Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
CURS DE
CHIINU 2000
IGOR CEMORTAN
SVETLANA CAPCELEA
L ARI SA ARANOV
DUM I TRU AM OAI I
Curs de
BI OL OGI E M OL ECUL AR
II
CZU 577.1/2
C 95
Colectivul de autori
Colaboratorii Catedrei de Biologie molecular i Genetic uman USMF N.
Testemianu:
Igor Cemortan confereniar, doctor n tiine biologice
Svetlana Capcelea lector superior, doctor n tiine medicale
Lar isa ar anov confereniar, doctor n tiine medicale
Dumitru Amoaii confereniar, doctor n tiine medicale
Recenzeni:
Leonid L si profesor universitar , doctor habilitat , eful catedrei
de Biochimie, USMF N. Testemianu
Nicolae Eanu - confereniar universitar, doctor n tiine medicale,
eful Catedrei de Histologie i Embriologie, USMF N.
Testemianu
Galina Lupacu doctor habilitat n tiine biologice, eful
Laboratorului de Imunogenetic, AM
Coordonator tiinific:
Nicolae Barbacaru Confereniar universitar, doctor n tiine biologice,
eful Laboratorului de Biologie molecular, AM
Consultant:
Natalia Cherdivarenco Profesor universitar, doctor habilitat n tiine
medicale, Catedra de Biologie molecular i Genetic uman, USMF N.
Testemianu
Redactor:
Olga Tagadiuc - confereniar universitar, doctor n tiine medicale, Catedra
de Biochimie USMF N. Testemianu
IV
Cupr ins
Cuvnt nainte ............................................................................. 1
SISTEME BIOLOGICE .............................................................. 6
Organizarea sistemelor biologice ........................................... 6
Nivele de organizare a sistemelor biologice ....................... 7
Formele acelulare de via .................................................... 9
Celula unitatea elementar structural-funcional a viului . 12
Metodele de studiu utilizate n cercetarea celulelor ......... 16
Unele realizri importante n biologia celulei ................... 18
Verificarea cunotinelor:....................................................... 20
ORGANIZAREA CHIMIC A MATERIEI VII ..................... 21
Componenta neorganic a organismelor vii .......................... 22
Componenta organic a materiei vii ...................................... 24
ACIZII NUCLEICI ............................................................... 32
Acidul dezoxiribonucleic ....................................................... 32
Acizii ribonucleici .................................................................. 42
Verificarea cunotinelor:....................................................... 45
MEMBRANELE BIOLOGICE ................................................ 46
Organizarea molecular a membranelor ................................ 47
Membrana plasmatic ............................................................ 51
Particularitile membranelor interne .................................... 51
Biogeneza i evoluia membranelor ....................................... 53
Transportul prin plasmalem ................................................. 54
Adeziunea celular ................................................................. 60
Verificarea cunotinelor:....................................................... 62
V
COMPARTIMENTARA CELULEI EUCARIOTE ................. 63
Reticulul endoplasmatic ......................................................... 64
Aparatul (complexul) Golgi. ................................................ 66
Lizozomii ............................................................................... 69
Peroxizomii ............................................................................ 71
Mitocondriile.......................................................................... 73
Citoscheletul .......................................................................... 76
Verificarea cunotinelor:...................................................... 80
PROCARIOTELE ..................................................................... 81
nveliul celular al bacteriei .................................................. 82
Bacteriile Gram pozitive ..................................................... 82
Bacteriile Gram-negative ....................................................... 85
Flagelii i pilii ...................................................................... 86
Componente intracelulare ..................................................... 87
Aparatul genetic al celulelor bacteriene ............................. 88
Recombinarea genetic la bacterii ......................................... 90
Verificarea cunotinelor ........................................................ 93
NUCLEUL ................................................................................ 94
Anvelopa nuclear ................................................................ 96
Nucleolul ................................................................................ 99
Biogeneza ribozomilor ......................................................... 101
Cromatina = cromozomii interfazici .................................... 101
Nivelurile de organizare a cromozomilor ............................ 103
Verificarea cunotinelor:..................................................... 108
REPLICAREA I REPARAREA ADN ................................. 109
VI
Aparatul de replicare ............................................................ 109
Mecanismul replicrii .......................................................... 114
Etapele replicrii .................................................................. 116
Modele de replicare.............................................................. 117
Reparaia ADN ..................................................................... 121
Metilarea ADN ..................................................................... 123
Verificarea cunotinelor:..................................................... 125
GENA ...................................................................................... 127
Funcia genei ........................................................................ 128
Organizarea molecular a genelor ....................................... 129
Particularitile organizrii genelor structurale la eucariote 131
Particularitile organizrii genelor pentru ARNr i ARNt la
eucariote ............................................................................... 136
Particularitile organizrii genelor la procariote ................ 137
Particularitile organizrii genomului uman ....................... 138
Transpozonii ........................................................................ 143
Verificarea cunotinelor:..................................................... 146
TRANSCRIPIA. PROCESSINGUL ARN ........................... 147
Transcripia la eucariote ....................................................... 148
Transcrierea genelor de clasa II ........................................... 149
Processingul ARN ................................................................ 154
Editarea ARN ....................................................................... 159
Particularitile transcripiei genelor de clasa I i clasa III .. 159
Reglarea transcripiei la eucariote ........................................ 159
Nivelele de reglare ale transcripiei ..................................... 160
VII
Transcripia la procariote ..................................................... 163
Verificarea cunotinelor ...................................................... 164
TRANSLAIA ........................................................................ 165
Proprietile codului genetic ................................................ 165
Aparatul de translaie ........................................................... 168
Mecanismul translaiei ......................................................... 173
Reglarea translaiei ............................................................... 178
Particularitile translaiei n mitocondrii ............................ 180
Verificarea cunotinelor:..................................................... 181
TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT ............................... 182
Izolarea acizilor nucleici ...................................................... 183
Obinerea fragmentelor de interes ........................................ 184
Clonarea ADN .................................................................... 186
Biblioteci de ADN ............................................................... 189
Hibridarea acizilor nucleici .................................................. 192
Verificarea cunotinelor:..................................................... 193
TEHNICI DE ANALIZ A GENELOR ................................ 194
Secvenierea ADN ............................................................... 195
Tehnica Southern-blot .......................................................... 198
Tehnica Northern-blot .......................................................... 199
Tehnica Western-blot ........................................................... 200
Tehnica PCR n analiza genelor ........................................... 200
Hibridarea in situ.................................................................. 202
Verificarea cunotinelor:..................................................... 203
CICLUL CELULAR ............................................................... 204
VIII
Interfaza ............................................................................... 205
Mitoza i citochineza ........................................................... 206
Reglarea ciclului celular ...................................................... 208
Evoluia celulelor dup diviziune ........................................ 214
Verificarea cunotinelor:..................................................... 219
RECOMBINAREA GENETIC ............................................ 220
Recombinarea genetic la eucariote ..................................... 220
Mecanismul molecular al crossing-overului ........................ 232
Recombinarea genetic la procariote ................................... 233
Verificarea cunotinelor:..................................................... 235
BIBLIOGARFIE ..................................................................... 236
IX
Cuvnt nai nte
1
***
Cu ocazia tipririi acestei cri avem posibilitatea s le
exprimm gratitudinea noastr tuturor care au contribuit la
realizarea acestui curs.
n primul rnd dorim s mulumim D-lui confereniar,
doctor n tiine biologice Nicolae Brbcaru, eful laboratorului
de Biologie Molecular la Institutul de Genetic a AM, care
ne-a inspirat interesul ctre aceast ramur a biologiei, ne-a
sftuit i ne-a coordonat partea tiinific a acestui curs.
Recunotina noastr este ndreptat spre prim-vice
Rectorul USMF N.Testemianu Profesorul Petru Galechi care
ne-a ncurajat editarea acestui curs.
n mod deosebit dorim s mulumim recenzenilor
Cursului dat D-lui Decan al Facultii de Medicin General
confereniar Nicolae Eanu, D-lui Profesor Leonid Lsi, D-ei
doctor habilitat n tiine biologice Galina Lupacu, efa
laboratorului de Imunogenetic la Institutul de Genetic a AM.
2
Elementele eseniale pe car e studentul
tr ebuie s le cunoasc:
3
celulelor i stabilirea unui sistem de conexiune intercelular.
La om ntlnim mai mult de 200 tipuri celulare, care apar n
mod net distincte. Acestea stau la baza formrii diferitor
tipuri de esuturi. Creterea i diferenierea celulelor se
realizeaz dup un program genetic bine stabilit. Unele gene
sunt activate sau represate n funcie de necesitile celulelor.
Diviziunea mitotic st la baza multiplicrii celulelor,
asigur creterea organismului pluricelular, determin
citologic biomasa organismului. La organismele cu
reproducere sexuat exist un tip deosebit de diviziune
meioza, proces prin care din celule cu nuclee diploide
rezult celule cu nuclee haploide gameii. Prin contopirea
gameilor haploizi se formeaz zigotul diploid (celul unic)
care st la originea dezvoltrii organismului. Declanarea,
derularea i succesiunea evenimentelor implicate n
diviziunea celular se afl sub controlul a numeroi factori
intra- i extracelulari: formarea i disocierea complexelor
ciclin-protein kinaze dependente de ciclin (cdk); proteine
senzor ale creterii celulare; factori de cretere; densitatea
celular; proteine inplicate n adeziunea celular; proteine
codificate de antioncogene (pRB, p53).
Pe lng proliferare i difereniere, n organism, celulele a
cror funcie este epuizat, sunt nlturate i nlocuite de
celule tinere. nlturarea este un proces fiziologic i a fost
numit apoptoz. n mod obinuit apoptoza asigur
homeostazia organelor prin participarea la turnover-ul
celular. Procesul apare n cursul dezvoltrii normale a
embrionului, involuia organelor provizorii, pierderea
celulelor interdigitale la embrionul uman, selecia clonal n
sistemul imun.
Capacitatea proliferativ a celulei normale este controlat de
gene care stimuleaz (protooncogene) i de gene care inhib
(antioncogene) multiplicarea celular. Cancerul apare din
4
cauza unui dezechilibru dintre cele dou seturi de gene,
favoriznd proliferarea nelimitat.
Biologia molecular s-a dezvoltat datorit apariiei unor noi
tehnici avansate de microscopie electronic, folosirii
culturilor celulare, realizrii anticorpilor monoclonali,
tehnologiei ADN-recombinant, manipulrii genice i tiinei
computerilor, factori care au demonstrat puterea lor
analitic i au permis unificarea experimentului biologic, a
substratului molecular i a terminologiei.
Importana practic
a cunotinelor acumulate de studeni la cursul de
BIOLOGIE MOLECULAR:
5
SISTEME BIOLOGICE
Sistemul biologic la nivel molecular reprezint un
complex de biopolimeri (acizi nucleici, proteine, lipide, glucide)
ce interacioneaz ntre ei, asigurnd fluxul permanent de
informaie, energie i materie. Programul activitii sistemului
biologic este nscris n macromoleculele de ADN. Realizarea
acestuia se efectueaz prin intermediul diferitor tipuri de
proteine.
7
Celular reprezentat de celule att procariote, ct i
eucariote; att cele ce duc o via solitar, ct i cele din
componena organismelor pluricelulare.
8
Tisular - celulele specializate cu funcii i structur
similare formeaz esuturi. Prin asocierea programat a diferitor
esuturi se formeaz organe i sisteme de organe ce asigur
fiziologia organismului pluricelular.
Individual reprezentat de organisme separate,
acelulare (virusuri), monocelulare (procariote i eucariote) i
pluricelulare.
Populaional grupuri de indivizii din aceeai specie,
separate geografic.
Biocenotic totalitatea comunitilor de organisme vii
ce convieuiesc pe un anumit teritoriu.
Biosfera ansamblul materiei vii de pe Pmnt.
Virusurile
Din punct de vedere structural, virusurile sunt formate
dintr-o capsul proteic, numit capsid, n interiorul creia se
conine o molecul de ADN sau ARN mono- sau bicatenar (fig.
1.1). Uneori pot avea la suprafa o membran, care provine din
membrana gazdei distruse. Capsida viral poate avea cele mai
diverse forme: sferic, ixoedric, de bastona etc.
9
Dimensiunile virusurilor variaz n limitele 20-250 nm.
Atunci cnd virusurile se afl n afara celulei-gazd ele sunt
inerte din punct de vedere metabolic nu se nmulesc, nu
consum i nu elimin nimic n exterior. Astfel, virusurile
reprezint parazii genetici obligatorii. n momentul contactului
particulei virale cu celula-gazd, materialul genetic al
parazitului este injectat n interiorul gazdei. Utiliznd resursele
i aparatul enzimatic al gazdei are loc multiplicarea particulelor
virale, urmat de distrugerea celulei. Astfel de multiplicare
poart denumirea de ciclu litic. Unele virusuri pot rmne n
stare latent mai mult timp, fiind integrai n ADN-ul gazdei,
aceast stadie numindu-se profag. Sub aciunea anumitor
factori din exterior are loc inducia sau reactivarea virusului.
ADN viral se excizeaz din genomul gazdei i se transfer n
citoplasm. La aceast etap este cunoscut sub denumirea de
virus vegetativ. Particulele virale se multiplic pe baza
sistemului metabolic celular, dup care are loc distrugerea
10
gazdei. Acest tip de virusuri se numesc virusuri cu ciclu
lizogenic (fig. 1.2).
Prionii
Prionii reprezint nite secvene de peste 250 aminoacizi,
dar spre deosebire de proteinele celulare obinuite, care se
sintetizeaz pe baza ARNm, pentru prioni nu este caracteristic
existena unor ARNm corespunztori. Ei prezint rezultatul
degradrii incomplete a unor proteine celulare normale. Ca
rezultat al aciunii acestor ageni patogeni, proteinele normale i
modific conformaia, ceea ce le face incapabile de a mai
funciona normal. Prionii sunt cauza unor boli
neurodegenerative i musculare. Adesea bolile reprezint nite
encefalopatii spongiforme care duc la degradarea creierului.
Astfel de maladii se ntlnesc att la oameni, ct i la animale
(mai ales bovine i ovine). Una dintre cele mai rspndite este
scarpia, ntlnit la vitele mari cornute. Dintre bolile umane
cauzate de prioni cea mai cunoscut este Kuru, ntlnit ntre
aborigenii din Papua Noua Guinee, la care este rspndit
canibalismul ritual, el fiind i mijlocul de transmitere a agentului
infecios. Bolile prionice pot fi de asemenea motenite cu
frecvena 1:1000000.
12
individualizarea celulelor, realizarea schimbului de substane
dintre mediul intern i cel extern, astfel autoreglnd compoziia
chimic a celulei. Toate celulele conin material genetic sub
form de ADN. n moleculele de ADN se conine informaia
despre organizarea i funcionarea fiecrei celule. Datorit
Celulele procariote
Din procariote fac parte bacteriile, micoplasmele,
cianobacteriile (algele cianofite). Toate procariotele sunt
organisme monocelulare sau coloniale, aerobe sau anaerobe, cu
13
dimensiuni 110 m. Celulele procariote se caracterizeaz prin
lipsa nucleului bine evideniat, materialul ereditar reprezentat
prin molecule de ADN inelar (fig. 1.4), plasat direct n
citoplasm i numit nucleoid.
14
Celulele eucariote
Eucariotele reprezint celule nucleate, de regul cu
dimensiuni cuprinse ntre 10-1000 m, care formeaz
organismele monocelulare, coloniale i pluricelulare. Nucleul
conine majoritatea ADN-ului celular i este principalul loc
unde se desfoar sinteza ARN-ului. Citoplasma din jurul
acestuia este format din citosol i organite celulare (reticulul
endoplasmatic, aparatul Golgi, mitocondriile, lizozomii,
peroxizomii) aflate n suspensie (fig. 1.5). Membranele,
organitele sau particulele din interiorul celulei au funcii
speciale, determinate de setul de proteine pe care l conin.
Celulele eucariote se nmulesc prin mitoz i meioz.
Metabolismul, de regul, se caracterizeaz prin respiraie
aerob. Celulele vegetale sunt autotrofe sau mixotrofe, iar cele
animale sunt heterotrofe.
15
Celulele organismelor pluricelulare se grupeaz formnd
esuturi, care alctuiesc organe cu funcii specifice n organism.
16
Microscopia cu polarizare. Se utilizeaz pentru
studierea structurilor celulare care polarizeaz lumina (de ex.,
fusul de diviziune, miofibrilele).
M icr oscopia cu fluor escen. Fluorescena este
proprietatea unor compui chimici de a lumina n cazul
absorbiei luminii de o anumit lungime de und. Spectrul
luminii fluorescente este deplasat spre o lungime de und mai
mare. De exemplu, clorofila iluminat cu raze UV, apare de
culoare roie. Pot fi studiai de asemenea i ali pigmeni, ct i
vitamine, hormoni n celulele vii.
M icr oscopia histocitochimic. Se bazeaz pe fixarea i
colorarea specific a anumitor structuri sau molecule cu
colorani speciali (de ex., fuxina bazic pentru acizii nucleici;
sudanul negru pentru lipide etc.).
Citofotometria. Se efectueaz determinarea cantitii de
substane organice pe baza absorbiei luminii de o anumit
lungime de und specific pentru diferite clase de compui (de
ex., absorbia maxim pentru acizii nucleici = 260 nm;
pentru proteine = 280 nm).
I munofluor escena. Permite studierea repartizrii
diferitor substane pe baza reaciilor imunochimice prin
utilizarea anticorpilor marcai cu ageni fluoresceni.
Autoradiografia. Iniial culturile celulare se cresc pe
medii speciale, care conin precursori radioactivi (nucleotide,
aminoacizi). Dup fixare i colorare, preparatele se acoper cu
un strat fin de emulsie fotografic, care permite identificarea
locurilor n care s-a incorporat precursorul radioactiv.
M icr oscopia electronic cu tr ansmisie. Utilizeaz un
fascicul de electroni n locul luminii. Capacitatea de rezoluie
este de pn la 1, adic poate fi atins o mrire de 10 6 ori. Ca
obiecte de studiu servesc seciuni ultrafine prin preparatele
fixate i contrastate cu ageni speciali (sruri ale metalelor
grele).
17
M icr oscopia electr onic cu scanar e. Se caracterizeaz
prin obinerea imaginilor n volum, obiectul cercetat fiind
acoperit cu un strat subire de metal (Au). Puterea de rezoluie
este mai mic dect cea a microscopiei electronice cu
transmisie, ns poate fi evideniat configuraia exact a
structurii analizate.
Fr acionar ea componentelor celular e. Celulele
cercetate se distrug prin omogenizare mecanic sau cu
ultrasunet. Fraciile de organite se pot separa fie prin
centrifugare la diferite viteze, fie prin centrifugare utiliznd
gradiente de concentraie.
Analiza biochimic. Celulele, esuturile i lichidele
corpului pot fi analizate pe cale biochimic, punnd n eviden
componentele proteice, lipidice, glucidice.
Analiza molecular-genetic. Se realizeaz studiul
moleculelor de acizi nucleici n ce privete numrul de copii a
genelor per genom, nivelul de transcripie, structura primar,
detecia mutaiilor. Tehnicile de biologie molecular sunt bazate
pe manipulrile ADN-ului recombinat.
18
crescut mult interesul fa de microscop.
1831 Robert Brown a descris nucleul ca un corpuscul
1833 sferic ce se prezint n celulele vegetale.
1838 Botanistul Schleiden i zoologul Schwann au mbinat
1839 ideile diferitor cercettori i au formulat teoria
celular, postulatul de baz al creia era, c unitatea
structural i funcional de baz a organismelor vii
este celula.
1840 Purkinje a propus denumirea de protoplasm pentru
coninutul celular, fiind convins c anume ea (dar nu
pereii celulari) reprezint substana vie. Mai trziu a
fost introdus termenul de citoplasm (citoplasma +
nucleu = protoplasma).
1855 Virchov a demonstrat c celulele se formeaz din alte
celule prin diviziune celular.
1866 Haeckel a determinat c pstrarea i transmiterea
caracterelor ereditare o realizeaz nucleul.
1866 A fost studiat minuios diviziunea celular i au
1888 fost descrii cromozomii.
1890 Au fost descoperite mitocondriile.
1898 A fost descoperit aparatul Golgi.
1887 Perfecionarea microscopului, a metodelor de fixare,
1900 colorare i preparare a seciunilor. Una din ramurile
citologiei devine citogenetica, ce studiaz rolul
nucleului n transmiterea informaiei ereditare.
Anii Apare microscopul electronic, ce permite posibiliti
1930 mult mai mari n vizualizarea structurilor celulare.
Din Microscopul electronic este foarte rspndit n
1946 biologie, ceea ce a permis cercetarea ultrastructurii
celulei.
1950 Descoperirea ribozomilor de savanii A. Claude,
K.R.Porter, G. Palade.
19
Ver ificar ea cunotinelor :
1. Definii noiunile: sistem biologic, celul, virus, eucariote,
procariote, prion, autoreproducere.
2. Care este obiectul de studiu al biologiei moleculare?
3. Care sunt proprietile fundamentale ale sistemelor
biologice?
4. Care sunt nivelele de organizare a materiei vii?
5. Care sunt metodele de studiu a sistemelor biologice?
6. Care sunt particularitile celulelor eucariote?
20
ORGANIZAREA CHIMIC A MATERIEI VII
Elementele chimice cel mai frecvent ntlnite n materia vie
sunt H, C, N, O, P, S (numite elemente organogene) care
reprezint n medie 99% din masa organismelor i stau la baza
unui numr impuntor de compui, caracterizai printr-o
stabilitate nalt i interaciune lent ntre ele cu apa sau ali
componeni celulari. n tabelul 2.1este prezentat compoziia
elementar a unuia dintre cele mai studiate organisme vii
bacteria Escherichia coli.
Tabel ul 2. 1. Compozi i a el ement ar a E. coli ( concent r a i a
pr ocent ual r apor t at l a masa uscat )
Elementul % Elementul %
C 50 K 1
O 20 Na 1
N 14 Ca 0,5
H 8 Mg 0,5
P 3 Cl 0,5
S 1 Fe 0,2
21
Tabel ul 2. 2. Compozi i a mol ecul ar a or gani smel or vi i
Numr ul
% din masa
Substane din celula bacter ian tipurilor de
total a celulei
molecule
Ap 70 1
Ioni neorganici 1 20
Hidrai de carbon i precursorii lor 1 250
Aminoacizi i precursorii lor 0,4 100
Nucleotide i precursorii lor 0,4 100
Acizi grai i precursorii lor 1 50
Alte molecule mici 0,2 ~ 300
Macromolecule (proteine, acizi nucleici,
26 ~ 3000
polizaharide)
22
Emulsii se obin la combinarea apei cu substane
insolubile lichide. Fazele se separ prin decantare (de ex.,
ap + ulei; laptele);
Soluii coloidale se obin la combinarea apei cu substane
cu greutate molecular mare; decantarea nu are loc (de ex.,
albuul de ou ap + proteine).
Coeziune. Reprezentnd dipoli, moleculele de H2O se
lipesc ntre ele datorit legtorilor de hidrogen. Aceasta
determin temperatura nalt de evaporare i tensiunea
superficial nalt.
