PROTEINE PLASMATICE IMPLICATE ÎN LEGAREA

SUBSTANŢELOR CHIMICO - FARMACEUTICE

FLORENTINA CUTAŞ, G.L.RADU, DANOIU
CLAUDIU
, Departamentul de Biochimie Analitică, Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare pentru Ştiinţe
Biologice, Bucureşti

Proteine plasmatice – prezentare generală

Proteinele plasmatice sunt un amestec heterogen de aproape 100

componente cu proprietăţi fizico – chimice şi funcţii diferite. Unele dintre ele sunt
haloproteine, iar altele complexe proteice cu: i) glucidele (glicoproteine) cca 80%
dintre proteinele plasmatice; ii) lipidele (lipoproteine); iii) metalele (metalo-
proteine). Greutăţile moleculare ale acestora sunt cuprinse in intervalul 60.000 -
1.300.000 Da. Într-un volum total de sânge de 5L, cu un hematocrit de 40%, cei
trei litri de plasmă conţin 180-240 g proteine, corespunzând la 6-8 g proteine la 100
ml plasmă. Proteinele plasmatice se află într-un schimb metabolic continuu cu
proteinele tisulare, faptul fiind dovedit prin metode radioizotopice. Ele sunt
prezente în spaţiul extravascular într-o concentraţie de 1g/100ml, fiind in echilibru
dinamic cu cele intravasculare. In spaţiul extracelular se găsesc în total 400 g
proteine [1]. Ele sunt biosintetizate preponderent în ficat şi în ţesutul SRH
(limfocite, plasmocite). Informaţia genetică pentru biosinteza lor este, ca de altfel
pentru toate proteinele, conţinută în AND (acid deoxoribonucleic) din nucleul
celulelor formatoare, ce codifică fiecare aminoacid prin tripletul corespunzător lui.
Cu cele patru baze pirimidinice şi purinice (adenină, guanină, timină şi citozină) se
formează 43 adică 64 de tripleţi diferiţi.
Procesul de biosinteză se desfăşoară în modul prezentat în Figura 1.

Figura 1. Biosinteza proteinelor

77
 Florentina Cutaş, G.L.Radu, Danoiu Claudiu

Gradul înalt de complexitate şi, respectiv, heterogenitatea proteinelor

plasmetice au putut fi evidenţiate datorită aplicării unor metode de fracţionare
moderne cu o înaltă putere de rezoluţie (electroforeza în diferite variante,
cromatografia, ultracentrifugarea, metode enzimatice etc). Principalele proteine
plasmatice sunt prezentate în Tabelul 1.
Funcţiile importante pe care proteinele plasmatice le au de îndeplinit sunt
următoarele:
- menţin volumul normal şi presiunea osmotică a sângelui, precum şi
schimburile dintre capilare şi ţesuturi; albuminele sunt preponderent
răspunzătoare de această funcţie;
- transportă hormoni, metale, lipide, vitamine, pigmenţi, coloranţi, medicamente,
dispunând de o suprafaţă totală de circa 700.000 mm2;
- participă la procesele de apărare specifică şi nespecifică a organismului prin :
imunogobuline, sistemul complement, properdina, lizozim, transferine, precum
şi fenomenele de coagulare şi fibrinoliză;
- participă la menţinerea echilibrului acido-bazic al sângelui, ca sistem tampon,
datorită caracterului lor amfoter;
- influenţează vâscozitatea şi microcirculaţia, contribuind la realizarea unui
mediu protector pentru eritrocite şi favorizându-le mobilitatea;
- reprezintă o rezervă proteică importantă în situaţiile în care aportul proteic
exogen scade.
Proteinele plasmatice care sunt cel mai implicate în procesul reversibil al
legării substanţelor chimico- farmaceutice sunt albumina şi 1- acid glicoproteina.
Cu toate că albumina este cea mai abundentă proteină sanguină, multe
medicamente prezintă o legare semnificativă şi de alte proteine plasmatice.
Alte componente sanguine cum ar fi eritrocitele, lipoproteinele şi
globulinele sunt de asemenea capabile de interacţii medicament - proteină.
Metodele de dozare, separare şi caracterizare ale proteinelor plasmatice
sunt extrem de variate, acestea bazându-se pe proprietăţile fizico-chimice
caracteristice acestui grup de compuşi: solubilitate, masă moleculară, sarcină
electrică, reactivitate chimică.

