Proiectul Genom Uman

Proiectul Genom Uman
CUPRINS
INTRODUCERE.................................................................................................................................2
CAPITOLUL I.....................................................................................................................................6
ADN MOLECULA FUNDAMENTAL A VIEII......................................................................6
I.1 Scurt istoric.................................................................................................................................6
I.2 Definiie i caracteristici............................................................................................................8
I.3 Proprieti fizice i chimice ale ADN.......................................................................................10
I.4 Genomul definiie..................................................................................................................13
CAPITOLUL II.................................................................................................................................15
PRINCIPII DE CARTARE GENIC.............................................................................................15
II.1 Metode de cartare genic........................................................................................................17
II.2 Metode clasice.........................................................................................................................17
II.2.2 Polimorfismul de lungime al fragmentelor de restricie (RFLP).......................................17
II.3 Metode citologice....................................................................................................................24
II.3.1 Vectori................................................................................................................................24
II.3.2 Celule gazd......................................................................................................................27
II.3.3 Etapele clonrii moleculare...............................................................................................28
II.3.4 Construcia bibliotecilor de gene......................................................................................30
II.3.5. Amplificarea selectiv a secvenelor de acizi nucleici prin metoda "Polymerase Chain
Reaction".....................................................................................................................................31
CAPITOLUL III................................................................................................................................34
SECVENIEREA ADN....................................................................................................................34
III.1 Metoda chimic Maxan - Gilbert............................................................................................34
III.2 Metoda enzimatic (SANGER)..............................................................................................37
CAPITOLUL IV................................................................................................................................39
PROIECTUL GENOM UMAN.......................................................................................................39
IV.1 Derularea PGU.......................................................................................................................39
IV.2 Secvenierea genomului uman.................................................................................................40
IV.3 Aplicaiile practice ale PGU...................................................................................................42
BIBLIOGRAFIE...............................................................................................................................46
1
INTRODUCERE
Cunotinele
despre
gene
(genetic)
genom
(genomic)
diferitelor
organisme continu s avanseze n pas vioi. Toate manifestrile vieii sunt determinate
de gene i de interaciunea acestora cu mediul. Componentele genetice constituie
cauzele celor mai multe boli umane. Mai mult de 1000 de boli rezult din alterarea
unor gene cunoscute.
Genetica clasic, dezvoltat n prima jumtate a secolului trecut i genetica
molecular, dezvoltat n a doua jumtate, au fuzionat ntr-un fantastic efort tiinific.
Acestea au furnizat att baze teoretice ct i un repertoriu de metode de explorare a
mecanismelor celulare, pentru a fi nelese procesele normale i bolile la nivel
molecular. Descifrarea genomurilor a mai multor organisme, printre care bacterii i
plante, prin determinatea secvenei de nucleotide a acidului dezoxiribonucleotidic
(ADN), argumenteaz nelegerea noastr cu privire la funcionarea normala sau
anormal a organismului. Noile cunotine ofer promisiuni pentru descoperirea de noi
produse farmaceutice orientate spre solicitri individuale. Acestea vor pava calea spre
noi terapii i metode de prevenire.
Fiecare din cele aproxinativ 1014 celule din organismul unui adult conine n
nucleul su un material genetic care susine viaa. Acesta permite organismului de a
interaciona cu mediul, nu doar cu ajutorul organele senzoriale, care i permit s vad,
s aud, s guste, s simt cldur, frig, durere, sau s comunice, ci i penmite i s
memoreze sau s se integreze n societate datorit comportamentului nrudit. Permite
conversia oxigenului atmosferic i a hrnii ingerate n energie i controleaz sinteza i
transportul unor importante molecule biologice. Sistemul imun, care realizeaz
aprarea mpotriva virusurilor, a bacteriilor sau a fungilor este coordonat tot de acest
material genetic. Forma i mobilitatea oaselor, a muchilor sau a pielii nu ar putea fi
meninute fr existena lui. Soarta fiecrei celule este determinat de controlul
diviziunii celulare i diferenierea n diferite tipuri de celule i esuturi, incluznd
interaciunile intra- i intercelulare, precum i transducia extracelular. n final, arii
diferite precum reproducerea sau detoxifierea i excreia de molecule care nu mai sunt
fofositoare depind de asemenea de acest material, precum i multe alte funcii ale
organismelor vii.

Aceast program celular este determinat genetic. Se transmite de la o celul la
ambele celule fiice rezutate n urma diviziunii celulare i formeaz, de la o generaie la
alta, celule specializate i celule gametice (ovule i spermatozoizi). Integritatea
materialului genetic trebuie meninut intact de la o generaie la alta, cu toate c a
artat o anumit adaptivitate n urma schimbrilor pe termen lung ce au survenit n
mediu. Acest lucru constituie o enorm sarcin. Deci nu este de mirare c erorile n
meninerea i propagarea materialului genetic au loc n mod frecvent la toate
organismele
vii,
ciuda
existenei
unor
sisteme
complexe,
specializate
recunoaterea acestor erori i repararea lor.

Toate aceste procese biologice sunt rezultatul unor reacii biochimice realizate
de moleculele numite proteine. Proteinele sunt implicate n producerea majoritii
moleculelor (incluznd alte proteine) n celulele vii. Proteinele sunt compuse din sute
de aminoacizi diferii legai n mod liniar i formnd polipeptide, acestea urmnd a fi
aranjate n structuri tridimensionale, cel mai des n combinaie cu alte cu alte
polipeptide. Informaia genetic reprezint matricea prin care celula sintetizeaz
proteinele specifice celulelor respective. Majoritatea celulelor nu sintetizeaz toate
proteinele posibile, ci doar pe cele determinate de tipul celulei.
Fiecare dintre cei 20 de animoacizi utilizai de organismele vii este codificat de o
secven de trei structuri chimice, numite nucleotide, care sunt o parte a unei moleculi
mari, ADN (acid dezoxiribonucleic). Secvena de nucleotide este numit codon. ADN
reprezint o memorie read-only a informaiei genetice. n comparaie cu sistemul binar
de niruiri de 0 i 1 utilizat de computer pentru codificarea informaiei, codul genetic
al organismelor vii folosete un sistem cuaternar de patru baze nucleotidice ale cror
denumiri chimice ncep cu literele A, C, G i T (adenin, citozin, guanin i timin).
Fiecare secven linear de aminoacizi dintr-o pretein este codificat de o anumit
secven de codoni din ADN (cod genetic). Codul genetic este universal i este folosit
de toate celulele vii, inclusiv plantele sau virusurile. Fiecare unitate de informaie
genetic este numit gen.
n funcie de complexitatea organizatoric a unui organism, numrul de gene
poate fi mic la virusuri i bacterii (10 gene la unii bacteriofagi sau 4289 de gene la
Escherichia coli), mediu (6241 gene la drojdii, 13601 la Drosophila sp., 18424 la
nematode) sau mare (aproximativ 80000 la oameni sau la alte mamifere). Deoarece
multe proteine sunt implicate n funcii nrudite ale aceleiai ci, ele i genele lor
corespunztoare pot fi grupate n familii de gene cu funcii nrudite. Se estimeaz c
4

genele umane formeaz aproximativ 1000 de familii de gene. Fiecare familie de gene
s-a format din evoluia unei gene ancestrale sau a ctorva astfel de gene. Totalitatea
genelor i a ADN-ului din celulele unui organism este numit genom. Prin analogie,
totalitatea proteinelor dintr-un organism este numit proteom.
Genele sunt localizate pe cromozomi. Acetia formai din cte 2 molecule de
ADN i din proteine speciale (proteine histonice) i sunt localizai n nucleul celulei.
Cte un cromozom din perechea omoloag din fiecare celul somatic provine de la
mam, cellalt provenind de la tat. Specia uman are 23 de perechi de cromozomi.
n timp ce numrul i mrimea cromozomilor din diferite organisme variaz, cantitatea
total de ADN i numrul total de gene sunt aceleai pentru o anumit clas de
organisme. Genele sunt aezate n mod liniar pe fiecare cromozom. Fiecare gen are o
poziie bine stabilit (locus) i, de asemenea, o structur i o funcie individual. n
organismele mai evoluate, genele sunt structurate n seciuni continue de secvene
codificatoare i necodificatoare, numite exoni i, respectiv, introni. n organismele
pluricelulare, genele variaz att ca mrime general (de la cteva sute pn la cteva
milioane de baze azotate), numrul i mrimea exonilor, a secvenelor reglatoare de
ADN, care determin statului lor de activitate, numit expresie genic (majoritatea
genelor, n celulele specializate i difereniate, sunt n permanen neutilizate). Este
remarcabil c mai mult de 90% din totalul de 3 miliarde de nucleotide (3 x 10 9) din
ADN-ul organismelor mai evoluate, nu poatr informaie genetic.
Secvana linear de informaie coninut n secvenele codificatoare de ADN nu
poate fi citit direct. Prin urmare, ntreaga secven este la nceput transcris ntr-o
structur molecular nrudit cu secvena corespunztoare de codoni. Aceast
molecul este numit ARN (acid ribonucleic) deoarece conine, n locul dezoxiribozei
din ADN, riboz. Din aceast molecul sunt eliminai intronii de ctre enzime
specializate, iar exonii (secvenele informaionale) sunt nbinai unul cu altul, formnd
ARN-ul mesager (ARNm). Din aceast molecul, secvena codificatoare corespondent
de animoacizi n nite organite celulare numite ribozomi, n urma unui proces de
translaie.
Genele identice, similare sau nrudite din diferite orgamisme codifica acelai
caracter sau unul similar acestuia. Genele sunt similare din punct de vedere structural
i funcional, lucru explicat prin teoria evoluiei. Toate organismele vii sunt nrudite
ntre ele deoarece genele lor sunt nrudite. Prin urmare, structurile genice necesare
pentru realizarea funciilor fundamentale sunt pstrate intacte la o gam foarte mare
5

de organisme, ca de exemplu funciile controlului ciclului celular sau funcionarea i
diferenierea embrionar. Aceste gene sunt asemntoare sau identice chiar i la
organismele nenrudite direct, cum ar fi drojdiile, insectele, nematodele, vertebratele,
mamiferele sau chiar plantele. Genele cu o importan fundamental nu pot suferi
modificri (mutaii) deoarece funciile lor ar putea fi compromise. Toate organismele vii
i-au elaborat sisteme celulate care pot recunoate i corecta erorile care afecteaz
integritatea ADN-ului i a genelor. Aceste mecanisme acioneaz prin sacrificarea
celulei afectate prin programarea morii acesteia (apoptoz), dac eroarea nu poate fi
reparat.
Pe lng secvenele importante pe care evoluia le-a conservat, secvenele de
ADN neimportante sau de o importan limitat pentru organism difer chiar i la
indivizii aparinnd aceleiai specii. Aceste diferene ntre indivizi (polimorfism genic)
constitue baza ereditar pentru unicitatea fiecrui individ. Cel puin 1000 de perechi de
baze din ADN-ul organismului uman difer de la un individ la altul.
Diferenele genetice individuale ce afecteaz eficiena metabolismului sunt ci
ce duc spre predispoziii la diferite afeciuni, rezultate prin interaciunea a numeroase
gene, de obicei, n combinaie cu diveri factori de mediu. De asmenea mai pot apra
un individ de o boal la care un altul este predispus.
Proiectul Genom Uman (PGU) are rolul de a contribui la dezvoltarea geneticii
medicale, prin posibilitatea punerii unor diagnosticuri i realizarea unor terapii specifice
unui anumit organism.
CAPITOLUL I
ADN MOLECULA FUNDAMENTAL A VIEII
I.1 Scurt istoric
Cu toate c ADN-ul a fost descoperit n 1869 de ctre Friedrich Miescher ca fiind
o substan nou, de natur acid, coninnd o cantitate mare de fosfor, format din
molecule mari, pe care el le-a numit nuclein, rolul ei biologic nu a fost nc
recunoscut. n 1889, Richard Altmann a introdus termenul de acid nucleic. n anul
1900 erau cunoscute de asemenea i bazele purinice i pirimidinice. Douzeci de ani
mai trziu, cele dou tipuri de acizi nucleici, ADN i ARN, au fost difereniate. O
observaie accidental dar precis (1928) i o investigaie relevant (1944) au indicat
c ADN-ul ar putea fi purttorul informaiei ereditare.
n 1928 microbiologul englez Fred Griffith a fcut o observaie remarcabil. Prin
investigarea mai multor tulpini ale bacteriei Pneumococcus, el a determinat c oarecii
injectai cu tulpina S (smooth neted) au murit, n timp ce oarecii injectai cu tulpina
R (rough rugos) triau. Prin inactivarea prin cldur a tulpinii S letale, a observat c
aceasta nu mai afecta animalul iar acesta supravieuia. n mod surprinztor, o
combinaie ntre tulpina R neletal i tulpina S inactivat a avut acelai efect letal ca i
tulpina S activ. Pe lng aceasta, a gsit pneumococci din tulpina S vii n sngele
animalului. Aparent, celulele din tulpina R au fost transformate n celule de tip S.
Pentru un timp, acest surprinztor rezultat nu a putut fi explicat i a fost ntmpinat cu
scepticism. Relevana sa pentru genetic nu era evident. (Fig. 1)
Fig. 1 Observaiile lui Griffith

