ 20-100 de perechi de baze n lungime, cu toate c lungimea lor specific nu este
definit strict. Aceste repetiii n tandem sunt motenite de la ambii prini, prin urmare, nimeni
nu va avea aceleai VNTRs ca oricare dintre prinii lor. Numrul de repetri la locusu afecteaz
poziia sa dup electroforez i lungimea ADN-ului dup ce cromozomul a fost tiat cu o enzim
de restricie. Minisateliii au fost primul tip de polimorfism care urmeaz s fie utilizat ntr-o
anchet penal n cazul criminalului britanic Colin Pitchfork.

Cu toate acestea VNTRs nu sunt utilizate n general n medicina legal, deoarece aceasta tehnic
este adesea un proces mai costisitor i dureaz mai mult din cauza VNTRs-urilor care au o
lungime mai mare dect, s zicem,STR.

MICROSATELII SAU REPETRI SCURTE N TANDEM (STR)

Short tandem repeats (SRT) sunt regiuni ale genomului compuse din aproximativ 1-5 baze i
repetate de pn la 17 ori. Markerii STR, fie vor fi simpli (repetri cu lungime identic), compui
(dou sau mai multe repetiii adiacente) sau compleci (mai multe repetiii diferite lungimi). Ele
se gasesc in 22 de cromozomi autozomali precum i ambii cromozimi de sex X i Y ,dei cele de
pe cromozomul Y difer puin din cauza lipsei de recombinare. Numai un numr select de
markeri STR sunt utilizai n profilarea ADN medico-legal (10 in Marea Britanie si 13 in

6
SUA) .Acestea exprim un grad nalt de polimorfism, ceea ce le face deosebit utilizate n tiina
medico-legal. Variabilitatea STR este cauzat de imprecizia polimerazei ADN n copierea
regiunii. Regiuniile STR fiind non-codare, nu exist nici o presiune selectiv asupra ratei ridicate
de mutaie, avnd ca rezultat variaii nalte ntre oameni diferii

RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISMS (RFLP)

RFLP-urile au fost utilizate n prima tehnic dezvoltat pentru a analiza lungimi variabile ale
fragmentelor obinute prin digestia ADN-ului. Exploateaza variatii in secventele de ADN din
cauza locaiilor diferite ale site-urilor de enzime de restricie. Metoda utilizeaz endonucleaze de
restricie pentru a "digera" ADN-ul prin tiere la matrie de secvene specifice.Fragmentele de
restricie rezultate sunt apoi separate prin electroforez pe gel i transferate ntr-o membran
folosind tehnica Southern Blotting. Dup ce se transfer fragmentele de ADN separate, sonda de
hibridare este utilizat pentru a detecta fragmentele.

Cu toate acestea analiza ADN cu RFLP necesit cantiti relativ mari de ADN iar probele
degradate nu au putut fi analizate cu precizie. Mai eficiente, mai ieftine si mai rapide au fost
tehnici de profilare ADN.

REACIA N LAN A POLIMERAZEI (PCR)

Cantitatea de probe de ADN obinute n cursul unei analize este adesea foarte mic, astfel, pentru
o stabilire a profilului ADN cu succes o anumit form de amplificare este ideal. Reacia n lan
a polimerazei (PCR) este o tehnic care permite amplificarea exponenial a fragmentelor de
ADN la lungimi de aproximativ 10.000 de perechi de baze. Acest lucru nseamn c, teoretic, o
singur copie a unui fragment de ADN poate fi amplificat la milioane de exemplare n doar
cteva ore. PCR-ul este deosebit de benefic n amplificarea cantitilor minime sau a probelor
degradate.

O reacie PCR cu succes necesit un numr de componente primare vitale. Primeri

oligonucleotidici care sunt complementari int ADN-ului i marcheaz obiectivul care urmeaz

7
s fie amplificat, cu utilizarea a doi primeri. Secvena de baz a unui primer se leag de o parte a
intei n timp ce cellalt primer se leag de cealalt parte a intei, ADN-ul dintre primeri fiind
amplificat.

Etichete fluorescente sunt adesea adugate primerilor pentru a vizualiza ADN-ul amplificat n
electroforez.