Adeziunea. Este capacitatea moleculelor de ap de a se
uni cu alte molecule. Aceasta provoac, n special, fenomenele
capilare, pe baza crora apa se ridic n sus prin tuburile
ultrasubiri.
Apa i reaciile chimice. Fiind un bun solvent, apa
prezint un mediu ideal pentru desfurarea diferitor reacii
chimice. Concomitent ea particip n unele procese chimice (de
ex., reacii de hidroliz, fotosintez). n celule apa se formeaz
n rezultatul respiraiei aerobe.
Capacitatea termic a apei. Datorit adeziunii
moleculelor, apa are o capacitate termic foarte nalt (este
necesar o cantitate mare de energie pentru a-i schimba
temperatura). Aceast proprietate face posibil existena vieii n
ap i explic stabilitatea celulelor n diferite condiii termice.
Substanele minerale
n dependen de coninutul n organe i necesitile
diurne, substanele minerale se clasific n trei grupuri:
macroelemente (K, Na, Ca, Mg, Cl, P, S), microelemente (Cu,
Co, Bi, I, Zn, Mn, Mo) i ultramicroelemente (U, Ra, Au, Ag,
Ce). Rolul substanelor minerale este divers. Ele particip la
meninerea presiunii osmotice (NaCl), asigur stabilitatea valorii
pH (Na+, K+, Cl-, H+), ndeplinesc funcii de susinere (Ca, P
23
intr n componena oaselor), asigur potenialul membranar de
repaus i cel de aciune (Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-),
ndeplinesc funii de cofactori enzimatici (Mg2+, Mn2+), au rol
important n procesul de respiraie (Fe, Cu) i fotosintez (Mg).
24
Hidraii de carbon.
Formula care caracterizeaz toi hidraii de carbon este
Cx(H2O)y, unde x i y pot avea diferite valori mai mari ca 3.
Dup numrul de resturi monomerice hidraii de carbon se
mpart n monozahar ide, dizahar ide, oligozahar ide i
polizaharide.
Monozaharidele. Au formula general (CH2O)n, unde
9 n 3. n dependen de numrul de atomi de carbon deosebim:
trioze, tetroze, pentoze, hexoze etc.
- Trioze (C3H6O3) gliceraldehida, dihidroxiacetona sunt
compui intermediari importani n cile metabolice de
sintez i scindare.
- Pentoze (C5H10O5) riboza, ribuloza, dezoxiriboza. Riboza
i dezoxiriboza intr n compoziia acizilor nucleici, ATP,
NAD, NADP, FAD, FMN, CoA.
- Hexoze (C6H12O6) glucoza, fructoza, galactoza
reprezint surse importante de energie. Servesc n calitate de
monomeri n sinteza dizaharidelor (2 monomeri),
oligozaharidelor (pn la 10 monomeri) i a polizaharidelor
(peste 10 monomeri).
Dizaharidele. Dizaharidele se formeaz prin reacia de
condensare ntre 2 molecule de monozaharide, mai frecvent 2
hexoze. Legtura dintre monomeri se numete legtur
glicozidic.
Cele mai frecvente dizaharide sunt:
Maltoza (-glucoz + -glucoz)
Zaharoza (-glucoz + -fructoza)
Lactoza (-galactoza + -glucoza)
Polizaharidele. Reprezint molecule formate dintr-un
numr mare de resturi monomerice, unite prin legturi
glicozidice. Cel mai frecvent polizaharide sunt formate din
resturi de glucoz. Funciile principale ale polizaharidelor sunt
cele structurale (celuloza) i de depozitare (glicogen, amidon).
25
Lipidele
Lipidele sunt substanele organice insolubile n ap, dar
solubile n solveni nepolari (cloroform, eter, benzen). Conform
importanei fiziologice lipidele se mpart n: lipide de rezerv i
lipide structurale. Lipidele structurale particip la formarea
membranelor biologice, nveliurilor protectoare. n calitate de
exemple de lipide structurale pot servi sterolii i fosfolipidele, care
au rol major n realizarea ultrastructurii funcionale a celulei.
Funciile lipidelor:
energetic la scindarea 1g lipide se degaj 39,1 kJ;
structural n componena membranelor celulare
(fosfolipidele, colesterolul);
de emulsionare emulgatorii se orienteaz la limita
ap-ulei, stabilizeaz emulsia, mpiedic stratificarea
lor (fosfogliceridele, acizii biliari - emulgatori pentru
acilgliceroli n intestin);
mecanic protejeaz organele de lezri mecanice;
termoizolatoare pstreaz cldura (esutul adipos
subcutanat);
de solveni pentru alte substane de natur lipidic
(acizii biliari pentru vitaminele liposilubile);
hormonal - toi steroizii (hormonii sexuali, hormonii
corticosuprarenali) sunt de natur lipidic;
vitaminic - vitaminele liposolubile (acizii grai
nesaturai: A, D, E, K).
Proteinele
Proteinele sunt principalele molecule funcionale din
celule i sinteza lor este determinat genetic. Aceti compui
organici sunt alctuii din una sau mai multe catene de
aminoacizi, plicaturate i spiralate ntr-o structur spaial,
tridimensional, care le confer funciile lor biologice.
26
Monomerii
moleculelor proteice sunt
aminoacizii. Fiecare
aminoacid este format
dintr-o regiune constant,
comun pentru toi
aminoacizii i o regiune
variabil, care se
deosebete la diferii
aminoacizi (fig. 2.1).
Regiunea constant
conine la rndul su
grupele carboxil i amino
legat la atomul de carbon din poziia . n dependen de
structura regiunii variabile aminoacizii pot fi acizi, bazici sau
neutri. Din cei peste 150 de aminoacizi cunoscui n natur, n
componena proteinelor intr doar 20 -aminoacizi.
28
Urmtorul nivel de organizare a proteinelor, structura
secundar, este realizat cu ajutorul legturilor de hidrogen.
Structura secundar se caracterizeaz prin formarea diverselor
conformaii spaiale. Cele mai frecvente sunt -spiralele. ntr-o
spir se conin 3,6 resturi de aminoacizi. O alt conformaie este
reprezentat de -structuri, care apar la interaciunea a 2 regiuni
mai ndeprtate ale aceleai molecule, sau ntre molecule diferite
(fig. 2.3). Unele proteine cu structur fibrilar (de ex.,
colagenul) au conformaia spaial determinat de structura
secundar.
Un nivel superior conformaional, caracteristic
proteinelor globulare, este reprezentat de structura teriar o
alternare a -spiralelor, -structurilor i a regiunilor
nestructurate (fig.
2.4). Structura
teriar este asigurat
de legturile de
hidrogen care apar
ntre diverse grupe
funcionale din
radicali, ct i de
punile disulfidice,
legturile hidrofobe,
care apar ntre radicalii hidrofobi, legturile ionice etc. Unele
proteine cu structur teriar pentru a deveni active
interacioneaz cu molecule neproteice (de ex., hemul n
molecula de mioglobin pentru transportarea oxigenului).
Nivelul cel mai complicat de organizare a proteinelor
este reprezentat de structura cuaternar. n astfel de molecule
se conin cteva lanuri polipeptidice, care pot fi identice, sau
diferite. Astfel, n molecula de hemoglobin se conin 2 catene
de -globin i 2 catene de -globin (fig. 2.5). Structura
29
cuaternar este determinat de legturile hidrofobe, legturile de
hidrogen i cele ionice.
Structurile teriar i
cuaternar asigur formarea
centrilor activi ai proteinelor,
regiuni prin care moleculele
proteice interacioneaz cu alte
molecule. O deosebit
importan o au centrii activi ai
enzimelor, care catalizeaz
modificarea substratului.
Aminoacizii care particip la
realizarea structurilor
tridimensionale, spaiale,
biologic active sunt deosebit de importani, formnd situsuri
funcionale. Substituirea lor ca rezultat al mutaiilor, duce la
pierderea activitii proteinei. Acelai fenomen pentru
aminoacizii, neimplicai n legtulile spaiale, este mai puin
important.
Secvena aminoacizilor dintr-o protein reprezint
elementul esenial al structurii sale, deoarece:
- este unic, constant i specific fiecrei proteine;
- determin caracterul ei funcional;
- este specific pentru o anumit specie;
- este determinat genetic (de informaia ereditar coninut n
ADN).
Sub aciunea diferitor factori ai mediului, legturile
dintre atomi se pot rupe, ceea ce duce la denaturarea proteinei.
Denaturarea poate surveni sub aciunea factorilor fizici
(temperatur, radiaie, factori mecanici), chimici (acizi, baze,
sruri ale metalelor grele). Denaturarea poate fi reversibil, dac
la nlturarea factorului proteina revine la structura iniial i i
poate ndeplini funciile i ireversibil, dac n rezultatul
30
denaturrii proteina nu-i poate restabili structura i funcia.
Ruperea legturilor peptidice ntotdeauna duce la denaturare
ireversibil.
Dup compoziia chimic toate proteinele se mpart n
proteine simple i proteine conjugate.
Proteinele simple (holoproteinele) formeaz n urma
hidrolizei doar aminoacizi. Ele includ: proteinele globulare,
solubile n ap (de ex., histonele, actina, tubulina, majoritatea
enzimelor) i proteinele fibrilare majoritatea insolubile n ap
(de ex., keratina, colagenul, fibrina, laminina etc.).
Proteinele conjugate (heteroproteide) rezult din
combinaia unei proteine simple cu o alt substan sau grup
prostetic. Prin hidroliz se obin aminoacizi i un compus
neproteic: nucleoproteidele, glicoproteidele, lipoproteidele,
metaloproteidele etc.
Proteinele reprezint suportul biochimic al caracterelor,
realiznd urmtoarele funcii majore:
catalitic accelerarea transformrilor chimice (ATP-
sintetaza, ADN-polimeraza);
hormonal reglare a metabolismului (insulina);
de recepie fixarea hormonilor, mediatorilor la suprafaa
membranei celulare sau n interiorul celulei (glicoforina);
de transport (pompa Na+/K+, hemoglobina, mioglobina
transportarea oxigenului);
structural intr n componena tuturor
compartimentelor celulare i extracelulare;
de sprijin, mecanic determin forma i motilitatea
celular (colagenul, tubulina, actina);
imunologic anticorpii (IgA, IgM, IgG) inactiveaz
antigenele;
de dezintoxicare grupele funcionale ale proteinelor
leag metalele grele, alcaloizii (de ex.: albuminele);
31
homeostatic formarea trombilor n procesul coagulrii
sngelui (fibrinogenul);
de substrat energetic la scindarea 1g de protein se
degaj 17,1 kJ de energie.
ACIZII NUCLEICI
Acizii nucleici sunt biopolimeri reprezentai n celule
prin acid dezoxiribonucleic (ADN) i acid ribonucleic (ARN).
n calitate de monomeri servesc nucleotidele. Ambele tipuri de
molecule poart sarcin negativ i migreaz n cmpul electric
spre polul pozitiv. La fel ca i proteinele, acizii nucleici au
cteva nivele de organizare conformaional.
Acidul dezoxiribonucleic
Moleculele de ADN sunt alctuite din
dezoxiribonucleotide (fig. 2.6).
32
n calitate de baze azotate n componena nucleotidelor
servesc adenina (A) i guanina (G) baze purinice, timina (T)
i citozina (C) baze pirimidinice. Pentoza din ADN este
reprezentat de 2-dezoxiriboz. Bazele pirimidinice se unesc de
pentoz prin N1, iar cele pirimidinice prin N9. Pentru a preveni
ambiguitatea n enumerarea atomilor n bazele azotate i
pentoz, atomilor din dezoxiriboz li se adaug prim ('). O baz
azotat mpreun cu pentoza formeaz nucleozidul (adenozina,
guanozina, timidina, citidina). La adugarea acidului fosforic se
obine nucleotidul.
34
S-a constatat c legturile apar ntre o baz purinic i
una pirimidinic. Legitatea prin care Adenina se unete cu
Timina prin 2 legturi de hidrogen, iar Guanina cu Citozina
prin 3 legturi de hidrogen poart denumirea de principiul
complementaritii (fig. 2.8).
35
Aceast regul este universal, comun pentru toate
organismele vii i st la baza proceselor genetice fundamentale
replicaia i transcripia. Aceste legiti au fost observate pentru
prima dat de Erwin Chargaff, care a dedus c cantitatea de
Adenin este aproximativ egal cu cea de Timin, iar cantitatea
de Guanin cu cea de Citozin.
Deoarece legturile fosfodiesterice confer flexibilitate,
este posibil rotirea fiecrei perechi de baze cu ~36 n jurul
axei relative a helixului. Astfel, ntr-o spir complet (360)
ncap ~10 nucleotide. Rotirea unei catene n jurul alteia face ca
dublul helix s conin un an mare (cu un diametru de ~20 )
i un an mic (~12 ) (fig. 2.8; fig. 2.10).
Complementaritatea bazelor azotate (A=T i GC)
determin:
stabilitatea moleculei ADN;
mecanismul replicrii;
mecanismul transcripiei;
mecanismul recombinrii;
mecanismul reparrii leziunilor ADN.
Faptul c catenele ADN sunt antiparalele explic
mecanismul replicrii moleculelor de ADN, funcie prin care
este conservat informaia genetic n succesiunea generaiilor
de celule i indivizi.
n anumite condiii legturile de hidrogen dintre catene
se pot rupe, provocnd astfel denaturarea ADN. n calitate de
factori de denaturare servesc acizii, bazele i temperaturile
nalte. Cu ct o molecul este mai lung, sau conine mai multe
perechi GC fa de A=T, cu att molecula este mai stabil.
Dup denaturarea prin nclzire, la rcirea lent molecula poate
s renatureze prin restabilirea legturilor complementare ntre
bazele azotate. n cazul rcirii brute (de ex., introducerea
eprubetei n baie cu ghea) renaturarea n-are loc i moleculele
rmn monocatenare.
36
Structura secundar a ADN este reprezentat de mai
multe tipuri de spirale, care se deosebesc prin nclinarea bazelor
azotate fa de axa central, numrul de baze azotate ntr-o spir
complet, direcia rsucirii catenelor i ca rezultat
proprietile ADN. Se cunosc mai multe forme rsucite spre
dreapta, dintre care cel mai des se ntlnesc formele A, B, C.
Exist i o form rsucit spre stnga forma Z (tab. 2.3).
Tabelul 2.3. Parametrii unor forme de ADN
Parametrii helixului A B Z
ADN ADN ADN
Sensul helixului Dreapta Dreapta Stnga
Numrul de baze n spir 11 10,4 12
Distana dintre baze () 2,9 3,4 3,7
Diametrul moleculei () 25,5 23,7 18,4
Incidena cea mai nalt se remarc pentru forma B, care
este constatat n toate celulele (fig. 2.10). Anume forma B de
ADN a determinat modelul
Watson-Crick. Totodat, dup
cum s-a stabilit, n cadrul formei
B mai pot exista unele devieri n
ce privete numrul de
nucleotide per spir i care
poate varia n limitele 10,0
10,6.
Forma mai compact de
tip A este caracteristic n
special pentru moleculele de
ARN. Totodat, s-a constatat c
hibrizii ADN/ARN, de
asemenea, se caracterizeaz prin
forma A de conformaie.
Aceasta are o mare importan
37
n procesul de replicaie, cnd pentru iniierea sintezei fiecrei
catene se utilizeaz un primer ARN.
Forma Z se deosebete mult de toate celelalte n primul
rnd prin direcia de rotire a helixului. Denumirea provine de la
forma zig-zag a acestei conformaii. O alt caracteristic este
existena unui singur an, ceea ce o determin ca purttoare a
unei sarcini negative mai mari. Forma Z poate s se formeze in
vitro la o concentraie sporit de sruri n regiunile unde
alterneaz o purin cu o pirimidin (de ex., d {{GC
CG}
}
sau d {{TG
AC }
}
).
Se consider c forma Z se ntlnete i n sistemele in vivo n
cazul metilrii ADN-ului.
n toate sistemele in vivo moleculele de ADN sunt
cuplate cu proteine prin legturi de hidrogen sau electrostatice,
rezultnd o structur supramolecular structura teriar.
Proteinele au roluri diverse n complexele cu ADN: particip la
compactizare (histone), controleaz replicarea (ADN-
polimeraza) i transcripia (ARN-polimeraza, factori de
transcripie), particip la repararea moleculelor lezate (ADN-
ligaza). Avnd proprieti acide, moleculele de ADN se
asociaz cu proteine bazice, formnd nite complexe stabile. La
eucariote aceste proteine poart denumirea de histone. La
formarea structurii teriare particip histonele H1, H2A, H2B,
H3, H4. Structura care
se formeaz n urma
rsucirii ADN-ului n
jurul unui miez proteic
poart denumirea de
nucleozom mod de
organizare a ADN-
ului nuclear al
eucariotelor (fig.
2.11). La procariote
ADN-ul are form de
38
inel. Datorit tensiunii intramoleculare ADN-ul procariotic, de
obicei, are form de supraspiral i este asociat cu proteine
bazice (fig. 2.12).
39
Flexibilitatea ADN este capacitatea dublului helix de a
trece de la o form conformaional la alta de ex.: trecerea de
la forma B la forma A se asociaz cu activarea ADN-ului pentru
transcripie, iar trecerea la forma Z cu inactivarea secvenei.
Funciile ADN-ului
ADN-ul deine, pstreaz, transmite i realizeaz
informaia genetic. Secvena (succesiunea) nucleotidelor din
molecula de ADN reprezint informaia ereditar codificat.
Codul genetic este universal pentru toate organismele vii i
determin succesiunea aminoacizilor n protein. Mecanismul de
transmitere a mesajului genetic este determinat de structura
bicatenar, complementaritate i se realizeaz n timpul
replicrii ADN, urmat de mitoz sau meioz. n procesul de
transcripie de pe ADN se sintetizeaz trei tipuri de ARN ce
particip la sinteza matricial a proteinelor. Proteinele sunt
substratul molecular a tuturor caracterelor i proprietilor unui
organism.
41
O clas special de secvene nalt repetitive este
reprezentat de palindromi. Palindromii reprezint succesiuni
de nucleotide inversate, care au proprietatea de a se uni
complementar pe aceeai caten, formnd agrafe sau bucle n
moleculele monocatenare de ARN sau ADN i structuri n form
Acizii ribonucleici
Molecule ARN sunt biopolimeri monocatenari, care
constau din nucleotide unite prin legturi fosfodiesterice 3
5. Spre deosebire de nucleotidele din componena ADN,
monomerii ARN-ului conin n calitate de pentoz riboza, iar
bazele azotate sunt Adenina, Guaniana, Citozina i Uracilul (U),
care substituie Timina din ADN (fig. 2.14). De regul,
42
moleculele de ARN sunt monocatenare, excepie fiind
moleculele de ARN viral, care pot fi i bicatenare.
Structura primar a moleculelor de ARN este
reprezentat de secvena nucleotidelor i determinat de
secvena de ADN, de pe care are loc transcrierea. Structura
secundar reprezint conformaia spaial a moleculei. Ea este
stabilizat cu ajutorul legturilor complementare care se
formeaz n cadrul aceleai catene datorit existenei secvenelor
inversate. Moleculele de ARN se pot asocia cu proteinele
specifice n scopul proteciei contra ARN-azelor (particulele
RNP ribonucleoproteice, care reprezint forma de export a
43
variaz n dependen de perioada ciclului vital sau de tipul
esutului din care face parte. n celula exist mai multe tipuri
de ARN, dintre care cele mai reprezentative sunt ARN mesager
(informaional, matricial) ARNm, ARN ribozomal ARNr,
ARN de transport (de transfer) ARNt, ARN nuclear mic
(ARNsn), ARN heterogen nuclear.
ARNm se sintetizeaz n rezultatul transcripiei genelor
structurale i servete ca matri n procesul de sintez a
proteinelor. n celule exist o varietate mare de ARNm, care se
deosebete cantitativ i calitativ la diferite celule (vezi capitolul
9).
ARNr reprezint molecule cu lungime i succesiune de
nucleotide conservat (tab. 2.4), care fiind asociate cu proteine
formeaz ribozomii. ARNr particip la sinteza proteinelor,
asigurnd legtura dintre ribozom ARNm i ARNt.
45
MEMBRANELE BIOLOGICE
Celulele ca sisteme biologice sunt delimitate de ambiant
prin membrane semipermeabile. Acestea asigur funciile:
- barier biologic;
- transport selectiv al ionilor i moleculelor;
- recepionarea i transmiterea semnalelor extracelulare i
intercelulare;
- suport pentru enzimele implicate n diferite procese
metabolice;
- compartimentalizare a mediului intern al celulelor eucariote;
- regleaz homeostazia intracelular i intercelular.
46
Membranele biologice sunt formate din trei componente
moleculare de baz: lipide, care asigur funcia de barier
semipermeabil; proteine, ce asigur funcionalitatea
membranei; glucide cu rol de recunoatere i semnalizare.
Bistratul lipidic
Principalele lipide ntlnite n membranele celulare sunt
fosfolipidele (fosfogliceride i sfingolipide), colesterolul,
glicolipidele (situate spre exteriorul plasmalemei sau spre
lumenul organitelor) (fig. 3.2).
47
pot autoasambla determinnd formarea barierelor ntre diferite
medii lichide. Totodat, membranelor le este caracteristic
fluiditatea, asigurat n mare msur de mobilitatea
fosfolipidelor care poate fi de mai multe tipuri:
micarea n interiorul moleculei de fosfolipid;
micarea ntregii molecule de fosfolipid;
micarea de difuziune lateral, transversal, micarea
de rotaie n jurul axei longitudinale a moleculei;
salturi extrem de rare de pe un strat pe altul (flip-
flop)
n consecin, bistratul lipidic are proprietate de barier
semipermeabil (doar unele molecule mici, nepolare,
liposolubile pot trece uor prin bistrat). Fosfolipidele sunt
heterogene i, interacionnd cu alte molecule (proteine,
glucide), asigur specificitatea funcional a membranelor.
Colesterolul din compoziia membranelor celulelor
animale asigur elasticitatea i rezistena mecanic, pstrarea
integritii celulei ca sistem biologic.
48
Proteinele membranare
Proteinele constituie baza material a funciilor
principale ale membranei: transportul substanelor, cataliza unor
reacii biochimice, recepie. Cantitatea de proteine variaz la
diferite tipuri de celule. Astfel, n teaca de mielin proteinele
constituie 25% din greutate, n plasmalem n medie 50%, n
membrana intern a mitocondriei 75%. Dup localizare se
deosebesc dou categorii de proteine membranare (fig. 3.3):
- periferice (extrinseci) - sunt ataate la exteriorul stratului
dublu lipidic, unde interacioneaz n principal cu grupurile
polare ale lipidelor sau altor proteine.
- integrale (intrinseci) - ce trec prin stratul lipidic; aceste
proteine penetreaz parial sau total stratul dublu de lipide.
