PROTEINE

TIPURI DE PROTEINE, CLASIFICARE

STRUCTURA PROTEINELOR
TEHNICI UTILIZATE N ANALIZA
PROTEINELOR - PROTEOMIC
Analiza prin tehnici cromatografice
Analiza prin tehnici electroforetice
SECVENIALIZAREA PROTEINELOR

PEPTIDE (2-20 AA)

PROTIDE
PROTEINE propriu-zise
holoproteine - alctuite
numai din aminoacizi
heteroproteine conin o
component proteic (AA) i
o component prostetic
2

Funcii:
- rol structural (colagenul, keratina, elastina)
- rol de transport (hemoglobina, albumina)
- rol contractil (actina, miozina)
- rol de aprare a organismului (imunoglobulinele
serice, factorii de coagulare ai sngelui trombina i
fibrinogenul)
- rol hormonal (hormonii cu structur derivat de la
aminoacizi, hormonii peptidici i cei polipeptidici)
- biocatalizatori enzime

Holoproteine
globulare
Albumine
Globuline
Histone
Protamine
Prolamine
Gluteline

Holoproteine
fibrilare

Keratinele
Colagenul
Elastina
Fibrinogenul
Miozina si actina
Fibroina

 Albumine - precipita in prezenta sarurilor

concentrate si coaguleaza la temperaturi ridicate
serumalbumine (serul sanguin)
proteina monomerica cu masa moleculara ~ 66.500 kDa
- are rolul de a transporta molecule cu solubilitate scazuta
(acizi grasi liberi, anumiti hormoni, bilirubina, etc.)
- rol in mentinerea presiunii osmotice a sangelui
lactalbumina (din lapte)
proteina sintetizata de glanda mamara (sub controlul
prolactinei)
- masa moleculara ~ 13.500 kDa
- componenta a sistemului enzimatic lactaz-sintetaza
mioalbumina (din muchi)
ovalbumina (albuul de ou)
5

 Globuline
- proteine prezente in serul sanguin
- in functie de mobilitatea electroforetica
(1 si 2), si globuline
- globulinele si sunt sintetizate in ficat
- globulinele sunt sintetizate de catre limfocite

1 globuline:
- 1 - antitripsina - reprezinta aproximativ 70 %
- 1 - antichimotripsina
- - lipoproteine
- 1 - glicoproteina acida
- proteina de legare a tiroxinei

2 globuline:
- 2 - macroglobulina - reprezinta 30 - 50 %
- haptoglobina - reprezinta 30 %
- ceruloplasmina
- alte enzime

-globuline:
- transferina - 60 %
- chemotripsina - 30 %
- fractiuni ale sistemului complement
- fibrinogen
- beta lipoproteine
- beta 2 - microglobulina
- transcobalamina
- proteina C reactiva
Gamaglobulinele
- sunt reprezentate de imunoglobuline, produse de plasmocite, care au rol de
anticorpi: imunoglobulinele A, G, M, D, E.
8

 Histone
-proteine bazice (aprox. 30% din totalul de
aminoacizi = arginina si lizina)
-mase moleculare - 11.000 si 21.000 kDa
-sunt prezente in cromatina celulelor eucariote in
forma asociata cu AND
-5 tipuri diferite> H1, H2A, H2B, H3 si H4
9

Proteine fibrilare

Keratine
-proteine majore din par, unghii, coarne, copite, etc.
-formate din unitati numite protofibrile (diametrul 20)
prin asocierea a 8 protofibrile se formeaza microfibrile
(diametrul 80) care prin asociere formeaza
macrofibrile (diametrul 2000)
-stabilitatea si rigiditatea structurii este data de legaturile
disulfidice S-S- formate intre resturi de cisteina
10

 Colagen
-proteina cea mai abundenta 25% din totalul
proteinelor din organism
-componenta majora a matricei extracelulare
-prezent in piele, oase, tendoane, cartilagii, artere,
mischi, etc.
-in forma cristalina apare in cornee
-contine 35% glicocol, 11% alanina, 21% prolina si
hidroxiprolina
-La nivelul oaselor apare in asociere cu hidroxiapatita
Ca5(PO4)3OH
11