(Eberhard Passage Color Atlas of Genetics, 2001)
Observaiile lui Griffith au constituit baza de investigaie pentru Avery, MacLeod

i McCarty (1944). La Insitutul Rockefeller din New York, Avery i colaboratorii si au
elucidat bazele chimice ale principiul transformant observat de Griffith. Din culturile
unei tulpini S ei
au extras celulele lizate. Dup ce toate proteinele, lipidele i
polizaharidele au fost eliminate, extrasul nc i-a pstrat abilitatea de a transforma

pneumococcii din tulpina R, nevirulent, n pneumococci din tulpina S, virulent.
n urma unor cercetri ulterioare, Avery i colaboratorii si au ajuns la concluzia
c acesast transformare era atribuit sut la sut ADN-ului. Prin urmare, ADN-ul
trebuie s conin informaia genetic corespunztoare. Acest lucru explic observaiile
lui Griffith. Inactivarea prin cldur las ADN-ul din cromozomul bacterian intact.
Seciunea de cromozom ce conine genele responsabile cu formarea capsulei pot fi
eliberate din celulele S distruse i preluate de unele celule din culturile R. Dup
ncorporarea genelor S n ADN, celulele R sunt transformate n celule S. (Fig 2)
Fig. 2 Principiul transformant ADN-ul

Ultima dovad cum c ADN-ul i nu alt molecul, este responsabil de

transmiterea informaiei ereditare a fost furnizat de ctre Hershey i Chase n 1952.
Ei au etichetat capsida proteic a bacteriofagilor cu sulf radioactiv ( 35S) i ADN-ul cu
fosfor radioactiv (32P). Cnd bacteriile au fost infectate de ctre bacteriofagii etichetai,
doar
P (ADN) a intrat n celul, nu i
32
S (capsida proteica). Formarea de noi
35
bacteriofagi complei de ctre celul a demonstrat c ADN-ul este singurul purttor al

informaiei genetice necesare pentru formarea de noi particule virale, inclusiv
capsidele acestora. (Fig. 3)
Fig. 3 Experimentul lui Hershey i Chase

I.2 Definiie i caracteristici

Acidul dezoxiribonucleic (ADN) (fig. 4) este un acid nucleic ce conine
instruciunile genetice folosite pentru dezvoltatea i funcionarea tuturor organismelor
vii i a unor virusuri. Rolul principal al moleculelor de ADN este acela de stocare pe
termen lung a informaiei ereditare. ADN-ul este foarte adesea comparat cu un set de
matrie sau cu o reet, deoarece conine instruciunile necesare pentru construirea
tuturor componentelor celulare, cum ar fi proteinele i moleculele de ARN. Segmentele
de ADN ce poatr informaia genetic se numesc gene, dar pe lng acestea, exist i
alte segmente ADN ce au, fie un rol structural, fie sunt implicate n procese de reglare
a folosirii materialului genetic.
Fig. 4 Dublul helix ADN

Din punct de vedere chimic, ADN-ul este un polimer alctuit din uniti simple,
numite nucleotide, avnd o structur alctuit din polizaharide i grupri fosfat, legate
ntre ele prin legturi esterice. (Fig. 5) Ataat la fiecare polizaharid se gsete cte
una din cele patru tipuri de baze azotate. niruirea acestor baze de-a lungul structurii
polizaharidice este cea care codific informaia ereditar. Aceast informaie este citit
cu ajutorul unui cod genetic care determin ordinea n care se vor asambla aminoacizii
pentru formarea unei anumite proteine. Codul este citit prin copietea unor poriuni de
ADN pe un acid nucleic nrudit, acidul ribonucleic (ARN), proces numit transcripie.
Fig. 5 Scheletul format dintr-un polizaharid i un fosfat

(Charles Cantor Gemonics, 1999)
10
n interiorul celulei, ADN-ul este organizat n structuri numite cromozomi. Aceti

cromozomi sunt duplicai, nainte de a avea loc diviziunea celular, procesul celular
fiind denumit replicarea ADN. Organismele eucariote (animalele, plantele i fungii) i
stocheaz
ADN-ul
nucleul
celular
timp
ce
la
procariote
(bacteriile
arhebacteriile), acesta se gsete n citoplasm. n interiorul cromozomului, proteinele

cromatidice, cum ar fi histonele, condenseaz i organizeaz ADN-ul. Aceste structuri
compacte ghideaz interaciunea dintre ADN i alte proteine, ajutnd la controlul
secvenelor de ADN ce urmeaz a fi transcrise.
I.3 Proprieti fizice i chimice ale ADN

Molecula de ADN este alctuit din dou lanuri complementare, unite ntre ele
prin legturi de hidrogen. Distana dintre cele dou lanuri, calculat n 1953 de ctre
James Watson i Franies Crick, este de 22 pna la 26 (2,2 2,6 nm). Lungimea unei
nucleotide este de 33 (0,33 nm)(Fig. 6). Cu toate c fiecare unitate repetitiv
individual este foatre mic, molecula de ADN poate fi enorm, putnd conine pn la
milioane de nucleotide. Spre exemplu, cel mai mare cromozom uman, cromozomul 1,
este alctuit din aproximativ 220 milioane de perechi de baze azotate.
Fig. 6 Dimensiunile moleculei ADN

Cele dou lanuri de ADN se mpletesc precum via de vie, unul n jurul celuilalt,
cptnd forma unui dublu helix. Nucleotidele conin att segmentul ribozo-fostat,
care le ine unite ntr-un lan, ct i bazele azotate, care interacioneaz cu bazele din
cellalt lan ADN din cadrul helixului.
11

De obicei, o baz azotat legat de o polizaharid poatr denumirea de
nucleozid iar o baz legat att la o polizaharid ct i la o grupare fosfat se numete
nucleotid. Dac mai multe nucleotide sunt unite ntre ele, cum este cazul ADN-ului,
atunci polimerul poart numele de polinucleotid.
Structura lanului de ADN este format prin alternarea resturilor fosfat cu cele
polizaharidice. Poliglucidul din ADN este o pentoz, 2dezoxiriboza. Polizaharidele sunt
unite ntre ele cu ajutorul gruprilor fosfat, prin legturi fosfodiesterice realizate ntre
atomii de carbon 3 i 5 ai ribozelor adiacente. Aceste legturi asimetrice arat c lanul
de ADN are o direcie de asamblare a nucleotidelor. n cadrul dublului helix, direciile
celor dou lanuri sunt opuse, acest tip de aranjare fiind denumit antiparalel. Catepete
asimetrice ale catenelor de ADN sunt denumite capete 5` (5 prim) i 3` (3 prim),
captul 5` terminndu-se cu o grupare fosfat iar captul 3` cu o grupare hidroxil.
Dublul helix este stabilizat cu ajutorul legturilor de hidrogen dintre bazele
azotate ataate la cele dou catene. Cele patru baze azotate din ADN sunt: adenina
(A), citozina (C), guanina (G) i timina (T). (fig. 7) Aceste patru baze, ataate la
ribozo-fosfat, formeaz nucleotida complet, asemeni formrii adenozinmonofosfatului
(AMP).
Fig. 7 Bazele azotate purinice i prirmidinice

Aceste baze sunt clasificate n dou clase: adenina i guanina sunt compui
heterociclici numii purine, n timp ce citozina i timina sunt nuclee formate din ase
atomi de carbon, numite pirimidine. O a cincea baz pirimidinic, uracilul (U), ia locul
12

timinei (T) n molecula de ARN. Uracilul difer de timin prin lipsa unei grupri metil
din cadrul nucleului. Uracilul nu se ntlnete de obicei n ADN, apariia lui fiind
datorat unei scindri a citozinei.
Dublul helix este o spiral ce orienteaz planul luminii polarizate spre dreapta.
Prin mpletirea celor dou catene de ADN una n jurul celeilalte, bazele azotate, legate
prin legturi de hidrogen, sunt orientate spre interiorul helixului. Fiecare tip de baz
dintr-o caten formeaz legturi doar cu un singur tip de baze din cealalt caten.
Acest lucru se realizeaz pe baza principiului complementaritii. Purinele realizeaz
legturi de hidrogen cu pirimidinele, adenina unindu-se doar cu timina iar citozina doar
cu guanina. Acest aranjament al celor dou nucleotide unite ntre ele n cadrul dublului
helix pot fi astfel ndeprtate una de cealalt, precum un fermoar, fie cu ajutorul
forelor
mecanice,
fie
cu
ajutorul
temperaturilor
ridicate.
Ca
rezultat
al
complementaritii, toat informaia din structura dublu catenar de ADN se gsete

n dublu exemplar, pe ambele catene, lucru vital pentru replicarea ADN. Prin urmare,
aceast interaciune specific i reversibil dintre perechile complementare de baze
azotate este fundamental pentru realizarea tuturor funciilor le care le ndeplinete
ADN-ul n organismul viu.
Cele dou tipuri de perechi de baze formeaz numere diferite de legturi de
hidrogen. Adenina i timina sunt unite de dou legturi de hidrogen iar citozina i
guanina formeaz trei astfel de legturi. Prin urmare, perechea de baze C-G este mai
puternic dect perechea A-T. Astfel, att procentajul perechilor C-G, ct i numrul de
nucleotide dintr-o spir complet, determin puterea de asociere dintre cele dou
lanuri de ADN. n biologie, prile de ADN care necesit o separare uoar tind s aib
un coninut mai ridicat n A i T, acestea fiind mai uor denaturabine.
Fig. 8 Legturile dintre bazele azotate