Enzima ADN-polimerazei permite componentei ADN-ului pentru a fi copiat prin adugarea de

nucleotide la captul 3 'al primerilor. Alte componente necesare includ un tampon de reacie cu
clorur de magneziu pentru a asigura condiii ideale pentru funcionarea enzimei,
dezoxiribonucleotide pentru a construi molecula de ADN, i ADN-ul ablon. PCR-uri moderne
utilizeaz ADN polimeraze termostabile. Cel mai frecvent utilizat este Taq polimeraza, care a
nlocuit n mare msur enzima utilizat anterior polimeraza derivat E. coli. Aceasta a fost
izolat din Thermus aquaticus, care este un organism capabil s supravieuiasc la temperaturi de
peste 70 C. Cu toate acestea Taq polimerazei i lipsete capacitatea de a citi dovada. VENT
polimeraza este de la litoralis Thermococcus, care pot supravieui la temperaturi de peste 100
C.

Ciclul PCR const n trei etape principale: Denaturarea, recoacere i extindere. Procedeul este, n
general, condus ntr-un tub mic de centrifug, din plastic, cu temperatura controlat , folosind
un aparat de cicluri termice.

Denaturarea: Proba este nclzit la 94-95oC timp de aproximativ 30 de secunde. Aceasta

separ ADN-ul dublu-catenar prin ruperea legturilor de hidrogen, care s permit
accesul primerilor.
Recoacerea: Probele se pstreaz la 50-65oC, n funcie de secvena primerului, pentru a
permite legturii de hidrogen de a se forma ntre primeri i secvena de ADN
complementar.
Extensia: De asemenea, cunoscut sub numele de stadiul de alungire/elongare. Proba se
nclzete la 72oC pentru o durat care varaiaz n funcie de lungimea catenei de ADN
care urmeaz s fie amplificat i viteza enzimei polimerazei (Taq polimeraza) care
contruieste componenta. Deoxinucleotide trifosfat se adaug la captul 3 'al primerului.

8
Fiecare ciclu de PCR poate dura doar 5 minute. Aceast procedur poate fi repetat dac este
necesar, pn cnd secvena iniial a fost amplificat o cantitate suficient, aceasta fiind dublat
cu fiecare ciclu. In urma PCR, produsele sunt separate prin electroforez.

Din pcate, PCR nu este adecvat n analiza secventelor lungi de ADN, i deci nu pot fi utilizate
cu tehnicile anterioare, cum ar fi RFLP. Trebuie luat n considerare faptul c anumii compui pot
inhiba reaciile PCR, adesea substane asociate cu etapele de extracie i purificare a ADN-ului.
Astfel de substane includ proteinaza K (care degradeaz enzima polimeraz), detergeni ionici i
colorani de ncrcare n gel. n mod similar, anumite substane prezente n snge pot inhiba
PCR, cum ar fi hemoglobina si heparina.

Diferite modificri au fost fcute pentru a mbunti metoda PCR. Multiplex Polymerase Chain
Reaction presupune amplificarea a numeroase secvene ADN ntr-o singur reacie prin utilizarea
primerilor care produc marimi de alele care nu se suprapun, permind un numar mare de regiuni
ale unei probe s fie testate simultan.

ERORI DE PCR

Diveri factori pot contribui la erori i inadvertene n datele obinute prin tehnica de reacie n
lan a polimerazei. PCR este adesea realizat folosind ADN polimeraza, cum ar fi Taq
polimeraza ADN, care nu are capacitatea de a "citi dovada", avnd ca rezultat erori de
amplificare. Cu ct este mai mare amplificarea, cu att mai probabil este c se vor produce astfel
de erori. Gresirea primerilor este, de asemenea, o problem potenial, fiind formate produse din
site-urile care nu sunt vizate.Dimeri de primeri in exces pot fi formate, care sunt produse
secundare ale PCR-ului si s-au produs atunci cnd un primer este relocat la o alt extensie care
cauzeaz elongarea. Acest lucru poate avea ca rezultat o variabilitate neateptat a succesului
PCR ntr-o serie de probe sau un esec al conditiilor ultilizate anterior.