 Elastina
-proteina prezenta in peretii vaselor sanguine, in plamani,
ligamente, piele, etc.
-masa moleculara ~ 64.000 66.000 kDa
-contine glicocol 33% si proportii mai ridicate de alanina, valina,
prolina
-poate fi hidrolizata sub actiunea elastazei, enzima produsa de
neutrofile

Miozina si actina
-Miozina = proteina majora din muschii striati ( M= 200 kDa)
-Actina = proteina majora din filamentele subtiri
-Asociere actina - miozina
12

HETEROPROTEIDE
Clasificare in functie de natura chimica a
gruparii prostetice:
metaloproteide
fosfoproteide
glicoproteide
lipoproteide
cromoproteide
nucleoproteide

13

Metaloproteide
Ca2+, Mg2+, Fe2+/3+, Cu1+/2+, Zn2+, Mn2+
Cu rol de transport
Transferina transporta Fe
Ceruloplasmina transporta Cu
Calmodulina Ca
Hemoglobina Oxigen, CO2, Fe
Cu rol de rezerva
Feritina depozit de Fe 3+ ficat si splina
Hemosiderina ficat
Ovotransferina rezerva de Fe 3+ in ou
Lactotransferina - rezerva de Fe 3+ in lapte
Cu rol functional metaloenzime

14

Fosfoproteide
componenta

prostetica consta in resturi fosfat

legate esteric la grupari OH (dinSer sau Tre)
Cazeinele

80 % din proteinele din lapte

- Proteine complete - conin toti AA eseniali
- NU coaguleaz la nclzire
- precipit n mediu acid - paracazeinat de Ca
Ovovitelinele
Fosfovitelinele glbenuul de ou
15

O
CH2

CH
N
H

O-

O-

Ca2+

C
O

Phosphate group esterified at a serine residue

16

Glicoproteide
Grupare prostetica rest glucidic, mai frecvent
o oligoglucida, O sau N-glicozidic
Cu rol structural:
Intra in alcatuirea matricii extracelulare si tesutului
conjunctiv: proteoglicanii sau mucoproteinele, sialoproteinele
Glicophorina (eritrocite)
Avidina din albuul de ou leag biotina
Peptidoglicanii peretelui celulelor bacteriene mureina
Cu rol de aparare (anticorpi): imunoglobulinele G, A, M, D, E
17

CH3

CH2OH
O

CH

CO

CH

Polypeptide chain
NH

OH
NH C CH3
O

-D-N-acetylgalactosamine linked to a threonine residue by

O-glycosidic linkage

18

Lipoproteide
asociaii complexe de proteine cu lipide
simple, complexe, colesterol liber i
colesterol esterificat

Lipoproteine de transport:
Chilomicroni (Volum , densitate )
vLDL (Very Low Density Lipoproteins)
LDL
HDL
Lipoproteine de membran - Biomembrane
19

Lipo-

Dimension

Type of

Prote-

Phospho

Choleste-

Triacyl-

protein

(nm)

apo-lipo-

in

lipids

rol

glycerols

protein

(% )

(% )

(% )

(% )

90

10

19

19

50

20

24

45

10

50

30

18

Chylomicrons

VLDL

100-1000

AI,

B,

CI,

CII,

CIII, E

30-70

AI,

B,

CI,

CII,

CIII, E
LDL

15-25

HDL

7,5-10

B
AI, AII,
D, E

20

21

Cromoproteide

Carotenoproteine (carotenoide)
crustacyanin

astaxanthine

linckiacyanin

22

 Rodopsina (11-cis-retinal)

23

 Hemoproteine

24

STRUCTURA
PROTEINELOR

25

Structura primara a proteinelor

= catena polipeptidica a proteinelor
R1
CH
NH

NH
C
O

CH

R3

CH
NH

R2

Capat aminoterminal

Numrul aminoacizilor
Tipul aminoacizilor
Proporia aminoacizilor
Secvena (ordinea) aminoacizilor
Poziia legturilor disulfidice