1. Albumina

1.1. Structura albuminei

Albumina este o componentă majoră a proteinelor plasmatice,
reprezentând procentual 55-60% din totalul lor. Este distribuită atât intravascular
cât şi extravascular. Nivelul albuminei din spaţiul extravascular comparat cu cel al
albuminei din spaţiul intravascular putând fi utilizat ca indicator pentru statutul
fiziologic a unui pacient.
78
 Proteine plasmatice implicate în legarea substanţelor chimico - farmaceutice

Tabelul 1. Principalele proteine plasmatice clasificate după criteriul electroforetic.

Grupe de % din Masa

Mobilitatea
proteine Tipuri de proteine proteina moleculară
electroforetică
totală (x103)
< 0,5 61
- Pre-albumina Pre-albumina 9,0
55,0 69
- Albumina Albumina 6,1
< 0,5 44
1-globuline - Acid glicoproteic 5,1
(orosomucoid)
- Glicoproteine
5,0 54
- Inhibitorul tripsinei
45
- Lipoproteine
3 195

- 2-globuline - Ceruloplasmina < 0,5 4,6 151

- Glicoproteide 1,2 4,2
- Macroglobuline < 4,5 4,2 820
- Mucoproteide 0,5 4,9
- Plasminogen 4,7
143
- Haptoglobulina
85
- Globulina acceleratoare
4,7

- globuline - 1 – globulina 3 93

- Transferina < 6,5 3,3 90
- Globulina 2,9
antihemofilică 2,9 5000-
- Lipoproteine < 14 20000
- Fibrinogen 2,1 341
- 2 – globulina 3

-  - globuline < 17,2

- Izohemaglutinină 1,1 160
.

Nivelul său plasmatic normal este cuprins între 3,5 - 4,5 g/100 ml sânge ;
molecula are forma elipsoidală, greutatea moleculară de aproximativ 65000- 69000
Da ( masa moleculară relativă = 66500) timpul de înjumătăţire T/2 de 17-27 zile şi
punctul izoelectric la pH = 4,9. Serumalbumina este sintetizată în ficat ; producţia
zilnică fiind de 120 – 150 mg/kilocorp. Albumina serică este expresia unei singure
gene care include 15 exoni şi 14 introni, genă care se întinde pe o distanţă de 16,
961 perechi de baze pe cromozomul IV [3,4]. Această genă responsabilă de sinteza
albuminei este codominantă având două gene alele; de asemenea, este înalt
polimorfică, variantele genetice ale albuminei detectate electroforetic
(aloalbumine) demonstrând o frecvenţă de expresie de 1:1000 sau 1:10000. Au fost
detectate mai mult de 100 de variante ale albuminei serice, fiind caracterizate

79
 Florentina Cutaş, G.L.Radu, Danoiu Claudiu

structural aproximativ 30 şi fiind identificate 26 tipuri de proteine diferite din punct