13

ADN-ul poate exista n mai multe posibile conformaii. Cu toate acestea, doar
ADN A, ADN B i ADN Z au fost observate n organismele vii. Conformaia ADN-ului
adoptat la un moment dat depinde de secvena de ADN, de supraspiralizarea
acestuia, de modificrile chimice ale bazelor i de caracteristicile soluiei (concentraia
ionilor metalici i a poliaminelor). Dintre acestea trei, conformaia B este descris ca
fiind cea mai ntlnit n celulele vii. Cele trei forme alternative de structuri helicoidale
difer prin aranjarea spaial i prin dimensiuni.
Conformaia A este o spiral mai larg, orientat spre dreapta. Forma A a ADNului apare n condiii nonfiziologice, n exemplare dezhidratate de ADN, n cazul unirilor
hibride dintre lanurile de ADN i ARN sau n complexele ADN enzimatice.
Secvenele de ADN care au suferit modificri chimice prin metilare pot suferi o
mare modificare a conformaiei adoptnd forma ADN Z. n acest caz, lanurile au o
orientare spre stnga, opusul conformaiei B. Aceast structur neobinuit poate fi
recunoscut de proteinele de legtur specifice i pot fi implicate n procese de reglare
genic i transcripie.
I.4 Genomul definiie

n biologie, prin genom se nelege ntreaga informaie ereditar codificat n
ADN sau, n cazul unor virusuri, ARN. El include att genele ct i secvenele
necodificatoare de ADN. Termenul a fost introdus n 1920 de ctre Hans Winkler,
profesor de botanic la Universitatea din Hamburg, Germania.
n mod mai precis, genomul unui organism reprezint secvena genetic
complet a unui set de cromozomi; spre exemplu al unuia dintre cele dou seturi de
cromozomi coninui n celulele somatice ale indivizilor diploizi. Termenul de genom
poate nsemna, n mod specific, att informaia stocat n ADN-ul nuclear ct i cea
stocat n organitele celulare, cum ar fi genomul mitocondrial sau genomul
cloroplasmic.
Cnd spunem c genomul unei specii cu reproducere sexual a fost secveniat,
ne referim la determinarea secvenei unui set de autozomi i a celor doi cromozomi
sexuali care, mpreun, reprezint ambele sexe posibile. Chiar i n cazul specilor care
prezint doar un singur sex, ceea ce este descris ca secvenierea genomului este o
citire compus a cromozomilor unei varieti mari de indivizi.
14

tiina care studiaz proprietile organismelor nrudite poarta denumirea de
genomic, termen ce deriv din genetic. Genetica se ocup, de obicei, cu studiul
proprietilor unei singure gene sau a unui grup de gene.
Att numrul bazelor azotate ct i al genelor variaz foarte mult de la o specie
la alta, existnd o conexiune destul de mic ntre ele dou. n prezent, cel mai mare
numr de gene, aproximativ 60000, s-au descoperit la Trichomonas vaginalis,
aproximativ de trei ori mai multe gene dect n genomul uman.
Majoritatea entitilor biologice care sunt mai complexe dect un virus poart,
uneori sau ntotdeauna, un material genetic adiional pe lng cel stocat n cromozomii
lor. n unele cazuri, cum ar fi secvenierea genomului unui miocrob patogenic, n
genom sunt incluse i informaiile stocate n materialul genetic auxiliar, localizat n
plasmide. n aceste circumstane, prin genom se nelege totalitatea genelor i a
informaiei necodificatoare prezente n celul.
n cazul eucariotelor, cum sunt plantele, protozoarele i animalele, genele
coninute n ADN-ul mitocondrial sau plasmidial nu sunt incluse n genom. Mitocondriile
conin propriul lor genom denumit genom mitocondrial.
15
CAPITOLUL II
PRINCIPII DE CARTARE GENIC
Cartarea
genetic
la
om
este
un
proces
complex,
care
implic
multidisciplinaritate i care reprezint apogeul demersului tiinific de analiz a

genomului uman, cu profunde semnificaii fundamentale i implicaii practice medicale,
n spe acordarea sfatului genetic. Cartarea genic la om are multiple faete i numai
prin eforturi remarcabile se poate obine o imagine sintetic privind aezarea genelor
umane n locurile lor fireti din cromozomi.
Cartarea genetic meiotic se realizeaz prin urmrirea segregrii alelelor de la
doi sau mai muli loci genici n cadrul studiilor familiale, cu realizarea de pedigree i
identificarea haplotipurilor. Prin haplotip (genotip haploid) se nelege structura
genetic la nivel haploid, dat de localizarea sintetic a unor markeri genetici.
Termenul deriv de la cuvintele haploid i genotip.
Dac distana dintre doi loci genici este foarte mic i ntre ei nu se poate
realiza crossing-overul, acetia se transmit ca atare, n bloc, adic strns lincai, ntrun acelai segment cromozomial, neschimbat prin rupere-reunire de la prini la
descendeni, constituind ceea ce s-a numit un haplotip. Haplotipurile marcheaz
segmentele cromozomiale reperabile, ce pot fi urmrite n studiile familiale, n
pedigree i n populaii. Pstrate ca atare, de-a lungul generaiilor, ele pot fi
considerate pentru scopuri de cartare genic.
Cu ct doi loci genici sunt localizai la o dstan mai mare ntr-un cromozom, cu
att probabilitatea ca ei s fie separai prin crossing-over este mai mare, i viceversa.
Astfel, fracia de recombinare devine o msur a distanei dintre doi loci genici. Din
acest motiv este important ca n studiile familiale
s se stabileasc riguros natura
tipului de recombinare genetic, n vederea precizrii naturii sinteniei locilor genici

urmrii i aprecierii probabilitii de transmitere nlnuit (linkage) sau de disjuncie
independent, relevant n acordarea sfatului genetic.
16
Fig. 9 Harta fizic de lincaj

(Lucian Gavril Genomica, 2003)
Harta fizic (fig. 9) este reprezentarea grafic a distribuiei genelor n

cromozomi, realizat prin manipularea i observarea citologic a cromozomilor. Harta
fizic mai este denumit hart citologic.
Constituirea unei hri citologice se bazeaz pe: hibridarea fluorescent in situ
(fluorescence in situ hibridization FISH, hibridare somatic, dozaj genic).
Cartarea genetic uman necesit dezvoltarea de markeri genetici. ntruct la
om nu pot fi utilizate aceleai metode de cartare genetic de la animale, cele mai
multe date de cartare genetic la om se bazeaz pe utilizarea markerilor. Aceti
markeri sunt cartai n relaie cu bolile ereditare umane sau se realizeaz prin cartarea
marker-marker. Orice caracter care este mendelian (supus legilor lui Mendel) i
polimorfic (poate avea mai multe fenotipuri) poate fi utilizat ca marker.
Fiecare tip de hart are propriul su sistem de markeri. Astfel, markerii se
mpart n trei categorii principale:
1. gene;
2. fragmente de ADN anonime;
3. locuri cu traiect scurt, situate la extremitile secvenelor delimitate
(STS).
Coninutul de informare polimorfic (PIC) msoar ct de informativ este un
marker.
17
II.1 Metode de cartare genic

Procedeele de cartografiere genic se mpart n:
1. metode clasice, cu obinere de hri genetice;
2. metode citologice, moleculare, cu obinere de hri fizice.
Metodele clasice se bazeaz pe studii de lincaj familiale, realizate prin
backrossuri i intercrossuri.
Metodele citologice cuprind metodele citogenetice: hibridarea celulelor somatice,
cromozomii artificiali de drojdie de bere (YAC), FISH, electroforeza n cmp pulsator
etc.
II.2 Metode clasice

II.2.1 Polimorfismul de lungime al fragmentelor de restricie (RFLP)
Polimorfismul de restricie este definit prin variaiile individuale ale secvenei de
ADN relevate de modificrile hrii de restricie. RFLP reprezint un ansamblu de
fragmente specifice de ADN generat din ADN genomic prin digestie endonucleazic
adecvat, ce difer n lungime de la un individ la altul, sau la dou alele ale genelor la
acelai individ.
Un RFLP este definit printr-un cuplu sond-enzim de restricie i corespunde
unei amplasri strict definite n genom, adic unui locus genetic. El se caracterizeaz
prin variabilitate de la un individ la altul i prin transmitere mendelian, fiind un
marker genetic.
Secvenele RFLP sunt secvene scurte de ADN randomic. Ele nu sunt nc pe
deplin caracterizate i sunt detectate prin Southern blotting.
Deleii i rearanjamente ale situsurilor de restricie creaz polimorfisme n
populaii. Profilul unei serii de polimorfisme poate defini componenta genetica a unui
individ. Polimorfismele specifice pot fi uneori corelate cu modelul ereditii unei boli.
Dac este strns lincat, RFLP poate furniza mijloace pentru un test care ar putea
prezice evenimentul bolii genetice, sau poate s confirme diagnosticul unei boli
genetice.
RFLP-urile pot fi izolate n numr mare, iar utilizarea lor primar este n
depistarea unui numr mare de markeri n genom care pot fi folosii ca indicatori ce
stau la grania dintre poziia secvenelor importante din punct de vedere genetic.
18

Legarea unui RFLP de o caracterisic fizic sau o boal este adesea prima indicaie a
unei poziii pentru aceast boal.
Fig. 10 Analiza i ereditatea fragmentelor alelice RFLP

(Wikipedia The Free Encyclopedia)
Diferena dintre hrile de restricie, obinute de la doi indivizi constituie RFLP.

Acest polimorfism poate fi folosit ca marker genetic n evaluarea genotipului.
Dac polimorfismele de restricie apar la ntmplare n genom, este foarte
probabil ca unele s apar n imediata vecintate a unei gene int. Astfel de markeri
de restricie pot fi identificai prin lincajul lor restrns n fenotipul mutant. Comparnd
harta de restricie a ADN obinut de la pacienii care manifest o boal ereditar, cu
aceea a ADN dintr-o populaie normal, se poate identifica ntotdeauna un situs
particular de restricie. Identificarea unui astfel de marker are dou consecine:
1. poate oferi o procedur de diagnostic pentru identificarea bolii. Unele
dintre bolile umane, bine caracterizate genetic, nu pot fi uor definite n
termeni moleculari. Dac un marker de restricie este legat de fenotip,
atunci prezena lui poate fi folosit la diagnosticul pre- i postnatal al
bolii.
2. poate conduce la izolarea unei gene. Markerul de restricie trebuie s se
situeze relativ aproape de gen pe harta genetic, dac cei doi loci se
combin rar sau niciodat.
RFLP apare relativ frecvent n genomul uman pentru a fi folosit n cartarea
genetic. Dac se compar secvenele alelice ale unei perechi de cromozomi, n
perechile de baz individuale apar diferene cu o frecven mai mare de 1%. Aceste
modificri de baze, care afecteaz situsurile de restricie, pot fi detectate ca RFLP.
19

Hibridizarea molecular Southern, Northern i Western Blotting
La baza acestei metode st fenomenul de complementaritate i permite
identificarea macromoleculelor de interes dintr-un numr mare de alte molecule.
Complementaritatea este recunoaterea molecular specific de secven sau de
form, care se produce atunci cnd dou molecule sunt legate mpreun. Proprietatea
secvenelor complementare de a se lega sau hibridiza una cu alta poate fi utilizat n
identificarea moleculelor care conin aceeai secven unic de nucleotide. Hibridizarea
se realizeaz chiar i atunci cnd secvenele complementare reprezint o parte a unui
amestec complex de molecule de acizi nucleici. Hibridizarea analitic presupune
hibridizarea unei secvene marcate, numit prob (sau sond) cu o secven
nemarcat, numit int. Secvena prob (sonda) este cunoscut i se marcheaz
radioactiv sau neradioactiv, iar inta este necunoscut i urmeaz a fi identificat prin
hibridizare.
Complementaritatea dintre o molecul prob i o molecul int determin
formarea unui complex prob-int, se poate identifica localizarea acestui complex,
dac
moleculele
prob
sunt
marcate
radioactiv
sau
neradioactiv
(enzimatic).
Localizarea acestui complex poate fi utilizat pentru a obine informaii despre despre
moleculele int. Hibridizarea se poate realiza n soluie sau pe filtre, bazndu-se pe
denaturarea i renaturarea ADN.
n soluie, se pot forma complexe moleculare hibride (hibrizii moleculari) de
urmtoarele tipuri:
ADN ADN. O molecul prob de ADN monocatenar poate forma un

hibrid dublucatenar, mperecheat cu un ADN monocatenar int, dac
secvena prob este complementar secvenei int.
ADN ARN. O molecul prob de ADN monocatenar poate forma un

hibrid
dublucatenar
cu
un
ARN
int,
dac
secvena
prob
este
complementar secvenei int.
Protein protein. O molecul prob de anticorp (Ac) poate forma un

complex cu o molecul proteic int, dac situsul de legare la antigen
(Ag) al Ac se poate lega la un epitop (regiunea antigenic mic) pe
proteina int.
Exist dou caracteristici importante pentru hibridizare:
20