Proteinele care strbat bistratul lipidic de la o fa la alt se
numesc proteine transmembranare. Pot exista proteine cu
mai multe domenii transmembranare. Se consider c i
proteinele au poriuni hidrofile care proemineaz n afara
membranei pentru a contacta cu mediul apos i cu gruprile
polare ale fosfolipidelor. Partea hidrofob se gsete n interiorul
membranei i interacioneaz cu lanurile acizilor grai din
molecula fosfolipidelor.
49
pot fi menionate spectrina (asigur forma biconcav i
stabilitatea celulelor), glicoforina (are rol n recepia celular),
proteina banda 3 (meninerea i controlul pH al celulei).
Proteinele se pot deplasa i ele n cadrul membranelor.
Micrile lor sunt laterale, determinate de schimbarea
conformaiei spaiale. Totodat moleculele se pot roti n jurul
axei perpendiculare planului membranei.
Glucidele membranare
Glicolipidele i glicoproteidele formeaz un nveli periferic
la suprafaa celulelor animale numit glicocalix (fig. 3.4).
Funciile glicocalixului:
asigur recunoaterea i adeziunea intercelular servesc n
calitate de receptori moleculari;
asigur individualitatea celulei;
este un depozit de cationi;
ajut la orientarea corect a proteinelor n membran
50
Membr ana plasmatic
Membrana plasmatic (membrana citoplasmatic,
plasmalema) are grosimea de 6-10 nm, separ celula de mediul
nconjurtor, permite desfurarea schimbului de substane
dintre celul i mediul extern, servete la comunicarea celulei
cu alte celule sau cu mediul nconjurtor.
Membrana plasmatic ndeplinete diverse funcii,
printre care evideniem:
funcia de barier, prin delimitarea mediului intern al celulei
de cel extern;
particip la metabolismul celulei, cataliznd procesul de
transport al substanelor i reglnd proprietile fizico-
chimice ale celulei (pH, presiune osmotic, potenial electric
etc.);
controleaz fluxul de informaie dintre mediul extern i
celul, prin recepia i transmiterea semnalelor din mediu;
intervine n recunoaterea i adeziunea celular;
funcia de protecie imunologic a celulei i a organismului.
Anvelopa nuclear
Nucleul este delimitat de citoplasm printr-o membran
dubl, strbtut de pori, numit anvelop nuclear.
52
Membrana nuclear intern se unete prin proteine
specifice de lamina fibroas a nucleului. Ea vine n contact cu
ADN-ul i ARN-ul transcris n nucleu (fig. 3.5).
Membrana nuclear extern continu cu membrana
reticulului endoplasmatic granulat. Pe suprafaa ei, la fel ca i pe
suprafaa RE rugos se gsesc ribozomi care particip la
biosinteza proteinelor.
ntre cele dou membrane ce alctuiesc anvelopa
nuclear se afl un spaiu perinuclear cu o lime de 20-40
nm. Proteinele sintetizate pe suprafaa nucleului nimeresc direct
n lumenul RE cu care comunic spaiul perinuclear.
Prezena a dou membrane alturate face imposibil
trecerea moleculelor de acizi nucleici n ambele direcii.
Transportul macromoleculelor se realizeaz prin intermediul
numeroilor pori nucleari, care strbat ambele membrane. n
medie se conin 3000 4000 pori per nucleu, ceea ce constituie
aproximativ 10% din suprafaa nucleului. Fiecare por este
format din complexul porului care const din opt seturi de
proteine plasate n trei starturi. Octamerul proteic mrginete un
canal cu diametrul de 9 nm i lungimea de 15 nm prin care
nucleul comunic cu citoplasma (vezi fig. 6.3). n mijlocul
porului se afl granula central cu rol de diafragm. Prin pori
trec particulele RNP, subunitile ribozomale, componentele
necesare pentru activitatea normal a nucleului.
53
sau n citosol. Proteinele intrinseci, de regul, se sintetizeaz pe
suprafaa RE granular, conin regiuni hidrofobe i rmn
integrate n permanen n membrane. Conformaia spaial a
proteinelor poate fi stabil, sau poate fi modificat n RE neted
i AG prin glicozilare. Grupele oligozaharidice att pentru
proteine, ct i pentru lipide sunt adugate n partea ndreptat
spre lumenul RE sau AG.
Traficul de membrane se realizeaz prin intermediul
veziculelor, care se afl ntr-o micare continu. Veziculele se
insereaz ntr-o membran deja preexistent. Reciclarea
membranelor este un proces continuu, ceea ce asigur
funcionarea lor normal n permanen.
Citosol
Transportul pasiv
Transportul pasiv se face fr consum de energie,
substanele se deplaseaz n sensul gradientului de concentraie
sau n sensul gradientului electrochimic (pentru ioni). Gradientul
electrochimic e compus din gradientul de concentraie i cel
electric. Partea intern a membranei are sarcin electric
negativ, iar cea extern - pozitiv.
A) difuziunea simpl, are loc prin stratul dublu lipidic.
Ptrunderea substanelor liposolubile are loc conform
coeficientului de repartiie ntre ulei i ap. De asemenea
prin bistratul lipidic trec gazele i, ca excepie, unele
substane hidrofile din care face parte apa, ureea,
metanolul.
Transportul activ
Transportul activ - transport contra gradientului
electrochimic, care necesit consum de ATP.
Transportul activ se efectueaz de proteine
transportatoare integrate n membrana plasmatic.
A) Transportul ionilor - pompa de Na+ i K+ reprezint o
protein-enzim (Na+ - K+ ATP-aza) ce scindeaz ATP n ADP
i fosfat anorganic i necesit Na+ i K+ pentru activitatea sa.
Pentru fiecare molecul de ATP hidrolizat se pompeaz la
exterior 3Na+ i la interior 2K+ (fig. 3.8). Proteina contribuie la
generarea potenialului electric de membran. Pompa de Ca2+
menine concentraia sczut de Ca2+ n citosol fa de
concentraia mai mare a Ca2+ extracelular.
57
B) Transportul activ cuplat cu gradiente ionice e reprezentat
de transportul glucozei i al aminoacizilor prin plasmalem.
Glucoza este transportat de un cru al glucozei de care se
leag i Na+ - sistem sinport. Na+ tinde s intre n celul
conform gradientului electrochimic, antrennd n acelai sens
glucoza. Cu ct gradientul de Na+ este mai mare i viteza
transportului e mare; dac se reduce gradientul de Na+ se
oprete i transportul glucozei. Na+ care ptrunde cu glucoza
este pompat n exterior de Na+/K+ ATP-aza ce menine
gradientul de Na+.
Transportul aminoacizilor se face prin sistemul sinport
cu Na+, existnd cel puin cinci proteine diferite n plasmalema
celulelor animale.
59
Pinocitoza - este capacitatea celulei de a ngloba din
exterior picturi de lichide (mai frecvent picturi de lipide),
procesul fiind similar fagocitozei.
Exocitoza se produce prin fuziunea unor vezicule din
citoplasm cu plasmalema i, astfel, materialul din vezicule este
vrsat n afara celulei. Acest proces are loc n cazul eliberrii
hormonilor i a neuromediatorilor n membrana presinaptic.
Transcitoza - o form de transport prin vezicule, cnd
macromoleculele sunt captate de o parte a celulei prin
endocitoz, traverseaz citoplasma i sunt eliberate n partea
opus prin exocitoz. Acest mecanism asigur transportul
macromoleculelor prin epiteliul intestinal i endoteliul capilar.
Adeziunea celular
n organismele pluricelulare celulele care ndeplinesc
funcii similare formeaz esuturi, n care, n majoritatea
cazurilor, se stabilesc contacte. Contactul intercelular este
realizat prin intermediul unor structuri specializate numite
jonciuni intercelulare. (fig. 3.10). Jonciunea se realizeaz
cu ajutorul complexului de macromolecule localizat n spaiile
intercelulare numit matrice intercelular.
Jonciunile strnse (jonciuni de ocluzie) se
formeaz prin apropierea puternic a dou membrane vecine.
Reinerea membranelor n apropiere se realizeaz cu ajutorul
unor proteine speciale, care sunt comune pentru ambele
membrane. Ele apar ntre celulele epiteliale ce delimiteaz
lumenul unor caviti (vezica biliar, unele glande endocrine).
Jonciuni de adeziune se ntlnesc, de asemenea,
ntre celulele epiteliale, n apropierea jonciunilor strnse. Astfel
de contacte se menin cu participarea citoscheletului
(filamentelor de actin), distana dintre membranele vecine
pstrndu-se de 15-20 nm.
60
Desmozomii asigur adeziunea celulelor n epitelii,
necesar pentru asigurarea rezistenei mecanice. Membranele
celor dou celule i pstreaz individualitatea, ntre ele exist
un spaiu de 15-20 nm. Contactele sunt meninute cu ajutorul
62
COMPARTIMENTARA CELULEI EUCARIOTE
Celulele eucariote conin membrane interne care separ
diferite medii fermentative, formnd organite membranare, care
ocup aproximativ o jumtate din volumul total al celulei (tab.
4.1). Principalele compartimente membranare sunt reticulul
endoplasmatic (RE), aparatul Golgi (AG), lizozomii,
peroxizomii, mitocondriile i nucleul. Fiecare dintre acestea
conine un set specific de proteine i ndeplinete o funcie
definit. Astfel, n celul se pot realiza multiple reacii chimice
care asigur vitalitatea: asimilarea substanelor din exterior,
sinteza substanelor proprii, metabolismul energetic,
autoreproducerea, rennoirea structurilor celulare, adaptarea la
condiiile de mediu, interaciunile cu alte celule. Numrul, forma
organitelor membranare i, n special, compoziia lor chimic
difer de la celul la celul, de la esut la esut.
Tabelul 4.1. Volumul relativ al compartimentelor celulare
dintr-un hepatocit
64
RE rugos este responsabil de sinteza diferitor tipuri de
proteine:
proteine secretate;
plicoproteine pentru membranele:
plasmalemei;
nucleului;
RE;
aparatului Golgi;
enzime lizozomale;
enzime ale RE rugos;
Enzime ale aparatului Golgi;
proteine ataate pe suprafaa extern a membranei celulare:
colagenul, laminina etc.
RE neted. RE neted este conectat la cisternele formate
de RE rugos i reprezint o reea de canale cu un diametru de
30-60nm. Este responsabil de sinteza i metabolizarea acizilor
grai i a fosfolipidelor, sinteza colesterolului i a hormonilor
steroizi, ct i de detoxifierea xenobioticelor (pesticide,
medicamente, cancerigeni chimici). Enzimele implicate n
biosintez sunt proteine membranare integrate i au centrele
active ndreptate spre citozol.
n sintez RE exercit urmtoarele funcii biologice:
crearea n interiorul celulei a gradientelor ionice
transmembranare i a potenialului de membran;
biosinteza proteinelor;
glicozilarea proteinelor;
biogeneza membranelor;
detoxifierea substanelor endogene i exogene prin
neutralizarea efectelor lor nocive (hidroliza, oxidarea,
reducerea, conjugarea);
biosinteza lipidelor;
transportul substanelor organice sintetizate;
depozitarea substanelor organice.
65
Aparatul (complexul) Golgi.
Aparatul Golgi (AG) a fost pus n eviden de Camille
Golgi (1898) printr-o coloraie special, observat n celulele
sistemului nervos i reprezint un set de compartimente
funcional distincte, formate dintr-un sistem de cisterne turtite i
delimitate de o membran (5-11 compartimente per celul) (fig.
4.2). Proteinele sintetizate n RE trec n AG pentru a fi
prelucrate, sortate i exportate.
67
Sortarea i repartizarea moleculelor se face datorit
interaciunii lor specifice ligand receptor (fig. 4.4 ).
n general, complexul Golgi este considerat sediul central al
sintezei hidrailor de carbon i al modificrii specifice a
macromoleculelor. Proteinele i lipidele care trec prin aparatul
Golgi sunt supuse n mod dirijat unor modificri specifice.
Procesul cel mai important const n ataarea lanurilor de
oligozaharide sau grupri fosfat la proteine i lipide, care pot
servi i ca semnale de direcionare sau sortare.
Patologia AG:
boala von Geerke defect genetic enzimatic ce duce la
suprancrcarea celulelor cu glicogen;
sindromul adrenogenital sinteza deficitar a unor steroli;
68
miopatii congenitale RE anormal n fibrele musculare
striate i cele cardiace;
tolerana la unele medicamente n cazul alcoolismului cronic
(alcoolul induce enzimele microsomale, ceea ce accelereaz
metabolismul medicamentelor i respectiv eliminarea lor
rapid din snge).
Lizozomii
Lizozomul a fost vizualizat ca organit celular doar prin
microscopia electronic (Cristian de Duve, 1950). El a fost
descris ca o vezicul, limitat de o membran, funcia lui
principal fiind digestia intracitoplasmatic a diverselor
molecule, componente celulare, corpusculi fagocitai. Sub aspect
biochimic, lizozomii au fost prevzui nainte de identificarea lor
morfologic, prin aciunea hidrolitic pe care o aveau
omogenatele
obinute din
celulele hepatice.
Dimensiunea i m-
rimea lizozomului
variaz n limite
foarte largi 0,05-0,5
m, ns nsuirea
comun a acestora
este faptul c
reprezint depozitul
cu enzimele hidro-
aza litice acide (enzime
de digestie) (fig.
+P 4.5). n membrana
lizozomului se
gsesc proteine puternic glicozilate, ceea ce o face rezistent la
aciunea hidrolitic a enzimelor din lizozom.
69
Lizozomul conine aproximativ 40 enzime hidrolitice a cror
activitate optim are loc la pH ~5,0. Aceast dependen a
aciunii enzimatice de pH protejeaz componentele citozolului
(care are pH ~7,2) de o eventual lezare a membranei
lizozomale, deoarece enzimele devin inactive la pH 7,2.
n interiorul lizozomului pH-ul acid este meninut de o
pomp de H+ (H+-ATPaza) prezent la nivelul membranei, care
folosete hidroliza ATP ca surs de energie. Astfel, ionii de
hidrogen sunt pompai continuu n lumenul lizozomal asigurnd
n permanen un mediu acid. Acest mediu este necesar pentru
denaturarea proteinelor, care le fac accesibile aciunii
hidrolazelor lizozomale.
Traficul materialelor spre lizozomi
Materialele care urmeaz a fi digerate sunt transportate
la lizozomi pe diferite ci (fig. 4.6).
70
Autofagocitoza, prin care resturile celulare (prile de
celule) sunt transportate n lizozom pentru a fi distruse.
Crinofagocitoz, prin care se regleaz cantitatea de produse
secretate din celular (de ex., hormonii n celulele
endocrine).
Fagocitoza, care reprezint procesul n care particulele sau
microorganismele sunt incorporate n lizozomi i ulterior
digerate. Acest proces are loc numai n celule specializate
(macrofagi, neutrofile). Prin incorporarea acestor materiale
se formeaz fagozomii, care se transform n fagolizozomi.
Patologii lizozomale:
boala Tay Sachs se manifest prin ntrzierea dezvoltrii
mintale a copilului, perturbarea sistemului nervos central i
moartea pn la vrsta de 5 ani. Boala este cauzat de
alterarea unei enzime lizozomale necesare pentru
catabolizarea mucopolizaharidelor; ca rezultat, n membrana
celulelor nervoase se acumuleaz gangliozida GM2.
boala cu celule I este cauzat de incapacitatea atarii
gruprii manozo-6-fosfat la enzimele lizozomale, din care
cauz aceste enzime nu mai pot fi sortate i direcionate spre
lizozomi la nivelul AG. Ca rezultat majoritatea enzimelor
hidrolitice lipsesc din celule, avnd ca efect acumularea
incluziunilor nedigerate n citoplasm. La astfel de bolnavi
fibroblatii conin nite vezicule mari cu glicolipide i
componente extracelulare, care n mod normal ar trebui s
fie hidrolizate de enzimele lizozomale.
Peroxizomii
Peroxizomii au fost identificai prin microscopie
electronic de ctre Rhodin n anul 1954. Organitul are
dimensiuni de 0.5-1m i este nconjurat de o singur membran
cu grosimea de 6 nm. n interior se afl o matrice ce conine
oxidaze (urat-oxidaz, D-aminoacid oxidaz) i catalaza.
71
Peroxizomii utilizeaz oxigenul molecular pentru ndeprtarea
atomilor de hidrogen din D-aminoacizi provenii din bacteriile
intestinale. n felul acesta se obine apa oxigenat (H2O2), toxic
pentru celul, care este mai apoi utilizat de catalaz pentru
detoxificarea fenolilor, acidului formic, formaldehidei i
alcoolilor.
RH2 + O2 Oxidaza R + H2O2
Catalaza
H2O2 + R'H2 R' + 2H2O
Patologia peroxizomilor:
sindromul Zellweger este cauzat de lipsa peroxizomilor,
ceea ce duce la disfuncii cerebro-hepato-renale, ca rezultat
copii mor pn la vrsta de 1 an;
adrenoleucodistrofii sunt cauzate de diminuarea funciei
peroxisomilor n oxidarea acizilor grai, ceea ce duce la
distrugerea progresiv a substanei albe din creier i a
corticosuprarenalei;
72
acatalazemia peroxisomii lipsesc n celulele tumorale, ceea
ce duce la creterea rapid a tumorii.
Mitocondriile
Mitocondriile sunt prezente n toate celulele eucariote i
sunt responsabile de conversia energiei eliberate din
metabolizarea glucidelor, acizilor grai i aminoacizilor n
legturile macroergice fosfoanhidrice ale ATP. Au lungime de
2-10 m, diametrul de 0.5-1 m i ocup aproximativ 25% din
volumul citoplasmatic. Orientarea i distribuirea lor se
realizeaz prin intermediul asocierii la microtubulii
citoplasmatici.
Structural mitocondriile constau din dou membrane (cu
grosimea de 6 nm fiecare), compartiment periferic (spaiu
intermembranar) i compartimentul central (matricea
mitocondrial) (fig. 4.7).
73
Compartimentul periferic (spaiul intermembranar) are
limea de 6-8 nm i servete la acumularea protonilor, ct i
transportarea substanelor.
Membrana intern este alctuit din proteine (80%) i
cardiolipin (difosfatdiglicerol 10%), care ofer
impermebialitate pentru mai multe tipuri de ioni. Proteinele
se clasific n:
proteine implicate n reaciile de oxido-reducere, ce se
realizeaz la nivelul lanului respirator;
proteine transportoare, ce asigur intrarea metaboliilor n
matricea mitocondrial sau ieirea lor n spaiul intermembranar;
complexul enzimatic ATP-sintetaza care asigur fosforilarea
oxidativ.
Membrana intern formeaz numeroase invaginri numite criste,
numrul lor fiind determinat de intensitatea metabolismului celular.
Compartimentul central (matricea mitocondrial) care este
format din:
genomul mitocondrial (ADN circular, se conine n mai
multe copii);
ribozomii mitocondriali (coeficientul de sedimentare de n
mediu 70S; la mamifere 55S);
74
molecule de ARNm, ARNt;
granulaii cu densiti electronice diferite (depozite de
Ca2+);
enzime implicate n:
replicarea i funcionarea aparatului genetic al
mitocondriei;
oxidarea piruvatului i a acizilor grai pn la acetil-
CoA;
ciclul acizilor tricarboxilici (ciclul Crebs).
75
Patologia mitocondriilor.
n cazul defectului genelor mitocondriale boala poate fi transmis
doar pe linie matern. Bolile provocate se refer la miopatii i
neuropatii:
miopatia mitocondrial;
encefalopatia i encefalomiopatia familial;
neuropatia optic ereditar Leber;
sindromul Kearns-Sayre afeciune neuromuscular,
cauzat de alterarea enzimelor lanului respirator.
Citoscheletul
Una din particularitile celulelor eucariote este
capacitatea lor de a-i pstra forma, de a efectua micri
coordonate i direcionate, care se bazeaz pe existena unui
sistem de filamente proteice numit citoschelet.
Funciile principale ale citoscheletului sunt:
determin i menine forma celulei;
76
asigur localizarea precis a organitelor;
asigur motilitatea celular:
micri de contracie muscular,
micarea de locomoie ameboidal,
micrile cililor i flagelilor,
micrile din microvli,
micrile din cadrul diviziunii celulare,
curenii citoplasmatici prin sistemul microtubul;
intervine n organizarea molecular i funcional a
membranei celulare, n chemotaxis i n adezivitatea
celular;
asigur transportul intracelular al macromoleculelor asociate
filamentelor.
Citoscheletul este alctuit, n principal, din trei tipuri de
structuri fibrilare: microfilamente de actin, microtubuli i
filamente intermediare.
Filamentele de actin (microfilamente) sunt polimeri
bicatenari formai din proteina actina. Reprezint nite structuri
flexibile cu diametrul de 5-9 nm. Dei filamentele de actin
sunt dispersate n celul, ele sunt concentrate mai mult n
regiunea cortical a celulei. Actina interacionnd cu miozina,
determin formarea miofilamentelor asigurnd contracia
muscular i motilitatea membranei plasmatice n timpul
fagocitozei sau deplasrii celulelor pe substrat.
Filamentele intermediare reprezint nite filamente
heterogene cu diametrul ~10 nm formate din proteine fibrilare.
Exist o specificitate nalt a filamentelor intermediare n
dependen de esut (de ex., keratina n celulele epiteliale,
desmina n celulele musculare, vimentina n fibroblati). Ele
intr n compoziia laminei nucleare, strbat citoplasma,
asigurnd rezistena la stresurile mecanice i particip la
jonciunea celulelor.
77
Microtubulii reprezint nite cilindri lungi formai din
tubulin (fig. 4.9). Ei au
diametrul de 25 nm i
sunt mai rigizi dect
filamentele de actin.
Microtubulii, de obicei,
sunt fixai cu un capt de
centrozom centrul de
origine a microtubulilor.
Fiecare microtubul este
format din 13
Fig. 4.9. tructura microtubulilor
protofilamente, iar acestea la rndul lor sunt formate fiecare din
heterodimeri de tubulin ( i ) aezai cu capul spre coad,
ceea ce confer microtubulilor un caracter polar. n celul
microtubulii pot fi izolai, forma structuri provizorii (fibrele
fusului de diviziune) sau organite permanente (centrioli,
corpusculi bazali, cili, flageli) (fig. 4.10). Microtubulii
realizeaz numeroase funcii vitale pentru celul: distribuia
cromozomilor n mitoz sau meioz, transportul intracelular,
motilitatea celular.
Patologia citoscheletului:
patologia motilitii celulare:
- modificri complexe ale motilitii leucocitare sindromul Chediak-
Higashi (se caracterizeaz prin albinism parial, infecii piogene
severe i pancitopenie) ca rezultat al defectului de asamblare a
tubulinei n microtubul scade motilitatea neutrofilelor;
- diminuarea capacitii chemotaxice a celulelor sindromul
leucocitelor lenee (lazy-leucocyte syndrome);
- alterri moleculare i funcionale ale micrii ciliare sindromul
Kartagener (caracterizat prin triada: broniectazie bilateral,
inversiune visceral, polipoz nazal sau sinuzit maxilar +
sterilitate masculin din cauza pierderii motilitii
spermatozoizilor);
78
modificri ale citoscheletului la nivelul celulelor canceroase; moleculele
suprafeei celulare sunt implicate n metastazarea tumorilor maligne;
cardiomiopatia familial ca urmare a anomaliilor discurilor intercelulare
din miocard;
anemia megaloblastic modificarea conformaiei spectrinei eritrocitare.