ELECTROFOREZA

9
Dup cum sa menionat, n urma analizei, fragmentele individuale ale ADN-ului pot fi separate
cu ajutorul electroforezei pentru a produce distinct amprenta ADN-ului ". Electroforeza este, n
esen, o metod de separare a moleculelor dup mrimea lor prin aplicarea unui cmp electric,
provocnd moleculele de a migra la o rat i la o distan n funcie de mrimea lor. n
electroforeza n gel, se folosete o matrice de gel poros, adesea constnd n gel de agaroz pentru
sarcini simple sau gel de poliacrilamid pentru proceduri specifice. Gelul adesea plutete ntr-o
soluie tampon pentru a asigura nivelul pH-ului la un nivel constant, iar curentul electric aplicat
este realizat. Probele de analizat sunt plasate n mici caviti n partea superioar a gelului
folosind pipete. O prob de control i o prob etalon / marcator de locaie va rula simultan de
multe ori. Deoarece se aplic curentu electric, fragmentele de ADN ncrcate negativ ncep
deplasarea prin gel spre anodul ncrcat pozitiv. Gelul acioneaz n esen, ca un tip de sit
molecular, care permite moleculelor mai mici s se deplaseze mai repede dect fragmentele mai
mari. Dupa electrofore, poate fi necesar pentru a vizualiza aceste benzi folosirea de sonde sau
vopsele radioactive sau fluorescente. Electroforeza nu numai c separ ADN-ul, dar, de
asemenea, permite fragmentelor s fie msurate i exprimate adesea n perechi de baze.
Msurarea lungimii acestor fragmente poate permite n cele din urm numrul de repetri care
urmeaz s fie determinate i astfel genotipul la acel locus.

Tehnicile anterioare foloseau electroforez n gel de tip pat-plat, dei electroforeza capilar se
realizeaz mai rapid i automatizat fiind folosit mai des. In aceasta tehnica, abreviat CE, gelul
este inut ntr-un tub capilar fin prin care ADN-ul marcat fluorescent trece similar ca n
electroforeza n gel, de multe ori cu o dimensiune standard a ADN-ului adugat. Poziionat de-a
lungul capilarelor este un fascicul laser, care face ca ADN-ul s emit lumin fluorescent pe
msur ce trece. Acest lucru poate fi detectat i alimentat direct la un sistem informatic sub
forma unui electropherogram. Din pcate, electroforeza capilar nu este capabil s separe mai
mult de o prob la un moment dat, dei un analizor genetic poate fi folosit pentru a separa o serie
de probe, una dup alta.

TEHNICI DE BLOTTING

10
Dupa electroforeza n gel, sondele sunt n general utilizate pentru a detecta molecule specifice.
Cu toate acestea, deoarece probele nu pot fi aplicate direct pe gel, metode blotting au fost iniial
utilizate. Exist o serie de tehnici de blotting comune: Southern blot, Western Blot, Northern
Blot, Eastern Blot i Southwestern Blot.

Southern blot - Folosit n analiza ADN-ului. ADN-ul este extras, separat prin electroforez i
transferat pe membrana.Se adaug sonde marcate, care hibridizeaz la secvene specifice i duce
la identificarea acestora.

Western Blot - Folosit pentru a detecta proteinele. SDS-PAGE utilizat pentru proteinele separate,
care sunt transferate pe membran. Apoi se adaug anticorpi specifici, urmat de un substrat
pentru a vizualiza benziile.

Northern Blot - folosit pentru a studia expresia genelor. Similar cu Western blot, cu excepia c
ARN-ul este analizat.

Eastern Blot - folosit pentru a studia proteinele. Considerat a fi o extensie a Western blotting-
ului.

Southwestern blot - combin caracteristici de la Southern si West. Utilizat pentru caracterizarea

rapid a proteinelor de legare a ADN-ului i a site-urilor lor.

ANALIZA ADN CU NUMAR SCAZUT DE COPII

Analiza ADN cu numar scazut de copii, denumit n continuare LCN (low copy number), este o
tehnic dezvoltat de Serviciul de Stiinta in Medicina Legal din Marea Britanie ntr-o ncercare
de a crete sensibilitatea metodelor de profilare ADN. Probele care conin cantiti mici de ADN
sau prost degradat de multe ori duc la probleme cum ar fi amprentele digitale de calitate slab
sau chiar rezultate complet negative. Aceast tehnic a redus aceste probleme.

Dezvoltat n 1999, LCN este n esen o extensie a tehnicii din a doua generaie Multiplex Plus
(SGM +), i este utilizat n general n cazul n care tehnica anterioar a euat sau a produs
rezultate slabe. Sensibilitatea mbuntit este realizat printr-un numr mai mare de cicluri de
PCR, n general, folosind tehnici standard de 28 de cicluri, dar LCN folosind 34. Acest lucru ar

11
putea permite ca in cele din urma pentru profilurile ADN s fie obinute cu succes din cantiti
infime de prob i chiar din celule unice.