1. Relaiile de hibridizare sunt specifice probele se vor lega doar la inte
cu secven complementar.
2. Relaiile de hibridizare se vor produce n prezena unor mari cantiti de
molecule similare, dar nu identice cu inta. O prob poate gsi o
molecul int ntr-un amestec, dar nu molecule complementare.
Denumirea blotting-uri vine de la tipul de molecul int.
Pentru ADN Sourthern blotting: ADN tiat cu enzime de restricie

ADN marcat radioactiv.
Pentru ARN Northern blotting: ARN ADN sau ARN marcat radioactiv.
Pentru proteine Western blotting: proteine Ac marcai radioactiv sau

enzime.
Southern blotting. Prin Sourthern blotting fragmentele de ADN sunt separate

prin electroforez n gel de agaroz; ADN dublu catenar este denaturat prin incubarea
gelului n soluie alcalin NaOH 0,5N, apoi neutralizat. Dup neutralizarea soluiei
alcaline, gelul este plasat ntr-un rezervor ce conine o soluie salin, tamponat i se
suprapune un filtru care se acoper cu foi de hrtie de filtru. Tamponul din rezervor
trece prin gel, purtnd cu el fragmente de ADN. Acizii nucleici monocatenari se leag
ireversibil pe filtrul prin expunere la UV. Pe durata transferului, fragmentele i
pstreaz poziiile sale. Transferul se realizeaz prin capilaritate la for ionic mare.
Ca prob, poate fi utilizat orice ADN natural clonat dau oligonucleotide scurte,
sintetizete chimic. Separarea iniial a moleculelor se face pe baza greutii
moleculare.
n general, procesul se desfoar n urmtoarele etape: elecrtoforez, transfer
pe suport solid, blocarea, prepararea probei, hibridizarea, splarea i detecia hibrizilor
prob-int.
1. Electoforeza. Prin electroforez se separ moleculele pe baza dimensiunii
lor. Separarea se face de obicei n gel de agaroz sau poliacrilamin. n cazul pregtirii
ADN pentru Southern blot, ADN este mai nti tiat cu enzime de restricie i
fragmentele de ADN rezultate sunt meninute n form linear.
2. Transferul pe suport solid. Dup ce ADN, ARN sau proteina au fost
separate pe baza greutii moleculare, acestea se transfer pe un suport solid, nainte
de hibridizare. Acesta este n sine procesul de blotting, motiv pentru care toate aceste
tehnici se numesc blotting-uri. De obicei, suportul solid este o foaie de hrtie de
21

nitroceluloz, uneori sunt utilizate i alte materiale cum ar fi filtrul de nylon. ADN, ARN
sau proteina se lipesc bine pe nitroceluloz, ntr-o manier independent de secven.
ADN, ARN sau proteina pot fi transferate pe nitroceluloz pe una din aceste dou ci:
electroforez sau prin blotting capilar.
3. Blocarea. n acest punct, suprafaa filtrului are pe ea molecule separate,
precum i multe spaii ntre coloane unde moleculele nu s-au legat. Dac se adaug
proba direct pe filtru, n acelai moment proba se va lipi i de aceste pri libere ale
filtrului, simultan ca i moleculele transferate din gel, n rezultat se va obine un filtru
complet acoperit cu prob care va face imposibil localizarea hibrizilor prob-int.
Pentru aceasta filtrele sunt nmuiate ntr-o soluie de blocare, care conine o
concentraie mare de ADN, ARN sau protein. Aceasta mbrac filtrul i previne
alipirea probei direct de filtru. Pe durata hibridizrii se dorete ca proba s se lege doar
de moleculele int.
4. Prepararea probei. Proba se marcheaz anterior, prin prehibridizare, prin
ncorporarea nucleotidelor marcate radioactiv sau modificate chimic pentru a fi
detectate imunologic. Prepararea probelor ce d sensibilitate nalt i marcri specifice
este crucial pentru succesul analizei Southern sau Northern blotting. Obiectivul este
creearea unei copii marcate radioactiv a fragmentului ADN dublucatenar.
5. Hibridizarea. n toate trei blotturi, proba marcat radioactiv este adugat
pe filtrul supus blocrii, n soluie tampon i incubat pentru cteva ore pentru a putea
permite moleculelor-prob s gseasc moleculele sale int.
6. Splarea. Dup ce s-au format hibrizii ntre prob i int, este necesar s
se ndeprteze orice prob de pe filtrul care nu s-a legat la macromoleculele int.
Deoarece filtrul de nitroceluloz este absorbant, unele probe se infiltreaz n filtru i
trebuie ndeprtate; dac nu sunt ndeprtate, tot filtrul va fi radioactiv i hibrizii
specifici nu vor fi detectabili. Pentru aceasta, filtrul este cltit n mod obligatoriu n
cteva bi de soluie tampon, pentru a ndeprta orice prob nehibridizat.
7. Autoradiografierea. Dac proba este radioactiv, particulele radioactive
care au fost emise pot fi expuse unui film de raze X. Peste filtru se pune un film i se
las la ntuneric pentru o perioad de cteva zile pn la cteva sptmni, filmul va fi
expus acolo unde proba s-a legat de filtru. Dup developare, vor aprea spoturi
ntunecate pe film, oriunde s-a legat proba.
22
Enzimele de restricie
Enzimele de restricie sunt endonucleaze, care au capacitatea de a recunoate
specific o secven de ADN (bacterian, de levur, de mamifer) i de a seciona acest
ADN la nivelul sau n apropierea situsului de recunoatere. Enzimele de restricie sunt
prezente la numeroase specii de bacterii, avnd rol n aprarea bacteriei mpotriva
infeciei cu diverse virusuri. Genomul bacterian este protejat de aciunea propriei
enzime de restricie prin metilarea situsurilor de clivaj, astfel nct aceste enzime
acioneaz numai asupra secvenelor de ADN exogen.
Au fost identificate mai mult de 300 de enzime de restricie diferite, denumirea
lor fiind derivat din denumirea bacteriei, din care a fost izolat (tabelul VII.1., figura
VII.2.).
Tabelul VII.1. Enzime de restricie
Enzima1
Bacteria
Secvena
Alu I
Hae III
Taq I
Mn/I
Hind III
EcoRI
BamHI
Artrobacter lutesu
Haemophilus aegyptus
Thermus aquaticus
Moraxella nonliquefaciens
Hemophilus influenzae Rd
Escherichia coli R factor
Bacillus amyloliquefaciens
specific2
AGCT
GGCC
TCGA
CCTC/GAGG
AAGCTT
GAATTC
GGATCC
PstI
MstI
H
Providencia stuartii
Microcoleus species
CTGCAG
CCTNAGG
1. Denumirea indic: specia i ordinea descoperirii enzimei de restricie. (De exemplu,

EcoR I:Esherichia coli, prima restrictaz descoperit; Hind III: Haemophilus
influenzae
2. A adenin, G guanin, C citozin; T timin; N oricare nucleotid
Enzima de
restricie
HaeIII1
2
4 3
MboI
BamHI
PstI
Fragmente
rezultate
Situs de restricie
5---GG CC---3
3---CC GG---5
5---GA
5---GGA
5---CTG TC---3
CAG---3
TCC---3
3---CT
3---GAC
3---CCT AG---5
AGG---5
GTC---5
5 GGCC
3
23
5
GATC---3
5GATCCG
5 GCTGCA
3
3
3---CTAG
3ACGTCG
3GCCTAG
5
Fig. 11 Modalitatea de aciune a diferitelor tipuri de enzime de restricie 2
capt proeminent 5 GATC;
capt proeminent 5 GATC;
capete drepte;
capt proeminent 3 TGCA
Enzimele de restricie au capacitatea de a recunoate specific secvene

oligonucleotidice de 4-8 pb, de regul palindromice. Secvenele palindromice sunt
caracterizate prin faptul c secvenele de pe ambele catene de ADN sunt identice, dac
sunt citite n sensul 53
n urma aciunii enzimei de restricie asupra situsului specific de pe molecula de
ADN pot rezulta fragmente cu capete drepte sau cu capete proeminente (engl.
overhang). Sunt preferate enzimele care asigur obinerea de fragmente de ADN cu
capete proeminente, deoarece secvena monocatenar terminal este adeziv,
avnd tendina de a se fixa complementar la secvene similare.
n condiiile n care dou molecule de ADN de la specii diferite sunt supuse
aciunii aceleiai enzime de restricie vor rezulta fragmente de ADN cu capete similare.
n prezena unei ADN-ligaze se produce hibridarea fragmentelor de ADN de la specii
diferite, rezultnd molecule de ADN recombinant.
Sub aciunea unei anumite enzime de restricie, molecula de ADN este clivat
ntr-un numr definit, caracteristic i reproductibil de fragmente, care reflect
localizarea i frecvena situsurilor specifice de clivare. Situsurile de restricie nu sunt
dispuse la distane egale, localizarea lor depinznd de compoziia n baze azotate ale
regiunilor genomice, iar fragmentele rezultate sunt inegale. Datorit inegalitii
dimensiunilor, fragmentele pot fi separate prin electroforez.
24

Mutaiile pot modifica un situs de restricie, care nu va mai fi recunoscut de
enzim sau pot crea situsuri noi. Aceste mutatii se acumuleaz n timp, astfel nct
clivarea moleculei de ADN cu aceeai enzim produce la persoane diferite fragmente
de ADN cu lungimi diferite, rezultnd
un polimorfism al lungimii fragmentelor de
restricie (RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (engl.) care poate fi folosit
ca marker n diagnosticul unor afeciuni genetice.
II.3 Metode citologice