79
Ver ificar ea cunotinelor :
1. Definii noiunile: organit, endosom, hidrolaz, catalaz,
citoschelet, tubulin, centriol.
2. Care este rolul compartimentalizrii celulare?
3. Care sunt funciile reticulului endoplazmatic?
4. Care sunt particularitile de organizare ale AG?
5. Care sunt etapele sortrii enzimelor lizozomale?
6. Care sunt funciile peroxizomilor?
7. Care sunt procesele metabolice din mitocondrii?
8. Ce roluri ndeplinete citoscheletul n activitatea celulelor?
80
PROCARIOTELE
Celulele procariote se caracterizeaz printr-o
organizare relativ simpl, dar posed toate nsuirile de baz
ale unei celule vii: membran, aparat genetic, aparat enzimatic
pentru sinteza substanelor organice. Membrana plasmatic
formeaz un singur compartiment citoplasmatic, fr o structur
intern bine organizat. Conin un singur cromozom
(nucleoidul), constituit dintr-o singur molecul inelar de
ADN, fr a prezenta un nucleu bine conturat. Din acest motiv
ele au fost denumite procariote. Principalii reprezentani ai
acestei grupe de organisme vii sunt bacteriile i algele cianofite.
Bacteriile sunt procariotele care se ntlnesc cel mai frecvent n
mediul nconjurtor, fiind considerate cele mai mici entiti vii,
autonome, guvernate de informaia coninut n ADN.
n natur se ntlnesc diverse tipuri de bacterii. n dependen de
form se deosebesc:
bacili bacterii n form de bastona (Escherichia coli);
coci bacterii sferice (Micrococcus cerolyticus);
diplococi doi coci ntr-o capsul (Diplococcus pneumoniae provoac
pneumonia);
streptococi iraguri de coci (Streptococcus pyogenes provoac
angina i scarlatina);
stafilococi ciorchine de coci (Staphylococcus aureus provoac boli
ale cilor respiratorii);
spir il - spiral cu flagel (Spirrilum);
81
vibrion form de virgul, cu flagel (Vibrio cholerae provoac
holera).
82
reprezint o structur multifuncional care combin funciile
realizate de diferite compartimente ale celulei eucariote.
83
n bacteriile Gram pozitive se pot depista nite structuri
membranare veziculare sau veziculo-membranare numite
mezozomi, care se formeaz prin invaginarea membranei
plasmatice. La moment se consider c mezozomii sunt nite
analogi ai mitocondriilor din celulele eucariote i particip la
procesele de respiraie aerob.
Peretele celular al bacteriilor este constituit din
murein, care prezint un polimer format din catene de N-
acetilglucozamin (NAG), acid N-acetomuramic (NAM), unite
ntre ele prin aminoacizi (fig. 5.2). Grosimea peretelui celular
variaz ntre 20-80 nm (la bacteriile Grampozitive), constituind
de la 5-10% i, respectiv, pn la 95% din masa uscat a celulei.
84
Acizii teihoici sunt strns legai de peptidoglican la bacteriile
Grampozitive, n timp ce la bacteriile Gramnegative lipsesc;
- Acizii lipoteihoici reprezint polimeri din glicofosfai
i glicolipide i sunt ancorai de plasmalem. Ei au rol antigenic,
citotoxic i adeziv (Streptococcus pyogenes).
La exterior peretele celular este acoperit cu un strat
subire de lipide care-l protejeaz de aciunea lizozimei enzim
capabil s hidrolizeze legturile dintre resturile de glucide,
distrugnd mureina. Stratul lipidic apr celula i de aciunea
penicilinei, care represeaz procesul de formare a legturilor
dintre componentele peretelui celular la bacteriile Gram
pozitive.
Bacteriile Gram-negative
Bacteriile Gramnegative se caracterizeaz prin existena
a dou membrane: membrana plasmatic intern - membrana,
care comunic direct cu citoplasma, i membrana plasmatic
extern cu grosimea de 7.5-10 nm, situat spre exteriorul
celulei. La majoritatea bacteriilor Gramnegative membrana
plasmatic intern este unit covalent de peptidoglican prin
intermediul lipopoproteidelor. La unele bacterii (E. coli),
membrana extern i cea intern comunic n mai multe locuri,
ceea ce provoac ntreruperea continuitii peretelui de murein.
Membrana plasmatic intern la bacteriile Gram-
negative are o organizare i funcii similare cu membrana
plasmatic a bacteriilor Gram-pozitive, cu deosebirea c nu
formeaz mezozomi.
n spaiul periplasmatic exist un strat de murein cu
grosimea de 3-10 nm, unit covalent cu membrana plasmatic
extern prin intermediul unor lipoproteide.
Membrana plasmatic extern are o structur asimetric
format de: fosfogliceride i cardiolipine din stratul intern al
acestei membarane i lipidele A (molecule hidrofobe) din stratul
85
extern asociate cu polizaharide, formnd stratul extern al
nveliui bacteriilor Gram-negative de natur lipopolizaharidic.
Lipopolizaharidele reprezint complexe formate din
lipida A cu funcie de ancor i lanuri de carbohidrai
(Antigenul O).
n componena membranei externe doar la bacteriile
Gramnegative intr o protein specific numit porina, care
formeaz canale pentru transportarea substanelor hidrofile.
Aceste canale au permeabilitate selectiv, astfel mpiedicnd
trecerea unor antibiotice (ampicilina) cu aciune contra
bacteriilor Grampozitive. O trstur specific pentru
membrana extern a bacteriilor este incapacitatea realizrii
transportului activ din cauza lipsei complexelor enzimatice
specializate.
Flagelii i pilii
De la suprafaa celulelor bacteriene pornesc nite
excrescene filiforme care pot fi de dou tipuri: pili i flageli.
Unele bacterii posed ambele tipuri de structuri.
Flagelii sunt prezeni de obicei la suprafaa bacililor, mai
rar a cocilor. Ei reprezint nite tubuli cu grosimea de 10-60 nm
formai din 3-11 filamente asamblate din proteina globular
flagelina. Spre deosebire de flagelii celulelor eucariote, flagelii
bacterieni nu sunt acoperii cu membran plasmatic. Ei se
unesc cu plasmalema i peretele celular prin intermediul unor
discuri, care la bacteriile Grampozitive sunt n numr de o
pereche, iar la bacteriile Gramnegative n numr de dou
perechi. Deoarece flagelina nu posed activitate de ATP-az,
flagelii nu sunt capabili s efectueze micri ondulatorii ca la
eucariote. Micarea lor se datoreaz rotirii flagelului n jurul
axei sale. Ca surs de energie pentru micare servete gradientul
H+ de la suprafaa membranei plasmatice. Flagelii posed
proprieti antigenice (antigenul H).
86
n dependen de numrul de flageli deosebim
urmtoarele tipuri de bacterii:
monotrihi cu un singur flagel (Vibrio ohoterae);
lofotrihi cu un mnunchi unipolar (situat la un singur capt) de flageli
(Bartonella bacilliformis);
amfitrihi cu mnunchiuri bipolare (la dou capete) de flageli
(Spririllum serpens);
peritrihi cu flageli n jur (Escherichia coli).
Componente intracelulare
Bacteriile nu conin organite celulare membranare aa ca
RE, AG, lizozomii, peroxizomii, mitocondriile. Unele specii
conin membrane fotosintetizatoare i sunt de asemenea,
descrise vezicule umplute cu gaze.
Celulele bacteriene conin ribozomi cu coeficientul de
sedimentare 70S (30S + 50S), responsabili de sinteza
proteinelor. Ribozomii pot fi dispersai n citoplasm sau pot fi
asociai la ARNm n preajma nucleoidului. n citoplasm se mai
pot gsi i substane de rezerv sub form de granule de
glicogen etc.
Numeroase specii bacteriene pot forma endospori
structuri care permit supravieuirea speciei n condiii
nefavorabile. Au fost descoperii spori care au existat n stare
latent peste 25 milioane ani, pstrndu-i capacitatea de
87
restabilire. Endosporii au un perete celular gros ce conine
proteine, iar citoplasma este deshidratat.
88
proteinele bazice prin rsucire. La fiecare 40 mii nucleotide
(40kb) ADN-ul astfel compactizat formeaz nite bucle prin
asocierea fizic la alte proteine bazice (fig. 5.4). Mecanismul de
meninere a structurilor superspiralizate nu este deocamdat
cunoscut, dar posibil sunt implicate moleculele de ARN.
89
plasmide cu un numr mediu de copii (10-50) - molecule de
dimensiuni medii, se afl sub control parial;
plasmide cu un numr nalt de copii (>50) - molecule mici,
semiautonome.
Dup genul de activitate n celul deosebim:
plasmide R - codific sinteza factorilor de rezisten la
antibiotice;
plasmide Col - asigur sinteza colicinilor proteine
capabile de a distruge bacteriile lipsite de aceste plasmide;
plasmide F (plasmide de sex) - asigur transferul de gene
n cadrul conjugrii bacteriene.
90
Conjugarea reprezint procesul n care dou celule
bacteriene fac schimb de material genetic prin intermediul
pililor. n acest scop contacteaz o bacterie purttoare de
plasmid F (F+) i una lipsit de plasmid (F-). Se consider ca
donor de material genetic celula F+, iar celula F- - acceptor de
material ereditar. Din celula-donor se transfer o copie
monocatenar a plasmidei F. n celula acceptor molecula
monocatenar se transform n bicatenar i obine form de
cerc. Ca rezultat ambele celule se transform n F+ i n
continuare pot funciona ca donori de informaie genetic (fig.
5.5).
91
n unele cazuri factorul F se integreaz n nucleoid, iar
suele respective se numesc Hfr (High frequency
recombination). Celula Hfr servete ca donor la conjugarea cu o
celul F-, transfernd n celula-recipient o copie ntreag a
nucleoidului (fig. 5.6). La fel ca i factorul F, n celula acceptor
trece o molecular monocatenar. n unele cazuri procesul de
conjugare se ntrerupe, ca rezultat are loc transferul doar a unui
fragment din nucleoid.
n unele celule
Hfr factorul F se
excizeaz din nucleoid,
purtnd cu sine i un
fragment al acestuia. n
acest caz molecula
recombinat poart
denumirea de factor F'
(plasmid F') (fig. 5.7).
Celulele cu plasmide F'
pot participa n procesul
de conjugare.
Transformare
a genetic se
caracterizeaz prin
ptrunderea n bacterie
a moleculelor de
ADN din exteriorul
celulei. Celulele
pregtite pentru
transformare poart denumirea de celule competente i pot fi
obinute n condiii de laborator prin incubarea la temperaturi
sczute n prezena ionilor de Ca2+, Cs+ etc. Importana practic
a transformrii genetice const n posibilitatea introducerii unor
92
gene de interes (de ex., gena insulinei) n bacterii cu scopul
obinerii proteinelor ce pot fi utilizate n calitate de preparate
medicamentoase. n condiii de laborator pentru transformare se
utilizeaz n special plasmidele din familiile R i Col. n condiii
naturale s-a descris transformarea pneumococilor i a E.coli cu
ADN circular i liniar. Pentru ca moleculele de ADN s nu fie
hidrolizate de enzimele gazdei ele devin circulare, sau se
integreaz n genomul gazdei.
Tr ansducia reprezint transmiterea informaiei
ereditare de la o celul bacterian la alta prin intermediul
bacteriofagilor. Bacteriofagii lizogeni sunt capabili s se
integreze n genomul celulei gazde. Sub aciunea factorilor
exogeni (radiaie, temperatur, pH), ei se excizeaz din nucleoid
purtnd un fragment al acestuia. Bacteriofagul excizat se
multiplic, ceea ce conduce la distrugerea celulei-gazd.
Infectnd alte celule, bacteriofagul transport i informaia
genetic de la celula distrus.
Recombinarea genetic la bacterii are i un rol medical. n
primul rnd, este vorba despre posibilitatea obinerii preparatelor
farmaceutice prin utilizarea bacteriilor transformate. Datorit
recombinrilor genetice n natur apar populaii de bacterii patogene
rezistente la preparatele medicamentoase, ceea ce pune n dificultate
vindecarea bacteriozelor.
93
NUCLEUL
Nucleul este o structur intracitoplasmatic prezent n
toate celulele eucariote cu excepia hematiilor adulte (fig. 6.1).
95
i transcripia se efectueaz n nucleu, iar traducerea mesajului
n citoplasm.
Anvelopa nuclear
Anvelopa nuclear este o membran dubl prevzut cu
pori. Membrana extern a nveliului nuclear continu cu RE
rugos, membrana intern e lipsit de ribozomi. n locurile unde
foia intern continu cu cea extern se formeaz porii nucleari,
iar spaiul dintre membrane este numit perinuclear (20-40nm) i
comunic cu RE. Porii reprezint circa 10% din toat suprafaa
nveliului nuclear (la mamifere).
98
difer de la o celul la alta dup cantitatea de
heterocromatin n nucleul respectiv.
Nucleoscheletul complexului lamina-por conine 2-3%
din totalul proteinelor din nucleu. Este alctuit n principal din
proteine nehistone (95%), ntre care predomin cele acide. Pe
faa intern a complexului lamin-por se realizeaz activitatea
nucleozid-trifosfatazei, considerat a fi implicat n transportul
ARN ctre citoplasm.
Rolul matricei nucleare
Matricea nuclear menine forma nucleului i stabilitatea
sa n interfaz. Modificrile matricei nucleare sunt strns cuplate
cu funciile nucleului: organizarea cromatinei, replicarea ADN,
transcripia i transportul intranuclear al ARN.
Matricea nuclear poate modula fluiditatea membranei
nucleare, fluiditate necesar la rndul ei funciei matricei
nucleare, n special n cea de transport al subunitilor
ribozomale prin porii nucleari.
Matricea nuclear poate modifica structura cromatinei,
fenomen important pentru realizarea replicrii ADN,
transcripiei ARN (activarea sau inactivarea genelor).
n timpul mitozei 95% din proteinele matricei nucleare
sunt distribuite n citoplasm. n refacerea nucleului dup
diviziune un rol important l joac glicozilarea acestor proteine
la nivelul AG.
n nucleol scheletul ar avea rol de suport pentru
depozitarea subunitilor ribozomale.
Nucleolul
Nucleolul e prezent la toate celulele eucariote cu
excepia celulelor blastomerilor, n care nu are loc biosinteza
proteinelor proprii (fig. 6.4). El conine trei componeni
principali: ADN - 3%; ARN - 7%; proteine - 90%.
99
Nucleolul nu este separat prin membran de restul
nucleului. Numrul i volumul nucleolilor depinde de etapa
funcional a nucleului (n celulele omului teoretic pot fi
maximal 10 nucleoli mici la nceputul interfazei i un nucleol
mare la sfritul interfazei). Nucleolii ocup circa 30% din
volumul nucleului. Exist un raport determinat ntre volumul
100
- componentul fibrilar - din fibre de ADN de 5 nm (pe care
se sintetizeaz ARNr) i fibre de transcripi;
- componenta amorf a spaiilor dintre fibre i granule, se
gsete la periferia nucleolului.
Rolul nucleolului este sinteza ARNr i asamblarea
precursorilor ribozomali. Segmentul de ADN (cromozom) n
care se conin gene ce codific pentru ARNr poart denumirea
de organizator nucleolar. La om exist 5 perechi de cromozomi
cu organizatori nucleolari care controleaz formarea nucleolilor
la sfritul mitozei (perechile: 13, 14, 15, 21, 22).
Biogeneza ribozomilor
n nucleol are loc sinteza a trei fracii de ARNr (5,8S;
18S; 28S) i stocarea precursorilor ribozomali. De pe ADN se
transcrie un precursor - ARNr 45S, care este procesat n trei
fracii mai mici (28S; 18S; 5,8S). ARNr 5S este sintetizat n
afara nucleolilor. Moleculele de ARNr se asociaz cu proteine
ribozomale sintetizate n citoplasm i importate n nucleu.
Particulele ribonucleoproteice (RNP) sunt transportate n
citoplasm sub form de subuniti ale ribozomilor (40S i 60S).
102
Tabelul 6.1. Caracteristica proteinelor histone
Tipul de Numr Masa
Aminoacizii pr edominani
histon aminoacizi molecular
H1 Lizina 215 21500
H2A Leucina, lizina 129 14000
H2B Serina, prolina, lizina 125 13775
H3 Arginina, conine cistein 135 15320
H4 Arginina, lizina 102 11280
Funciile histonelor
Proteinele histone stabilizeaz dublul helix de ADN,
inducnd o structur teriar nivel elementar de organizare a
ADN la eucariote. Din punct de vedere funcional ele represeaz
nespecific transcripia, mpiedicnd unirea ARN-polimerazei la
ADN.
Proteinele nonhistone - proteine acide (20%) cu un
coninut mrit de aminoacizi acizi (acid glutamic i acid
aspartic). Sunt heterogene, au o mobilitate mare, ndeplinesc
funcii catalitice n metabolismul ADN-ului i expresia
informaiei genetice (polimeraze, ligaze, topoizomeraze, SAR,
factori de transcripie). O cantitate mare a proteinelor
nonhistonice este prezent n esuturile active, pe cnd histonele
sunt prezente n cantiti egale n esuturile active i inactive.
ARN este prezent n cromatin fiind produsul de sintez de pe
ADN, n special transcripi primari i ARNsn (de ex., ARN din
compoziia primazei, telomerazei, etc.).
103
nivel molecula de ADN se scurteaz de ~6 ori. Fiecare
nucleozom const dintr-un miez histonic (core) format din: 8
proteine: 2H2A, 2H2B, 2H3, 2H4 i o secven de ADN cu o
lungime de 146 pb.
ADN-ul nfoar de ~2 ori octamerul histonic, formnd
un complex stabil nucleozomul. ntre nucleozomi secvena de
ADN- linker are o lungime variabil, de la 8 pn la 114 pb.
Astfel filamentul polinucleozomic de cromatin are aspectul
unui irag de mrgele.
104
filamentului de cromatin (fig. 6.6). Acest nivel de compactizare
scurteaz molecula de ADN de 40-60 ori.
Solenoidul reprezint o superspiral de dreapta cu ase
nucleozomi per tur (fig. 6.6., B,C). Trecerea cromatinei de la
nivelul I la II i invers este determinat de modificrile chimice
ale histonei H1. Fosforilarea H1 se asociaz cu superspiralizarea
DNP, iar defosforilarea H1 cu despiralizarea solenoidului (fig.
6.6., A). Acest lucru este important n reglarea activitii
genelor. Histona H1 este asociat att cu miezul nucleozomic,
ct i cu segmentul ADN linker i are rol n stabilitatea
nucleozomului.
Al treilea nivel de compactizare este reprezentat de
mpa-chetri
suplimentare, formnd
structuri mai complexe
denumite bucle (300
nm,700 nm).
Acest tip
structural de cromatin
este bine legat ntr-un
suport structural n
nucleu denumit matrix
nuclear sau ax
cromozomial
(scaffold) prin
interme-diul unor
proteine acide SAR
(Scaffold Associated
Regions) (fig. 6.7 ).
105
Al patrulea nivel reprezint condensarea i plicaturarea
buclelor ce
duce la
formarea
cromatidelor
cromozomului
metafazic.
Fiecare
cromatid are
grosimea de la
700 la 1200
nm, iar ADN
n cromosom
se scurteaz de ~ 10000 ori.
Datorit proprietii
cromatinei de a se compactiza n
nucleul celulei umane cu diametrul
de ~4 m ncap 46 molecule de ADN
cu lungimea total de circa 2 m.
Cromozomul metafazic este
format din 2 cromatide surori
identice unite prin centromer la
nivelul constriciei primare (fig.
6.8). Constricia primar ct i
perechea de kinetocori (disc
trilamelar din fibre de cromatin
superior organizate) reprezint
situsurile de ancoraj ale
microtubulilor fusului de diviziune.
Centromerul reprezint punctul de unire a cromatidelor
i de asamblare a kinetocorilor.
106
Centromerul mparte cromozomul n dou brae: braul p -
proximal, mai scurt; braul q - distal, mai lung. Regiunea
centromeric a cromozomului este format din ADN i proteine
speciale. ADN centromeric conine secvene repetitive n
tandem i secvene repetitive dispersate cu localizare
pericentromeric, ce intervin n recunoaterea cromozomilor
omologi la conjugare, meninerea celor dou cromatide surori
pn la sfrit de metafaz i separarea lor n anafaz. La drojdii
centromerul are dimensiuni de ~120 pb (fig. 6.9). La eucariotele
superioare regiunea centromeric are dimensiuni mult mai mari,
de ordinul sutelor de mii de nucleotide.
Telomerii reprezint complexe din ADN i proteine
specializate care formeaz capetele cromozomilor eucariotelor.
La procariote toate moleculele de ADN sunt circulare
ceea ce previne degradarea lor enzimatic. La eucariote ADN
are structur liniar, de aceea pentru a asigura protecia de
exonucleaze i individualitatea cromozomilor (mpiedic
reanrajamentele cromozomice) apare o structur specific din
secvene scurte repetate de ADN (tab. 6.2).
107
Tabel ul 6. 2 Var i et at ea secven el or t el omer i ce
Specia Secvena r epetat
Macronucleul ciliatelor (Tetrahymena) CCCCAA
Minicromozomul la Trypanosoma CCCTA
Cromozomii drojdiei Saccharomyces C2-3A(CA)1-3
Cromozomii plantelor (Arabidopsis) C3TA3
Cromozomii umani C3TA2
108
REPLICAREA I REPARAREA ADN
Replicarea ADN este procesul molecular prin care se
realizeaz copierea exact a moleculelor de ADN (a secvenei
nucleotidice). Datorit replicrii are loc transmiterea exact a
mesajului genetic de la o generaie de celule la alta, astfel toate
celulele organismului pluricelular conin aceeai informaie
ereditar.
Procesul de sintez a ADN este, de regul, exact. Dintr-o
molecul de ADN se formeaz dou molecule identice att ntre
ele, ct i cu molecula parental. Acest proces are loc datorit
particularitilor de structur ale ADN:
- ADN este bicatenar;
- catenele ADN sunt complementare i antiparalele.
Principalele caracteristici ale replicrii sunt:
sinteza replicativ a ADN-ului este semiconservativ,
deoarece, cel mai des, fiecare din cele dou catene este folosit
ca matri pentru sinteza unei catene noi de ADN;
sinteza este bidirecionat;
polimerizarea nucleotidelor are loc doar n direcia 5 3;
procesul implic participarea mai multor factori proteici.
Aparatul de replicare
Aparatul de replicare include ADN-matri cu punctul de
origine, nucleozide trifosfai ct i proteine pentru despiralizarea
109
helixului de ADN, iniierea replicrii, polimerizarea
nucleotidelor etc.
Originea replicrii
Originea replicrii este reprezentat de o secven specific
de nucleotide numit secven autonom de replicare ori.