O
NH
C
O

C
CH
R4
Capat carboxiterminal

26

Structura secundar a proteinelor

structura de tip -helix
foaie pliata paralala si antiparalela
O

N
H

H
N

N
H

N
H

H
N

H
N

C
O

O
C

R
O

O
O

H
N
C

N
R

C
C

N
H

H
N

H
N

H
N
C

N
H

H
N

N
H

27

28

 Modelul de tip colagen

29

Structura teriar

Descrie modul n care catenele polipeptidice

caracterizate prin structura secundara interacioneaz
prin resturile R ale AA, pentru a da o structur
tridimensional
Catena polipeptidic sufer plieri i nfurri spontane
Interactiuni hidrofobe si Van der Waals: Leu, Ileu, Ala, Val, Tri
Legaturi de hidrogen: Tir-His, Ser-Asp sau Glu
Legaturi ionice: Glu-Arg sau Lis
30

Structura cuaternar
Consta n asocierea a doua sau mai multe catene
polipeptidice, numite monomeri (protomeri)
Monomerii pot fi identici sau diferii
In funcie de numarul de monomeri: dimeri,
trimeri, tetrameri, etc.
Intre monomeri se stabilesc diferite tipuri de
interaciuni chimice

Structura cuaternar
a hemoglobinei

31

1. Extracia proteinelor din materiale biologice

2. Determinarea concentraiei proteinelor
3. Tehnici de separare i purificare a proteinelor:
- Cromatografie
- Electroforez
4. Determinarea structurii proteinelor purificate
32

EXTRACIA PROTEINELOR
DIN MATERIALE BIOLOGICE
- cantitatea de esut disponibil
- cantitatea de proteine prezente n esut
- solubilitatea proteinelor
- prezena unor electrolii
- prezena unor solveni organici
- pH-ul
- localizarea intracelular a proteinelor
- stabilitatea proteinelor extrase

33

 localizarea intracelular a proteinelor

citoplasma
- Celule animale - suspendarea celulelor ntr-o
soluie hipotonic liz osmotic
- Celule vegetale LIZOZIME - enzime care
degradeaz chimic membranele celulare
componente ale formaiunilor subcelulare
(membrane sau mitocondrii) CENTRIFUGARE
DIFERENIAT
34

Celulele suspendate sunt centrifugate la viteze potrivite, alese

astfel nct s putem separa uor componentele mai dense

35

 stabilitatea proteinelor extrase

PROTEAZE
-pH ales astfel nct s inactiveze enzima dar s
nu produc degradri ale proteinei de interes
- utilizarea unor inhibitori enzimatici specifici
(anumii ageni chimici) care s nu interacioneze
i cu proteina analizat

36

DETERMINAREA
CONCENTRAIEI PROTEINELOR
metode fotometrice
Determinarea absorbiei la 280nm
Metoda biuretului
Metoda Lowry
Metoda Blue Coomassie
metode / teste imunochimice
37

triptofanul
tirozina
Determinarea absorbiei la 280nm
fenilalanina
cisteina
- absorbia de numrul moleculelor de triptofan.
- o soluie ce conine 1 mg de proteine / ml absorbtie 0,5 i 2,0
Avantaje:
- o bun sensibilitate (50 100 micrograme)
- este o metod simpl i uor de realizat
- nu este o metod distructiv
Dezavantaje:
- contaminai acizii nucleici ( 254 nm)
1941 - Warburg i Christian - determinarea absorbiei la dou
lung de und diferite 280nm pentru proteine i 260 nm pentru
acizii nucleici
mg proteine / ml = 1,55 x A280 0,76 x A260
- contaminai
sol.tampon i detergenii utilizarea probei n alb
38

39

 Metoda biuretului
O C

CH R

R HC N

N CO

OC N
R HC

Cu

N CH R
CO

Cornall - 1949

2 Na+

max = 560 nm

Avantaje:
- este o metod simpl i rapid
- sensibilitate medie ( 1 20 mg)
Dezavantaje:
- sensibil la prezena unor contaminani cum sunt peptidele,
glicerol sau tampon TRIS
40

 Metoda Lowry
1951
combinaie ntre reacia biuretului i reac. Folin-Ciocltu
se bazeaz pe proprietatara tirozinei i a triptofanului de a
reactiona cu fodsfomolibdatul i fosfotungstat cu formarea
unui complex colorat n albastru
Dezavantaje:
sensibil la numeroase substane interferente cum ar fi
anumite peptide i aminoacizi, zaharoza, glicerol, derivai
de mercaptan, EDTA i numeroi detergeni.