Pentru analiza fragmentului de ADN obinut, fie prin utilizarea unei enzime de
restricie, fie prin metoda ADNc, este necesar multiplicarea fragmentului n cantiti
suficiente. Aceast amplificare implic dou etape: introducerea fragmentului de ADN
ntr-un vector i inseria vectorului ntr-un organism gazd, n care vectorul are
replicare independent. n final, celulele gazd purttoare ale vectorului sunt
recunoscute specific, iar fragmentul de ADN analizat este extras din celulele
respective.
II.3.1 Vectori
Vectorii sunt molecule de ADN, utilizate pentru incorporarea unor secvene de
ADN strin ntr-o celul gazd. Vectorii trebuie s prezinte urmtoarele particulariti:
s aib replicare activ i independent de genomul celulei gazd;
s poat fi obinui uor;
s prezinte situsuri de clivare enzimatic unice, pentru a facilita recombinrile;
s aib talie mic, pentru a fi posibil inseria unor fragmente de ADN mari;
s perturbe minim activitatea celulei gazd;
s nu prezinte mutaii n timpul amplificrii;
s posede caliti care s permit selecia celulelor n care a fost ncorporat.
Principalele utilizri ale vectorilor sunt:
clonarea si amplificarea unei secvene de ADN;
introducerea unei gene n celule (transfecie);
introducerea unei gene n organisme superioare (animale transgenice);
studiul mecanismelor de expresie a unei gene;
25

sinteza industrial de proteine codificate de gene.
n tehnicile de clonare pot fi utilizate patru tipuri de vectori, alegerea acestora

depinznd de lungimea ADN-ului exogen, pe care-l fixeaz i de tipul de ADN clonat
(genomic sau complementar) (tabelul VII.2.)
Tabel VII.2. Tipuri de vectori
Vector
Gazd
Tip ADN
Mrimea
clonat
fragmentului
Plasmide
Bacterii, levuri
Genomic,
inserat
5-6 kb
Bacteriofa
Bacterii
ADNc
Genomic,
10-23 kb
gi
Cosmide
Cromoso
Bacterii
Bacterii (BAC)
ADNc
Genomic
Genomic
50 kb
100-300 kb
mi
Bacteriofagi
artificiali
(PAC)
100-120 kb
100-1000 kb
Levuri (YAC)
Plasmidele sunt vectorii cei mai simpli, fiind alctuii din mici molecule
circulare, dublu catenare de ADN, de circa 2-5 Kb, prezente n bacterii i care au
replicare independent de cea a cromosomului bacterian. Fiecare celul bacterian
conine 50 - 100 plasmide. Ele prezint un situs de iniiere/origine a replicrii ("ori")
una sau mai multe gene care confer rezisten la antibiotice i un situs unic de
restricie, situat ntr-o gen de selecie (figura VII.4.a). La nivelul situsului de restricie
pot fi inserate molecule exogene de ADN, cu dimensiuni de 5-10 Kb. Dup
introducerea secvenei de ADN, plasmidul este ncorporat ntr-o bacterie, proces numit
transformare.
Bacteriofagii sunt virusuri care infecteaz anumite bacterii. De obicei, n
tehnicile de ADN recombinant sunt folosii fagii , care infecteaz Escherichia coli,
deoarece ei au un sistem de penetrare a bacteriei i se replic rapid i intens.
Proliferarea lor n bacterii este certificat de apariia unor regiuni de liz a culturii
bacteriene. Bacteriofagii conin o molecul bicatenar, liniar de ADN, de aproximativ
45 Kb, localizat n capsula virusului (figura VII.4.b). Aceast molecul de ADN
prezint la ambele extremiti segmente monocatenare, adezive, numite cos, care
26

permit inseria ADN-ului fagic n cromosomul bacterian. La nivelul regiunii centrale a
moleculei de ADN fagic exist un segment (10-20 kb) neesenial pentru replicare, care
poate fi decupat i nlocuit cu ADN exogen, rezultnd fagi recombinani, care pot fi
introdui n bacterii, cu scopul amplificrii fragmentului de ADN exogen.
Pst1
Amp
Tc
BamH1
Ori
Fig.12 Tipuri de vectori: a plasmid; b bacteriofag

a - amp (gena de rezisten la ampicilin) tc (gena de rezisten la tetraciclin) ori (originea replicrii)
BamH1, PstI (situsuri de restricie) b- 1 capsula fagului; 2 nveliul proteic al genomului; 3 molecul
bicatenar de ADN; 4 secvenele cos
Cosmidele sunt vectori artificiali, sintetizai prin adugarea la o molecul de

plasmid a secvenelor cos ale fagului , secvene care permit ncorporarea unui
fragment de ADN de circa 50 Kb. Cosmidele acioneaz ca bacteriofagii naturali, astfel
nct
dup
introducerea
circularizeaz,
lor
replicndu-se
bacterie,
similar
unui
molecula
de
ADN
plasmid.
Avantajul
cosmidului
cosmidelor
se
este
determinat de posibilitatea clonrii unor fragmente lungi de ADN.

Cromosomii artificiali pot fi obinui pe baz de componente bacteriene (BAC
Bacterial Artificial Chromosome) bacteriofagice (PAC P1 bacteriophage Artificial
Chromosome) sau de levuri (YAC Yeast Artificial Chromosome).
n cazul cromosomilor artificiali bacterieni cel mai frecvent este folosit un
plasmid de E. coli, numit factorul F (Fertility factor). Utilizarea acestui tip de vector
prezint urmtoarele avantaje: pot fi ncorporate fragmente de ADN de pn la 300 kb
i pot fi clonate fragmente de ADN repetitiv. n cazul utilizrii unor vectori naturali,
replicarea fragmentelor de ADN eucariot, care conin secvene repetitive, n celulele
gazd poate conduce la rearanjamente moleculare Dezavantajul folosirii cromosomilor
27

artificiali bacterieni este legat de numrul redus de copii obinute, plasmidul F conine
dou gene, care limiteaz numrul acestor plasmide la 1-2/celul.
PAC-urile sunt hibrizi ntre un plasmid i bacteriofagul P1. Repliconul fagului este
iniial introdus n genomul plasmidului, dup care plasmidul este clivat cu dou enzime
de restricie. n continuare, este inserat fragmentul de ADN exogen. n final complexul
de ADN este intodus n capsula fagului P, care infecteaz o bacterie, fiind amplificat
secvena de ADN exogen.
n cazul sintezei unor cromosomi artificiali de levuri, din cromosomii naturali
este obligatorie pstrarea centromerului, a telomerelor i a secvenelor de replicare
autonom, elemente eseniale pentru replicarea cromosomului. Restul secvenelor
cromosomice pot fi nlocuite cu secvena de ADN, care trebuie clonat. Utilizarea
acestui tip de vector permite izolarea i clonarea unor fragmente mari de ADN, de
pn la 1000 Kb, iar replicarea fragmentelor de ADN repetitiv nu este afectat. Dup
sintez, cromosomii artificiali sunt reintrodui n celulele de levur, de regul
Saccharomyces cereviseae, care se multiplic, permind clonarea ADN-ului exogen.
Dup obinerea unui fragment de ADN , prin intemediul enzimelor de restricie
sau prin metoda ADN-c, se impune multiplicarea fragmentului n cantiti suficiente
pentru analize i utilizri. n acest scop, genele se nsereaz ntr-un vector i cu
ajutorul lui sunt introduse ntr-o celul gazd.
II.3.2 Celule gazd

Pentru multiplicarea unui vector recombinant se utilizeaz dou categorii de
gazde: factori nepatogenici i celule eucariote
Bacteriile sunt frecvent folosite datorit multiplicrii rapide, facilitilor de
manevrare i costului redus. Bacteriile sunt modificate pentru a diminua riscurile
diseminrii artificiale. Cel mai frecvent se utilizeaz E.Coli, mai rar sunt folosite:
Pseudomonas i Bacillus subtilis.
Introducerea unui vector ntr-o celul bacterian se numete transformare.
Fenomenul este facilitat de tratarea cu ioni bivaleni, urmat de oc termic, care
formeaz pori n peretele celular, prin care ptrund
plasmidiile.
Celulele eucariote utilizate sunt de levuri sau plante. Ele se folosesc pentru
studiul expresiei genelor eucariote, al modului de reglare sau al efectului mutaiilor in
vitro. Celulele pentru integrarea ADN strin trebuie s se multiplice rapid i continuu i
s poat fi selecionate dintre celulele, care nu integreaz ADN datorit unei
28

caracteristici fenotipice particulare. ncorporarea ADN-ului ntr-o celul eucariot se
numete transfecie. Aceasta poate fi realizat prin metode, precum:
precipitarea ADN cu fosfat de calciu, urmat de absorbia particulelor formate prin

endocitoz;
microinjecia;
electroparaia celulelor (aplicarea unui impuls electric, de tensiune nalt) soldat

cu permeabilizarea membranei pentru fragmentele de ADN;
incubarea celulelor int cu complexe reticulare sau liposomi modificai cu ADN;
infecia cu retrovirusuri recombinante defective.
II.3.3 Etapele clonrii moleculare

Pregtirea vectorului. Inaintea folosirii sale, vectorul trebuie secionat, cu o
enzim de restricie, la locul unde va fi introdus secvena de ADN exogen. Capetele
eliberate vor fi tratate cu fosfataz alcalin pentru a fi mpiedicat refacerea moleculei
de ADN (figura .VII.5.)
Alegerea gazdei depinde de vectorul utilizat. Astfel, celulele bacteriene sunt
folosite pentru purificarea, amplificarea sau analiza structurii genelor, iar celulele
eucariote pentru studiul funciei unei gene umane sau animale.
Realizarea recombinantului i ncorporarea n celulele gazd. Vectorul i
ADN sunt amestecai, n anumite proporii, n prezena unei ligaze, care realizeaz
legturi solide ntre moleculele de ADN. Recombinantul obinut va fi purificat i apoi
ncorporat ntr-o celul gazd unde, prin replicare autonom, va fi multiplicat.
Procedura de inserie este specific fiecrui tip de vector.
Selecia celulelor recombinate se bazeaz pe caractere fenotipice particulare.
Astfel, creterea bacteriilor pe un mediu cu Ampicilin selecteaz celulele care conin
copii ale plasmidei cu gena uman inserat confer bacteriei rezisten la acest
antibiotic. Se formeaz o colonie de bacterii cu ADN recombinant. Proliferarea fagilor
ntr-o colonie bacterian se traduce prin liza acesteia.
Izolarea ADN-ului recombinant se bazeaz pe modificrile diferite ale ADNului plasmidic i cele ale ADN-ului din cromosomii bacterieni n momentul n care sunt
supui la diverse tipuri de denaturare. Prin tratare cu soluii intens bazice (pH = 12)
cromosomii bacterieni se liniarizeaz, n timp ce ADN-ul plasmidic rmne circular. n
momentul restabilirii condiiilor fiziologice ADN-ul plasmidic i reface legturile de
hidrogen, n timp ce ADN-ul bacterian rmne monocatenar i precipit, ceea ce
29

permite separarea celor dou tipuri de ADN. Dac este necesar o purificare mai bun
se face o centrifugare izopicnic n soluie de clorur de cesiu i bromur de etidiu.
Prin distrugerea legturilor de hidrogen dintre cele dou catene, bromura de etidiu se
fixeaz pe cromosomii bacterieni liniarizai, formnd complexe mai dense dect ADN-ul
plasmidic, ceea ce permite separarea ADN-ului.
3
tc
amp
Fig.13 Etapele clonrii fragmentelor de ADN uman, folosind plasmidul pBR322 - 1 secionarea
plasmidului i a ADN-ului uman cu enzima de restricie Pst I, sgeile punctate indic situsurile de
restricie ale enzimei; 2 formarea ADN-ului recombinant, prin introducerea unui fragment de ADN uman
n molecula plasmidului n prezena unei ligaze; 3 introducerea plasmidului recombinant ntr-o celul de
E.coli, urmat de amplificarea clonei i selecia acesteia
A celule bacteriene care conin plasmidul, dar sunt lipsite de fragmentul de ADN uman (clone de E.coli
rezistente att la ampicilin, ct i la tetraciclin); B - celule bacteriene care conin plasmidul, iar
fragmentul de ADN uman este inserat (clone de E.coli rezistente la tetraciclin, dar sensibile la
ampicilin); C celule bacteriene care nu conin plasmidul (clone de E.coli sensibile att la ampicilin, ct
i la tetraciclin);
II.3.4 Construcia bibliotecilor de gene

