PROTEINE

● TIPURI DE PROTEINE, CLASIFICARE

● STRUCTURA PROTEINELOR
● TEHNICI UTILIZATE ÎN ANALIZA
PROTEINELOR - PROTEOMICĂ
Analiza prin tehnici cromatografice
Analiza prin tehnici electroforetice
● SECVENŢIALIZAREA PROTEINELOR

1
 PEPTIDE (2-20 AA)

PROTIDE

PROTEINE propriu-zise
holoproteine - alcătuite
numai din aminoacizi
heteroproteine – conţin o
componentă proteică (AA) şi
o componentă prostetică
2
►Funcţii:
- rol structural (colagenul, keratina, elastina)
- rol de transport (hemoglobina, albumina)
- rol contractil (actina, miozina)
- rol de apărare a organismului (imunoglobulinele
serice, factorii de coagulare ai sângelui – trombina şi
fibrinogenul)
- rol hormonal (hormonii cu structură derivată de la
aminoacizi, hormonii peptidici şi cei polipeptidici)
- biocatalizatori –enzime
3
Holoproteine
globulare Holoproteine
 Albumine fibrilare
 Globuline
 Keratinele
 Histone
 Colagenul
 Protamine
 Elastina
 Prolamine
 Fibrinogenul
 Gluteline
 Miozina si actina
 Fibroina
4
● Albumine - precipita in prezenta sarurilor
concentrate si coaguleaza la temperaturi ridicate

▪ serumalbumine (serul sanguin)

– proteina monomerica cu masa moleculara ~ 66.500 kDa
- are rolul de a transporta molecule cu solubilitate scazuta
(acizi grasi liberi, anumiti hormoni, bilirubina, etc.)
- rol in mentinerea presiunii osmotice a sangelui
▪ lactalbumina (din lapte)
– proteina sintetizata de glanda mamara (sub controlul
prolactinei)
- masa moleculara ~ 13.500 kDa
- componenta a sistemului enzimatic “lactaz-sintetaza”
▪ mioalbumina (din muşchi)
▪ ovalbumina (albuşul de ou)
5
● Globuline

- proteine prezente in serul sanguin

- in functie de mobilitatea electroforetica
a (1 si 2), b si g globuline
- globulinele a si b sunt sintetizate in ficat
- globulinele g sunt sintetizate de catre limfocite

6
a1 globuline:

- a 1 - antitripsina - reprezinta aproximativ 70 %

- a 1 - antichimotripsina
- a - lipoproteine
- a 1 - glicoproteina acida
- proteina de legare a tiroxinei

a 2 globuline:

- a 2 - macroglobulina - reprezinta 30 - 50 %
- haptoglobina - reprezinta 30 %
- ceruloplasmina
- alte enzime

7
b-globuline:

- transferina - 60 %
- chemotripsina - 30 %
- fractiuni ale sistemului complement
- fibrinogen
- beta lipoproteine
- beta 2 - microglobulina
- transcobalamina
- proteina C reactiva
Gamaglobulinele

- sunt reprezentate de imunoglobuline, produse de plasmocite, care au rol de

anticorpi: imunoglobulinele A, G, M, D, E.
8
● Histone
- proteine bazice (aprox. 30% din totalul de
aminoacizi = arginina si lizina)
- mase moleculare - 11.000 si 21.000 kDa
- sunt prezente in cromatina celulelor eucariote in
forma asociata cu AND
- 5 tipuri diferite> H1, H2A, H2B, H3 si H4 9
Proteine fibrilare

● Keratine
- proteine majore din par, unghii, coarne, copite, etc.
- formate din unitati numite protofibrile (diametrul 20Å)
→ prin asocierea a 8 protofibrile se formeaza
microfibrile (diametrul 80Å) → care prin asociere
formeaza macrofibrile (diametrul 2000Å)
- stabilitatea si rigiditatea structurii este data de
legaturile disulfidice –S-S- formate intre resturi de
cisteina 10
● Colagen
- proteina cea mai abundenta – 25% din totalul
proteinelor din organism
- componenta majora a matricei extracelulare
- prezent in piele, oase, tendoane, cartilagii, artere,
mischi, etc.
- in forma cristalina apare in cornee
- contine 35% glicocol, 11% alanina, 21% prolina si
hidroxiprolina
- La nivelul oaselor apare in asociere cu hidroxiapatita
Ca5(PO4)3OH
11
● Elastina
- proteina prezenta in peretii vaselor sanguine, in plamani,
ligamente, piele, etc.
- masa moleculara ~ 64.000 – 66.000 kDa
- contine glicocol 33% si proportii mai ridicate de alanina, valina,
prolina
- poate fi hidrolizata sub actiunea elastazei, enzima produsa de
neutrofile