Unitatea capabil de replicare independent se numete un
singur replicon, la eucariote ADN conine mai multe puncte de
origine, deci mai muli repliconi. n tabelul 7.1. sunt prezentate
datele privind numrul de repliconi per genom, lungimea medie
a unui replicon i viteza de polimerizare la diferite organisme.
110
Proteinele aparatului de replicare
Replicarea ADN implic aciunea mai multor factori
proteici i enzime (fig. 7.1).
ADN-helicazele realizeaz despiralizarea i denaturarea
local a moleculei de ADN prin hidroliza ATP. Datorit
existenei a dou furci replicative exist dou helicaze care se
deplaseaz n direcii opuse de la punctul de origine a replicrii.
111
ribonucleotide, care este numit primer (ARN-primer).
Helicazele mpreun cu primaza formeaz complexul primozom.
Topoizomerazele de tip I scindeaz legturile
fosfodiesterice ale unei catene, relaxnd dublul helix
previnindu-se supraspiralizarea ADN. Topoizomerazele de tip
II taie ambele catene ale duplexului.
Proteinele ce se leag de ADN monocatenar (proteine
SSB) - factori ce stabilizeaz catenele de ADN n regiunile
denaturate i mpiedic refacerea structurii dublucatenare prin
unirea celor dou catene, sau n cadrul aceleai catene n
regiunile cu secvene palindromice (fig. 7.2).
112
Tabelul 7.2. Caracteristica ADN-polimerazelor la
eucariote
ADN
polimeraza
Mitocon-
Localizarea Nucleu Nucleu Nucleu Nucleu
drii
Sinteza Sinteza
Funcia sintetic Reparaie Reparaie Replicare
primerilor ADN
Exonucle-
Funcii Exonucle- Exonucle-
- az -
suplimentare az az
113
De rnd cu activitatea sintetic, ADN polimeraza conine
subuniti care prezint activitate nucleazic pentru scindarea
ARN-primerului din fragmentele de ADN sintetizate sau excizia
nucleotidelor n procesul de corecie a erorilor introduse n
timpul replicrii.
ADNligaza este enzima ce leag capetele fragmentelor
de ADN sintetizate prin formarea legturilor 3' 5'
fosfodiesterice.
Mecanismul r eplicr ii
Sinteza ncepe prin despiralizarea catenelor de ADN i
formarea furcii de replicare. Fiecare caten reprezint o matri
pentru catena nou format. Despiralizarea este necesar pentru
expunerea bazelor celor dou catene n aa mod ca noile baze s
le poat recunoate i s formeze perechea complementar.
Sinteza decurge bidirecional: de la fiecare punct de origine se
formeaz dou furci replicative n direcii opuse fa de origine
(fig. 7.8).
Replicarea necesit un complex proteic numit replizom
care recunoatere punctul de origine a acesteia i o iniiaz.
Proteina / proteinele de recunoatere (la drojdii sunt cunoscute
cinci proteine) se leag de ori i iniiaz despiralizarea local a
ADN n situsul DUE.
Complexul multifermentativ, numit replizoma, se mic de-
a lungul ADN-ului i efectueaz sinteza pe ambele catene ale
furcii. Replicarea ar putea fi vzut ca creterea continu a
celor dou catene de ADN n dublul helix. Este necesar de
accentuat c:
- citirea matriei se efectueaz doar n direcia 3 5;
- sinteza catenei noi se efectueaz doar n direcia 5 3.
n furca de replicare (fig. 7.4):
114
catena matr i 3 5 de ADN se numete caten
lider, se citete n direcia 3 5; catena fiic este
sintetizat nentrerupt n direcia 5 3;
catena - matr i 5 3 este numit caten ntrziat, se
citete la fel n direcia 3 5; catena fiic se sintetizeaz
la fel n direcia 5 3 discontinuu, pe fragmente,
cunoscute ca fragmente Okazaki,. Lungimea fragmentelor
Okazaki este de 1000-2000 de nucleotide la procariote i de
100-200 de nucleotide la eucariote.
115
Etapele r eplicr ii
1. I niier ea include urmtoarele procese:
ataarea replizomului la punctul de origine al replicrii i
despiralizarea local a helixului ADN de ctre helicaze;
sinteza ARNprimerului o secven scurt de
ribonucleotide de ctre primaz (o enzim cu actrivitate
ARN-polimerazic);
adugarea dezoxiribonucleotidelor complementare matriei
la captul 3 al primerului realizat de ADN polimeraz.
2. Elongarea se caracterizeaz prin alungirea catenelor nou -
sintetizate nfptuit de ADN-polimeraz, ce se deplaseaz rapid
de-a lungul catenelor de ADN, fcnd posibil sinteza pe
ambele pri ale furcii ntr-un mod coordonat i eficient.
Evenimentele principale sunt:
creterea continu a catenei lider;
116
sinteza discontinu a fragmentelor Okazaki;
controlul erorilor de mperechere a bazelor n timpul
replicrii i nlturarea lor, nfptuit de o exonucleaza
35 din componena ADN-polimerazei.
3. Terminarea include urmtoarele procese:
nlturarea ARNprimerilor de ctre o component
enonucleazic 5 3 a polimerazei;
nlocuirea golurilor de ctre ADN-polimeraz;
unirea capetelor fragmentelor catenelor de ADN sintetizate
cu ajutorul ADN-ligazei.
Modele de replicare
Moleculele circulare ale procariotelor (nucleoidul,
plasmidele) se replic prin mecanismul replicrii de tip . Din
situsul ori pornesc concomitent dou furci replicative, ceea ce
duce la formarea unor structuri asemntoare cu litera greceasc
(teta) (fig. 7.6).
118
replicare ajunge la punctul ori al catenei L (catena uoar)
ncepe replicarea acesteia n sens opus. Astfel replicarea celor
dou catene este asincronic (replicare de tip D) (fig. 7. 7., B).
119
molecule ntr-un timp limitat (n celulele umane 7 x109 pb se
replic n 8-9 ore) replicarea ncepe n mai multe puncte ori
(cele 46 de molecule de ADN din celula uman conin 105 106
repliconi) (fig. 7.8).
La eucariote replicarea are loc numai n perioada S a
ciclului celular i este asincron: secvenele eucromatice se
replic mai timpuriu, la nceputul perioadei S, iar secvenele
heterocromatice la sfritul perioadei S.
O particularitate a replicrii ADN eucariotic este c
captul 5 al catenei noi este mai scurt, deoarece nu exist
posibilitatea completrii golului dup nlturarea primerului
ultimului fragment Okazaki. Astfel apare riscul ca n
succesiunea generaiilor de molecule s se scurteze cromozomii,
ceea ce ar putea cauza pierderea informaiei genetice de la
captul lor. Pentru prevenirea pierderilor de secvene terminale
de ADN captul cromozomului este prevzut cu o structur
special (telomerul) cu un mecanism propriu de sintez.
Regiunile telomerice ale cromozomilor se replic dup
un mecanism special, cu participarea enzimei telomeraza,
format dintr-o protein cu funcie de reverstranscripie ce
conine ARN n calitate de matri (fig. 7.9). n prima etap
are loc asocierea telomerazei la captul 3' al catenei lider din
regiunea telomeric. Ulterior enzima extinde catena, utiliznd ca
matri ARN telomerazic. Procesul de extindere a captului 3'
se repet de mai multe ori. Catena complementar a ADN
telomeric este sintetizat dup principiul catenei ntrziate de
ADN-polimeraz.
120
Repar aia ADN
Procesul de restabilire a leziunilor din moleculele de ADN care
asigur pstrarea intact a materialului genetic de-a lungul mai
multor generaii poart denumirea de reparaie. Acest proces
este caracteristic doar pentru moleculele de ADN i este
determinat de particularitile de structur a acestor molecule:
existena a dou catene complementare i antiparalele.
n structura moleculelor de ADN pot surveni dou tipuri de
schimbri:
Substituia unui nucleotid. Se afecteaz doar secvena
ADN-ului fr a ainfluena structura lui. Aceste schimbri nu se
reflect asupra proceselor de replicare sau transcripie. Ele pot
aprea ca rezultat al erorilor n cadrul replicrii din cauza
mperecherii necomplementare a bazelor (de ex., C::A) sau
datorit transformrilor chimice ale bazelor azotate: (de ex.,
dezaminarea citozinei duce la formarea uracilului).
121
Modificri structurale. Se formeaz ca rezultat al
apariiei legturilor covalente nespecifice ntre nucleotidele
aceleai catene sau din catene opuse. De exemplu, razele
ultraviolete (UV) duc la apariia dimerilor timinici legturi
ntre resturile de timin alturate, de pe aceeai caten. Astfel de
schimbri pot mpiedica replicarea i transcripia.
Sistemele reparative principale ntlnite la diferite
organisme sunt:
- reparaia direct se ntlnete foarte rar i const n revenirea
moleculei la starea iniial (de ex., prin aminare UC);
- fotoreactivarea este este larg rspndit n natur i const
n nlturarea dimerilor pirimidinici cu ajutorul unei enzime
dependente de lumin;
- reparaia prin excizie const n recunoaterea de ctre
enzime a fragmentelor denaturate i nlturarea fragmentului
monocatenar defect. Ulterior are loc restabilirea catenei lezate
cu ajutorul ADN-polimerazei, utilizndu-se ca matri catena
intact. ADN-ligaza unete fragmentul nou-sintetizat cu restul
moleculei, restabilind integritatea ei (fig. 7.10);
- reparaia prin recombinare const n excizia fragmentului
defectat, urmat de importarea secvenei corespunztoare
normale dintr-o molecul omoloag de ADN (fig. 7.11).
Dimerul pirimidinic dup recombinare este nlturat prin
mecanismul reparrii prin excizie (fig. 7.10, B);
- reparaia inducibil SOS - sistemul SOS funcioneaz ca
rrspuns la aciunea unor factori de stres. De exemplu, la E.coli
sub aciunea ocului termic sau a apariiei dimerilor pirimidinici
se sintetizeaz abundent proteina RecA-proteaza, cantitatea
creia este reglat de activitatea altei proteine LexA. Proteina
LexA este unit la o secven de ADN numit blocul SOS care
blocheaz sinteza enzimelor de reparaie. RecA-proteaza, fiind
n cantitate mare, hidrolizeaz proteina LexA, fcnd posibil
activarea unor gene ce codific proteinele de reparaie
122
(aproximativ 15 la numr). Rspunsul celulei se produce foarte
rapid n decursul ctorva minute. n a doua etap se
sintetizeaz n exces proteina LexA, care blocheaz sinteza
RecA-proteazei i peste 30-60 minute sistemul de reparare se
inactiveaz. Mecanismul de reparaie SOS intervine n cazul
leziunilor masive. Scopul lui este completarea golurilor prin
mecanisme de excizie sau recombinare. Acest tip de reparaie nu
este ntotdeauna foarte exact, iar principiul complementaritii
nu se respect n toate cazurile. Ca rezultat, moleculele reparate
prin SOS pot conine erori.
La eucariote au fost determinate mai multe gene incluse
n procesul de reparaie de exemplu familia RAD de la drojdii:
RAD3 reparaia prin excizie; RAD6 reparaia post-
replicativ; RAD52 reparaia prin recombinare.
La oameni cel mai bine a fost studiat sistemul
responsabil de maladia xeroderma pigmentosum (XP). XP este o
boal genetic cu transmitere autosomal recisiv i se
caracterizeaz prin hipersensibilitate la lumina solar, n deosebi
la radiaia UV. Boala este determinat de deficiena
mecanismelor de reparaie prin excizie.
Metilarea ADN
La procariote exist enzime care asigur metilarea
(adugarea grupelor metil CH3) citozinei i adeninei, din care
rezult metilcitozina i metiladenina. Secvenele metilate sunt
rezistente la aciunea unor enzime specifice endonucleaze de
restricie (restrictaze). La bacterii restrictazele digereaz
moleculele strine de ADN, n timp ce ADN-ul propriu care
este metilat nu se hidrolizeaz. La eucariote metilarea bazelor
azotate conduce la inactivarea genelor nefuncionale. Astfel,
regiunile heterocromatice din nucleu conin secvene de ADN
metilat.
123
Ver ificar ea cunotinelor :
1. Definii noiunile: replicare, replicon, replizom, polimeraz,
fragment Okazaki, reparare, metilare.
2. Care sunt principiile ce stau la baza replicrii ADN?
3. Care sunt particularitile replicrii la pro- i eucariote?
4. Ce componeni intervin n procesul replicrii?
5. Care sunt particularitile sintezei catenei lider i catenei
ntrziate?
6. Ce modele de replicare a ADN cunoatei?
7. Cum se replic capetele cromozomilor?
8. Care sunt mecanismele ce intervin n stabilitatea moleculei
de ADN?
9. Care enzime intervin n procesul de reparaie?
10. Care este importana biologic a metilrii moleculelor de
ADN?
126
GENA
Prima ipotez despre structura i funcia materialului
genetic a fost formulat de Gregor Mendel (1865). Pentru a
explica geneza unor caractere fenotipice ereditare i modul lor
de transmitere la descendeni, el a presupus existena unor
factori ereditari. Aceste elemente, care iniial erau pur
ipotetice, au devenit, n timp, structuri reale, materiale. Dup
descoperirea i descrierea cromozomilor (Waldeyer, 1988)
Boveri i n special Sutton (1902) au emis i susinut ipoteza c
factorii ereditari sau genele (dup termenul introdus de Wilhelm
Johansen, 1903) sunt pri din cromozomi. Aceast idee a fost
confirmat de Thomas Hunt Morgan i colaboratorii si (1910-
1925). n felul acesta, gena nceteaz s mai fie o supoziie
logic, abstract, a geniului mendelian i capt un coninut
concret, material. Cercetrile ulterioare au demonstrat natura
chimic a cromozomilor i genelor. n 1944 Oswald Avery i
colaboratorii si au demonstrat c materialul genetic este
reprezentat de molecula de ADN. n 1953 Francis Crick i
James Watson au descoperit organizarea molecular a ADN i
au determinat c succesiunea de baze azotate (A, G, C, T)
reprezint codul genetic. Informaia genetic perpetueaz
datorit replicrii moleculelor de ADN i se realizeaz prin
transcripia ARN i sinteza de proteine.
n concluzie, gena reprezint un fragment din molecula
de ADN care conine informaia genetic despre sinteza unui
127
anumit tip de protein sau a unei molecule de ARN. Grupul de
gene alturate, localizate ntr-un cromozom formeaz un grup
de nlnuire (grup lincaj). n cadrul acestor grupri, gena
ocup o poziie delimitat de genele vecine. Gena nu este
delimitat de granie morfologice sau grupri chimice
particulare. Ea are o delimitare funcional, relevat de
semnificaia mesajului genetic nscris.
Funcia genei
Gena deine secvena de nucleotide ce controleaz
sintez diferitor molecule de ARN (ARNm, ARNr, ARNt,
ARNsn) i a
diferitor molecule
de proteine.
Fiecare gen are o
succesiune
specific de baze,
de regul de pe ea
se sintetizeaz un
singur tip de ARN.
Complexitatea structurii i funciei organismelor vii este
determinat de spectrul proteinelor pe care le conine. De aceea,
organismele simple (de ex., bacteriile) conin cteva sute de
gene, iar organismele mai complexe - cteva zeci de mii de
gene. n setul diploid de cromozomi umani se conin circa
125000 de gene diferite.
Genele care codific ARNm, tradus n lanuri
polipeptidice specifice, sunt denumite gene structurale. Pentru
acestea se utilizeaz frecvent termenul de cistron. Genele care
se transcriu independent poart denumirea de uniti
transcripionale monocistronice (caracteristice pentru
eucariote), iar mai multe gene ce se transcriu n comun uniti
transcripionale policistronice (caracteristice procariotelor).
128
Prin sinteza diferitor tipuri de proteine genele
controleaz structurile, funciile i proprietile celulei i a
organismului n ntregime. Produii genelor, interacionnd cu
factorii de mediu, pot modula activitatea organismului pentru
adaptarea lui n condiiile schimbtoare ale ambiantului.
Sub aciunea factorilor de mediu genele i pot modifica
structura chimic (apar gene mutante). Mutaiile determin
apariia diferitor variante alelice ale uneia i aceleai gene care
pot avea asupra fenotipului diferite efecte:
- neutre apar variaii individuale ale unuia i aceluiai
caracter (grupele sanguine i serice la om);
- folositoare gene de rezisten la anumite noxe;
- defavorabile apar caractere patologice letale sau
semiletale (de ex., deficiene enzimatice i blocarea unor
lanuri metabolice).
Totalitatea genelor din setul diploid de cromozomi al
unui individ se numete genotip. Totalitatea caracterelor i
proprietilor individului controlate de genotip n interaciune cu
mediul se numete fenotip.
130
Par ticular itile or ganizrii genelor str uctur ale la
eucariote
Promotorul genelor eucariotelor const dintr-un segment
de cteva sute de nucleotide situate la extremitatea 5' a genei.
Aceast regiune conine o combinaie de secvene consens ce
constituie situsuri pentru factorii de transcripie (tab. 8.1).
Promotorul genelor structurale, recunoscut de ARN-polimeraza
II, prezint la distana de -20 -30 nucleotide de la situsul de
iniiere (+1) boxa Goldberg-Hogness sau boxa TATA la nivelul
creia se gsete secvena 5' TATA ATAAA-3'. Aceast
secven direcioneaz enzima ARN-polimeraza II spre situsul
de iniiere al transcripiei.
n poziia -75 se gsete boxa CAAT, caracterizat prin
secvena 5'-GGCCAATCT-3'. Boxa CAAT controleaz legarea
proteinelor de iniiere a transcripiei i eficiena acestui proces.
Mai proximal, la -90 nucleotide se gsete o alt
secven conservat boxa GC cu succesiunea 5'-GGGCGG-3'.
Boxa GC poate avea mai multe copii n promotor i intervine n
direcionarea procesului de transcripie.
131
n afar de aceste boxe mai sunt i alte secvene consens,
ce se leag de proteine reglatoare specifice pentru gena dat (fig.
8.3). Acestea sunt necesare pentru o expresie difereniat a
genelor n celule diferite i perioade diferite ale ciclului celular
(de ex., genele pentru globin se transcriu doar n celulele
precursoare ale eritrocitelor, gena pentru miozin n celulele
musculare, iar gena pentru insulin - n celulele specializate ale
pancreasului etc.).
Secvene codificatoar e
S-a demonstrat c la eucariote structura genei este
discontinu. Paradoxul valorii C confirm c din totalul ADN-
ului genomic doar o parte (10-15%) particip la sinteza
proteinelor. Secvenele neinformaionale au rol diferit:
separ genele (spacieri);
se conin n gene, dar nu sunt reprezentate n secvenele de
aminoacizi (introni);
au rol structural propriu-zis (telomeri, centromeri, satelii).
S-a constatat o discordan ntre dimensiune moleculei
de ARNm, cu cea a ARN precursor (transcript primar) i
dimensiunea secvenei de ADN care a servit ca matri pentru
transcripia ARN respectiv. P. Sharp (1977) a emis ipoteza
structurii discontinue, sau n mozaic, a genei la eucariote.
132
133
Regiunea transcriptibil a genelor la eucariote cuprinde
secvene codificatoare denumite exoni i secvene
necodificatoare introni (fig. 8.4). Numrul de exoni i introni
este variabil i depinde de complexitatea proteinei pe care o
codific:
- gena -globinei conine 3 exoni i 2 introni (fig. 8.5);
- gena pentru precolagen conine 51 exoni i 50 introni;
- gena pentru Hemofilia A conine 26 exoni i 25 introni
(secvena de ADN const din 180000 p.b., iar molecula
ARNm respectiv are o lungime de doar 9000 b. i constituie
0,2%);
- gena care codific distrofina conine mai mult de 25000000
pb, iar ARNm - doar 14000 b.
Exonii
Exonii reprezint secvene codificatoare ale genei ce se
transcriu, sunt prezeni n ARN precursor, n ARNm i se
regsesc n secvena de aminoacizi a proteinei (fig. 8.4). La
captul 5 al primului exon este o secven scurt de cteva zeci
de nucleotide (secvena lider) cu rol de iniiere a translaiei care
este urmat de codonul universal de iniiere a translaiei ATG.
La captul 3 al ultimului exon se afl unul din cei trei codoni de
STOP informaional (TAA, TAG, TGA) ce determin
terminarea sintezei proteinei i o secven scurt netranslat.
134
Numrul exonilor la diferite gene este diferit. n fig. 8.6.
este reprezentat dependena dintre numrul de exoni i
frecvena lor n genomul vertebratelor.
Intronii
Intronii reprezint secvene necodificatoare ale genei ce
se transcriu, sunt prezeni n ARN-precursor, dar nu sunt
prezeni n ARNm (fig. 8.4). n timpul maturizrii ARNm
(splicing) intronii sunt eliminai din ARN-precursor.
Intronii au o lungime cuprins ntre 100 i 10000 pb i,
de regul, sunt mai lungi dect exonii (fig. 8.7). Majoritatea
intronilor prezint la extremitatea 5' secvena dinucleotidic GT
iar la 3' AG, astfel sunt recunoscui de enzimele ce i nltur n
timpul splicing-ului.
Tabel ul 8. 2. Func i i l e i nt r oni l or
135
Par ticularitile or ganizr ii genelor pentr u ARNr i
ARNt la eucariote
Genele pentru ARNr (5,8S; 18S; 28S) sunt organizate
ntr-o unitate de transcripie ce se repet n tandem de cteva
sute de ori i formeaz organizatorul nucleolar (fig. 8.8).
136
Particularitile or ganizr ii genelor la pr ocariote
Aparatul genetic al procariotelor este reprezentat de
molecule circulare de ADN (nucleoid i plasmide). Genomul
procariotelor conine puine secvene necodificatoare. Genele se
caracterizeaz printr-o structur mai simpl i sunt lipsite de
introni. Deoarece metabolismul este intens i necesit modificri
rapide n dependen de condiiile de moment ale mediului,
majoritatea genelor implicate ntr-un lan metabolic formeaz
uniti transcripionale numite operoni.
Operonul conine un singur promotor la captul 5, mai
multe gene structurale (numrul de gene structurale este egal cu
numrul proteinelor implicate n procesul metabolic dat), iar la
captul 3 se afl terminatorul (fig. 8.9). Unii operoni pot conine
i alte secvene reglatoare (secvene operatoare, secvene
atenuatoare etc.).
137
Celelalte clase de gene (pentru ARNr, ARNt) sunt
organizate n uniti transcripionale mixte, separate prin
spaceri. n fig. 8.11 este prezentat schema unui astfel de cluster
de gene.
139
140
Genomul mitocondrial
141
Cooperarea dintre genomul nuclear i cel mitocondrial
constituie un factor esenial att n funcia normal a celulei, ct
i a mitocondriei. Circa 90 gene nucleare codific proteine ce au
rolul de susinere a sistemului genetic mitocondrial: proteine
ribozomale, aminoacil-ARNt-sintetaze, ADN- i ARN-
polimeraze, enzime implicate n procesarea i modificarea ARN,
etc. O serie de proteine codificate de gene nucleare intervin n
reglarea numrului de mitocondrii per celul i a cantitii de
142
proteine sintetizate de aceste organite. Studii efectuate asupra
complexelor enzimatice din membrana mitocondrial intern au
evideniat faptul c acestea conin subuniti esut-specifice ce
acioneaz ca reglatori ai transportului de electroni i care sunt
codificate de gene ce aparin genomului nuclear.