de vedere a unor proprietăţi [5]. Dintre toate variantele de albumină serică care sunt
rezultatul modificării unui singur aminoacid din structura genei există o singură
excepţie şi anume o mutantă italiană la care este modificat aminoacidul COOH-
terminal [6]. Această aloalbumină a fost denumită Veneţia şi a fost descoperită la
un număr mare de familii italiene. Această albumină posedă un lanţ peptidic de 578
aminoacizi şi are ca aminoacid terminal acidul glutamic. Sinteza aloalbuminei
Veneţia este rezultatul deleţiei exonului 14 şi translaţia acestuia la primul codon
terminal al exonului 15 care normal nu codifică proteina. Proteina mai posedă un
rest terminal de arginină care este succeptibil la digestia carboxipeptidazelor.
Existenţa acestor modificări la capătul COOH- terminal au demonstrat că aceste
modificări sunt critice pentru stabilitatea albuminei.
Datele structurale privind structura albuminei au arătat că ea are cel mai
lung lanţ peptidic cunoscut, fiind alcătuit din peste 585 de resturi de aminoacizi [7-
9]. Dintre aceştia predomină : acidul glutamic (83 resturi), acidul aspartic (55
resturi), lizina (59 resturi), valina (46 resturi), leucina (73 resturi). Aminoacidul N-
terminal este acidul aspartic, iar acidul COOH- terminal este leucina. Aşa cum a
fost prezentat mai sus în cazul aloalbuminei Veneţia modificările care apar la
capătul COOH- terminal sunt foarte importante pentru stabilirea structurală a
albuminei [10]. Realizându-se profilul hidrofilicităţii [11] s-a demonstrat că
regiunea cuprinsă între aminoacidul 577 şi capătul COOH- terminal prezintă un
înalt grad de hidrofobicitate. În albuminele normale regiunea COOH- terminală
este sub formă de helix, care se extinde spre resturile COOH- terminale. Prezenţa
Pro - 572 (prolină-572) poate fi responsabilă de ruperea acestui helix sau de
inducerea unei tensiuni la acest nivel [12]. Studiile efectuate au arătat că regiunea
507-585 reprezintă situsul primar de legare pentru lanţurile de acizi graşi [13].
Albumina serică este alcătuită dintr-o serie de nouă ochiuri de reţea închise
de punţi disulfidice (Figura 2) [14] , posedă şi un grup – tiol liber ce permite
formarea complexelor cu metalele ca Hg, Zn, Ag, Cu. Ochiurile de reţea se
asociază în trei domenii similare, cele duble fiind conectate între ele într-o catenă
polipeptidică unică.
Studiile de cristalografie cu raze X [15,16] efectuate pentru albumină au
relevat prezenţa a trei domenii omoloage I, II şi III asamblate într-o moleculă
organizată , în care fiecare domeniu este compus din două subdomenii A şi B.
Majoritatea moleculei este sub formă de - helix (aproximativ 67 %), restul
lanţului polipeptidic fiind sub formă răsucită reprezentând regiunile flexibile care
unesc cele trei domenii.
Determinarea structurii secundare a unor forme izomere de albumină serică
umană prin analize în IR (infrarosu) cu transformantă Fourrier [17], printr-un
procedeu particular de deconvoluţie bazat pe algoritmul minimalizării gradientului
conjugat au permis determinarea unor structuri secundare de tipul : 
pliată, răsucită şi dezordonată. Rezultatele obţinute pentru albumină
serică şi alte proteine (α- chimotripsină, citocrom c) au fost comparate cu
rezultatele obţinute prin alte metode (cristalografie cu raze X şi alte determinări
de spectroscopie vibraţională).
80
Proteine plasmatice implicate în legarea substanţelor chimico - farmaceutice

Figura 2. Structura albuminei serice

81
 Florentina Cutaş, G.L.Radu, Danoiu Claudiu

Valorile obţinute pentru albumina serică au fost: 2,5 % 1,16 %

pliată şi 5,1 % pentru alte structuri (β-răsucită şi foi dezordonate).
Cele 17 punţi disulfidice generează ochiurile duble rigide [18]. Această
structură a albuminei serice a reprezentat un bun model pentru identificarea
benzilor cu activitate optică Raman (ROA) în studiul proteinelor mari, cu structură
de helix şi cu ochiuri de reţea.
Datorită unei asemenea construcţii spaţiale, albumina are o flexibilitate cu
totul remarcabilă. Au fost găsite analogii structurale între albumină şi
imunoglobulină IgG, dar şi cu mioglobina în special în secvenţa Arg- His –Pro
(arginină-histidină-prolină), găsită în ochiurile 3 şi 6 ale albuminei şi în helixul G
al mioglobinei [19].
Prin degradarea albuminei cu un extract de splină , s-au obţinut fragmente
peptidice dintre care s-a putut separa un fragment care nu precipită cu antialbumina
de iepure dar care inhibă parţial precipitarea antiserului de albumină. Degradarea
acestui segment inhibitor cu tripsină a avut ca rezultat obţinerea unui mic fragment
cu activitate imunologică “F1”. Acest fragment conţine patru lanţuri numite 
în funcţie de mobilitatea electroforetică a acestuia. Determinarea secvenţei de
aminoacizi ai fragmentului “F1” a făcut posibilă localizarea acestuia în molecula
de albumină. Astfel s-a arătat că fragmentul inhibitor este compus din ultimele 92
sau 89 de resturi de aminoacizi din structura albuminei, iar fragmentul F1 este
compus din două părţi ale capătului COOH- terminal legate printr-o punte
disulfurică.
Foarte importantă este omologia între ochiurile 4 şi 5 ale albuminei şi
1-feto–proteina (α1-globulina) produsă în cursul vieţii fetale, înaintea albuminei şi
în ficatul adult neoplazic ( hepatom primar).
Prin tratarea cu enzime proteolitice (tripsină, pepsină) a albuminei au fost
obţinute fragmente proteice de diverse mărimi care conţin cele 9 ochiuri ale
albuminei. Fragmentele îşi păstreză construcţia şi, în proporţie de 50% au o
structură Aceste experimente, pe lângă faptul că au confirmat
structura terţiară a albuminei, au evidenţiat faptul că distribuţia fragmentelor de
albumină obţinute prin digestie enzimatică este dependentă de pH şi mai puţin de
activitatea enzimatică a enzimelor proteolitice [19].