● Miozina si actina
- Miozina = proteina majora din muschii striati ( M= 200 kDa)
- Actina = proteina majora din filamentele subtiri
- Asociere actina - miozina
12
 HETEROPROTEIDE
Clasificare in functie de natura chimica a
gruparii prostetice:

 metaloproteide
 fosfoproteide
 glicoproteide
 lipoproteide
 cromoproteide
 nucleoproteide
13
 Metaloproteide
Ca2+, Mg2+, Fe2+/3+, Cu1+/2+, Zn2+, Mn2+
Cu rol de transport
►Transferina – transporta Fe
► Ceruloplasmina – transporta Cu
► Calmodulina – Ca
► Hemoglobina – Oxigen, CO2, Fe

Cu rol de rezerva
► Feritina – depozit de Fe 3+ ficat si splina
► Hemosiderina – ficat
► Ovotransferina – rezerva de Fe 3+ in ou
► Lactotransferina - rezerva de Fe 3+ in lapte

Cu rol functional ► metaloenzime 14

 Fosfoproteide
componenta prostetica consta in resturi fosfat
legate esteric la grupari OH (dinSer sau Tre)
 Cazeinele
– 80 % din proteinele din lapte
- Proteine complete - conţin toti AA esenţiali
- NU coagulează la încălzire
- precipită în mediu acid - paracazeinat de Ca
 Ovovitelinele
 Fosfovitelinele –gălbenuşul de ou
15
 O
CH2 O P O-

O- Ca2+
CH
N C
H
O
Phosphate group esterified at a serine residue
16
 Glicoproteide
Grupare prostetica – rest glucidic, mai frecvent
o oligoglucida, O sau N-glicozidic

Cu rol structural:
 Intra in alcatuirea matricii extracelulare si tesutului
conjunctiv: proteoglicanii sau mucoproteinele, sialoproteinele
 Glicophorina (eritrocite)
 Avidina din albuşul de ou – leagă biotina
 Peptidoglicanii peretelui celulelor bacteriene – mureina

Cu rol de aparare (anticorpi): imunoglobulinele G, A, M, D, E

17
 

CH3
CH2OH CO
O O O CH CH Polypeptide chain
OH NH

NH C CH3
O

ß -D-N-acetylgalactosamine linked to a threonine residue by

O-glycosidic linkage

18
 Lipoproteide
 asociaţii complexe de proteine cu lipide
simple, complexe, colesterol liber şi
colesterol esterificat

► Lipoproteine de transport:
Chilomicroni (Volum ↑, densitate ↓)
vLDL (Very Low Density Lipoproteins)
LDL
HDL
► Lipoproteine de membrană - Biomembrane
19
 Lipo- Dimension Type of Prote- Phospho Choleste- Triacyl-
protein (nm) apo-lipo- in lipids rol glycerols
protein (% ) (% ) (% ) (% )
AI, B,
Chylo-
100-1000 CI, CII, 1 4 6 90
microns
CIII, E
AI, B,
VLDL 30-70 CI, CII, 10 19 19 50
CIII, E
LDL 15-25 B 20 24 45 10
AI, AII,
HDL 7,5-10 50 30 18 5
D, E

20
21
 Cromoproteide
 Carotenoproteine (carotenoide)

crustacyanin

astaxanthine

linckiacyanin 22
 Rodopsina (11-cis-retinal)

23
■ Hemoproteine

24
STRUCTURA
PROTEINELOR

25
Structura primara a proteinelor
= catena polipeptidica a proteinelor
R1 R3
O O
CH NH C CH NH C
NH C CH NH C CH
O O
R2 R4

Capat amino- Capat carboxi-

terminal terminal

 Numărul aminoacizilor
 Tipul aminoacizilor
 Proporţia aminoacizilor
 Secvenţa (ordinea) aminoacizilor
 Poziţia legăturilor disulfidice 26
► Structura primară nu oferă informaţii (sau prea puține)
privind forma moleculei din spațiu, o formă adesea necesară
pentru activitatea moleculei
► Lanțul polipeptidic adoptă o structură sau o conformație
spațială care este unică și constantă pentru o anumită proteină
► Structurile secundare, terțiare și cuaternare fac posibilă
definirea conformației

- Proteinele adoptă, în condiții bine definite (pH, forţa ionică,

temperatură), o singură conformație

- Această conformație, obținută în general în condițiile biosintezei,

este denumită conformație nativă

27
 Structura secundară a proteinelor
● structura de tip α-helix

● foaie pliata – paralelă şi antiparalelă

O O O
R O R R
H R H H
H N C
N C N C N C

N C N C N C N C
H H
H R H
O R R O R
O O

O O O
O R R
R R H H
H H C N C N
N C N C

N C C N C N
N C H
H R
R R R O
O O O

28
● α helix = este o structură stabilă care are 3,6
resturi de aminoacizi per spiră