Transpozonii
Secvenele de ADN capabile s migreze de sine stttor
i ocupa o nou poziie n genom poart denumirea de elemente
genetice migratoare sau transpozoni. Cei mai simpli
transpozoni au fost depistai la E.coli i constau din gena
transpozaza flancat de elemente repetitive invertate. Ele
formeaz o familie cu denumirea de IS (insertion sequences).
De obicei ele se insereaz n locuri int cu o secven specific
pentru fiecare transpozon (des. 8.15).
143
Unii transpozoni poart i alte gene, de exemplu gene de
rezisten la antibiotice sau alte preparate medicamentoase. Din
ei face parte familia Tn care conine o regiune central cu gene
specifice, iar regiunile periferice sunt reprezentate de elemente
IS (fig. 8.16).
144
Retrotranspoziia are loc n dou etape. Mai nti
elementul migrator se transcrie, apoi de pe copia de ARN cu
ajutorul revertazei (ADN-polimeraz ARN-dependent) are loc
sinteza unei molecule complementare de ADN. Fragmentul nou
format se integreaz n locus nou. Ca efect are loc creterea
cantitii de material genetic.
146
TRANSCRIPIA. PROCESSINGUL ARN
ADN deine, sub form codificat, informaia ereditar
necesar edificrii i funcionrii structurilor ce alctuiesc fiina
vie, precum i realizrii proceselor metabolice care
caracterizeaz viaa. Sinteza proteinelor este realizat pe baza
genelor de structur i are loc n citoplasm, pe ribozomi.
Informaia ereditar necesar secvenierii aminoacizilor din
protein se gsete n ADN nuclear. Aceast molecul nu poate
prsi nucleul i de aceea mesajul genetic ce corespunde unei
proteine va fi mai nti copiat, transcris, sub forma unei
molecule mai mici, ARNm, care va putea trece prin porii
membranei nucleare i transmite informaia n citoplasm.
Astfel, sinteza proteinelor se realizeaz n dou etape majore:
transcripia i translaia.
Prima etap este transcripia sau copierea mesajului
codificat n ADN, sub forma unei secvene specifice
complementare de nucleotide, intr-o molecul de ARNm. A
doua etap const n: translaia (descifrarea) informaiei copiat
de ARNm de ctre moleculele de ANRt (care fixeaz specific un
aminoacid), aezarea aminoacizilor n secvena indicat de
ARNm i legarea lor peptidic.
Sinteza proteinelor este precis controlat n funcie de
programul ontogenetic al organismului sau de necesitile sale,
impuse de anumite condiii metabolice sau de mediu.
147
Transcripia este realizat de enzimele numite - ARN-
polimeraze. Sinteza ARN pe baza matriei ADN se desfoar
n direcia 5'3' dup principiul complementaritii (A=U;
T=A; GC; CG). Procesul decurge n mai multe etape
(iniierea, elongarea, terminarea) cu participarea mai multor
componente. Transcripia este reglat de secvene de ADN
specifice ale promotorului, terminatorului i alte secvene
modulatoare (enhancer, silencer, operator). Secvenele consens
sunt recunoscute de proteine specifice reglatoare, ce
interacioneaz cu ARN-polimeraza, direcionnd, accelernd
sau ncetinind procesul.
148
Transcrierea genelor de clasa II
Aparatul de transcriere:
Gena cu secvene codificatoare i reglatoare (promotor,
terminator):
- regiunea promotorului include secvene consens:
boxa TATA, boxa CAAT, boxa CG, octamer etc.,
care sunt recunoscute de proteine reglatoare;
- secvena transcris a moleculei de ADN include: +1,
secvena lider, exonii, intronii, terminatorul (fig. 9.1).
Poziia secvenelor consens din promotor determin care din
cele dou catene de ADN va servi drept matri n sinteza
moleculei de ARN. Catena 5'3' poart denumirea de catena
codogen, netranscris. Catena 3'5' poart denumirea de
catena anticodogen, este transcris, deci servete drept matri
pentru activitatea ARN-polimerazei.
153
Elongarea. Primul eveniment al acestei etape const n
modificarea configuraiei complexului proteic de transcripie.
Astfel, se elibereaz de la ARN-polimeraza II factorii TFIIB i
TFIIE rmnnd ataat TFIIF i FTIIH. Factorul TFIIH este
considerat factor de elongare, avnd activitate de helicaz ATP-
dependent, kinaz i poate fi implicat n repararea ADN.
ARN polimeraza II citete catena de ADN 3'5' i
polimeraz n direcia 5'3' cu o rat de 30 nucleotide/sec.
La nceputul fazei de elongare la ARN- polimeraz se
ataeaz TFIIS care deine rol n prevenirea eliberrii premature
a ARN-polimerazei. n spatele ARN-polimerazei, de-a lungul
catenei de ARN se deplaseaz un factor proteic de eliberare.
La promotor rmn ataate urmtoarele proteine: FTIID,
FTIIA i proteina intensificatoare. Acestea sunt necesare pentru
ataarea altor molecule de ARN-polimeraz II care vor sintetiza
alte lanuri de ARN, pn la recepionarea semnalelor reglatoare
care blocheaz transcripia.
Terminarea transcripiei. Cnd ARN-polimeraza ajunge la
secvena terminatorului transcrie i secvena palindromic.
Molecula de ARN imediat formeaz o bucl care ncetinete
deplasarea ARN-polimerazei (fig. 8.2). n consecin, polimeraza
este ajuns de factorul de eliberare ceea ce condiioneaz
disocierea complexului ADN, ARN, ARN-polimeraz.
Processingul ARN
Produsul primar al transcripiei nu poate fi imediat
transportat n citoplasm. n primul rnd, ARNm precursor
conine secvene necodificatoare (introni), n al doilea rnd
poate fi uor scindat de ARN-aze. Pentru a preveni degradarea,
are loc prelucrarea capetelor moleculei, iar intronii sunt
nlturai. Totalitatea reaciilor de modificare a ARNm precursor
poart denumirea de maturizarea ARNm sau processing.
Aceste procese se desfoar n nucleu i sunt catalizate de
154
enzime specifice. Etapele processing-ului sunt urmtoarele:
prelucrarea captului 5' (cap-are), prelucrarea captului 3'
(poliadenilare), nlturarea intronilor (splicing) (fig. 9.5).
Splicing-ul
nlturarea intronilor din ARNm precursor i unirea
exonilor are loc n nucleu, cu participarea unui complex
enzimatic denumit splicesom. Componentele acestui complex
sunt reprezentate de moleculele mici de ribonucleoproteide
nucleare (snRNP), notate U1 U6. Intronii sunt recunoscui dup
156
secvena GU la captul 5' i secvena AG la extremitatea 3'.
Procesul se desfoar n mai multe etape (fig. 9.7):
la situsul GU a intronului se leag ribonucleoproteida U1;
ribonucleoproteida U2 se unete la nivelul unei adenine din
interiorul intronului (situsul buclei);
ribonucleoproteidele U4,U5,U6 se asociaz cu U1, i U2
formnd o bucl. Bucla se formeaz prin unirea captului 5'
al intronului cu adenina printr-o legtur nespecific 5'2';
eliberarea ribonucleoproteidei U4 din complex duce la
clivarea captului 3' al intronului. Intronul este nlturat sub
form de lasou mpreun cu proteinele U2, U5, U6;
formarea legturilor fosfodiesterice 3' 5' ntre capetele
exonilor.
157
Ca rezultat al splicing-ului se formeaz un ARNm,
ulterior va fi transferat n citoplasm i va servi matri pentru
sinteza proteinei.
La eucariote exist mai multe tipuri de splicing.
Splicing constitutiv prin care se nltur toi intronii, iar
exonii sunt unii n ordinea n care erau dispui n gen.
Splicing alternativ are loc prin selecia exonilor i/sau
eliminarea difereniat a intronilor. Astfel, de pe un ARNm
precursor pot fi obinute mai multe variante de ARNm i
respectiv mai multe tipuri de proteine. n diferite esuturi
i/sau la diferite perioade de dezvoltare pot fi sintetizate
proteine diferite de pe aceeai gen (fig. 9.8).
158
Splicing prin amestec de exoni (exon shuffling)
moleculele de ARNm se pot forma prin schimbarea ordinii
exonilor. Se ntlnete foarte rar.
Trans-splicing formarea unei molecule de ARNm din cteva
molecule de ARNm precursor, sintetizate de pe gene diferite. Se
ntlnete la tripanosome, la unele nematode i trematode.
Editarea ARN
n urma processing-ului n ARNm pot fi adugate,
nlocuite sau nlturate unele nucleotide. Acest fenomen decurge
n nucleu cu participarea unor enzime specifice. Ca rezultat
informaia din molecula de ARNm nu coincide cu cea
corespunztoare din ADN. Procesul de modificare a secvenei
codificatoare din ARNm poart denumirea de editarea ARN.
160
Elementele promotorului funcioneaz ca modul n reglarea
expresiei genei. Unele elemente promotoare (secvena TATA) sunt
absolut necesare pentru iniierea transcripiei. n schimb, alte
elemente stimuleaz sau mpiedic transcripia genei. Acestea sunt
secvene de ADN, de care se leag proteine specifice reglatoare (fig.
9.9). Dac transcripia a fost activat de legtura dat, elementul
promotor se numete element de reglare pozitiv, iar proteina este o
protein reglatoare pozitiv. Dac transcripia este blocat, elementul
promotor se numete element de reglare negativ.
161
interaciune dintre proteine determin activarea sau supresia
transcripiei (fig. 9.4; fig. 9.9).
De aceea, efectul unui element de reglare asupra
transcripiei depinde de combinaia diferitelor proteine legate.
Deci, combinaiile particulare dintre proteinele reglatorii
controleaz, n mod specific, transcripia genelor n diferite
tipuri de celule. Aceasta se numete reglare genic combinativ.
Genele care controleaz acelai proces i/sau lan
metabolic, de regul, conin secvene reglatoare similare i sunt
recunoscute de aceleai proteine reglatoare. De exemplu, genele
implicate n dezvoltarea embrionar conin o secven comun
numit homeobox. Astfel de gene sunt localizate pe acelai
cromozom n ordinea conectrii lor, formnd astfel o familie de
gene. Un al exemplu de expresie difereniat a genelor n timp i
spaiu este sinteza hemoglobinei la om (fig. 9.10). Hemoglobina
embrionar este format din dou polipeptide i dou i se
sintetizeaz iniial n sacul vitelin. Hemoglobina fetal ncepe s
se sintetizeze n ficat i n splin din dou polipeptide i dou
. La nou-nscut i adult sinteza hemoglobinei se transfer n
mduva osoas unde sunt sintetizate adevratele catene i ,
cu un % mic de polipeptide de tip .
162
Controlul sintezei ARN. Dup formarea complexului de
iniiere a transcripiei ARN-polimeraza II sintetizeaz molecula
de ARN pn la situsul de terminare. Viteza i rata de
transcripie este determinat de configuraia promotorului i de
interaciunea cu proteinele reglatoare. Sfritul procesului este
semnificat prin secvena palindromic i formarea buclei n
molecula de ARN.
Contr olul posttranscr ipional. Pentru prevenirea
degradrii ARN i transportul lui n citoplasm are loc CAP-area i
poliadenilarea capetelor. Varianta splicing-ului decide structura
proteinei ulterior sintetizate. Astfel de pe aceeai gen pot fi
sintetizate diferite proteine. n consecin o gen poate controla
diferite perioade ontogenetice sau diferenierea celular.
Contr olul tr ansfer ului ARNm n citoplasm. ARNm
produsul processing-ului i splicing-ului se asociaz cu proteine
speciale, inracioneaz cu receptorii complexului porului nuclear
i se transfer din nucleu n carioplasm.
163
Transcripii de pe genele pentru ARNt i ARNr sunt
procesai, formnd molecule mature de ARNt i ARNr (fig.
8.11).
Reglarea transcripiei la procariote
Particularitile ciclului vital al organismelor procariote,
ct i organizarea simpl a aparatului genetic fac ca reaciile de
activare/inactivare a sintezei proteinelor s decurg rapid. Se
disting dou tipuri de control al genelor: control negativ i
control pozitiv.
Controlul negativ este mecanismul de inactivare a
genelor printr-o protein represor. Proteina represor este
controlat de o gen reglatoare, plasat n afara operonului. Ea
se unete la regiunea promotorului i mpiedic deplasarea
ARN-polimerazei. Proteina represor poate fi inactivat de un
inductor (factori de natur neproteic care poate fi substratul).
Controlul pozitiv reprezint mecanismul de activare a
genelor cu ajutorul unei proteine activator. De regul,
activatorul este n stare inactiv i nu are afinitate fa de
promotor. Inductorul condiioneaz legarea proteinei activator
la promotorul operonului ce va fi transcris. n aa mod ARN-
polimeraza recunoate regiunea promotorului i efectueaz
transcripia.
Ver ificar ea cunotinelor
1. Definii noiunile: expresia genei, transcripie, promotor,
exon, intron, factor de transcripie, boxa TATA, ARN
polimeraza II, transcript primar, ARN precursor, ARN
mesager, splicing, splicesom, enhancer, silencer, control
pozitiv, control negativ.
2. Care sunt etapele transcripiei genelor structurale?
3. Cum se formeaz complexul de iniiere a transcripiei?
4. Care sunt particularitile activitii ARN polimerazei II?
5. n ce const processingul ARNm-precursor?
6. Care sunt nivelele de control al transcripiei la eucariote?
164
TRANSLAIA
Dup transcripia i transmiterea mesajului genetic din
ADN nuclear n citoplasm, secvena nucleotidelor din ARNm
este convertit ntr-o secven specific de aminoacizi n
protein. Procesul se numete translaie, ntruct limbajul
nucleotidelor este tradus n limbajul celor 20 de aminoacizi ce
alctuiesc proteinele. Catenele polipeptidice sunt sintetizate prin
aranjarea riguroas a aminoacizilor ntr-o anumit ordine,
asigurat de ctre codul genetic un sistem de corespondene
dintr-o anumit secven de trei nucleotide (codon) din ARNm
i fiecare din cei 20 de aminoacizi.
n procesul transcrierii ARNm a preluat mesajul genetic
din molecula de ADN despre succesiunea aminoacizilor din
lanul polipeptidic. Sistemul prin care succesiunea nucleotidelor
din molecula de ADN (sau ARN) determin ordinea
aminoacizilor n protein poart denumirea de cod genetic.
Pr opr ietile codului genetic
Este alctuit din triplete, fiecare triplet formeaz un codon.
Exist 64 de codoni, dintre care 61 codific pentru anumii
aminoacizi, iar trei - sunt codoni de STOP informaional.
Este universal - la toate organismele exist acelai cod
genetic, cu unele excepii la procariote, protozoare i n
mitocondrii.
165
U C A G
(Phe) (Ser) (Tyr) (Cys) U
(Phe) (Ser) (Tyr) (Cys) C
U
(Leu) (Ser) STOP STOP A
(Leu) (Ser) STOP (Trp) G
(Leu) (Pro) (His) (Arg) U
(Leu) (Pro) (His) (Arg) C
C
(Leu) (Pro) (Gln) (Arg) A
(Leu) (Pro) (Gln) (Arg) G
(Ile) (Thr) (Asn) (Ser) U
(Ile) (Thr) (Asn) (Ser) C
A
(Ile) (Thr) (Lys) (Arg) A
(Met) (Thr) (Lys) (Arg) G
(Val) (Ala) (Asp) (Gly) U
(Val) (Ala) (Asp) (Gly) C
G
(Val) (Ala) (Glu) (Gly) A
(Val) (Ala) (Glu) (Gly) G
166
Ordinea codonilor n molecula de ARNm se numete faz de
lectur. n fiecare molecul de ARNm exist trei faze de
lectur. Faza de lectur care ncepe cu AUG se numete faz de
lectur deschis (fig. 10.1).
168
Regiunea translabil conine secvena de baze ce
controleaz ordinea asamblrii aminoacizilor n polipeptid. La
captul 5 al secvenei translate se conine codonul de iniiere
AUG, iar terminaia este determinat de unul din cei trei codoni
STOP. La captul 3 al mesagerului se gsete o regiune de 100-
200 nucleotide netranslate coada poli(A).
170
Aminoacil-ARNt-sintetaza. Selecia corect i legarea
aminoacidului la molecula respectiv de ARNt se realizeaz cu
ajutorul enzimei aminoacil-ARNt-sintetaza. Aceast enzim are
specificitate pentru fiecare dintre aminoacizi, de aceea n total
exist 20 tipuri (fig. 10.4). Aminoacidul se unete la grupa OH
din poziia C2' sau C3' de la captul 3' al moleculei de ARNt.
Adiionarea se realizeaz n 2 etape:
Mg 2
1) Enzima + aminoacid + ATP Enzima-aminoacil-
AMP + P~P
2) Enzima-aminoacil-AMP + ARNt Aminoacil-ARNt +
AMP + enzima.
171
Ribozomii eucariotici. Subunitatea 40S conine o
molecul de ARNr 18S i ~33 proteine. Subunitatea 60S conine
la rndul su, trei molecule de ARNr (5S, 5,8S, 28S) i circa 49
proteine. ARNr i subunitile ribozomale 40S i 60S se
formeaz n nucleol.
Ribozomii procariotici. Subunitatea 30S conine o
molecul de ARNr 16S i 21 proteine. Subunitatea 50S este
format din ARNr 5S, 23S i 31 proteine. Sinteza ARNr i
formarea subunitilor ribozomale are loc direct n citoplasm.
172
Ribozomii au cteva centre catalitice:
Situsul A - aminoacil - este responsabil de unirea
complexului aminoacil-ARNt;
Situsul P - peptidil - este responsabil de unirea peptidil-
ARNt;
Situsul E este responsabil de eliminarea ARNt.
Legtura dintre ribozom, molecula de ARNt i molecula
de ARNm se realizeaz prin intermediul ARNr. Molecula ARNr
din subunitatea mic este responsabil de recunoaterea i unirea
la ARNm. Moleculele de ARNr din subunitatea mare sunt
responsabile de unirea celor dou subuniti ribozomale,
interaciunea ARNt cu subunitatea mare i cu molecula de
ARNm. Reaciile ce se desfoar pe ribozom sunt catalizate de
proteinele ribozomale.
Factor i pr oteici de tr anslaie. Fiecare etap a translaiei
este controlat de un complex de factori proteici specifici: IF
factori de iniiere; EF factori de elongare; RF factori de
terminare.
Mecanismul translaiei
Sinteza proteinelor se face prin aezarea secvenial a
aminoacizilor n ordinea impus de mesajul genetic preluat de
ARNm, n procesul sintezei sale pe matri de ADN. Descifrarea
mesajului se face n sensul 5'3' al moleculei de ARNm, deci n
aceeai ordine n care a fost copiat de ARNm n procesul de
transcripie.
Procesul de biosintez a proteinelor decurge n trei etape:
iniierea, elongarea i terminarea. Fiecare etap este controlat
de factori proteici specifici, care difer la procariote i eucariote.
I niier ea include reaciile care preced formarea legturii
peptidice ntre primii doi aminoacizi din protein. Ea necesit
legarea ribozomului la ARNm i formarea complexului de
173
iniiere care include primul aminoacil-ARNt. Aceasta este o
etap relativ lent a translaiei i determin rata cu care ARNm
este tradus (fig. 10.6).
Iniierea decurge n cteva etape:
(1) formarea complexului metionil-ARNt met (la procariote
formilmetionil-ARNt fmet);
(2) activarea complexului metionil-ARNtmet prin adugarea
unei molecule de GTP;
(3) formarea complexului [metionil-ARNtmet] [GTP]
[subunitatea ribozomal mic]. Metionil-ARNt se
situeaz n situsul P (proprietate unic doar pentru ARNt
de iniiere);
(4) asocierea complexului format la ARNm i recunoaterea
codonului de iniiere AUG, cu consumul unei molecule
de ATP;
(5) asocierea subunitii ribozomale mari i disocierea GTP
n GDP i Pi.
174
La eucariote mai nti se recunoate CAP-ul, apoi
subunitatea ribozomal mic migreaz pn cnd ajunge la
primul codon AUG. Primul aminoacid incorporat este
metionina (Fig 10.7).
La procariote se recunoate fiecare AUG care servete
drept semnal pentru iniierea translaiei. Primul aminoacid
incorporat este formilmetionina.
175
(3) transportarea complexului [aminoacil-ARNt] [GTP] la
situsul A al ribozomului i eliberarea GDP + Pi;
(4) transferul aminoacidului iniiator din situsul P n situsul
A i formarea legturii peptidice ntre aminoacizi.
Procesul este catalizat de enzima peptidil-transferaza. n
etapele urmtoare ale elongaiei din situsul P se va
transfera n situsul A ntregul lan polipeptidic;
(5) eliberarea moleculei de ARNt din situsul P i asocierea
unei molecule de GTP la ribozom;
(6) translocarea ribozomului cu un triplet. Micarea
ribozomului se efectueaz n direcia 5' 3' al
moleculei de ARNm:
- tripletul decodificat nimerete n afara sectorului P;
- n situsul P se va deplasa ARNt cu polipeptidul
format (peptidil-ARNt);
176
- n sectorul A se situeaz urmtorul codon, iar n
situsul A urmtorul aminoacil-ARNt. n calitate de
energie servete GTP care se hidrolizeaz pn la
GDP + Pi.
Procesul decurge pn cnd n sectorul A nimerete unul
din cei trei codoni STOP.
Terminarea cuprinde evenimentele necesare pentru
eliberarea lanului polipeptidic sintetizat i disocierea
ribozomilor de la ARNm.
Cnd n sectorul A se situeaz unul dintre cei trei codoni
STOP (UAG, UGA, UAA), la ribozom se unete factorul de
eliberare RF. RF condiioneaz disocierea complexului de
translaie. Subunitile ribozomale, ARNt, ARNm, RE, factorii
proteici de translaie pot fi reutilizai (fig. 10.9.).
177
Lanul polipeptidic sintetizat, de obicei, sufer unele
modificri posttranslaionale: nlturarea metioninei iniiale,
fosforilarea, glocozidarea, hidroliza specific etc.
Reglar ea tr anslaiei
Biosinteza proteinelor poate fi activat/inactivat de
diveri factori de natur proteic sau neproteic care
interacioneaz cu componeni aparatului de translaie.
n tab. 10.1 sunt enumerai principalii factori de
translaie la procariote i eucariote, mecanismul lor de aciune la
diferite etape ale iniierii, elongrii i terminrii biosintezei
proteinei.
La procariote este bine studiat mecanismul de aciune i
al altor factori ce pot modula translaia. Spre exemplu sunt
prezentate unele antibiotice i modul lor de blocare a sintezei
proteice la bacterii.