1.2. Proprietăţile albuminei

1.2.1. Echilibrul şi tranziţia neutro- bazică (N-B)
O proprietate foarte importantă a albuminei serice este tranziţia N-B
(neutră-bazică) [20]. În regiunea de pH 6-9 albumina serică trece de la o formă
neutră la o formă bazică. Această tranziţie poate fi reprezentată conform ecuaţiei:
NB + nH +
82
 Proteine plasmatice implicate în legarea substanţelor chimico - farmaceutice
Legarea multor medicamente la albumină depinde de stadiul echilibrului
N-B, de aici rezultând diferita afinitate a medicamentelor la albumină pentru
conformaţia N sau B. deoarece multe medicamente se leagă cu o afinitate înaltă
(K>105 M-1) fracţia de medicament nelegat din plasmă se modifică drastic atunci
când echilibrul N-B este alterat. Când albumina este în conformaţie B atunci ea are
legaţi câţiva protoni. Singurele resturi de aminoacizi care sunt capabile să elibereze
protoni când pH-ul creşte de la 6 la 9 sunt histidina prin grupările sale imidazol şi
resturile NH2 – terminale ale proteinei. Protonii implicaţi în tranziţia N- B provin
de la aceste resturi de aminoacizi. S-a demonstrat că ionul de Ca+2 prezintă o
influenţă particulară extrem de puternică asupra tranziţiei N-B. Acest efect al Ca+2
conduce în condiţii de pH constant, la o modificare în fracţie albuminică în
conformaţie N. Această modificare pare a fi rezultatul scăderii valorii pK a unor
resturi de histidină. Se presupune, pe baza unor modele de calcul că există 5
conformaţii de care se leagă resturile de histidină care trec prin modificări de pK
[21].
În scopul studierii mecanismului molecular al tranziţiei N-B a albuminei
serice s-a procedat la digestia enzimatică a proteinei cu pepsină şi tripsină. S-au
obţinut un fragment P46 care conţine aminoacizii 1-387 incluzând astfel domeniile
1 şi 2 din structura albuminei. Al doilea fragment obţinut, T45 corespunde lanţului
de aminoacizi cuprinşi între 198-585 sau domeniilor 2 şi 3 din structura albuminei.
Masa moleculară a celor două fragmente obţinute a fost de 45000 pentru T45
respectiv 46000 pentru P46. Măsurându-se adsorbanţa albuminei şi fragmentelor
P46 şi T45 la o concentraţie de 1% (V/V) într-o celulă cu l=1cm, pentru = 278
nm s-au obţinut valorile de 5,8 şi 6,0 pentru cele două fragmente respectiv 5,0
pentru albumină. Prin realizarea de titrări acido/ bazice se poate determina sarcina
netă a celor trei probe ea fiind dată de legarea protonilor. În Figura 3 sunt
prezentate curbele de titrare pentru albumină , şi cele două fragmente [22].
Distanţele dintre picurile diferitelor curbe de titrare au fost de 14,4 0,2
pentru albumina ; 12,9 0,3 pentru P46 respectiv 7,6 0,5 pentru T45. Valorile
au prezentat aceeaşi deviaţie standard pentru patru sau şase determinări. Din aceste
valori s-au putut calcula numărul de resturi histidinice titrabile (nHIS). Admiţând ca
pK a – ul grupării amino terminale este 8,0 numărul de resturi titrabile de histidină
sunt 13,4 pentru albumină respectiv11,9 şi 6,6 pentru fragmentele P46 şi T45.
Experimentele de rezonanţă magnetică nucleară de proton (1H
RMN) au demonstrat că în albumină , fragmentele P46 şi T45 conţin 16, 12 şi
respectiv 9 resturi de histidină. În Figura 4 este prezentată o reprezentare
schematică a structurii conform prezenţei resturilor de histidină.
Prin clivarea enzimatică a albuminei la diferite valori de pH s-a demonstrat
că regiunea COOH- terminală se depliază sau se separă de restul moleculei pe
parcursul tranziţiei N-B [23].