= stabilizată prin legăturile de

hidrogen între H grupării -NH și O
grupării -C = O

= o structură compactă și foarte

stabilă datorită numărului mare de
legături de hidrogen orientate paralel
cu axa helixului

29
● foaie pliata – paralelă şi antiparalelă

O O
O R R
R O H H
H R N C
H N C
N C N C
N C N C
N C N C H
H R H
H O O R
O R R
O

O O
R R
O O H H
R R C N
H H C N
N C N C
C N C N
N C H
N C R R
H O
R R
O
O O

= catenele paralele sau antiparalele sunt unite/stabilizate prin

legături de hidrogen care pot fi distruse prin încălzire într-un mediu
apos
- Adesea, desfacerea legăturilor de hidrogen ale unei α-helix prin
încălzire conduce la formarea structurii de foaie pliată
Structurile secundare sunt deseori schematizate prin forme
cilindrice pentru helix și prin planuri de săgeți pentru structura
de foi pliate

31
32
● Modelul de tip colagen

33
Structura terţiară

 Descrie modul în care catenele polipeptidice

caracterizate prin structura secundara interacţionează
prin resturile R ale AA, pentru a da o structură
tridimensională
 Catena polipeptidică suferă plieri şi înfăşurări spontane
 Interactiuni hidrofobe si Van der Waals: Leu, Ileu, Ala, Val, Tri
 Legaturi de hidrogen: Tir-His, Ser-Asp sau Glu
 Legaturi ionice: Glu-Arg sau Lis 34
► Tipuri de structuri terțiare în funcție de predominanța și
distribuția în moleculă a structurilor secundare de tip α-helix sau
foi pliate

Structură de tip α Structură de tip ß Structură α / ß

35
 Structura cuaternară
 Consta în asocierea a doua sau mai multe catene
polipeptidice, numite monomeri (protomeri)
 Monomerii pot fi identici sau diferiţi
 In funcţie de numarul de monomeri: dimeri,
trimeri, tetrameri, etc.
 Intre monomeri se stabilesc diferite tipuri de
interacţiuni chimice

Structura cuaternară
a hemoglobinei 36
Aranjamentul monomerilor implică sisteme simetrice în jurul unei
axe sau mai complexe cu mai multe axe de simetrie

37
 PROTEOM
 este setul de proteine produse de un genom (~ 60.000
de proteine la om).
 rezultă din traducerea genomului în proteine în
condiții exact definite.
 variază în funcție de tipul de celule, activitățile
acestora spcifice și mediul .
 mărimea proteomului este mai mare decât cea a
genomului, deoarece o genă poate codifica mai multe
proteine prin luarea în considerare a modificărilor
introduse prin maturarea ARNm și a modificărilor
post-translaționale (glicozilare, fosforilare, ...)

38
 PROTEOM
 Proteomul este dinamic,
genomul este constant
 Proteome este studiul unui
grup de proteine la un moment
dat
PROTEOMICA = tehnicile utilizate în
analiza proteinelor
1. Extracţia proteinelor din materiale biologice
2. Determinarea concentraţiei proteinelor
3. Tehnici de separare şi purificare a proteinelor:
- cromatografie
- electroforeza
4. Determinarea structurii proteinelor purificate
Aplicatii ale proteomicii
 Înțeleagerea proceselor celulare normale și a proceselor responsabile
aparitia sau evolutia unor boli (cancer, boli neurodegenerative, etc.)
 Identificarea de noi proteine
 Identificarea proteinelor indicator bolii (bio-markeri)
40
 EXTRACŢIA PROTEINELOR
DIN MATERIALE BIOLOGICE
- cantitatea de ţesut disponibil
- cantitatea de proteine prezente în ţesut
- solubilitatea proteinelor
- prezenţa unor electroliţi
- prezenţa unor solvenţi organici
- pH-ul
- localizarea intracelulară a proteinelor
- stabilitatea proteinelor extrase

41
 ► localizarea intracelulară a proteinelor

■ citoplasma
- Celule animale - suspendarea celulelor într-o
soluţie hipotonică liză osmotică
- Celule vegetale – LIZOZIME - enzime care
degradează chimic membranele celulare

■ componente ale formaţiunilor subcelulare

(membrane sau mitocondrii) CENTRIFUGARE
DIFERENŢIATĂ
42
Celulele suspendate sunt centrifugate la viteze potrivite, alese
astfel încât să putem separa uşor componentele mai dense