Dup perfecionarea tehnicilor de clonare molecular a aprut necesitatea crerii
unei colecii de clone de ADN recombinant, care s conin toate secvenele dintr-o
surs ADN genomic sau ADNc. Identificarea clonei care conine gena dorit din
30

ansamblul clonelor din biblioteca sau banca de gene a impus realizarea unor tehnici
de identificare (screening).
Dup extragerea ntrgului ADN genomic dintr-o celul somatic se realizeaz
fragmentarea sa cu o enzim de restricie, care produce fragmente de circa 20 Kb. n
general, se utilizeaz concentraii ale enzimei de restricie inferioare celei necesare
pentru secionarea tuturor situsurilor de restricie. Astfel, n urma digestiei cu enzima
de restricie ADN-ul genomic este secionat aleatoriu, rezultnd fragmente de
dimensiuni diferite i care parial sunt superpozabile. Aceste fragmente sunt nserate
ntr-un vector (bacteriofag ) vectorul este amplificat n bacterii, rezultnd o banc cu
sute de mii de fagi recombinani, care conin fragmente de ADN genomic. Pentru a
facilita identificarea unei anumite gene au fost constituite colecii de clone, ce
corespund anumitor cromosomi.
Un alt tip de banc / bibliotec folosit frecvent pentru izolarea genelor este banca
de ADNc, care cuprinde copiile de ADNc nserate ntr-un vector, ce corespunde ARNm
dintr-o anumit celul. n acest caz, este extras tot ARN-ul dintr-un esut, se separ
ARNm, iar cu ajutorul transcripiei inverse se produc copii de ADNc, corespunztoare
fiecrui ARNm. Fiecare segment de ADNc este nserat n vectori de tip bacteriofag ,
rezultnd o banc de ADNc. Avantajele utilizrii unei bnci de ADNc sunt determinate de
faptul c ADNc este sintetizat pe baza secvenei ARNm, care corespunde doar exonilor din
genele de structur, ceea ce faciliteaz identificarea genei cutate.
Identificarea clonei care conine ADN recombinant sunt folosite: criblajul
cu oligonucletide i criblajul prin anticorpi. Criblajul cu oligonucleotide de sintez
utilizeaz o secven nucleotidic scurt, sintetizat pe baza secvenei de aminoacizi a
unei pri din proteina X (15-20 aminoacizi) astfel nct secvena oligonucleotidic
corespunde unei pri din gena investigat. Aceast secven este marcat radioactiv
i hibridat cu clone din banca de ADN. Sonda se fixeaz specific pe secvena omolog,
permind identificarea clonei care conine gena care codific proteina X. Criblajul cu
anticorpi permite identificarea proteinei codificat de o anumit gen. Complexul
antigen-anticorp este identificat prin utilizarea de proteine marcate cu
I.
125
Dup identificarea vectorului cu secvena ADN dorit, acesta va fi utilizat pentru

clonare i producerea copiilor necesare analizei (identificarea markerilor caracteristici
fragmentului, digestia ADN n fragmente uor de clonat n plasmide i secvenializarea ADN).
31
II.3.5. Amplificarea selectiv a secvenelor de acizi nucleici prin metoda

"Polymerase Chain Reaction"
Analiza genotipic a fost perfecionat prin introducerea tehnicii de polimerizare
n lan (polymerase chain reaction - PCR). Aceast metod permite amplificarea
selectiv a unei secvene scurte de ADN sau ARN. Amplificarea este considerabil (de
milioane de ori) i rapid (n cteva ore) permind obinerea unei cantitti suficiente
de material, necesar pentru analize.
Metoda PCR asigur amplificarea unei secvene int dintr-o molecul de acid
nucleic, prezent ntr-o matrice complex. Metoda permite obinerea unui fragment de
ADN cu lungime i secven bine definite.
Metoda utilizeaz dou oligonucleotide amorse, pe care le hibrideaz la capetele
unei secvene int i necesit prezena unei ADN-polimeraze termorezistente.
Secvena amorselor trebuie s fie cunoscut i s fie complementar unei secvene de
20-25 nuleotide, situate la captul 3' al celor dou catene ale segmentului de ADN.
Metoda PCR implic trei etape care se repet la fiecare ciclu de amplificare:
n prima etap, segmentul de ADN ce trebuie amplificat este denaturat termic (la
95oC), obinndu-se un amestec de fragmente monocatenare;

n a doua etap, se produce (la 37 oC) poziionarea i hibridarea amorselor la
secvenele complementare (situate n poziia 3') de pe fiecare caten.

In a treia etap (la 70oC) sub aciunea unei ADN-polimeraze termorezistente, plecnd de la
fiecare amors este sintetizat, n sensul 5' 3', o caten de ADN complementar catenei
matrice. n circa 10 minute se produce o dublare a cantitii iniiale de ADN (figura VII.10.).
Repetarea ciclurilor de denaturare termic, hibridare a amorselor i sintez
enzimatic a ADN-ului, produce o amplificare exponenial: dup n cicluri se obin 2 n
exemplare din segmentul iniial de ADN (cuprins ntre capetele 5' ale amorselor).
Deoarece se folosesc cantiti n exces de amors i enzim, pot fi parcurse
aproximativ 30 de cicluri, ceea ce asigur amplificarea de circa un milion de ori a
segmentului dorit i o cantitate de ADN suficient pentru orice analiz.
Pentru accelerarea procesului trebuie lucrat la temperaturi nalte (70-95
C)
ceea ce impune utilizarea unei ADN-polimeraze termostabile, precum cea izolat din
bacteria Thermus aquaticus (Taq). ADN-polimeraza Taq asigur sinteza unor fragmente
de ADN cu lungimea de 10 kilobaze.
Avantajele procedeului PCR sunt urmtoarele :
32
Amplificarea unei secvene genice specifice n proba recoltat de la pacient,

fr clonare i fr a fi necesar o metod de analiz genotipic: Southern sau
Northern;
5
Denaturare
termic
5
Hibridare cu
amors specific
Ciclul I
3
5
Polimerizare n prezena
Taq polimerazei
3
3
5
3
5
3
3
5
3
5
3
3
5
Fig. 14 Polymerase chain reaction (PCR)
Simplitatea procesului, nefiind necesare dect modificri ale temperaturii reaciei,
astfel nct metoda se preteaz la automatizare;

Rapiditatea (dup 25 de cicluri de 3-5 minute pentru fiecare copie, o gen poate fi
amplificat de milioane de ori n cteva ore) i costul redus.

Sensibilitatea deosebit, astfel nct este posibil amplificarea unei secvene de ADN
provenit dintr-o singur celul;

Specificitatea se coreleaz cu hibridarea ADN-ului, cu amplificarea exponenial a
fragmentelelor complementare i cu un grad nalt de fidelitate a sintezei ADN

Exist i o serie de aplicaii particularea ale metodei PCR:
prin includerea la capetele 5 ale produsului amplificat a unor secvene specifice de
ADN, se produc fragmente optime pentru clonare, care conin informaiile necesare
33

pentru expresia fragmentului ntr-o gazd bacterian sau n sisteme unde nu este
posibil transcripia i translaia;
prin utilizarea unui amestec de oligonucleotide primare cu secvene modificate pot fi
amplificate i studiate secvene de ADN nrudite cu unele secvene cunoscute, dar

care nu au fost anterior izolate sau caracterizate;
utilizarea unor concentraii diferite ale amorselor oligonucleotidice genereaz ADN
monocatenar;
utilizarea deoxiribonucleozid-trifosfailor marcai ofer posibilitatea preparrii de
probe marcate pentru studii de hibridare.

O limit a metodei este lungimea segmentului amplificat care, n general, nu
depete 3 kb.
Metoda permite amplificarea secvenelor de ADN: genomic, mitocondrial,
exogen (n special viral) sau complementar. Metoda PCR are aplicabilitate n bolile
genetice, a cror defect molecular este cunoscut. Sensibilitatea PCR permite
detectarea agenilor patogeni ai bolilor infecioase, chiar dac concentraia acestora
este foarte mic sau se gsesc n stare latent. Metoda PCR poate fi aplicat n
biologie pentru studii evoluioniste, deoarece permite amplificarea secvenelor de ADN
prelevate din fosile.
Utilizarea PCR pentru analiza particularitilor ADN-ului unor indivizi diferii este
de interes n medicina legal pentru teste de paternitate, n timp ce posibilitatea
analizei de probe vechi sau degradate, rapiditatea, i nalta specificitate i sensibilitate
are aplicabilitate n criminalistic.
34
CAPITOLUL III
SECVENIEREA ADN
Dup izolarea i amplificarea unui fragment de ADN este necesar determinarea
secvenei nucleotidice, corespunztoare informaiei genetice. Aceast analiz este
decisiv pentru: stabilirea structurii genei i a secvenei de aminoacizi din proteina
codificat de gen. Stabilirea secvenei nucleotidice este util i pentru sinteza
oligosondelor specifice pentru o alel (ASO) i a amorselor folosite n tehnica PCR,
avnd aplicaii n diagnosticul molecular.
Secvenierea ADN este operaia de identificare a ordinii liniare a bazelor azotate
din ADN, prin metode chimice sau prin metode enzimatice. n ultimul deceniu, s-au
pus la punct metode automate de secveniere, precum i metode de secveniere
direct a produilor de amplificare PCR i de detecie direct a polimorfismului de
secven a moleculelor de ADN.
Pentru secvenierea ADN seaplic dou metode: metoda Maxam-Gilbert i
metoda Sanger.
III.1 Metoda chimic Maxan - Gilbert

Aceast metod utilizeaz molecula de ADN de lungime difrit pecare
dorim s o secveniem i care are un capt marcat. Aceast molecul de ADN este
tiat cu reactivi care au specificitate de baz azotat.
n cazul n care utilizeaz un reactiv specific pentru tierea la nivelul resturilor
de guanin (G), cu toate c acelai principiu se aplic i pentru celelalte trei baze
azotate, mai nti se marcheaz captul moleculei ce urmeaz a fi secveniat, fie n 3,
fie n 5, dup care are locmodificarea bazei azotate, cum ar fi, de exemplu, metilarea
guaninei cu dimetilsulfat (DMS). DMS poate metila i adenina, dar nu pe aceeai cale
care conduce la clonarea catenei de ADN. Metilarea se realizeaz n condiii menajate,
ceea n continuare, se utilizeaz reactivul piperidin care scoate din caten baza
metilat purinic i induce, astfel, o ruptur n coloana glucidofosfatic a catenei ADN,
la situsul apurinic G.
n cazul indicat, a fost metilat guanina, din mijlocul secvenei, astfel c ruperea
catenei apare aici, producnd un trimer marcat. ntr-o alt molecul de ADN, primul
rest de guanin ar putea fi metilat dndnatere la un fosfat marcat (baza i zahrul au
35

fost pierdute n cadrul clivajului chimic). n final, se realizeaz electroforeza produilor
i detecia lor prin autoradiografie. Vor trebui desfurate alte trei reacii care cliveaz
la nivelul altor trei baze. Se pot slbi legturile adeninei i guaninei cu acid, dup care
piperidina va determina depurinarea i ruperea catenei, att dup A-uri, ct i dup Guri. Dac se realizeaz electroforeza produilor acestei reacii A+G, n afar de reacia
doar a lui G, se poate determina poziia A-urilor, doar prin comparaie. n mod similar,
hidrazina deschide att inelul timinei ct i pe cel al citozinei, iar piperidina poate,
apoi, ndeprta aceste baze i rupe catena ADN, la situsurile apirimidinice rezultate. n
prezena soluiei 1M NaCl, hidrazina este specific doar citozinei, astfel c aceast
reacie poate fi realizat dup reacia C+T i se obin T-urile, prin comparaie.
Metoda de secveniere Maxam-Gilbert este laborioas, aplicat doar n anumite
cazuri, deoarece reactivii utilizai sunt toxici i greu de manevrat.
Matoda Maxam-Gilbert permite ruperea la nivelul unor baze specifice a unei
catene ADN cu un capt marcat, prin utilizarea unor reactivi cu specificitate de baze.
Fragmentele marcate sunt apoi supuse electroforezei ntr-un gel de poliacrilamid, de
nalt rezoluie, dup care are loc i detecia lor, prin autoradiografie. Prin aceasta, se
realizeaz ordonarea fragmentelor, dup lungimea lor i din aceast ordonare se
deduce secvena ADN.
36
37
III.2 Metoda enzimatic (SANGER)