Cu toate acestea, sensibilitatea crescut a acestei tehnici de profilare aduce preocupri

amplificate legate deproblemele n uurina de contaminare i de amplificare a acestor
contaminani, profiluri mixte fiind produse i acuzaii abuzive. Cu tehnici, cum ar fi LCN, este
acum mai important ca niciodat ca anchetatorii s poarte mbrcminte de protecie adecvat i
s urmeze proceduri stricte anti-contaminare, iar controalele s fie utilizate n analize.

AMPRENTAREA ADN SINGLE CELL

n strns legtur cu analiza LCN este profilarea Single Cell a ADN-ului. Dr. Ian Findlay si
colegii sai de la Australian Facility Genome Research au raportat n primul rnd dezvoltarea cu
succes a unei amprente digitale ADN dintr-o singur celul n 1997. 226 celule bucale de la patru
persoane au fost izolate folosind micromanipularea, amplificat folosind testul ( SGM) pentru a
crete sensibilitatea. ase merkeri STR i amelogenin pentru sex-tipuri au fost amplificate.
Rezultatele analizei unicelulare au fost comparate cu profiluri ADN cunoscute. ntruct un profil
complet i corect a fost obinut doar n 50% din testele unicelulare, 91% din teste au prezentat o
anumit form de rezultat.

Metodele anterioare de amprentare necesitau adesea sute de celule pentru a obine un profil.
Single cell este obinut prin tamponarea materialului i identificarea celulei care trebuie
analizate folosind microscopie nainte de analiz. Aceast tehnic este deosebit de rapid, ducnd
la o chestiune de ore, i are o specificitate de aproximativ 1 la zece miliarde.

Profilarea de ADN monocelular este deosebit de util n cazurile de viol, ca ADN-ul din celulele
spermatice este puternic conservat din cauza aceasta fiind att de compactat n capul
proteinelor. Exist, de asemenea, un potenial pentru tehnica utilizat n documente. ADN-ul
uman poate fi plasat n documente, cum ar fi obligaiunile guvernamentale, testamentele i
documente de securitate, pentru a urmri fluxul lor. Cu toate acestea, principala problem cu
aceast utilizare special este faptul c rudele apropiate pot manipula documentele, n special
atunci cnd este vorba de documente importante, cum ar fi testamente, i deci tehnica nu poate fi

12
adecvat. Analiza ADN dintr-o singur celul este, de asemenea, ideala in procedurile de FIV, in
care celulele pot fi analizate pentru defecte genetice.

Cu toate acestea, exist unele ngrijorri majore cu aceast metod. Cu un numr mai mare de
cicluri PCR necesare pentru a amplifica ADN-ul, aceasta provoac probleme ale alelei drop-in,
unde alelele suplimentare se adaug la prob. Alela drop-out este o problem similar cu
creterea numarului de probe de amplificare. Atunci cnd ncepe cu o singur celul sau cantitate
mic de prob, orice contaminani deja prezeni n eantion vor fi amplificai. In mod similar,
orice inhibitori PCR prezeni vor fi mai concentrai, cauznd probleme de amplificare. Una
dintre preocuprile principale este uurina de contaminare cu celule de la alte persoane. Acest
lucru ar putea duce la contaminarea probelor,astftel devenind inutile sau prestate, mai ru nc, n
cazul criminalistica, persoane nevinovate fiind acuzate pe nedrept.

ADN-UL MITOCONDRIAL (MTDNA)

ADN-ul mitocondrial este o molecul circular de ADN 16,569 de perechi de baze n mrime,
mai nti menionate ca secven Anderson, obinute din organele mitocondriei gasite in
interiorul celulelor. Acest aparat este implicat n producerea energiei celulare. Pot fi oriunde intre
100 si 1000 de mitocondrii intr-o celula, fiecare dintre ele coninnd numeroase copii ale
genomului mitocondrial. Aceast secven este n ntregime funcional i nalt conservat, astfel
nct exist o variaie foarte mic ntre indivizi. Totui, exist D-loop 1000 perechi baze
necodat, cunoscut ca regiune de control, care conine dou regiuni hipervariabile denumite
HV1 i HV2. Variaiile din cadrul acestor regiuni sunt, n general, polimorfisme unice de
nucleotide (SNPs). SNPs nu modific lungimea mtDNA, iar aceste regiuni, sunt axate pe n
analiza ADN-ului mitocondrial. ADN-ul mitocondrial este adesea supus unei rate relativ ridicate
de mutatie din cauza lipsei de repararea a ADN-ului, care provoac variaii ntre indivizi. Variaia
n cadrul acestei poriuni mici este ea nsi nu deosebit de semnificativ, cu HV1 i HV2 care
difer cu 1-3% dintre persoanele care nu sunt nrudite.