43
► stabilitatea proteinelor extrase

→ PROTEAZE
- pH ales astfel încât să inactiveze enzima dar să
nu producă degradări ale proteinei de interes
- utilizarea unor inhibitori enzimatici specifici
(anumiţi agenţi chimici) care să nu interacţioneze
şi cu proteina analizată

44
 DETERMINAREA
CONCENTRAŢIEI PROTEINELOR

metode fotometrice
Determinarea absorbţiei la 280nm
Metoda biuretului
Metoda Lowry
Metoda Blue Coomassie

 metode / teste imunochimice

45
● Determinarea absorbţiei la 280nm

- absorbţia ↔ de numărul moleculelor de triptofan.

- o soluţie ce conţine 1 mg de proteine / ml ↔ absorbtie 0,5 şi 2,0

46
● Determinarea absorbţiei la 280nm

Avantaje:
- o bună sensibilitate (50 – 100 micrograme)
- este o metodă simplă şi uşor de realizat
- nu este o metodă distructivă

Dezavantaje:
- contaminaţi → acizii nucleici ( 254 nm)
1941 - Warburg şi Christian - determinarea absorbţiei la două
lung de undă diferite – 280nm pentru proteine şi 260 nm pentru
acizii nucleici
mg proteine / ml = 1,55 x A280 – 0,76 x A260
- contaminaţi → sol.tampon şi detergenţii – utilizarea probei în alb

47
48
● Metoda biuretului Cornall - 1949

O C CH R
R HC N N CO
Cu 2 Na+
OC N N CH R
R HC CO
max = 560 nm

Avantaje:
- este o metodă simplă şi rapidă
- sensibilitate medie ( 1 – 20 mg)
Dezavantaje:
- sensibilă la prezenţa unor contaminanţi cum sunt peptidele,
glicerol sau tampon TRIS
49
● Metoda Lowry
● 1951
● combinaţie între reacţia biuretului şi reac. Folin-Ciocîltău
● se bazează pe proprietatara tirozinei şi a triptofanului de a
reactiona cu fodsfomolibdatul şi fosfotungstat cu formarea
unui complex colorat în albastru

Dezavantaje:
sensibilă la numeroase substanţe interferente cum ar fi
anumite peptide şi aminoacizi, zaharoza, glicerol, derivaţi
de mercaptan, EDTA şi numeroşi detergenţi.

50
● Metoda Blue Coomassie

● 1976 – Bradfort
● proprietatea colorantului Blue Coomassie de a se absoarbe la
suprafaţa proteinelor, într-un mediu acid  se modifica culoarea
de la maro la albastru
● bazată pe schimbarea culorii reactivului Blue Coomassie după
legarea la aminoacizii bazici (arginină, histidină, lizină) și resturile
hidrofobe ale aminoacizilor prezenți în proteine

Avantaje:
- o bună sensibilitate (2 – 5 mg)
- este o metodă simplă şi uşor de realizat
- rezistentă la prezenţa contaminanţilor
51
 teste imunochimice

tehnica ELISA

52
 TEHNICI CROMATOGRAFICE
UTILIZATE ÎN ANALIZA PROTEINELOR

 Soluția proteică dizolvată în faza mobilă este trecută printr-

o coloană constând dintr-un suport solid poros: faza
staționară
 Interacțiunile diferitelor proteine cu faza staționară
încetinesc mai mult sau mai puțin migrarea lor prin suport

1. Cromatografia pe coloană:
- prin schimb de ioni
- gel-filtrare (excluziune moleculară)
- de afinitate
2. Cromatografia pe hârtie
53
 CROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB DE IONI
- ionii legați la un suport insolubil și inert din punct de vedere
chimic sunt înlocuiți în mod rersibil cu ionii în soluție

Principiu:
o proteină – sarcină pozitivă la pH < pI
– sarcină nnegativă la pH > pI
● Prin urmare, poate fi reținută pe un schimbător de cationi
sau un schimbător de anioni, după caz
● Aceasta poate fi apoi eluată prin trecerea unui tampon care
conține sare în cantități crescânde
schimbător de anioni= gel care poartă încărcături fixe pozitive
schimbător de cationi = gel care poartă încărcături fixe negative
 CROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB DE IONI

DEAE cellulose [dimethylaminoethyl cellulose] (+)

CM-cellulose [carboxymethyl cellulose] (-)

55
 Denumirea fazei Natura chimică Gruparea ionizată
Dowex 1 Polistiren bazic -CH2-N+(CH3)3
Dowex 50 Polistiren acid - SO3H
DEAE celuloza Bazic Dietilaminoetil
ECTEOLA celuloza Bazic Amine
CM celuloza Acid Carboximetil
DEAE Sephadex Dextran – gel bazic Dietilaminoetil
CM Sephadex Dextran – gel acid Carboximetil