Metoda Sanger este cea mai utilizat metod de secveniere i se mai numete
metoda terminrii catenei, pentru mecanismul de lucru, precum i metoda dideoxi,
pentru reactivii utilizai. Metoda implic sinteza enzimatic, sub cataliza ADN
polimerazei, de monocatene polidezoxiribonucleotidice i stabilirea ordinii de includere
a nucleotidelor n acestea. Regiunea din ADN ce urmeaz a fi secveniat este mai nti
clonat n vectori specializai, utilizai n producerea de ADN monocatenar. Un primer
oligonucleotidic, sintetizat pe cale chimic, este cuplat la monocatena ADN ce urmeaz
a fi secveniat. Cuplarea se realizeaz ntr-un punct aflat imediat n amonte de
sectorul ce trebuie secveniat.
Metoda implic sinteza enzimatic de lanuri polinucleotidice de ADN, de
lungime diferit, cu stoparea replicrii la una dintre cele patru dideoxi care se ataeaz
la captul 3 al monocatenei n cretere, blocndu-i elongaia acesteia i stabilindu-i o
lungime anumit, pe baz de includere randomizat a dideoxiribonucleotidului n
catena replic.
Clonarea ADN ce urmeaz a fi secveniat este realizat ntr-un anumit tip de
vectori care permit ca ADN clonat s existe n forma de monocaten, obinut prin
denaturarea termic a ADN ce trebuie secveniat.
Lungimea primerului sintetic de secveniere este de 20 de nucleotide i el este
astfel proiectat nct s se hibridizeze cu o secven adiacent. Situsul de clonare
multipla din vector este orientat cu terminalul su 3 spre insertul ce urmeaz a fi
secveniat. Primerul este marcat radioactiv, pentru a putea fi identificate toate
catenele nou sintetizate, inclusiv cele care au adugat la captul lor 3 un singur
dideoxiribonucleotid.
Aceasta este tehnica de secveniere manual. Ea este foarte riguroas, dar
este nceat. Ea se aplic pentru secvenierea unor fragmente scurte de ADN. n anul
1993, cea mai lung molecul de ADN secveniat era de 350000 nucleotide lungime.
Cel mai mic cromozom uman are 50000000 de perechi de nucleotide. Cu dotarea cea
mai bun se putea secvenia atunci ntre 50000 i 100000 de nucleotide pe an, la un
cost de 1-2 dolari, perechea de nucleotide. Ca s se secvenieze ntregul genom uman
ar fi fost necesari 30000 de ani de munc la un pre de 3 miliarde dolari pe an.
Aceasta a impus deyvoltarea sistemelor automate de secveniere a genomurilor, care
38

pot secvenia cu acuratee peste 100000 de baze pe zi, la un cost de 0.50 dolari pe o
baza azotat.
Pentru secvenierea unor sectoare mari din genom se utilizeaz tehnica
secvenierii automate, tot pe baza metodei lui Sanger, de terminare a catenei cu
dideoxinucleotide.
n cadrul acestei metode automate, primerii utilizai n fiecare din cele patru
reacii sunt etichetai cu o molecul fluorescent diferit, astfel c produii de reacie
din fiecare eprubet voe emite o alt culoare fluorescent, atunci cnd sunt excitai de
lumin. Dup ce reaciile de extindere i terminarea catenelor sunt complete, toate
cele patru coninuturi ale eprubetelor se amestec i sunt electroforezate mpreun, n
acelai traseu prin gel.
n apropierea zonei de jos a gelului se afl un analizor
care excit
oligonucleotidele fluorescente cu o raz lase, pe cnd acestea trec prin el. Culoarea
luminii
fluorescente
emis
de
fiecare
oligonucleotid
este
detectat
electronic.
Informaia este trecut ntr-un computer, programat s converteasc informaia de

culoare ntr-o secven de baze. Dac el vede albastru, de exemplu, nseamn c
oligonucleotidul vine din tubul de reacie cu dideoxiC i se termin n C, fiind un ddC.
Verdele indic A, oranjul indic G i roul indic T. Computerul analizeaz profilul
fiecrei benzi fluorescente ce trece prin analizor, cu codul de culoare pentru fiecare
baz i depoziteaz informaia privind poziia fiecrei baze azotate n memoria sa.
Acum exist, aadar, secveniatoare automate care printeaz pur i simplu
secvena sau o trimit unui computer, pentru a fi analizat. Proiectele genomice mari
utilizeaz mai multe secveniatoare automate care lucreaz simultan, spre a obine
milioane i miliarde de baze ale secvenei, aa cum a fost cazul cu realizarea
proiectului de secveniere al genomului uman.
n prezent, secvena ADN se realizeaz i cu ajutorul reaciei n lan a
polimerazei (PCR), adaptat special acestui scop.
39
CAPITOLUL IV
PROIECTUL GENOM UMAN
IV.1 Derularea PGU
Proiectul Genom Uman (PGU) Human Genome Project (HGP) a atras atenia
asupra necesitii izolrii genelor specifice, precum i necesitatea localizrii lor ntr-o
regiune cromozomal. Scopul iniial al PGU a fost acela de a secvenia genomul uman
n ntregime, pn n anul 2005. A nceput n mod oficial n Octombrie 1990 i, dei a
fost planificat pentru a dura 15 ani, avansarea rapid a tehnologiei a accelerat
terminarea sa, el finalizndu-se n Aprilie 2003.
Proiectul a implicat o cooperare internaional unic n domeniul biologiei.
Principalele institute care au finanat PGU au fosr Departamentul de Energie al Statelor
Unite ale Americii i Institutul Naional de Sntate. Dei ideea pentru un asemenea
proiect a fost lansat nc din 1984, finanarea nu a fost obinut pn n 1988.
Cel puin 18 alte ri au nfiinat programe de cercetare a genomului uman.
Unele dintre cele mai extinse programe au avut loc n Australia, Brazilia, Canada,
Danemarca, Regatul
Unit al Marii Britanii, Frana, Germania, Israel, Italia, Japonia,
Koreea, Mexic, Olanda, Rusia, Suedia, Uniunea European, SUA. Datorit preocuprilor
internaionale cu privire la studiul genomuli uman, a fost necesar punerea bazelor
unei Organizaii Mondiale asupra Genomului Uman, ceea ce a devenit realitate, aceasta
fiind cunoscut sub sigla HUGO (Human Genome Organization). HUGO i-a asumat
responsabilitatea coordonrii eforturilor diferitelor ri n cercetarea genomului uman i
de a facilita schimburile de resurse tiinifice ntre parteneri, ncurajnd totodat i
participarea altor ri la realizarea obiectivelor PGU. HUGO a fost organizat n trei
ramuri: HUGO America (Washington), HUGO Europa (Londra) i HUGO Pacific
(Japonia).
Raiunea major a PGU a fost dobndirea informaiilor fundamentale privind
zestrea ereditar a fiinei umane i elucidarea rolului diferitelor gene asupra sntii
i patologiei umane. Achiziia major a PGU a fost, la nceput, construirea hrilor
genetice i fizice complete, adic secvenierea complet a genomului uman.
40

Principalele obiective ale PGU au fost:
identificarea tuturor celor aproximativ 20000-25000 de gene din ADN-ul

uman;
stocarea acestor informaii n baze de date;
perfecionarea unor mijloace pentru analizarea datelor;
discutarea problemelor etice, legale i sociale care pot aprea datorit

proiectului.
Pentru atingerea acestor obiective, cercettorii au studiat i componenta

genetic a mai multor organisme nonumane. Acestea includ bacteria Escherichia coli,
insecta Drosophila melanogaster i oarecele de laborator.
Beneficiul principal al proiectului este acela c datele privind efectele variaiei
ADN-ului printre indivizi pot conduce la aflarea unor metode revoluionare de
diagnostic, tratament i, uneori, de prevenire a miilor de boli care ne afecteaz.
Pe lng furnizarea indiciilor ce duc la nelegerea biologiei umane, studiile
privind ADN-ul organismelor nonumanepoate aduce la nelegerea capacitilor lor
naturale care pot fi aplicate pentru rezolvarea provocrilor privind ngrijirea sntii,
agriculturii, producerea energiei, remedierea mediului nconjurtor i retragerea
carbonului.
IV.2 Secvenierea genomului uman

n ultimii 25 de ani au fost secveniate primele gene, iar apoi genomuri ntregi.
Astfel, s-a reuit secvenierea a 599 de virusuri i viroizi, 205 plasmide naturale, 185
organite celulare eucariote, 31 eubacterii, 7 arhea, o ciuperc, dou animale i o plant.
n operaiunea de descifrare a genomului uman au fost stabilite dou standarde:
schia de lucru a secvenei sau schia draft i forma final a secvenei genomice. Pentru
schia de lucru, s-au prevzut a fi identificate 90% din genom, cu goluri i cu o rat de
1%, pe cnd secvena final va trebui s aib minimum posibil de goluri de secveniere i o
rat de eroare de numai 0,01%.
Finalizarea obiectivului secvenei finale a fost prevzut pentru anul 2005, la un
cost de cteva miliarde de dolari americani. Elaborarea unor strategii raionale de
secveniere a surmontat apariia multor dificulti. Ele au inclus realizarea mai nti a
hrilor fizice de contig-uri i apoi stabilirea secvenei coerente.
41

nainte de lansarea PGU, localizarea unei gene de interes presupunea identificarea
a doi markeri flancatori ai acelei gene, analiza bibliotecii genomice pentru identificarea
YAC-ului n care se afl aceti markeri i utilizarea insertului ADN uman din acel YAC, spre
a fi secveniat, ocazie cu care era dezvluit i secvena genei cutate.
Secvenierea genomului uman a nsemnat un proces mult mai complex n care cele
dou strategii, una a cartrii i secvenierii clon-de-clon, cealalt a abordrii shotgun, sau ngemnat, presupunnd totodat o larg colaborare internaional, cu implicarea a
mii de cercettori.
Secvena draft a genomului uman a fost generat dintr-o hart fizic ce acoper
peste 96% din partea eucromatinic a genomului uman i alturi de secvenierea
adiional prezentat n bazele de date publice, acoper peste 94% din genomul uman.
Secvena draft va fi convertit ntr-o secven finalizat, prin nchiderea golurilor i
eliminarea tuturor ambiguitilor. Deja, aproape un miliard de baze sunt definitiv
identificate.
Secvenierea genomului uman nseamn realizarea descifrrii celui mai mare
genom, acesta fiind de 25 de ori mai mare decat oricare din genomurile secveniate pn
acum i de 8 ori mai mare dect suma tuturor genomurilor secveniate anterior. Este
primul genom de vertebrat, extensiv secveniat i, faptul cel mai uimitor este c aparine
celui care l-a secveniat.
n genomul uman se estimeaz existena a 30000-40000 de gene codificatoare de
proteine, ceea ce nseamn doar un numr dublu fat de viermi i insecte. Numai c,
aceste gene sunt mai complexe i cu mult mai multe situsuri de splicing alternativ ceea ce
nseamn producerea unui numr mai mare de produi proteici.
Setul complet de proteine, aa numitul proteom, codificat de genomul uman, este
mai complex dect cel de la nevertebrate. Aceasta se datoreaz, n parte, prezenei unor
domenii proteinice i i a unor motive (estimare 7% din total) cu specificitate de
vertebrat, dar i mai mult, faptul c vertebratele i-au aranjat componentele preexistente
ntr-o colecie bogat de arhitecturi ale domeniului. Sute de gene umane apar a fi
rezultatul prin transfer orizontal de la bacterii, ntr-un anumit moment al evoluiei
vertebratelor. Pe de alt parte, zeci de gene par a fi aprut din elemente transpozabile.
42