41

 Metoda Blue Coomassie

1976 Bradfort
proprietatea colorantului Blue Coomassie de a se absoarbe la
suprafaa proteinelor, ntr-un mediu acid se modifica culoarea
de la maro la albastru
Avantaje:
- o bun sensibilitate (2 5 g)
- este o metod simpl i uor de realizat
- rezistent la prezena contaminanilor

42

 teste imunochimice

tehnica ELISA

43

TEHNICI CROMATOGRAFICE
UTILIZATE N ANALIZA PROTEINELOR
1. Cromatografia pe coloan:
- prin schimb de ioni
- gel-filtrare (excluziune molecular)
- de afinitate
2. Cromatografia pe hrtie

44

CROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB DE IONI

DEAE cellulose [dimethylaminoethyl cellulose] (+)

45

CM-cellulose [carboxymethyl cellulose] (-)

Denumirea fazei
Dowex 1
Dowex 50
DEAE celuloza
ECTEOLA celuloza
CM celuloza
DEAE Sephadex
CM Sephadex

Natura chimic
Polistiren bazic
Polistiren acid
Bazic
Bazic
Acid
Dextran gel bazic
Dextran gel acid

Gruparea ionizat
-CH2-N+(CH3)3
- SO3H
Dietilaminoetil
Amine
Carboximetil
Dietilaminoetil
Carboximetil

46

CROMATOGRAFIA PRIN EXCLUZIUNE

MOLECULAR (GEL- FILTRARE)

47

NUME

TIP

DIMENSIUNE
(kD)

Sephadex G-10
Sephadex G-25
Sephadex G-50
Sephadex G-100

Dextran
Dextran
Dextran
Dextran

0,05-0,7
1-5
1-30
4-150

Bio-Gel P-2
Bio-Gel P-10
Bio-Gel P-100
Bio-Gel P-300

Poliacrilamid
Poliacrilamid
Poliacrilamid
Poliacrilamid

0,1-1,8
1,5-20
5-100
60-400

Sepharose B6
Sepharose B2

Agaroz
Agaroz

10-4000
70-40000

48

DIALIZA

49

CROMATOGRAFIA DE AFINITATE

50

51

CROMATOGRAFIA PE HRTIE

The paper is suspended in a

container with a shallow
layer of a suitable solvent or
mixture of solvents in it. It
is important that the solvent
level is below the line with
the spots on it.

As the solvent slowly travels

up the paper, the different
components of the ink
mixtures travel at different
rates and the mixtures are
separated into different
coloured spots.

The distance travelled relative to the

solvent is called the Rf value. For each
compound it can be worked out using the
formula:
53

CROMATOGRAFIA PE HRTIE
BIDIMENSIONAL

54

ELECTROFOREZA
electroforez n mediu liber
migrarea liber a speciilor ionice ntr-o soluie
tampon de pH corespunztor.
electroforez n mediu stabilizant - medii suport
inerte (hrtia de filtru, acetatul de celuloz,
Sephadexul, etc)
monodimensional - sistem orizontal sau vertical
active, care interacioneaz
cu particulele
bidimensional
ncrcate (gelul de agar, de amidon sau de
poliacrilamid)
55

ELECTROFOREZA PE HRTIE

56

ELECTROFOREZA PE GEL DE POLIACRILAMID

O

H2C
CH

NH2

CH3

CH3

H3C

Acrilamida

(CH2)2

Tetrametilenetilendiamina (TEME
O

O
N
H

N
H

N,N-metilen-bis-acrilamida

57

CH3

58

Electroforez nedenaturant (PAGE)

- se separ proteinele native n funcie de raportul ntre sarcina
electric i masa lor molecular
-proteinele i pstreaz integritatea
Electroforez denaturant (SDS-PAGE)
- detergent ionic (ncrcat negativ) SDS sodiu dodecil sulfat
- Probele de analizat - SDS i 2-mercaptoetanol. Detergentul
determin ruperea legturilor ntre diferite proteine i
interaciunile lipide-proteine i se leag la moleculele de
proteine. Sub aciunea 2-mercaptoetanolului are loc ruperea
legturilor disulfifice inter- i intramoleculare din structura
proteinelor, separndu-se astfel subunitile oligoproteinelor.