56
 CROMATOGRAFIA PRIN EXCLUZIUNE
MOLECULARĂ (GEL- FILTRARE)

= este o metodă de separare a proteinelor bazată pe filtrarea

moleculelor de dimensiuni diferite prin intermediul unui gel poros
- molecule mari (cu un diametru mai mare decât cea a porilor)
sunt excluse și sunt eluate primele
- moleculele mici și medii sunt eluate mai târziu, deoarece sunt
incluse în gel (migrarea lor este încetinită)
- proteinele sunt eluate în ordinea inversă a masei lor moleculare

57
 CROMATOGRAFIA PRIN EXCLUZIUNE
MOLECULARĂ (GEL- FILTRARE)

58
 DIMENSIUNE
NUME TIP
(kD)

Sephadex G-10 Dextran 0,05-0,7

Sephadex G-25 Dextran 1-5
Sephadex G-50 Dextran 1-30
Sephadex G-100 Dextran 4-150

Bio-Gel P-2 Poliacrilamidă 0,1-1,8

Bio-Gel P-10 Poliacrilamidă 1,5-20
Bio-Gel P-100 Poliacrilamidă 5-100
Bio-Gel P-300 Poliacrilamidă 60-400

Sepharose B6 Agaroză 10-4000

Sepharose B2 Agaroză 70-40000

59
 DIALIZA

60
 CROMATOGRAFIA DE AFINITATE

În cromatografie de afinitate, un ligand care se leagă în mod

specific la proteină este atașat covalent la o matrice inertă,
poroasă

Atunci când o soluție proteică trece prin faza staţionară,

proteina de interes se leagă de ligandul imobilizat, în
timp ce celelate proteine sunt eliminate din coloană.
Proteina dorită poate fi recuperată, în formă foarte pură,
prin modificarea condițiilor de eluare astfel încât
proteina să se desprindă de matricea cromatografică.
 CROMATOGRAFIA DE AFINITATE

.
ligand atașat
la matrice

Proteina care are

afinitate pentru
ligandul

Alte proteine
din amestec

62
Alte tehnici cromatografice

a. Cromatografia cu fază inversă (RPC)

În proteinele denaturate, catenele laterale nepolare sunt expuse
la solvent. Prin urmare, proteinele pot forma interacțiuni
hidrofobe cu grupuri nepolare atașate la o matrice

Proteinele sunt eluate printr-o fază mobilă care conține o

concentrație ridicată de solvent organic cum ar fi acetonitrilul
Separarea aminoacizilor prin
cromatografie
(pe hârtie sau pe strat
subţire)

64
 CROMATOGRAFIA PE HÂRTIE

Hârtia este suspendată

într-un recipient cu un strat
superficial dintr-un solvent
sau amestec de solvenți
adecvat. Este important ca
nivelul de solvent să fie sub
linia de start.
Odată cu trecerea lentă a
solventului pe hârtie, diferitele
componente ale amestecurilor
se deplasează la viteze diferite
și stfel amestecurile se separă.
66
 CROMATOGRAFIA PE HÂRTIE
BIDIMENSIONALĂ

67
 ELECTROFOREZA

► electroforeză în mediu liber

migrarea liberă a speciilor ionice într-o soluţie
tampon de pH corespunzător.
► electroforeză în mediu stabilizant - medii suport
● inerte (hârtia de filtru, acetatul de celuloză,
Sephadexul, etc)
monodimensională - sistem orizontal sau vertical
● active, care interacţionează cu particulele
bidimensională
încărcate (gelul de agar, de amidon sau de
poliacrilamidă)
68
 ELECTROFOREZA PE HÂRTIE

69
 ELECTROFOREZA PE GEL DE POLIACRILAMIDĂ
H2C O CH3 CH3
CH N
N
NH2 H3C (CH2)2 CH3
Acrilamida Tetrametilenetilendiamina (TEMED)

O O

N N
H H
N,N-metilen-bis-acrilamida

70
71
Electroforeză nedenaturantă (PAGE)
- se separă proteinele native în funcţie de raportul între sarcina
electrică şi masa lor moleculară
-proteinele îşi păstrează integritatea

Electroforeză denaturantă (SDS-PAGE)

- detergent ionic (încărcat negativ) SDS – sodiu dodecil sulfat
- Probele de analizat - SDS şi 2-mercaptoetanol. Detergentul
determină ruperea legăturilor între diferite proteine şi
interacţiunile lipide-proteine şi se leagă la moleculele de
proteine. Sub acţiunea 2-mercaptoetanolului are loc ruperea
legăturilor disulfifice inter- şi intramoleculare din structura
proteinelor, separându-se astfel subunităţile oligoproteinelor.