ncepnd din anul 1955, eforturile analizelor genomice au fost orientate pe dou
fronturi:
1. construirea de hri genetice i fizice ale genomului uman i ale genomului
de oarece, acestea constituind elemente cheie n identificarea genelor
implicate n boli umane i puncte de ancorare pentru secvena genomic.
2. secvenierea genomurilor de Saccharomzces cerevisiae i Caenorhabditis
elegans.
Bibliotecile au fost realizate prin digestia parial a ADN genomic cu enzime de
restricie. Toate laolalt reprezint o acoperire de 65 de ori (probe redundante) a
genomului uman. Bibliotecile bazate pe ali vectori, precum sunt cosmidele, au fost
utilizate n primele etape ale derulrii proiectului.bibliotecile au fost preparate din ADN
obinut de la donatori umani anonimi, n acord cu Reglementrile Federale ale SUA pentru
Protecia Subiecilor Umani n Cercetare i dup referirea deplin de ctre un Comitet de
Revizuire Instituional. Au fost acceptai voluntari de diferite proveniene (rase, statut
social, vrst, etc.). Probele au fost obinute dup o discuie cu un consilier genetic i
consensul informal n scris. Probele au fost fcute anonime, prin marcare numenic
randomic i transferul n laborator unde s-au ndeprtat etichetele i au fost reetichetate
ntr-un nou sintem.Astfel, toate recordurile de marcare au fost distruse i s-a asigurat
pierderea identitii donatorilor.
IV.3 Aplicaiile practice ale PGU

Cele mai importante aplicaii ale unor asemenea cercetri se refer la
posibilitatea de identificare de gene ale bolilor umane cu funcie biochimic
necunoscut, prin analiza clonelor poziionale. Aceast metod implic cartarea
regiunii cromozomale care conine gena prin analiza de linkage n familiile afectate i
apoi disecia molecular a acelei regiuni, spre a gsi gena n cauz. Clonarea
poziional a fost propus n perioada anilor 1980 i se bazeaz pe construcia unei
hri de linkage, pe baza polimorfismelor lungimii fragmentelor de restricie. Un
cercettor care dorete s realizeze clonarea poziional va trebui s genereze markeri
genetici, spre a trasa ereditatea, apoi s se realizeze plimbarea cromozomal, spre a
obine ADN genomic ce acoper regiunea, dup care se realizeaz analiza unei regiuni
n jur de 1Mb, fie prin secveniere direct, fie prin metode indirecte de identificare
43

genic. Primele dou bariere au fost eliminate, o dat cu dezvoltarea, n anii 1990, a
hrilor genetice i fizice comprehensive ale cromozomilor umani, sub auspiciile
Proiectului Genom Uman. Celelalte bariere rmn nc foarte dificile. Secvena
genomului uman aflat n baza de date publice permite identificarea rapid in silico a
genelor candidat, urmat de sceening-ul mutaional al candidailor relevani, ajutat de
informaia despre structura genic. Pentru o dereglare mendelian, o cercetare genic
poate fi acum realizat n cteva luni, cu o echip de dimensiune modest.
Cel puin 30 de gene implicate n patologie au fost clonate prin eforturi de cercetare
care au depins direct de secvena genomic, disponibil public. n fiecare lun se
descifreaz secvena genic la multe gene patologice.
Secvena genic a relevat mecanisme care conduc la sindroame de deleie
cromozomal comune. n multe instane, s-a dovedit c deleiile recurente au derivat
din recombinare omoloag i crossing-over inegal dintre duplicaiile intracromozomale
aproape identice. Astfel sunt regiunea genic pentru sindromul velocardiofacial
DiGeorge, din cromozomul 22 i gena sindromului de deleie William-Beuren, din
cromozomul 7.
Secvena genomic permite identificarea rapid a paralogilor genelor patologice. Acest
aspect este important, deoarece mutaia ntr-o gen paralog poate sta la baza unei
boli genetice nrudite. Pe baza secvenei genomice, s-a gescoperit gena acromatopsiei
(orbirea complet a vederii colorate), artndu-se astfel c gena CNGB3 reprezint
cauza acromatopsiei. Un alt exemplu este reprezentat de genele presenilinei-1 i
presenilinei-2, ale cror mutaii cauzeaz debutul timpuriu al bolii Altzheimer.
n al doilea rnd, paralogul poate oferi posibilitatea pentru intervenia
terapeutic,
aa
cum
se
exemplific
prin
ncercrile
de
reactiva
genele
hemoglobinice, exprimate fetal, la indivizii cu anemie falciform sau -talasemie,

cauzate de mutaii n gena -globinei.
Analiza sistemic a paralogilor a 971 gene implicate n patologia uman, incluse
n baza de date OMIM i n baza de date proteinice SwissProt sauTrEMBL, a permis
identificarea a 286 paralogi poteniali.
Cerxcetrile genomice pot fi utile n domeniul producerii de medicamente cu
int genic, cum ar fi gena implicat n calea metabolic a serotoninei care esre
esenial n dereglri de comportament i schizofrenie. Tot astfel, calea leukotrienei a
constituit o int semnificativ pentru dezvoltarea de medicamente mpotriva astmului,
iar descoperirea unui receptor ar avea mare importan.
44

Depunerea abundent de -amiloid este generat de procesarea proteolitic a
proteinei precursoare amiloidei (APP). Una dintre enzimele de clivare APP -sit (BACE)
care este o aspartil proteaz transmembranar. Analiza computerizat a secvenei
genomului uman a permis identificarea unor noi secvene omologe lui BACE, ce
codific o protein ce s-a numit BACE2. Aceasta conine dou situsuri proteazice active
i se carteaz n regiunea din cromozomul 21 n care este cartat obligatoriu sindromul
Down, acolo unde este cartat i APP. Se pune ntrebarea dac copiile suplimentare ale
BACE2 i APP pot contribui la depunerea accelerat a -amiloidei, n creierul pacienilor
bolnavi de sindromul Dowm. Producerea de antagoniti pentru BACE sau BACE2
reprezint o abordare promittoare, n prevenirea bolii Alzheimer.
Pe baza acestor exemple, s-a realizat cercetarea sistemic de identificare a
paralogilor pentru proteinele la care intirea medicamentoas este deja realizat. S-au
identificat 18 paralogi noi posibili care include posibili receptori dopaminici, receptori
purinergici i receptori de factori insulini-asemntori. n ase cazuri, potrivirile
paralogeimplic cel puin un EST, ceea ce poate aduce identificare de gene cu funcii
noi. Pentru cei 12 posibili paralogi fr potrivire EST, au fost identificate ORF-uri lungi
i toi, cu excepia unuia, reprezint similitudine cu multipli exoni separai de introni,
aa c nu reprezint psedogene, ceea ce nseamn c ei pot reprezenta candidai de
gene noi, interesante ca inte pentru medicamente.
Analiza
secvenei
genomului
uman
permis
elucidarea
unei
probleme
misterioase a fiziologiei generale i a biologiei celulare, i anume baza molecular a

gustului amar. Omul i alteanimale prezint polimorfism pentru rspuns la anumite
gusturi amare. Recent, cercettorii au cartat aceast trstur la om i la oarece i
apoi au cercetat regiunea relevant a secvenei genomice draft pentru receptorii
cuplai proteineiG. Aceste studii au condus la descoperirea unei noi familii a acestor
proteine, demonstrnd c ele sunt exprimate aproape exclusiv n mugurii gustativi.
S-a obinut confirmarea experimental c receptorii n celulele cultivate rspund la
substane amare specifice.
Etapele viitoare n cadrul PGU vor realiza reproducerea unei secvene finisate
din clone care cuprind harta fizic curent i care acoper peste 96% din regiunile
eucromatice ale genomului. Aproape toate celelalte clone sunt deja secveniate el
puin la nivelul de acoperire provizorie, iar restul vor fi selectate pentru secveniere.
S-a ateptat ca toate clonele s ating acoperirea deplin shotgun la mijlocul anului
45

2001 i realizarea formei finale (acuratee 99,99%) a fost programat la scurt timp,
prin utilizarea de protocoale stabilite i automatizate.
n stadiul urmtor, vor fi cercetate biblioteci suplimentare, spre a nchide
golurile dintre coting-uti clonale. Probarea direcional a bibliotecilor de clone cu
inserturi mari va nchide multe dintre golurile rmase. Golurile nenchise vor fi
dimensionate prin tehnica FISH sau alte metode.
n final, trebuie identificate tehnici de nchiderea golurilor refractare la care
cauz nu au reprezentare n bibliotecile standard, cu inserturi mari. Ideal ar fi s se
obin secvena complet a tuturor regiunilor heterocromatice, precum centromerii i
crusterii genelor ribozomale, dei cea mai mare parte a acestei secvene va consta din
repetiii n tandem, nalt polimorfice, care conin puine gene codificatoare de proteine.
n toate aspectele legate de genomul uman trebuie s acioneze cu nelegere i
nelepciune , pentru ca beneficiile sa fie n slujba tuturor, n mod echitabil, deoarece
se ridic numeroase probleme etice, legale i sociale (ELSI), datorit sistemului
accelerat al descoperirilor n genetic.
Cu ct se cunosc mai multe aspecte despre genomul uman, cu att mai multe
aspecte sunt de cercetat, ceea ce amintete de cuvintele lui T.S.Eliot, redate pe
coperta interioar:
We shall not cease from exploration. And the end of all our exploring
will be to arrive where we started, and know the place for the first time.
Nu trebuie s ncetm niciodat s cercetm. i la sfritul tuturor cercetrilor
vom ajunge n locul din care am plecat i vom cunoate acel loc pentru prima dat.
46
BIBLIOGRAFIE
1. Atherly Alan, Jack R. Girton, John F. McDonald, 1999, The science of
genetics
2. Belegeanu Valerica, 2006, Elemente de genetic medical, Timioara;
3. Coco Relu, 2006, Metode i principii de genetic molecular, editura
Medical, Bucureti;
4. Cantor R. Charles, Cassandra L. Smith, 1999, Genomics The Science
and technology behind the Human Genome Project, New York;
5. Eberhard Passarge, 2001, Color Atlas of Genetics, editura Thieme, New
York;
6. Gavril Lucian, 2003, Genomica, vol.II, editura Enciclopedica, Bucureti;
7. Gavril Lucian, 2005, Genomul uman, editura All, Bucureti;
8. Gorduza Valeria Marta, 2007, Curs tehnologia ADN recombinant, Iai;
9. Pdureanu Silvica, 2004, Elemente de genetic molecular, Ed. "Ion
Ionescu de la Brad", Iai;
10.
Raicu
Petre,
1997,
Genetic,
vol.II,
editura
Didactic
Pedagogic, Bucureti;
11.
Tipa Mioara Florica, 2001, Introducere n clonarea monelular,

Arad
12.
Tudose Olimpia, 2000, Genetic medical, Bucureti;
13.
Voica Nicolae, Soare Marin, Soare Paula, 2005, Principii de

genetic, editura Universitaria, Bucureti;
14.
Zdreman
Monica,
2004,
Pedagogic, Bucureti.
47
Genetic,
editura
Didactic

Proiectul Genom Uman

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Proiectul Genom Uman

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Proiectul Genom Uman