In analiza ADN-ului mitocondrial, ADN-ul este extras i regiunile HV1 i HV2 sunt amplificate
folosind PCR. Secvenele de perechi de baze a acestor regiuni este apoi stabilit prin
secvenierea ADN-ului . Aceasta este apoi comparat cu referina de secven i diferenele
remarcate. Alte probe pot fi analizate, de asemenea prin comparatii efectuate pentru a stabili

13
poteniale similitudini. ADN-ul mitocondrial este n general utilizat atunci cnd alte metode, cum
ar fi analiza STR au euat. Acest lucru este adesea ntlnit n cazul corpurilor degradate grav, n
caz de dezastru sau accidente n cazul n care un individ este prea grav deteriorat pentru a
identifica, i, uneori, n taxonomie pentru a determina speciile folosind gena citocromului b.

Cel mai important avantaj al utilizrii ADN-ului mitocondrial este posibilitatea de a analiza
probele chiar foarte degradate. Dac un specimen este grav descompus la punctul n care nu este
posibil s se extrag cu succes un profil ADN folosind ADN-ul nuclear,acest lucru ar putea fi
posibil prin intermediul ADN-ul mitocondrial. n plus, este necesar doar o cantitate foarte mic
prob.

Cu toate acestea, utilizarea ADNmt are dezavantajele sale. Deoarece ADN-ul mitocondrial este
motenit doar pe linie matern, acest lucru denota faptul c nu se poate forma o amprenta ADN
complet a individului, deci aceasta tehnica este benefic numai dac profilurile ADN ale rudelor
materne sunt disponibile, cum ar fi mama indivizilor sau fraii biologici. Din cauza acestui fapt,
ADNmt este semnificativ mai puin discriminatoriu dect, de exemplu, STR. Detectarea
diferenelor de secven este, de asemenea, consumatoare de timp i costisitoare.

FENOTIPIZAREA ADN N SCOP MEDICO-LEGAL.

Au fost fcute ncercri de a utiliza analiza ADN-ului n identificarea caracteristicilor fenotipice,

cum ar fi culoarea pielii, culoarea parului si culoarea ochilor intr-un studiu cunoscut sub numele
de fenotipuri medico-legale ADN (FDP) sau profilare fenotipica. Acest lucru este, n general,
realizat cu ajutorul polimorfisme unice de nucleotide (SNPs), mai degrab dect SRT. SNPs au o
rat de mutaie mai mic i deci sunt mai susceptibile de a deveni fixate ntr-o populaie, prin
urmare, ele sunt adesea considerate populaii specifice. Ar putea fi posibil s se estimeze originea
etnic bazat pe prezena SNPs rare sau legate de anumite rupuri de populaie, dei aceast teorie
devine problematic cu indivizi de origine mixt.

Cea mai mare lucrare pe fenotipul SNPs s-a concentrat pe pigmentare, i SNPs ntr-un numr de
gene de pigmentare au fost asociate cu diferite fenotipuri de pr, piele i culoare a ochilor.

14
Avansrile sunt deja realizate n acest domeniu de studiu. Serviciul de Medicin Legal a
dezvoltat un test de dactilografiere SNP implicnd mutaii ale genei receprtor umane
melanocortin 1 (MC1R), care este asociat cu prul rou. alele specifice de-a lungul acestei gene
sunt asociate cu prul rou, dei, un individ care motenete alele de la fiecare printe a rezultat
ca exista o mare probabilitate a acelui individ s aib prul rou. Stabilirea faptului c un individ
este mai mult predispus s aib prul rou este limitat n domeniul tiinei medico-legale, prul
rou ne fiind deosebit de comun, dei este mai frecvent la anumite populaii.

Unele cercetri au fost efectuate in genetica culorii ochilor, i anume cu privire la gena OCA2 pe
cromozomul 15, care este de asemenea implicat n pigmentarea pielii ct i a prului. IrisPlex
este un test recent dezvoltat, care permite predicia exact a culorii ochiului albastru si cprui.