72
73
74
75
76
77
 Coloratia cu Blue Coomassie

Coloratia cu argint

78
Focalizarea izoelectrică
Dacă un amestec de proteine ​este supus electroforezei într-o matrice care
are un gradient de pH si creste încet pH de la anod la catod, fiecare
proteină va migra până la punctul în care pH-ul este egal cu punctul
izoelectric:
Electroforeză bidimensionala (electroforeză 2D)
82
Aplicaţii proteomică

83
 ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICE
PE GEL DE AGAROZĂ

84
 Agence Universitaire de la Francophonie
University Agency of Francophonie

Caractérisation des activités protéiques du lait

impliquées dans l’allongement intestinal
des souris PRM/Alf

Caracterizarea proteinelor din lapte implicate în

alungirea intestinală a șoarecilor PRM / Alf
  Linia de şoareci de laborator PRM/Alf se caracterizează printr-o
alungire intestinală (armonioasă și omogenă în toate părțile
intestinului), ce nu determină nici un defect digestiv funcțional
în şoarecii PRM/Alf.
 Lungimea intestinelor - PMR/Alf = 75 cm,
comparativ cu 55 cm = liniile de şoareci de de
laborator clasice

► factori genetici
 efect matern puternic → se dezvoltă de-a
lungul perioadei de lactație, înainte de
înțărcare.
 efectul matern reprezintă aproximativ
40% din diferența de lungime dintre
PRM/Alf şi alte sușe (linii) consangvinizate
de șoareci

Aubin-Houzelstein et al., Genetic interaction between a

maternal factor and the zygotic genome controls the intestine length in PRM/Alf mice. Physiol Genomics 2003; 16: 82-89.
 OBIECTIVE
► Compararea profilului proteic PRM / Alf si B6 (C57BL/6J)

► Compararea profilului proteic intre linia B6 si linii cu fond

genetic diferit - PWK si SEG
Liniile de laborator - subspecii Mus musculus : Mus m. domesticus, Mus
m. musculus, M. m.castaneus si hibridul M. m. molossinus
● C57BL/6J – aparţine speciei Mus musculus

► C57BL/6J si PWK/Pas
● aceste doua linii aparţin subspeciei Mus musculus şi s-au
dezvoltat separat începând acum un milion de ani
► C57BL/6J si SEGPas
● SEG/Pas a derivat din Mus spretus (acum aproximativ
2.5 milioane ani)
88
 175
SDS-PAGE
Gel 17 cm 83 Fatty acid synthase

62
Serotransferrine
Serotransferrine
47.5 Serum albumine

as1 caseine
as1 caseine
32.5 as1 caseine

Immunoglobulins
25
b caseine

g caseine

16.5 e caseine

WAP
6.5 a lactalbumine
B6 PRM PWK SEG
91
♦ GELS 2D, 24cm, pH 3−5.6 NL

B6-J4 PRM-J4

as1 caseine

b caseine

WAP

PWK-J4 a lactalbumine
SEG-J4
Profilul proteinelor din lapte de la vaci sănătoase
și vaci cu mamite subclinice

94
 10
15
20
25
30
35

0
5
AU

0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
17.010

16
0.278

95
17.360
0.107 cas K glycosyl.