Cazagamicina blocheaz iniierea translaiei prin legarea ei la
captul 3' al moleculei 16S, responsabil de interaciunea cu
ARNm.
Puromicina blocheaz sinteza proteinei prin unirea ei la ARNt
n loc de aminoacid.
Tetraciclina blocheaz legarea aminoacil-ARNt la situsul A al
ribozomului.
Streptomicina mpiedic trecerea de la iniierea la elongarea
lanului polipeptidic.
Cloramfenicolul blocheaz activitatea peptidil-transferazei.
Eritromicina - blocheaz translocaia ribozomului.
Procariote
Se unete la subunitatea 30S i stabilizeaz complexul de
IF-1
iniiere pn la interaciunea cu ali factori proteici
Se unete la ARNt de iniiere i controleaz ptrunderea lui
IF-2
pe ribozom
IF-3 Controleaz unirea corect a subunitii 30S la ARNm
Eucariote
Initierea
179
Pierderea/adiionarea unui sau mai multor nucleotide
provoac decalarea fazei de lectur i modificarea secvenei de
aminoacizi n ntregul lan, dup locul de modificare. Substituia
nucleotidelor poate provoca apariia codonilor missens sau
nonsens. Mutaiile missens determin nlocuirea unui
aminoacid cu altul. n cazul formrii unor codoni STOP
prematuri (mutaie nonsens), are loc sinteza unor lanuri
polipeptidice mai scurte. nlocuirea unui codon STOP cu un
codon sens duce la alungirea lanului polipeptidic.
Numrul de polipeptide sintetizate de pe aceeai matri
ARNm este determinat de durata de via a mesagerului. La
procariote ARNm sintetizat este supus imediat translaiei i are o
durat de via de 2-5 min. La eucariote exist mai multe
mecanisme ce asigur stabilitatea ARNm, care au o durat de
via de la 20 min pn la 48 ore. Unul dintre ele este asociat
cu lungimea secvenei poli(A). n plus la eucariote exist
particule RNP ce pstreaz ARNm. Asocierea ARN cu
proteinele previne degradarea enzimatic a mesagerului. Date
recente pun n eviden existena unor molecule de ARN-
antisens, care se pot lega complementar cu moleculele de
ARNm, blocnd astfel degradarea i prevenind translaia
mesagerilor respectivi.
180
recunoate orice pirimidin din tripletul codogen, iar U - orice
purin.
n mitocondrii sunt sintetizate doar o parte din enzimele
implicate n metabolismul energetic. Celelalte proteine
mitocondriale, inclusiv proteinele reglatoare ale replicrii,
transripiei, translaiei sunt codificate de genomul nuclear,
sintetizate n citoplasm i importate n mitocondrii. De aceea,
biosinteza proteinelor mitocondriale este reglat n mare parte
de activitatea genelor nucleare.
181
TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT
Descifrnd enigmele structurii genelor, savanii au
nceput s se preocupe de izolarea i sinteza lor. n urm cu 30
de ani cei care credeau n reuita acestor deziderate erau puini i
nimeni nu bnuia explozia actual a ingineriei genetice i
consecinele cu adevrat extraordinare pe care le va avea.
Primii pai au fost fcui de Beckwith i Shapiro, care n
1969 au izolat i fotografiat operonul lactozei. Un an mai trziu
G. Khorana reuete sinteza artificial a primelor gene de
procariote. Cu aceeai tehnic se sintetizeaz gena ce codific
somatostatina un hormon hipofizar (1977). Dup descoperirea
transcriptazei inverse se reuete sinteza altor gene de mamifere
(pentru hemoglobin, ovalbumin, insulin etc.). Genele
obinute nu erau ns active, deoarece nu aveau un sistem
propriu de replicare, nici secvenele necesare declanrii
transcripiei i apoi a sintezei proteinelor pe care le codific.
Aceste dificulti au fost depite, introducnd genele artificiale
n plasmidele unor bacterii sau virusuri. Pentru inseria genelor
n plasmide se folosesc enzime speciale care taie ADN n locuri
specifice enzime de restricie (Premiul Nobel, 1978).
Realizrile ingineriei genetice au un mare interes teoretic
i practic incontestabil. Izolarea sau sinteza genelor a dus la
obinerea artificial a unor produi naturali de mare valoare
(insulina, somatostatina, interferonul), dar speranele justificate
pe care savanii i le pun n acest domeniu sunt mult mai mari.
182
Nu este vorba numai de o nou industrie farmaceutic care s
produc antibiotice, hormoni, vaccinuri antivirale ci i de
posibilitile reale de a realiza o terapie cauzal terapie
genic, corectnd genele mutante sau nlocuindu-le i rezolvnd,
astfel, marea problem a incurabilitii bolilor genetice.
Actualmente exist toate posibilitile tehnice pentru
studierea direct sau indirect a acizilor nucleici purttori ai
mesajului ereditar. Gena de interes poate fi extras din
organism, supus unor modificri structurale, introdus n alt
organism, poate fi obinut produsul ei proteic. Toate procedeele
manipulrii acizilor nucleici se reunesc n termenul genetic
tehnica ADN recombinant.
Pentru studiul acizilor nucleici sunt necesare urmtoarele
procedee:
- extragerea i purificarea moleculelor de ADN (sau ARN)
din celule;
- izolarea fragmentului de ADN de interes;
- multiplicarea fragmentelor izolate;
- analiza secvenelor de interes (determinarea succesiunii
bazelor, determinarea expresiei, determinarea poziiei n
genom).
183
respective (de ex., ARNm pentru insulin poate fi izolat doar din
celulele ale pancreasului; ARNm pentru globine din celulele
eritroblatilor etc.).
Restricia ADN
Clivarea enzimatic a moleculelor de ADN se efectueaz
cu ajutorul unor enzime de restricie (ER) care recunosc
secvene specifice dublucatenare, numite situsuri de restricie.
184
ER sunt enzime ntlnite la procariote care, n natur,
sunt responsabile de clivarea ADN-ului exogen (de ex., ADN
virual). SR reprezint nite succesiuni specifice formate, de
regul, din 4-6-8 pb ce formeaz palindroame (fig. 11.1).
Secvenele respective n ADN-ul gazdei sunt metilate i nu pot
fi recunoscute de ER proprii.
Ca rezultat al aciunii diferitor ER se pot obine
fragmente de ADN cu capete monocatenare adezive (lipicioase)
sau cu capete neadezive.
ADN-ul din genomul eucariotelor (inclusiv genomul
uman) conine diferite SR dispersate la ntmplare de-a lungul
macromoleculei. Utiliznd ER pot fi obinute fragmente de
ADN cu lungimi diferite. Comparnd fragmentele de restricie
se poate construi harta de restricie a moleculei de ADN
localizarea SR pentru diferite restrictaze.
Sinteza ADNc
Clonarea ADN
Procesul de obinere a unui numr mare de copii a
secvenei ADN de interes cu utilizarea tehnicilor ADN
recombinant poart denumirea de clonare. Procesul poate fi
realizat att in vivo , ct i in vitro (PCR).
186
Clonarea ADN n vivo
Clonarea ADN n vivo const n izolarea unui fragment
de ADN, introducerea lui prin ligare ntr-un vector i
multiplicarea lui ntr-o celul gazd.
Vectorii de clonare sunt molecule de ADN care se
replic independent de cromozomul celular, chiar i atunci cnd
sunt introduse artificial n structura lor fragmente de ADN
strin. Pentru replicare vectorul are nevoie de dou elemente:
punctul ORI de iniiere a replicrii i gena pentru proteinele SSB
care pregtesc matria pentru replicare. n calitate de vectori se
utilizeaz plasmidele R, bacteriofagul , virusul simian SV-40,
cosmidele, cromozomii artificiali bacterieni (BAC), cromozomii
artificiali ai drojdiilor (YAC), etc. Selectarea vectorului de
clonare se face n funcie de dimensiunile fragmentului
multiplicat: fragmentele mici de pn la 15 kb pot fi clonate n
plasmide, fragmentele cu o lungime de pn la 50 kb n
cosmide i bacteriofagi, fragmentele mai mari de 300 kb pot fi
clonate n cromozomii artificiali BAC sau YAC.
n calitate de gazd de clonare sunt utilizate: celula
bacterian (pentru plasmide, cosmide, bacteriofagi, BAC),
celulele drojdiilor (pentru plasmide, YAC), celulele vegetale
(plasmide, virusuri), celulele animale (virusuri). Exist vectori
care se pot replica n mai multe gazde vectorii navet.
Moleculele hibride formate din ADN vector i ADN
pentru cercetare poart denumirea ADN recombinant. Obinerea
ADN recombinant necesit urmtoarele procese (fig. 11.3):
- izolarea ADN pentru clonare (o secven de ADN sau o
gen) i selecia vectorului de clonare;
- clivarea ADN de interes i a vectorului cu aceeai enzim de
restricie ce produce capete adezive;
- introducerea secvenei de ADN n vector prin ligarea
fragmentelor rezultate din digestia cu ER cu ajutorul enzimei
187
ADN-ligaza. ADN-ligaza unete complementar capetele
adezive ale fragmentelor prin legturi fosfodiesterice.
188
Amplificarea ADN in vitro
Biblioteci de ADN
Coleciile fragmentelor de ADN clonate dintr-o celul,
esut sau organism formeaz biblioteci de ADN. Acestea sunt
utile pentru identificarea genelor solicitate.
Biblioteca genomic
Colecia de clone ce conine cel puin o copie a fiecrei
secvene de ADN al genomului se numete bibliotec
189
190
Fig. 11.4. Principiul PCR
genomic. O bibliotec genomic este util pentru a gsi i izola
o gen de interes prin screeningul cu sonde specifice.
Bibliotecile genomice se obin prin dou tehnici:
1. ADN genomic este digerat complet cu o enzim de
restricie, iar fragmentele rezultate sunt clonate fie printr-un
vector derivat din bacteriofagul , fie ntr-un vector cosmidic.
2. O alt cale este digestia parial cu ER, care recunosc
secvene de 4 pb. Prin digestie parial doar o parte din SR este
tiat de ER.
Biblioteci cromozomiale
Dimensiunea genomului uman este att de mare, nct
sunt necesare mii de clone pentru a reprezenta ntregul genom.
De aceea sunt obinute biblioteci ADN pentru fiecare cromozom
n parte biblioteci cromozomiale. Pentru om sunt necesare 24
de biblioteci diferite. Deci, dac o gen este localizat pe un
cromozom cunoscut cu metode genetice, cercetarea va fi limitat
la biblioteca acelui cromozom.
Izolarea cromozomilor este posibil datorit dimensiunii
i morfologiei diferite ale cromozomilor, care pot fi separai cu
ajutorul citometriei n flux. Acum sunt disponibile biblioteci
preparate din toi cromozomii umani.
Biblioteci de ADNc
Colecia de clone obinute pe baza ADN complementar
se numete bibliotec ADNc. Fiind sintetizat pe matria
moleculelor de ARNm, ADNc va corespunde numai genelor
aflate n stare de activitate transcripional, reproducnd doar
genele funcionale specifice celulei respective. ADNc este
clonat n vectori plasmidici sau n vectori derivai din
bacteriofagul . Spre deosebire de fragmentele obinute prin
digestie cu ER, moleculele de ADNc nu posed capete adezive,
191
de aceea pentru introducerea n vector la moleculele de ADNc
se adaug adaptori care conin capete adezive.
192
2. sondele reci fragmente de acid nucleic, marcate cu un
produs chimic neutru: direct, cu enzime sau fluorocromi sau
indirect, cu biotin. Se vizualizeaz n funcie de tipul de
marcaj. Dei sunt mai puin sensibile, au avantajul de a fi
inofensive pentru cercettor.
193
TEHNICI DE ANALIZ A GENELOR
Genele reprezint substratul molecular al ereditii.
Structura i localizarea genelor n genom controleaz
proprietile organismului. Ca rezultat al interaciunii
genomului cu diveri factori ai mediului, n ADN se pot produce
mutaii. Mutaia poate modifica metabolismul celular i tisular,
ceea ce conduce la dezvoltarea strilor patologice (boli
genetice). Tehnologia ADN recombinant a creat premisele
dezvoltrii unor metode de diagnostic molecular dotate cu
capacitate de rezoluie, grad de precizie i nivel informativ net
mai superioare celor ale metodelor convenionale. Superioritatea
absolut a abordrii moleculare rezult ns din faptul c spre
deosebire de toate celelalte metode de diagnostic, limitate la
determinarea exclusiv a trsturilor fenotipice, - analiza ADN,
destinat nemijlocit studiului genotipului este singura n msur
s obiectiveze alterrile primare (mutaiile) care se fac direct
responsabile pentru starea de boal.
Tehnicile ADN recombinant permit identificarea genelor
normale i/sau a variantelor lor mutante, stabilirea purttorilor
de gene mutante, diagnosticul prenatal sau presimptomatic al
patologiilor genetice, iar n viitorul apropiat apare posibilitatea
terapiei genice.
Studiul molecular al genelor poate fi realizat pe mai ci
n dependen de scopul propus:
194
1. secvenierea ADN pentru determinarea structurii
primare a genei;
2. tehnica Southern-blot pentru identificarea poziiei
genei n genom.
3. tehnica Northen-blot pentru determinarea expresiei
genelor (analiza ARNm);
4. tehnica Western-blot pentru determinarea produsului
proteic al genei;
5. tehnica PCR pentru identificarea genei normale sau
mutante.
n laboratoarele de biologie molecular se utilizeaz
diverse variante ale metodelor menionate.
Pentru separarea fragmentelor de acizi nucleici se utilizeaz
electroforeza macromoleculelor n gel de agaroz sau de
poliacrilamid. Purtnd sarcin negativ, moleculele acizilor nucleici
migreaz n cmpul electric cu viteze diferite, n dependen de
greutatea molecular. Fragmentele mai scurte migreaz mai rapid, n
timp ce fragmentele lungi migreaz mai lent. Pentru determinarea
dimensiunilor fragmentelor din gel, concomitent cu fragmentele de
interes sunt supuse electroforezei n trecuri vecine i fragmente-
marker ai lungimii. Moleculele acizilor nucleici pot fi vizualizate n
gel prin colorare cu ageni fluoresceni chimici, sau sunt marcate
radioactiv. n cazul marcrii radioactive fragmentele se identific cu
ajutorul autoradiografiei care const n suprapunerea gelului cu un
film fotosensibil.
Secvenier ea ADN
Analiza secvenei bazelor azotate din structura primar a
ADN poate fi realizat prin dou ci: 1) calea chimic (Maxam-
Gilbert), n care se folosesc reaciile chimice de clivare a ADN-
ului n baze individuale (fig. 12.1), dar fiind o metod
complicat i laborioas, n ultimii ani nu se mai utilizeaz; 2)
calea enzimatic (Sanger) n care ADN-ul este sintetizat in
vitro pe baza matriei ADN studiat, n aa fel nct reacia se
195
termin specific n poziia care corespunde unei baze anumite.
Pentru a determina o secven de nucleotide pe una din cile
menionate, ADN-ul este supus seriei de patru reacii separate,
fiecare reacie fiind specific pentru una din baze. Prin
electroforez produii de reacie vor migra n patru curse
paralele, pe acelai gel. Urmrind band cu band, poate fi
identificat ordinea nucleotidelor n ADN (fig. 12.2).
196
grupa OH care mpiedic polimerizarea nucleotidelor (fig.
12.2).
Folosind patru analogi dedeoxi diferii n timpul sintezei
catenei noi de ADN, se poate de identificat fiecare nucleotid
normal din catena matri. Electroforeza fragmentelor obinute
permite stabilirea ordinii nucleotidelor n molecula de ADN.
n ultimii ani se utilizeaz o metod automat de
secveniere, bazat pe metoda dideoxi.
Tehnica Northern-blot
Metoda Northern-blot const n transferul moleculelor
denaturate de ARN pe filtre de nailon sau nitroceluloz, urmat
de hibridarea cu sonde marcate. Aceast metod este similar
199
tehnicii Southern-blot cu deosebirea c ARNm extras i purificat
nu este supus scindrii cu enzime, iar electroforeza decurge n
condiii de denaturare.
Tehnica Northern-blot permite identificarea transcripilor
genelor analizate, stabilirea lungimii lor.
Tehnica Western-blot
Aceast metod const n identificarea unei proteine specifice din
amestecul de proteine celulare. Pentru aceasta, proteinele sunt separate prin
electroforez n condiii de denaturare n prezena SDS (Dodecil Sulfat de
Sodiu). Proteinele fracionate dup greutatea molecular sunt transferate pe
filtre de nailon sau nitroceluloz i supuse tratrii cu anticorpi specifici
marcai radioactiv sau fluorescent. Prin aceast metod se poate identifica
prezena/lipsa proteinei, dimensiunile ei, rata de expresie a genei.
200
201
Aplicaiile practice ale tehnicii PCR:
- detectarea mutaiilor cunoscute la bolnavi i purttori;
- diagnosticul prenatal i presimptomatic al bolilor ereditare;
- determinarea genelor de predispoziie la bolile comune
(coronaropatii, boala hipertonic, tulburri psihice etc.);
- diagnosticul precoce i evaluarea pronosticului bolilor
canceroase;
- determinarea prenatal a sexului;
- identificarea agenilor patogeni (virui, bacterii);
- dactiloscopia genomic (identificarea persoanelor);
- analiza filiaiei (paternitate, maternitate);
- tipizarea HLA.
Hibridarea in situ
Hibridarea in situ reprezint o tehnic molecular , n
care o sond specific marcat poate identifica direct pe
preparatele celulare:
(1) un ARNm ntr-o celul particular sau esut;
(2) o gen pe un anumit cromozom sau fragment de cromozom;
(3) numrul moleculelor de ARNm n dependen de perioada
ontogenetic sau tip tisular;
(4) ADN viral;
(5) deleiile cromozomiale submicroscopice;
(6) genele responsabile de producerea cancerului, localizarea i
nivelul lor de expresie.
Din motiv c sondele marcate radioactiv au unele
dezavantaje (tehnic laborioas, pericol pentru sntate) n
ultimii ani se utilizeaz metoda FISH (Fluorescence In Situ
Hibridization) care utilizeaz sonde fluorescent marcate (fig.
12.6). Metoda FISH este simpl, poate fi aplicat pe preparate
celulare arhivate, este rapid, nu modific morfologia celulelor.
202
Ver ificar ea cunotinelor :
1. Definii noiunile: secvenierea ADN, hibridarea acizilor
nucleici, Southern-blot, Northern-blot, hibridarea in situ,
autoradiografie, primeri, sonde moleculare.
2. Ce tehnici moleculare se utilizeaz pentru studiul acizilor
nucleici?
3. Care sunt aplicaiile practice ale acestor tehnici?
4. Care sunt principiile secvenierii ADN?
5. Care sunt etapele tehnicii Southern-blot?
6. Care sunt avantajele i dezavantajele tehnicii Southern-blot?
7. n ce constau aplicaiile practice ale tehnicii PCR?
203
CICLUL CELULAR
Organismele vii sunt compuse din celule, a cror cretere
i diviziune necesit succesiunea programat a unor evenimente
i procese care formeaz ciclul celular. Unele din aceste procese
sunt continue, ca de exemplu sinteza proteinelor sau a lipidelor.
Altele, de exemplu sinteza ADN, din contra, sunt procese
discontinui i depind de procesul de diviziune celular. Fiecare
ciclu celular cuprinde dou perioade dinamic i calitativ
distincte: interfaza i mitoza (fig.13.1). Se accentueaz c
procesul multiplicrii celulare are la origine replicarea ADN-
ului cromozomial, replicare care are loc n perioada interfazic
S.
204
Interfaza
Interfaza ocup cea mai mare parte din durata ciclului
celular (90%), constituie perioada n care celula desfoar o
susinut activitate biosintetic (sinteza de ADN, ARN,
proteine), asigurnd condiiile necesare realizrii diviziunii
celulare. In cadrul acestei etape au fost descrise trei perioade
distincte:
Perioada G1 perioada presintetic sau postmitotic, se
caracterizeaz prin:
- intensificarea transcripiei i a proteosintezei, procese
aproape blocate n perioada mitotic;
- decondensarea cromatinei proces important pentru
activarea transcripiei genelor;
- reorganizarea nucleolilor;
- cromozomii sunt monocromatidieni i se
caracterizeaz prin set diploid (2n = 2c).
Perioada S perioada sintetic, se caracterizeaz prin:
- replicarea semiconservativ asincron a moleculelor
de ADN;
- dublarea cantitatii de ADN ;
- cromozomi bicromatidieni (2n = 4c);
- sinteza simultan de proteine histone i nehistone
implicate n sinteza i compactizarea ADN;
- dublarea centriolilor (fig. 13.2).
Perioada G2 perioada postsintetic sau premitotic care
se caracterizeaz prin:
- transcripia i sinteza proteinelor cu aceeai
intensitate ca i n G1, asigurndu-se condiiile
necesare intrrii celulei n mitoz.
205
Mitoza i citochineza
Diviziunea celular debuteaz prin diviziunea nuclear
sau mitoza, se ncheie cu diviziunea citoplasmei sau
citochineza.
Mitoza i citochineza ocup o scurt perioad de timp
(10%) din durata desfurrii ciclului celular, numit perioada
mitotic (M). Mitoza, odat declanat, este un proces continuu.
Dar pentru studiu i descriere, a fost mprit n patru etape:
profaza, metafaza, anafaza i telofaza.
Profaza. Se caracterizeaz prin prezena n nucleu a
cromozomilor bicromatidieni (2n=4c). Aceste cromatide, unite
la nivelul centromerului, reprezint imaginea citologic a
procesului chimic de replicare a ADN-ului. Cromozomii se
condenseaz puternic, se ngroa i devin vizibili. Pe ambele
pri ale centromerilor se maturizeaz cte un kinetocor. La
sfritul profazei nucleolul dispare iar membrana nuclear
disociaz. Concomitent se organizeaz aparatul de diviziune:
centriolii se deplaseaz spre polii opui ai celulei, se formeaz
fusul de diviziune prin asamblarea microtubulilor.
206
Metafaza. Firele fusului de diviziune unesc centriolii i
cromozomii prin intermediul kinetocorilor. Cromozomii sunt
dispui n plan ecuatorial, formnd placa ecuatorial. La aceast
faz cromozomii sunt maximal condensai i prezint forma
optim pentru studiul citologic.
Anafaza. ncepe prin clivarea longitudinal a
centromerului fiecrui cromozom, separarea celor dou
cromatide surori i migrarea lor simultan spre polii opui ai
celulei (fig. 13.3). La aceast faz cromozomii devin
monocromatidieni, iar celula are un set tetraploid de cromozomi
(4n = 4c).
208
superioare ciclul celular dureaz 10-25 ore, din care diviziunea
celular dureaz o or. Perioada G1 are durata cea mai variabil,
n timp ce perioada S este cea mai constant pentru un anumit
tip celular.
Dup ce au depit perioada G1, timpul necesar pentru
perioada S i G2, deci pn la nceputul diviziunii este foarte
constant pentru diferite celule. De acea s-a introdus noiunea de
punct de r estr icie (punct R) pentru momentul imediat, urmat
de sfritul perioadei G1, care trebuie depit pentru ca celula s
poat parcurge etapele urmtoare ale ciclului celular (fig. 13.4).