83
 Florentina Cutaş, G.L.Radu , Danoiu Claudiu

Figura 3. Curbele de
titrare pentru albumina
(A), fragmentul P46(B), şi
T45(C)

Figura 4.
Localizarea
resturilor de
histidină în
molecula
albuminei pe
baza datelor din
experimentele de
rezonanaţă
magnetică
nucleară de
proton (1H RMN)

84
 Proteine plasmatice implicate în legarea substanţelor chimico - farmaceutice
Concluzia determinărilor prin curbele de titrare este ca tranziţia N-B se
datorează prezenţei resturilor de histidină, la pH neutru proteina este în formă N, la
pH =8 predominând forma B.
Cercetările ulterioare au demonstrat că albumina prezintă mai multe stări în
funcţie de pH : forma normală N la pH neutru, forma bazică B la pH=8, forma “în
vârstă” ( aged form) care se dezvoltă în timp la pH=10 , forma rapidă de migrare F
care rezultă din forma N prin reducerea pH-lui la valoarea 4,3 şi forma extinsă E
rezultantă a conversiei formei F printr-o reducere a pH-lui la 2,7. Diagrama Ribbon
a structurii formelor N, F şi E obţinute prin experimente cu raze X este prezentată
în Figura 5.
Studiilespectrale
1H NMR ale regiunilor
alifatice şi aromatice au
relevat că stadiul F al
moleculelor de albumină are
caracteristicile unei “globule
fuzionate” în care se
păstrează structura secun-
dară dar un număr mare de
resturi hidrofobe sunt expuse
către solvent [24].
SpectreleRaman
obţinute pentru albumină
prin scăderea pH-lui de la 7
la 5 au arătat că variaţia de
pH nu a produs nici o
modificareînstructura
moleculei.
Activitateaoptică
Raman (ROA) obţinută
pentru întregul lanţ de
aminoacizi, a demonstrat
menţinerea structurii predo-
minante de S-a pus
în evidenţă existenţa mai
multor tipuri de 
Prin reducerea pH-Figura 5. Diagrama Ribbon a structurilor N, F
şi
lui la valoarea de 3,4 a fostE ale albuminei
obţinută forma F la care s-a
observat o reducere a structurii de cu 10%. Spectrele ROA, au demonstrat
că stadiul F reprezintă stadiul de mijloc a denaturării albuminei la starea de“globulă
fuzionată”. Trecerea de la stadiul N la F implică disocierea moleculei în două părţi

85
 Florentina Cutaş, G.L.Radu, Danoiu Claudiu

care, rămân conectate printr-un lung ochi de reţea. Studiile cu raze X au arătat
faptul că cele două subdomenii A şi B ale fiecărui domeniu (I, II, III) sunt legate
printr-o extensie flexibilă de polipeptid care implică resturile de aminoacizi
cuprinse între: Lys-106 (lizină) până la Glu-119 (acid glutamic); Glu-292 până la
Val-315 (valină); Glu – 492 până la Ala– 511 (alanină). Deoarece scindarea la
nivelul restului 306 are ca rezultat producerea a două fragmente de albumină,
ochiul de reţea care leagă cele două domenii în cazul formei F, pare să fie acelaşi
cu lanţul polipeptidic care conectează subdomeniile A şi B din domeniul II
(resturile cuprinse între 292 şi 315)
Pierderea intensităţii benzii ROA prin trecerea de la forma N la forma F a
fost asociată cu pierderea rigidităţii ochiului de reţea cuprins între resturile 292-
315, care conectează subdomeniile A şi B şi care are structura de Acelaşi
lucru a putut fi observat şi pentru ochiurile de reţea cuprinse între 106 şi 119; 492-
511 care conectează subdomeniile A şi B în domeniile I şi III.