59

60

61

62

63

64

Coloratia cu Blue Coomassie

Coloratia cu argint

65

Focalizarea izoelectric
Dac un amestec de proteine este supus electroforezei ntr-o matrice care
are un gradient de pH si creste ncet pH de la anod la catod, fiecare
protein va migra pn la punctul n care pH-ul este egal cu punctul
izoelectric:

Electroforez bidimensionala (electroforez 2D)

69

ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICE

PE GEL DE AGAROZ

70

DBA2/J C57BL/6

C3H/He

PRM/Alf

Dozare
proteine

lapte degresat

Bradford
NanoDrop

RP - HPLC

SDS-PAGE
separare benzi

SDS-PAGE

gel 17 cm

hidroliza cu tripsina

Voyager Spec #1 MC[BP = 842.5, 27761]

2.8E+4

Ech 2 - 02/03/06

90

spectrometrie de masa

80
70

% Intensity

mini gel

842.5089

100

60
1798.8404
50
40

1769.8639
832.3306

30

1045.5722
876.3139

Baza de date

20
703.9699
10 700.2688
709.4210
0
700.0

892.2810
906.5003
883.0575
1057.5994
879.5673

1814.8273
1785.8511

1243.5654
1259.5615
1400.7700
1260.2

2205.0472

1802.8537
1609.8208

2008.9554
1820.4

2212.1087
2380.6

Mass (m/z)

2808.2661
2940.8

71

3501.0

B6 J8

lapte degresat
+ solutie de clarifiere
(0.3% DTT, uree 8M)

B6 J8

lapte degresat
+ solutie de clarefiere
(3% DTT, uree 8M)

72

3
4

7
5
6

175
83
62
47.5

32.5

25

16.5

6.5

73

Score

M (Da) / pI
observs

123

20062.1/4.84

1.44e+009
285

M (Da)
thorique

Protin

17700

K caseine

76724.3/6.94
1437.0/4.83

12442

Serotransferrin
WAP

6.23e+016
9.96e+007

68693.0/5.75
35602.5/5.88

65892
34042

Serum albumine
s1 casein

1.16e+003

21100.7/6.20

19446

casein

195e+004

25337.5/5.82

23779

caseine

15300

caseine

13999

lactalbumine

PWK

ST, WAP

3
4 SA, s1

8
5

6
5

34
7

B6
175

83

3
ST

62

7
ST

SA

47.5

s1
32.5

s1

K
WAP

25

16.5

6.5

74

SA

WAP

B6

PRM

75

Profilul proteic al laptelui normal si mamitic

N1

M11 N2

M12 N3

M13 N4

M14 M15

Profilul proteic al laptelui normal si mamitic

N1

N2

N3

N4

N5

St

M1 M1

M3

M4

Lactoferina

BSA
Ig

-caz
-caz
-caz

A
-lac
-lac

N
120

M
500

N
200

M
N
1000 125

M
N
750 150

M
750

M
1000

NCS x 10-3

Gel lactoser - mamitic

pH = 3

pH = 10

BSA

Imunoglobuline cu caten lung

s2-cazeine

-cazeina +
s1-cazeina

-cazeina

Imunoglobuline cu caten scurt

-lactoglobulina
-lactalbumina

Gel lactoser - normal

pH = 3

pH = 10

BSA

Imunoglobuline cu caten lung

s2-cazeine

-cazeina +
s1-cazeina

-cazeina

Imunoglobuline cu caten scurt

-lactoglobulina
-lactalbumina

Gel lactoser - normal

Gel lactoser - mamitic

C1

C1
A

A
C2

C2

Determinarea structurii
proteinelor

determinarea secvenei de aminoacizi ce alctuiesc

catena polipeptidic
determinarea conformaiei pe care o adapt
proteina precum i interaciunile acesteia cu
molecule non-proteice

83

SECVENIALIZAREA
PROTEINELOR
Determinarea compoziiei generale n
aminoacizi
Analiza aminoacidului N-terminal
Analiza aminoacidului C-terminal
Determinarea secvenei de aminoacizi
- prin degradarea Edman
- prin spectrometrie de mas