Name

18
UV-2
19.235

Area Percent
3.611

Retention Time

1a
Proteine totale
19.750

EXP.2_1S
20.0450.408 cas K var A
1.281
20.593
3.783

20
21.532
21.947 0.287
cas K var B

1b
0.172
22.552 cas As2 var A
0.627

22
23.498
3.794

1c
cas As2 var B
24.230
1.210

2a
Proteine lactoser
25.040

24
0.012

26.355
0.051

2b
27.145

26
0.085
27.932
28.293 0.195
28.552 0.040

Cazeine
0.118

28
29.345
0.688
30.178
2.163
30.760 cas As1 15.824
31.063

30
4.647

Minutes
3

32
Normal
Mamitic

34
36.425
1.205

36
37.477
1.456
38.185 13.291
cas B

38
39.370
1.024

4a
B-lacto B-C 40.325 15.872

40
41.210
A-lactal 1.121
41.845
Protein

Casein b
Casein b

1.530
A
B-lacto 42.382
Casein as1

4b
42.793 22.7872.054

5
Casein K var. B
Casein K var. A

42
a - Lactalbumin
b - Lactoglobulin
Casein as2 var. A
Casein as2 var. A

43.563
0.095
Casein K glycosylated

44.242
6

0.117

44
45.492
0.069

46
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55

AU
6
5
3
1c

4a
2a
1a

4b
2b
1b
The symbol on the chromatograms
 AU

0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
17.010 0.55

16
17.360 0.278
0.107 cas K glycosyl.
Name

18
UV-2

19.235
Area Percent

3.611
Retention Time

1a
19.750
EXP.2_1S

20.0450.408 cas K var A

1.281
20.593
3.783

20
21.532
21.947 0.287
cas K var B
0.172
22.552 cas As2 var A
0.627

22
23.498
3.794

1c
cas As2 var B
24.230
1.210

2a
25.040

24
0.012

26.355
0.051

2b
27.145

26
1. caz K 1b 2+3 caz a
0.085
27.932
28.293 0.195
28.552 0.040
0.118

28
29.345
0.688
30.178
2.163
30.760 cas As1 15.824
31.063

30
4.647

Minutes
3

32
34

Mamite
36.425
1.205
AU
36

37.477
16.245 1.456
16.385 0.127
16.630 0.080 38.185 13.291

0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55

16.963 0.166
4. caz b

16
17.162 0.483 cas B
17.422 0.437 cas K glycosyl.
17.675 0.645
38

18.040 0.047 39.370

0.095 1.024
Name
6. b – Lactoglob.

4a

B-lacto B-C 40.325 15.872

18
UV-2

19.208
Area Percent

5.557
Retention Time
EXP.2_5

19.950 cas K var A

40

0.941 41.210
A-lactal 1.121
20.550
2.237 41.845

20
21.195 1.530
A
B-lacto 42.382
21.588 1.685
4b

1. caz K
0.831
21.947 cas K var B 42.793 22.7872.054
5

2.541
42

22.485
cas As2 var A
4.015 43.563
0.095

22
23.533 44.242
6

3.401 0.117
24.065cas As2 var B
24.507 2.614
44

2.520
25.040 45.492

24
2.385 0.069

26.327
26.672 0.902
46

0.711

26
27.182
0.927
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55

27.635
27.900 3.810
28.282 2.825
28.530
0.972 AU
2.090
2+3 caz a

28
29.302
3.300
29.935
2.713
30.707 cas As1 11.549

30
Minutes
32.907
32
0.207
33.625
0.755
34

36.588
3.160
36
Normal

37.908 11.629
cas B
38

39.135
cas B 0.389
40.072
6.352
B-lacto B-C
4. caz b

40

41.310
A-lactal 2.646
42.052
0.580 B-lacto A
42.497
6. b – Lactoglob.

0.941 42.863 12.662

42
44

45.392
0.073
46
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55

AU
Profilul proteic al laptelui – normal si mamitic

N1 M11 N2 M12 N3 6 M13 N4 M14 M15

 Profilul proteic al laptelui – normal si mamitic

N1 N2 N3 N4 N5 St M1 M1 M3 M4

Lactoferina
B BSA
Ig

a-caz
b-caz
k-caz
A
b-lac

a-lac
 N M N M N M N M M NCS x 10-3
120 500 200 1000 125 750 150 750 1000

c a d b

Streptococcus agalactiae Staphylococcus intermedius

Gel lactoser - mamitic
pH = 3 pH = 10

BSA

Imunoglobuline cu catenă lungă

as2-cazeine

b-cazeina +
as1-cazeina k-cazeina
Imunoglobuline cu catenă scurtă

b-lactoglobulina

a-lactalbumina
Gel lactoser - normal
pH = 3 pH = 10

BSA

Imunoglobuline cu catenă lungă

as2-cazeine

b-cazeina + Imunoglobuline cu catenă scurtă

as1-cazeina k-cazeina

b-lactoglobulina

a-lactalbumina
Gel lactoser - mamitic Gel lactoser - normal

B B

C1 C1
A
A

C2 C2
 Determinarea structurii
proteinelor
 determinarea secvenţei de aminoacizi ce alcătuiesc
catena polipeptidică
 determinarea conformaţiei pe care o adaptă
proteina precum şi interacţiunile acesteia cu
molecule non-proteice

103
 SECVENŢIALIZAREA
PROTEINELOR
 Determinarea compoziţiei generale în
aminoacizi
 Analiza aminoacidului N-terminal
 Analiza aminoacidului C-terminal
 Determinarea secvenţei de aminoacizi
- prin degradarea Edman
- prin spectrometrie de masă