1.2.2. Heterogenitatea structurală şi reactivitatea albuminei

Prin clivarea cu CNBr a albuminei umane s-a demonstrat că moleculele de
albumină sunt heterogene. A fost demonstrată astfel existenţa mercaptalbuminei şi
nonmercaptalbuminei [25]. Prin clivarea celei de a doua albumine cu CNBr rezultă
trei fragmente care au fost denumite A ,B şi C. Fragmentul A care corespunde la
aproximativ o jumătate din molecula albuminei a putut fi separat prin gel filtrare pe
Sephadex G- 100 de fragmentele B şi C care corespund fiecare unui sfert din
molecula albuminei, aceste fragmente fiind eluate împreună. Ulterior cele două
fragmente au fost separate prin cromatografie pe CM- celuloză.
Clivarea cu CNBr a mercaptoalbuminei are ca rezultat obţinerea a două
fragmente denumite A şi D. Studiile efectuate au arătat că fragmentul D este
asemănător lanţurilor B şi C datorită compoziţiei sale în aminoacizi care reprezintă
suma resturilor de aminoacizi aparţinând fragmentelor B şi C. Diferenţa constă
numai în prezenţa unui rest de triptofan. S-a observat că D prezintă doi aminoacizi
NH2–terminali şi anume alanina care corespunde cu aminoacidul terminal al
fragmentului B şi acidul aspartic care este unul din aminoacizii NH2- terminali a
fragmentelor A şi B.
Prin reducerea lui D au rezultat două lanţuri : unul mai mic, lanţul II care
este asemănător subfragmentului B- Ala şi C-Cys (cisteină) sunt legate de un lanţ
peptidic, lanţul I şi are ca rest C – terminal un rest de homoserină. Deoarece restul
NH2- terminal este alanina , fregmentul B- Ala urmează fragmentului C-Cys în
secvenţa albuminei umane aceste date fiind în concordanţă cu structura albuminei.
Existenţa fragmentului D demonstrează că restul de metionină existent la
capătul COOH- terminal al subfragmentului B- Ala, va fi în formă de sulfoxid
condiţii în care nu se mai poate realiza clivarea cu CNBr. Toate acestea au dus la
concluzia că moleculele de albumină umană care dau prin clivare fragmentul D nu
conţin metionină. Absenţa metioninei poate fi rezultatul unei deleţii sau substituţii.
86
 Proteine plasmatice implicate în legarea substanţelor chimico - farmaceutice
Datorită faptului că de exemplu 20 mg de fragment D poate fi preparat din 500 mg
albumina serică înseamnă că numai 8% din moleculele de albumină dau la clivare
fragmentul D.
Albumina serică prezintă posibilitatea adaptării conformaţiei astfel încât ea
poate lega numeroşi liganzi cum ar fi : bilirubina, acizii graşi, triptofanul şi diverse
medicamente [26-30]. Cercetările în domeniu au arătat că funcţia fiziologică a
albuminei nu depinde de interacţiile specifice ale albuminei ci de caracterul fizico-
chimic al acesteia.
În condiţii fiziologice glucoza, reacţionează neenzimatic cu o varietate de
proteine printre care şi albumina [31]. Această interacţie neenzimatică constituie o
sursă de heterogenitate pentru moleculele de albumină. S-a emis ipoteza că
glicolizarea neenzimatică a albuminei induce în proprietăţile fizice, chimice şi
biologice [32]. De exemplu, glicozilarea timpurie a albuminei produce modificarea
punctului izoelectric, aceasta are ca rezultat inducerea de modificări în conformaţia
moleculei [33]. Albumina serică glicozilată este catabolizată mai rapid şi se
acumulează mult mai rapid la nivelul ficatului decât cea nativă, observându-se şi o
acumulare a acesteia pe pereţii capilarelor. Această glicozilare neenzimatică reduce
numărul de legături ale albumineicu acizii graşi, bilirubina şi unele medicamente,
influenţând distribuţia şi eliminarea acestor compuşi precum şi a intensităţii
efectului farmacologic.
Determinarea procentului de albumină glicozilată depinde de tehnica
utilizată. Utilizarea tehnicii ELISA pentru aceste determinări a avut ca rezultat
valori scăzute (2,4 – 4,5 %), în timp ce metodele cromatografice cuplate cu
detectoare specifice au avut ca rezultat valori foarte mari (16,1- 39,9 %).
Principalul situs de glicozilare a albuminei este considerat a fi restul de
lizină din poziţia 525, 33 % din cantitatea de glucoză fiind legată covalent de acest
situs. Acest rest de lizină, este localizat în apropierea situsului de legare a multor
medicamente. Totuşi, dacă glicozilarea are loc numai la restul de lizină 525,
capacitatea de legare a medicamentelor de albumină nu este afectată.
Glicozilările timpurii ale albuminei au loc la resturile de lizină din poziţiile
199, 281 şi 439 care sunt considerate situsuri de legare a medicamentelor. Dacă
glicozilarea are loc mai târziu, modificările în capacitatea de legare nu mai au loc.
Acest lucru a fost demonstrat prin experienţe care au utilizat albumine umane cu
diferite grade de glicozilare. Formarea acestor albumine glicozilate poate creşte
hidrofobicitatea albuminei şi ca rezultat, compuşii hidrofobici se pot lega mult mai
bine.
Această proteină posedă o sarcină cationică netă datorită căreia atrage
rapid medicamentele acide, formând cu ele o legătură ionică. Datele experimentale
au arătat că cele trei domenii nu sunt identice din punct de vedere a capacităţii de
legare a unor liganzi. Abilitatea albuminei de a fluctua în soluţii apoase între forme
izomere pare să fie un avantaj permiţând adoptarea unei conformaţii cu afinitate
maximă pentru legarea liganzilor. O importanţă deosebită pentru procesul de legare