84

Determinarea compoziiei
generale n aminoacizi
hidroliza total a unei cantiti cunoscute de
protein
Hidroliz chimic - HCl 6M, 100-110C, 24 de
ore
separarea aminoacizilor rezultai prin hidroliz
cromatografie prin schimb de ioni sau de
absorbie

85

determinarea cantitativ a aminoacizilor separai

fotometric, prin reacia cu ninhidrina
O

R
OH

OH

H2N

CH
H

OH
COOH

O
Ninhidrina

CO2 + NH3

C O
H

O
OH

OH

OH

O
Ninhidrina

O
+ NH3

OH

O
C

N
H

Compus colorat (max = 570nm)

86

Analiza aminoacidului
N-terminal
Etape de analiz:
reacia proteinei cu un reactiv ce prezint
selectivitate fa de aminoacidul N-terminal
reactivul Sanger (2,4-dinitrofluorobenzenul)
clorura de dansyl

hidroliza proteinei
determinarea produsului specific de reacie
prin cromatografie i comparare cu standarde
87

 reactivul Sanger (2,4-dinitrofluorobenzenul)

R1

NO 2
O 2N

H2 N

C
H

H
N

peptida

fluorodinitrobenzen

- HF

NO 2
O 2N

NH

R1
C
H

peptida

O
hidroliza acida
Derivat colorat al aminoacidului
ce poate fi separat si identificat
cromatografic

dezavantaj - reacia cu anumite grupri amino din structura

aminoacizilor aflai in catena polipeptidic

88

 reacia cu clorura de dansyl

N(CH3)2

R1
SO 2Cl
Clorura de dansyl

C
H

H2N

H
N

peptida

O
- HCl

N(CH3)2

R1
SO 2

N
H

C
H

H
N

peptida

O
Hidroliza acida
Derivat fluorescent al aminoacidulu
ce poate fi separat si
identificat cromatografic

89

Analiza aminoacidului C-terminal

hidroliza sub aciunea carboxipeptidazelor
analiza produilor de hidroliz la intervale regulate de timp
Catena
polipeptidic

Gli

Ser

Leu

Cantitatea
de AA

2
Timp de hidroliz

3
90

Determinarea secvenei de
aminoacizi prin degradare a Edman
scindarea legturilor disulfidice formate la nivelul catenelor
separarea i purificarea catenelor individuale
determinarea compoziiei generale n AA pentru fiecare caten
purificat
determinarea capetelor C i N terminale pentru fiecare caten
hidroliza catenelor n fragmente mai mici ( maxim 50 AA)
determinarea secvenei specifice fiecrui fragment
reconstituirea proteinei plecnd de la fiecare fragment
secvenializat

91

 Mecanismul
O

R1
N

H2N

C
H

C
O

Fenil-izotiocianat

H
N

H
C

R2

capat N-terminal
etapa 1

R1

HN

C
H

O
C

O
Fenil-tiocarbamoil derivat

H
N

H
C

R2

92

O
Fenil-tiocarbamoil derivat

+ 2H

etapa 2
O

S
C

CH

H
C

R2
Catena polipeptidica mai scurta cu un aminoac

R1

H3N

etapa 3

NH

CH
R1

derivat fenil-tiohidantoin-aminoacid
93

94

Dezavantaje:
- se lucreaz pe catene polipeptidice mici
- randament de 98% este obinut pentru peptide
de maxim 30 aminoacizi
Avantaje:
- se lucreaz pe cantiti foarte mici de peptide
( 10 - 100 picomoli)
- procesul poate fi complet automatizat
95

Determinarea secvenei proteinelor

prin spectrometrie de mas
digestia proteinelor sub aciunea unor endopeptidaze
separarea produilor de hidroliz prin cromatografie
de nalt performan (HPLC) cuplat la spectrometrie
de mas
spectrul obinut pentru fiecare fragment polipeptidic
separat este analizat de un computer i identificat prin
comparaie cu spectre de peptide reunite ntr-o baz
de date
Procesul se repet apoi, cu alte enzime digestive
(peptidaze) rezultatele obinute corelate secvenei
finale
96