Studiile au fost efectuate prin examinarea frecvenei STR specifice repetate n grupuri de diferite
descendene geografice. Aceasta cercetare a avut ca rezultat posibilitatea de a estima
probabilitatea n ascenden, fiind stabilit datorit anumitor alele fiind mai probabile n unele
grupuri specifice. Totui, aceast utilizare special a analizei ADN-ului nu este infailibil i poate
fi folosit doar ca o estimare. Serviciul de Medicin Legal a dezvoltat un test de inferen
etnic, care prevede originea probabil a unui eantion de ADN-uri dintr-un numr de grupuri
(alb europene, afro-caraibiene, din Orientul Mijlociu, de Sud-Est din Asia i India Sub-
continental).

Anumite ri i state sunt n proces de punere n aplicare a legislaiei specifice referitoare la

utilizarea analizei ADN-ului fenotipice. Multe restricii juridice n prezent permit doar analiza
ADN-ului non-codar, dei rile de Jos (Olanda) permite n prezent fenotiparea medico-legal n
anumite circumstane. Utilizarea fenotipic a SNPs au fost de asemenea implicate n analiza non-
medico-legal, cum ar fi n determinarea culorii etnice, a prului i a pielii de vestigii antice.

Cu toate acestea, exist o serie de probleme i preocupri cu aceast abordare. Este puin
probabil ca, cteva SNP-uri alese s ofere o "imagine" foarte simpl de manevrat sursa probei,
datorit complexitii trsturilor multigenice precum i factori externi, cum ar fi mediul
nconjurtor i mbtrnirea. Chiar dac tehnica a fost perfecionat pentru utilizarea n domeniul
tiinei criminalistice, fenotipuri, cum ar fi prul sau culoarea ochilor pot fi mascate prin vopsele
si lentile de contact colorate, limitnd utilizarea acesetia in scopuri medico-legale.

15
Exist, de asemenea, preocupri legate de confidenialitate ,referitoare la posibilele trsturi
determinate, dei a fost convenit i argumentat c trsturile vizibile, cum ar fi prul i culoarea
ochilor nu pot fi considerate ca fiind private. Cu toate c ar trebui s continue progresele i s fie
efectuate n msura n care genele au fost localizate pentru trasaturi, cum ar fi agresivitatea i
predispoziia la anumite boli, mai multe ngrijorri serioase vor fi ridicate asupra sensibilitii
acestor informaii.

Cercetatorii anticipa ca progresele suplimentare ar putea permite ca anumite detalii suplimentare

s fie verificate, cum ar fi probabilitatea ca individul s fumeaze, impreuna cu posibilitatea de
gene pentru predispoziii de generozitate, agresiune i homosexualitate.

Y ANALIZA CROMOZOMIALA

O mare parte din profilarea ADN modern se bazeaz pe analiza n repetiii scurte n tandem
gsite pe autozomi. Cu toate acestea o ramur particular a analizei ADN-ului se concentreaz
asupra markerului amelogenin, singurul marker pe cromozomul sexual, util n analiza
cromozomul Y. Cromozomul Y, in general, gasit doar la barbati, este un cromozom mic, care,
spre deosebire de alte gene, este modificat numai prin apariia unor mutaii rare. Cu toate acestea,
similar cu ADN-ul mitocondrial (care este motenit matern), combinaia de alele n acest caz
este, teoretic, identic ntre tat i fiu, presupunnd c mutaia nu se produce. Mai mult dect
att, Y analiza cromozomiala discriminatorie este relativ sczut. Analiza cromozomului Y este
deosebit de util n cazurile de agresiune sexual i viol n care pot fi ntlnite profiluri ADN
mixte. Numeroase sisteme au fost dezvoltate pentru a analiza unele dintre STR -uri prezente pe
acest cromozom, cum ar fi Yfiler Applied Biosystems.

BIBLIOGRAFIE:

16
Jeffreys, A J. Thein, S L. Wilson, V. Individual-Specific Fingerprints of Human DNA. Nature.
1985, 316)6023), 76-79.

Watson, J D. Crick, F H. A Structure for DNA. Nature. 1953, 171, 737-738.

Findlay, I. Taylor, A. Quirke, P. et al. DNA Fingerprinting from Single Cells. Nature. 1997,
389(6651), 555-556.

Jackson, A. R. W, Jackson, J. M., 2011. Forensic Science. Essex: Pearson Education Limited.

White, P. C., 2004. Crime Scene to Court: The Essentials of Forensic Science. Cambridge: The
Royal Society of Chemistry.

17