87
 Florentina Cutaş, G.L.Radu, Danoiu Claudiu

o are şi tranziţia N-B. Un ligand se poate lega la unul sau mai multe situsuri de
legare în funcţie şi de caracteristicile structurale şi fizico- chimice ale acestuia.
Albumina leagă de compuşii lipofilici prin forţe hidrofobice. În plus, anumite clase
de medicamente se asociază cu albumina la situsuri specifice de legare (Figura 6)
cum ar fi situsul de legare pentru acizii graşi cu o înaltă specificitate şi care este
localizat în subdomeniul 1. Situsul de legare pentru octanoat, triptofan, clorozepat,
tiroxină, p-iodobenzonat şi alţi compuşi cloridici este situat în subdomeniul 2 şi
este mai puţin specific. Situsul pentru legarea bilirubinei, Phenol Red, Bromphenol
Blue şi iopanoat este situat în subdomeniul 3, iar situsul de legare a ionilor metalici
cum ar fi Cu2+ , Ni2+ se află situat în subdomeniul 4. Situsul pentru legarea hemului
este situat în subdomeniul 5 al moleculei. Legarea medicamentelor la aceste
situsuri specifice este caracterizată în mod obişnuit printr-o asociere cu afinitate
mare şi poate fi saturată peste concentraţiile terapeutice de medicamente.
Mulţi compuşi se adsorb de asemenea la albumină într-o manieră
nespecifică, cu afinitate mică şi nesaturabilă. În mod sigur, medicamentele se pot
asocia atât la situsuri specifice de legare cât şi la situsuri nespecifice.

146
223

422
231

386
194
48 307

198

P44

Figura 6. Situsuri de legare ale albuminei

2. Acidul -1 glicoproteic (AAG)

Grupul glicoproteinelor reprezintă unicitate din punct de vedere structural

datorită prezenţei într-o singură moleculă a trei tipuri de funcţiuni : corpul peptidic,
lanţurile de glicani şi acidul sialic terminal al acestor lanţuri.
Dintre seromucoizi (fracţia globuline), cel mai important este
orozomucoidul (OMD) Winzer sau seromucoidul perclorosolubil sinonim cu 1
glicoproteina lui Schmid (AAG).
88
 Proteine plasmatice implicate în legarea substanţelor chimico - farmaceutice
Acidul glicoproteic este o globulină cu o greutate moleculară de
aproximativ 41000 Da, componenţa glucidică reprezentând 40% din greutatea
totală.
Nivelele plasmatice normale ale acidului AAG sunt de la 0,9 la 1,0 g/l.
După cum implică şi numele , AAG are o sarcină aninonică şi prin urmare această
proteină atrage moleculele bazice.
Biosinteza AAG are loc în celula hepatică dar ea presupune etape
suplimentare care ţin de structura caracteristică moleculei. Principalele etape sunt:
- biosinteza lanţului peptidic la nivel de ribozomi;
- formarea unui oligoglucid precursor (are loc la nivel de reticul
endoplasmic);
- transferul oligoglucidului pe proteina acceptoare (are loc la nivel de reticul
endoplasmic);
- prelucrarea oligoglucidului precursor din molecula glicoproteinei cu
formarea glicoproteinelor mature (are loc la nivel de aparat Golgi).

2.1. Heterogenitatea AAG

În serul uman au fost evidenţiate două tipuri de AAG F1 şi /sau S şi A care
sunt codificate de două gene diferite [34,35]. Aceste două tipuri diferă prin
structura lanţului peptidic iar concentraţia lor în plasmă variază în funcţie de
condiţia fiziologică a organismului. Prin combinarea a două tehnici electroforetice
s-au putut realiza curbele de titrare pentru cele trei variante de acid 1
glicoproteic. Determinările s-au realizat în două tipuri de gradient de pH :unul mai
mare (pH 3,5 –9,5) şi celălalt mai mic (pH 5-8). Curbele obţinute au arătat că toate
cele trei variante de AAG prezintă diferenţe foarte mici de sarcină între ele şi
prezintă o mobilitate asemănătoare în domeniile de pH 3,5 - 5,5 şi pH 7,5-9,5.
Totuşi cele trei variante prezintă o microheterogenitate în sarcina totală în
domeniul de pH 5,5 - 7,5 date de grupările ionizabile titrate care aparţin acestui
domeniu de pH. Această diferenţă pare a fi dată de resturile de histidil titrabile
specifice fiecărei variante de acid glicoproteic [36-39].
O altă sursă de heterogenitate pentru moleculele AAG o constituie
conţinutul diferit în cantitatea şi compoziţia lanţurilor de glicani din structura
moleculei [37]. Această sursă de heterogenitate influenţează proprietăţile AAG din
punct de vedere a hidrofobicităţii, a accesibilităţii la situsurile de legare precum şi a
recunoaşterii moleculei de AAG de către alte componente celulare.