104
 Determinarea compoziţiei
generale în aminoacizi
 hidroliza totală a unei cantităţi cunoscute de
proteină
 Hidroliză chimică - HCl 6M, 100-110ºC, 24 de ore
 anumiți aminoacizi (cum ar fi serină, treonină, tirozină, triptofan,
acid glutamic și cisteină) sunt degradaţi.
 Se procesează alte probe ale aceleiași proteine, care sunt încălzite în
timp diferit, apoi se analizează fiecare probă de hidroliză separat.
 agenți preventivi pentru a reduce degradarea acestor aminoacizi. De
exemplu, fenolul poate proteja tirozina și degradarea triptofanului
produs de HCI
105
 Determinarea compoziţiei
generale în aminoacizi

 determinarea cantitativă a aminoacizilor separaţi

 separarea aminoacizilor rezultaţi prin hidroliză
 cromatografie prin schimb de ioni sau de
absorbţie

106
determinarea cantitativă a aminoacizilor separaţi
 fotometric, prin reacţia cu ninhidrina
O O
R R
OH OH
+ H2N CH + C O
OH H
COOH H
O CO2 + NH3 O
Ninhidrina

O O
OH OH
OH H
O O
Ninhidrina

+ NH3

O OH

C N C
H
O O
Compus colorat ( max = 570nm)
107
 Analiza aminoacidului
N-terminal
Etape de analiză:
► reacţia proteinei cu un reactiv ce prezintă
selectivitate faţă de aminoacidul N-terminal
reactivul Sanger (2,4-dinitrofluorobenzenul)
clorura de dansyl
► hidroliza proteinei
► determinarea produsului specific de reacţie
prin cromatografie şi comparare cu standarde

108
 ► reactivul Sanger (2,4-dinitrofluorobenzenul)
R1
NO 2
H
C N
O 2N F H2N H C peptida

fluorodinitrobenzen O

- HF

R1
NO2
C peptida
O 2N NH H C

hidroliza acida

Derivat colorat al aminoacidului

ce poate fi separat si identificat
cromatografic
dezavantaj - reacţia cu anumite grupări amino din structura
aminoacizilor aflaţi in catena polipeptidică 109
► reacţia cu clorura de dansyl
N(CH3)2

R1
H
C N
SO 2Cl H2N H C peptida
Clorura de dansyl
O

- HCl

N(CH3)2

R1
H
C N
SO 2 N H C peptida
H
O
Hidroliza acida

Derivat fluorescent al aminoacidului

ce poate fi separat si
identificat cromatografic 110
Analiza aminoacidului C-terminal
► hidroliza sub acţiunea carboxipeptidazelor
►analiza produşilor de hidroliză la intervale regulate de timp

Catena
Gli Ser Leu
polipeptidică
Cantitatea
de AA

1 2 3
Timp de hidroliză
111
 Determinarea secvenţei de
aminoacizi prin degradare a Edman
► scindarea legăturilor disulfidice formate la nivelul catenelor
► separarea şi purificarea catenelor individuale
► determinarea compoziţiei generale în AA pentru fiecare catenă
purificată
► determinarea capetelor C şi N terminale pentru fiecare catenă
► hidroliza catenelor în fragmente mai mici ( maxim 50 AA)
► determinarea secvenţei specifice fiecărui fragment
► reconstituirea proteinei plecând de la fiecare fragment
secvenţializat

112
► Mecanismul
R1 O
H
C N H C
N C S H2N H C C

O R2
Fenil-izotiocianat capat N-terminal

etapa 1

H S
O
N C R1
H
C N H C
HN H C C

O R2
Fenil-tiocarbamoil derivat

+ 2H+ etapa 2 113

H
 C N H C
HN H C C

O R2
Fenil-tiocarbamoil derivat

+ 2H+ etapa 2
H

N C S O
C O +
+ H3N H C
N C
CH
R2
R1 Catena polipeptidica mai scurta cu un aminoacid

etapa 3
H+

N C S

C NH
O CH
derivat fenil-tiohidantoin-aminoacid
R1
114
115
Dezavantaje:
- se lucrează pe catene polipeptidice mici
- randament de 98% este obţinut pentru peptide
de maxim 30 aminoacizi

Avantaje:
- se lucrează pe cantităţi foarte mici de peptide
( 10 - 100 picomoli)
- procesul poate fi complet automatizat

116
Determinarea secvenţei proteinelor
prin spectrometrie de masă
■ digestia proteinelor sub acţiunea unor endopeptidaze
■ separarea produşilor de hidroliză prin cromatografie
de înaltă performanţă (HPLC) cuplată la spectrometrie
de masă
■ spectrul obţinut pentru fiecare fragment polipeptidic
separat este analizat de un computer şi identificat prin
comparaţie cu spectre de peptide reunite într-o bază de
date
■ Procesul se repetă apoi, cu alte enzime digestive
(peptidaze) rezultatele obţinute corelate  secvenţei
finale
117