Un alt punct de r estr icie se afl spre sfritul perioadei
G2. Inhibarea sintezei proteinelor n aceast faz mpiedic
intrarea celulei n mitoz. Se consider c o proteinkinaz
solubil (o enzim ce catalizeaz fosforilarea proteinelor) este
activat spre sfritul perioadei G2 i acioneaz asupra
proteinelor din lamina nuclear i asupra histonelor H1.
Fosforilarea proteinelor din lamina nuclear induce
dezasamblarea nveliului nuclear, pe cnd fosforilarea
histonelor H1 produce condensarea cromozomilor, fenomen
caracteristic mitozei.
209
- derularea replicrii materialului genetic nuclear este
controlat de alt factor semnal de ntrziere a perioadei
mitotice;
- declanarea procesului mitotic, n care are loc segregarea
materialului genetic, este dirijat de factorul de activare a
mitozei (M-phase promoting factor: MPF).
Factorii de cretere
S-au descris mitogene specifice ca: eritropoietina,
factorii de cretere ai unor celule (nervilor, fibroblastelor),
poliamine (putrescina), hormoni (n special estrogenii). Exist i
factori tisulari, care inhib diviziunile celulare cum sunt
chalonele (peptide sau glicoproteine) (tab. 13.1).
Tabelul 13.1. Factor i i de cr et er e i ac i unea l or asupr a
cel ul el or i nt
FACTORI I DE CRETERE ACI UNEA ASUPRA CELUL ELOR I NT
Factorul de cretere Stimuleaz proliferarea mai multor tipuri
epidermal EGF celulare
Factori de cretere de tip Stimuleaz proliferarea adipocitelor i a
insulinic IGF1, IGF2 celulelor din esutul conjunctiv
Factorul de cretere a Stimuleaz proliferarea: fibroblatilor,
fibroblatilor FGF celulelor endoteliale i mioblatilor
Factorul de cretere neuronal Induce cretere axonal i viabilitatea
NGF neuronilor simpatici i senzori
INTERLEUKINA 2 IL2 Stimuleaz proliferarea limfocitelor T
Stimuleaz proliferarea celulelor Stem i a
INTERLEUKINA 3 IL3 majoritii celulelor precursoare ale multor
celule difereniate
Stimuleaz proliferarea celulelor precursoare
ERITROPOIETINA
ale eritrocitelor
Factori de stimulare a Stimuleaz proliferarea: celulelor
coloniilor granulocitare G- precursoare ale macrofagelor i
CSF granulocitelor, neutrofilelor
Factori de stimulare a
Stimuleaz proliferarea celulelor precursoare
coloniilor de macrofage
ale macrofagelor i granulocitelor
M-CSF
210
Competiia celulelor pentru factorii de cretere menine
constant densitatea populaiei celulare. n momentul n care
densitatea populaiei celulare depete o valoare prag,
concentraia factorilor de cretere scade i n consecin
diviziunea celular este oprit.
Ciclinele
Descoperirea ciclinelor i a protein-kinazelor
dependente de cicline (cdk) a permis interpretarea corect a
mecanismelor ce regleaz ciclul celular.
Ciclinele reprezint un grup restrns de proteine a cror
sintez se realizeaz ntr-un mod dependent de perioadele
ciclului celular. Ele activeaz cdk, formnd cu acestea complexe
ce prezint activitate kinazic. Pe parcursul formrii
complexelor, ciclinele induc modificri conformaionale i de
locaie a cdk ceea ce confer acestora specificitate n folosirea
diferitelor substraturi. Specificitatea activitii catalitice a
complexelor ciclina /cdk st la baza parcurgerii de ctre celul a
ciclului celular.
Evenimentele ce marcheaz intrarea celulei n perioada
mitotic sunt rezultatul fosforilrii directe sau indirecte a unor
proteine de ctre MPF. Prin fosforilarea laminelor nucleare,
MPF declaneaz dezorganizarea membranei nucleare.
Fosforilarea histonei H1, proces ce iniiaz condensarea
cromatinei, este catalizat de proteinkinaz, enzim activat prin
fosforilare de ctre MPF. Se consider c un mecanism indirect
similar de fosforilare st la baza asamblrii fusului de diviziune.
Ciclinele i protein-kinazele dependente de cicline constituie
componentele motorului ciclului celular (fig. 13.4).
Ciclinele se clasific n trei grupe (fig. 13.5):
1. ciclinele perioadei G1 ciclinele D i E;
2. ciclinele perioadei S ciclina A;
3. ciclinele perioadei G2 ciclina B.
211
212
Gene implicate n controlul ciclului celular
213
confer celulelor capacitatea proliferrii autonome (de ex., p53,
Rb).
Adeziunea celular
La majoritatea celulelor organismelor vertebrate,
formarea adeziunilor intercelulare i celula-matrice este o
condiie important n depirea punctului de restricie. Dup
intrarea n perioada sintetic, pn la ncheierea mitozei, celulele
pierd parial legturile ce le stabilizeaz n esut i se rotunjesc
(fig.13.6).
214
care i-au epuizat programul de supravieuire sunt eliminate din
esut prin apoptoz. Pe lng proliferare i difereniere, n
organism, celulele a cror funcie este epuizat, sunt nlturate i
nlocuite de celule tinere. Procesul de nlturare este un proces
fiziologic i a fost denumit apoptoz sau moarte celular
programat.
Diferenierea celular
Toate celulele unui organism pluricelular pornesc de la o
celul zigot cu setul de gene capabil s asigure creterea i
dezvoltarea unui organism complex format din diferite esuturi.
Replicarea ADN i mitoza asigur transmiterea aceleai
informaii genetice tuturor celulelor care vor rezulta din
diviziunea zigotului. n diferite perioade ontogenetice celulele
i modific aspectul, compoziia i ca rezultat funciile.
Diferite celule se deosebesc ntre ele prin setul de proteine
necesare pentru activitatea celulei i setul specializat de proteine
necesare pentru ndeplinirea unor funcii specifice esutului dat.
De exemplu, n celulele dermului se sintetizeaz keratin, n
eritrocite hemoglobina, n celulele intestinului fermeni
digestivi, n celulele retinei opsine etc. Coninutul difereniat
de proteine n diferite celule este determinat de expresia
difereniat a genelor n timp i spaiu. Astfel, diferenierea
celular este determinat de conectarea sau deconectarea
unor gene cu expresie difereniat n timp i spaiu.
Apoptoza
Homeostazia tisular necesit un echilibru ntre moartea
i proliferarea celular. n general, sinuciderea celular este
activat pentru a elimina selectiv celulele devenite indezirabile
(nedorite). Acestea pot fi: celule lezate sau senescente
(polinucleare acumulate la nivelul situsului inflamator), celule
215
recunoscute ca strine sau preneoplazice (a cror apoptoz este
indus de celule citotoxice) sau celule care au pierdut contactul
cu mediul lor nconjurtor (de exemplu, celulele epidermice,
care au migrat, n urma unui traumatism n esutul subcutanat),
sau celule n exces care intr n competiie cu alte celule pentru
un semnal inhibitor.
S-a demonstrat c apoptoza are loc n:
- cursul dezvoltrii normale a embrionului;
- regresia organelor la larve n timpul metamorfozei;
- pierderea celulelor din spaiul interdigital al mnii la
embrionul uman;
- eliminarea celulelor senescente sau lezate din esuturi;
- eliminarea celulelor transformate (canceroase);
- n sistemul imun - prin apoptoz se realizeaz ndeprtarea
unor clone limfocitare i selecia altora.
Fiecare celul primete multiple semnale (hormoni,
citokine) prin intermediul receptorilor specifici. Aceste semnale
pot induce intrarea celulei n ciclul celular sau n apoptoz. De
exemplu, glucocorticoizii sau ionoforul de Ca2+ induc apoptoza
n timocite. Acest proces este inhibat prin activarea protein-
kinazei C de ctre un ester forbol sau de ctre IL1. Alterarea
unui receptor specific ar putea determina apariia unei clone
maligne, dezechilibrnd aceast relaie ntre semnalele
inductoare i represoare ale apoptozei i ale proliferrii.
Caracteristica esenial a apoptozei este reprezentat de
clivajul ADN dublucatenar la nivelul linker-ilor
intranucleozomici (fig.13.7).
Modificrile din nucleu ce afecteaz n principal
moleculele de ADN, sunt produse n urma activrii sau induciei
unei endonucleaze care este dependent de ionii de Ca2+ i
Mg2+. Aceast enzim este prezent n mod constitutiv, n unele
tipuri de celule (timocitele din cortex), ns ea apare indus n
alte tipuri de celule. Aceast endonucleaz cliveaz ADN
216
internucleozomal, dnd natere la o serie de fragmente formate
din 180-200 perechi de baze.
Apoptoza i senescena
219
RECOMBINAREA GENETIC
Prin recombinare genetic se definete fenomenul
producerii unor combinaii genetice noi prin rearanjarea,
reasortarea sau redistribuia materialului genetic cuprins n dou
uniti genetice diferite.
Recombinarea genetic este un proces general n natur
i reprezint una din cheile mecanismelor prin care se formeaz
noi indivizi, proces important n selecia natural. Mecanismele
de recombinare genetic sunt diferite la procariote i eucariote.
220
Recombinarea genomic
Eucariotele superioare se caracterizeaz printr-un
mecanism particular de nmulire nmulire sexuat, la care
particip dou celule specializate - gameii. De regul, gameii
sunt de origine diferit (matern i patern). Contopirea
gameilor haploizi poart denumirea de fecundare, iar celula
rezultat ce conine materialul genetic al ambilor gamei - zigot.
Participarea gameilor (unui organism) la fecundaie este
aleatorie, asigurnd formarea diferitor tipuri de zigoi, ceea ce
reprezint recombinarea genomic.
Fuziunea celor doi gamei haploizi reface setul diploid
de cromozomi, caracteristic speciei. Mitozele succesive ale
zigotului duc la creterea i dezvoltarea organismului
pluricelular. ncepnd cu zigotul toate celulele somatice vor
avea cromozomii n perechi de omologi identici ca morfologie i
structur genic, dar diferii ca origine.
221
I diviziune meiotic diviziunea reducional
Diviziunea reducional este responsabil de
njumtirea setului de cromozomi i de recombinarea inter- i
intracromozomic.
Profaza I
Profaza I a meiozei reprezint cea mai important i
complex faz, n care are loc conjugarea cromozomilor i
recombinarea intracromozomic. Aceast faz este divizat n
cinci etape n care are loc condensarea continu a cromatinei i
formarea aparatului de diviziune.
Leptotenul (leptonemul) cromozomii bicromatidieni
se condenseaz, devin vizibili i au aspectul unor filamente
subiri.
Zigotenul (zigonemul) reprezint momentulcheie n
care are loc conjugarea cromozomilor omologi (perechea de
cromozomi identic dup
lungime, form,
structur, dar de origine
diferit unul matern i
altul patern). Conjugarea
omologilor are loc
centromer - la centromer,
telomer la telomer,
gen alel la gen
alel, formnd bivaleni
sau tetrade (doi
cromozomi omologi
bicromatidieni) (fig.
14.1). Procesul
conjugrii este facilitat
de complexul
sinaptonemal, format
din proteinele axului
222
cromozomic, care asigur apropierea cromatidelor i
stabilizeaz tetradele.
Cromozomii X i Y, nefiind omologi, n timpul
conjugrii se unesc prin capetele lor, formnd un bivalent
vezicula sexual.
Pachitenul (pachinemul) se caracterizeaz prin
schimbul reciproc de fragmente ntre cromozomii omologi
crossing-overul, care reprezint recombinarea intracromozomic
a materialului genetic. Astfel, fiecare dintre cromozomi va
conine material genetic de la ambii prini, iar noua combinaie
de gene va fi transmis generaiilor urmtoare.
Un rol
important n
realizarea
crossing-overului
l are complexul
sinaptonemal n
cadrul cruia se
formeaz un
complex catalitic
multiproteic -
nodul de
recombinare,
responsabil de
ruperea i
reunirea
ncruciat a fragmentelor omoloage (fig. 14.2).
Diplotenul (diplonemul) reprezint faza n care
cromozomii omologi ncep s se separe unul de altul prin
dezorganizarea complexului sinaptonemal. Omologii rmn
unii n punctele, n care a avut loc crossing-overul, formnd
chiasme (fig. 14.1). Numrul chiasmelor coincide cu numrul
nodulilor de recombinare.
223
Diachineza se remarc prin fenomenul de terminalizare
a chiasmelor deplasarea chiasmelor spre extremitile
cromozomilor. Bivalenii rmn unii doar prin capete.
225
Mecanismul molecular al crossing-overului
n procesul crossing-overului particip dou molecule
omoloage de ADN, care sunt apropiate fizic prin intermediul
complexului sinaptonemal. Recombinarea are loc ntre secvene
nalt specifice i se bazeaz pe principiul complementaritii.
Este un mecanism foarte precis i se efectueaz cu o acuratee
strict.
Procesul de recombinare necesit ruperea duplexelor de
ADN, formarea monocatenelor i reunirea ncruciat a
secvenelor complementare. Ca rezultat al ncrucirii
moleculelor, se formeaz o configuraie cruciform specific,
numit structura Holliday (fig. 14.5).
226
n dependen de modul de tiere a acestei structuri se
pot obine molecule recombinate de ADN de dou tipuri:
(1) molecule recombinate cu secvene heteroduplexe
(numai una din catene este recombinat);
(2) molecule recombinate, prin schimb reciproc de
fragmente bicatenare.
Crossing-overul nu este un proces obligatoriu la toate
eucariotele (de ex., la masculii dipterelor el n-a fost nregistrat).
Mecanismul molecular de reglare, inclusiv proteinele implicate
nu sunt deocamdat bine studiate. S-au gsit omologii ntre
unele proteine participante la crossing-over cu proteinele de
recombinare la E.coli.
227
Mecanismul molecular al recombinrii la E.coli
Modelul cel mai accesibil pentru studierea recombinrii
genetice este E.coli. n procesul de recombinare particip:
- molecula ADN bicatenar recipient cu situsul chi (secven
conservat la bacterii, localizat la fiecare 5-10kb, format
din 8 perechi baze 5' GCTGGTGG 3' );
3' CGACCACC 5'
- fragmentul ADN monocatenar donor (ADN fagic, ADN
plasmidic);
- complexul proteic RecBCD format dintr-o endonucleaz, o
exonucleaz i o ADN-helicaz;
- proteina RecA ce catalizeaz reacia de formare a
heteroduplexurilor (fig. 14.6);
- proteine SSB care stabilizeaz monocatenele.
228
(1) Complexul RecBCD gsete n molecula ADN recipient
secvena chi. RecBCD denatureaz ADN bicatenar i
produce o ruptur n una dintre catene, obinndu-se un
capt 3' liber.
(2) Proteina RecA asigur recunoaterea captului 3' liber i
catalizeaz unirea complementar cu fragmentul de ADN
donor monocatenar.
(3) Catena donor nlocuiete una dintre catenele originale,
formnd un heteroduplex (ADN recombinat).
(4) Catena dislocuit este eliminat.
229
BIBLIOGARFIE
1. Adams, R.L.P. et al. (Eds) (1986) The Biochemistry of the
Nucleic Acids, 10th revised edn (Chapman & Hall, London).
2. Bayer, M.E. (1968) Areas of adhesion between wall and
membrane in Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 53, 395.
3. Benga G. (1985) Biologia celular i molecular. Dacia,
Cluj-Napoca.
4. Bickmore, W.A. & Sumner, A.T. (1989) Mammalian
chromosome banding. Trends Genet. 5, 144178.
5. Blackburn, E.H. & Szostak, J.W. (1984) The molecular
structure of centromeres and telomeres. A. Rev. Biochem.
53, 163194.
6. Bloom, K & Green, M. (Eds) (1992) Nucleus and gene
expression. Curr. Opinion Cell Biol. 4, 377-567.
7. Brown, T.A. (1990) Gene Cloning, 2nd edn (Chapman &
Hall, London).
8. Burke, D.T. et al. (1987) Cloning of large segments of
exogenous DNA into yeast by means of artificial
chromosome vectors. Science 236, 806812.
9. Clarke, L. (1990) Centromeres of budding and fission yeasts.
Trends Genet. 6, 150-154.
10. Cormack, B.P. & Struhl, K. (1992) The TATA-binding
protein is required for transcription by all three nuclear RNA
polymerases in yeast cells. Cell 69, 685-696.
11. Covic M. (1981) Biologie i genetic medical. Ed.
Didactic i Pedagogic, Bucureti.
12. Darnell, J. et al. (1990) Molecular Cell Biology 2nd edn
(Scientific American Books, San Francisco, CA).
13. Dunderdale, H.J. (1991) Formation and resolution of
recombination intermediates by E. coli RecA and RuvC
proteins. Nature 354, 506-510.
230
14. Evans, W.H. & Graham, J.M. (1989) Membrane Structure
and Function (IRL Press, Oxford).
15. Felsenfeld, G. & McGhee, J.D. (1986) Structure of the 30-
nm chromatin fiber. Cell 44, 375377.
16. Felsenfeld, G. (1992) Chromatin as an essential part of the
transcriptional mechanism. Nature 355, 219224.
17. Gennis, R.B. (1989) Biomembranes (Springer-Verlag,
Berlin).
18. Giaever, G.N. & Wang, J.C. (1988) Supercoiling of
intracellular DNA can occur in eukaryotic cells. Cell 55,
849-856.
19. Goeddel, D. et al. (1979) Direct expression in Escherichia
coli of a DNA sequence coding for human growth hormone.
Nature 281, 544-548.
20. Greider, C.W. & Blackburn, E.H. (1985) The identification
of a specific telomere terminal transferase activity in
Tetrahymena extracts. Cell 43, 405413.
21. Hartwell, L.H. & Weinert, T.A. (1989) Checkpoints:
controls that ensure the order of cell cycle events. Science
246, 629-634.
22. Holliday, R. (1964) A mechanism for gene conversion in
fungi. Genet. Res. 5, 282-304.
23. Ingraham, J.L. et al. (1983) Growth of the Bacterial Cell
(Sinauer, Sunderland, MA).
24. Jeffreys, A.J. et al. (1991) Minisatellite repeat coding as a
digital approach to DNA typing. Nature 354, 204210.
25. Kuhlbrandt, W. (1992) Membrane proteins. Curr. Topics
Struct. Biol. 2, 503-510.
26. Lai, M.M.C. (1992) RNA recombination in animal and plant
viruses. Microbiol. Rev. 56, 61-79.
27. Landy, A. (1989) Dynamic, structural and regulatory aspects
of l site- specific recombination. Annu. Rev. Biochem. 58,
913-949.
231
28. Laskey, R. & Scott, M.P. (Eds) (1993) Gene expression and
differentiation. Curr. Opinion Genet, Dev. 3.
29. Lewin, B. (1997) Genes VI, Chs 1N7 (Oxford University
Press, Oxford).
30. Marsh, D. (1992) Lipids in membrane structure. Curr.Topics
Struct. Biol. 2, 497-502.
31. Matsumoto H. et al. (1989) A human centromere antigen
(CENP B)interacts with a short specific sequence in alphoid
DNA. J. Cell Biol. 109, 19631973.
32. McGhee, J.D. (1983) Higher order structure of chromatin:
orientation of nucleosomes within the 30tnm chromatin
solenoid is independent of species and spacer length. Cell
33, 831841.
33. Moyzis, R.K. et al. (1988). A highly conserved repetitive
DNA sequence (TTAGGG) present on the telomeres of
human chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,
66226626.
34. Murray, A.W. & Hunt, T. (1993) The Cell Cycle: An
Introduction (W.H. Freeman, New York).
35. Murray, A.W. & Kirschner, M.W. (1989) Dominoes and
clocks: the union of two views of cell cycle regulation.
Science 246, 614-621.
36. Nasmyth, K. (1993) Control of the yeast cell cycle by the
Cdc28 protein kinase. Curr. Opinion Cell Biol. 5, 166-179.
37. Neidhardt, F.C. et al. (Eds) (1987) Escherichia coli and
Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology
(American Society for Microbiology, Washington, DC).
38. Nikaido, H. & Vaara, M. (1987) In Escherichia coli and
Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology,
7-22 (American Society for Microbiology, Washington,
DC).
39. Norbury, C. & Nurse, P. (1992) Animal cell cycles and their
control. Annu. Rev. Biochem. 61, 441-470.
232
40. Oliver, S. et al. (1992) The complete DNA sequence of yeast
chromosome III. Nature 357, 3846.
41. Palecek, E. (1991) Local supercoil-stabilized DNA
structures.Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26, 151-226.
42. Rahmouni, A.R. & Wells, R.D. (1989) Stabilization of Z-
DNA in vivo by localized supercoiling. Science 246, 358-
363.
43. Rich, A. et al. (1984) The chemistry and biology of left-
handed Z-DNA. Annu. Rev. Biochem. 53, 791-846.
44. Richmond, T.J. et al. (1984) Structure of the nucleosome
core particle at 7 resolution. Nature 311, 532537.
45. Roman, L.J. et al. (1991) Rec BCD-dependent joint
molecule formation promoted by Escherichia coli RecA and
SSB proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3367-3371.
46. Saenger, W. (1984) In Principles of Nucleic Acid Structure
(Cantor, C.R., Ed.) (Springer-Verlag, Heidelberg/Berlin).
47. Schultz, M.C. et al. (1992) Variants of the TATA-binding
protein can distinguish subsets of RNA polymerase I, II and
III promoters. Cell 69, 697-702.
48. Schulze, D.H. et al. (1983) Identification of the cloned gene
for the murine transplantation antigen H2Kb by
hybridization with synthetic origonucleotides. Mol. Cell.
Biol. 3, 750-755.
49. Smith, G.R. (1987) Mechanism and control of homologous
recombination in Escherichia coli. Annu. Rev. Genet. 21,
179-201.
50. Southern, E. (1975) Detection of specific sequences among
DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol.
Biol. 98, 503-517.
51. Stryer, L. (1988) Biochemistry, 3rd edn (Freeman, San
Francisco).
52. Svaren, J. & Horz, W. (1993) Histones, nucleosomes and
transcription. Curr. Opinion Genet. Dev. 3, 219-225.
233
53. Thomas, P.S. (1980) Hybridization of denatured RNA and
small DNA fragments transferred to nitrocellulose. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205.
54. Voicule N. (1997) Biologia Molecular a celulei. BIC ALL,
Bucureti,
55. Watson, J.D. et al. (1987) The Molecular Biology of the
Gene, 4th edn (Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA).
56. Watson, J.D. et al. (1992) Recombinant DNA, 2nd edn
(Freeman, New York).
57. West, S.C. (1992) Enzymes and molecular mechanisms of
genetic recombination. Annu. Rev. Biochem. 61, 603-640.
58. Zavel, L. & Reinberg, D. (1992) Advances in RNA
polymerase II transcription. Curr. Opinion Cell Biol. 4, 488-
495.
59. . . (1994) .
.
234