2.2. Structura lanţului polipeptidic

Studiile privind structura AAG au început cu determinarea structurii
lanţurilor de carbohidraţi şi a unor mici fragmente din lanţul polipeptidic.
În 1972, Tokugi Ikenada a realizat [40] o caracterizare parţială a
fragmentelor obţinute prin clivarea cu CNBr a acidului AAG şi a reuşit să

89
 Florentina Cutaş, G.L.Radu , Danoiu Claudiu
elucideze secvenţa de aminoacizi a capătului COOH- terminal. Metoda de clivare
cu CNBr a fost foarte potrivită pentru studiul compoziţiei în resturi de aminoacizi
deoarece acidul AAG prezintă un conţinut foarte scăzut în resturi de metionină.
Prin clivarea cu CNBr au rezultat patru fracţii care au fost separate ulterior prin
cromatografie pe o coloană cu Sephadex G- 100 (Figura 7).

Figura 7. Cromatograma obţinută prin separarea fragmentelor

rezultate din clivarea AAG cu CNBr.

Fracţia I conţine jumătate din totalul de carbohidraţi ai acidului -1

glicoproteic şi reprezintă capătul NH2– terminal al proteinei. Fracţia II conţine 70
de resturi de aminoacizi şi reprezintă capătul COOH terminal al proteinei.
Compoziţia în carbohidraţi a fragmentelor obţinute nu s-a modificat semnificativ
faţă de proteine nativă după clivare. Totuşi s-a observat o scădere a conţinutului de
acid N- acetil neuraminic (NANA) de la 11% la 8%, resturile libere de NANA
completând însă diferenţa observată. Studiindu-se compoziţia în resturi de
aminoacizi a fragmentelor obţinute s-a observat prezenţa homoserinei în raport de
1,4 mol/mol. Clivarea unui singur rest de metionină duce la obţinerea de
aproximativ 1 mol de fragment amino terminal, 0,7 moli de fragment carboxi-
terminal şi respectiv 0,25 moli pentru celelalte două fragmente (III şi IV). Datorită
multiplelor substituţii de aminoacizi care au fost identificate la moleculele de
AAG, suma resturilor de aminoacizi care au fost identificate III şi IV nu este
aceeaşi cu numărul obţinut pentru CNBr-II. Studiul fragmentului I a arătat că

90
 Proteine plasmatice implicate în legarea substanţelor chimico - farmaceutice
acesta nu posedă capăt NH2 – terminal ceea ce indică faptul că el derivă din capătul
NH2 – terminal al acidului AAG. În sprijinul acestei afirmaţii vine şi constatarea că
celelalte trei fragmente posedă o grupare amino liberă.
Fragmentul II a fost supus hidrolizei cu chimotripsină, tripsină şi anhidrida
acidului citroconic. Pentru fiecare tip de hidroliză s-au obţinut mai multe fragmente
peptidice care au fost ulterior separate cromatografic şi analizate din punct de
vedere a conţinutului de aminoacizi prin metoda Edman. Sumarizând informaţiile
obţinute s-a ajuns la concluzia că fragmentul CNBr-COOH terminal al acidului
AAG este constituit din 70 resturi de aminoacizi şi este caracterizat de prezenţa
unui număr mare de resturi bazice (9 resturi de Lys; 1 rest Hys; 2 resturi de Arg) şi
acide (7 resturi de Asp şi 11 Glu) de aminoacizi care îi conferă un caracter puternic
hidrofilic. În apropierea punctului de neutralizare, 30 din cele 70 de resturi sunt
disociate, acesta fiind cauza polarităţii mari a fragmentului –CNBr. Un număr mare
dintre aceste resturi sunt concentrate în ultimele 21 de resturi COOH- terminale în
contrast cu capătul NH2 – terminal care conţine un număr relativ mic de resturi
disociabile.
Alegerea metodei de hidroliză cu tripsină a fragmentului studiat este legată
de prezenţa resturilor de Lys şi de obţinerea unui rest liber de Arg care este dificil
de elucidat. Chimotripsina s-a folosit datorită prezenţei aminoacizilor aromatici iar
pentru elucidarea ultimelor 21 de resturi de aminoacizi s-a folosit citratconilarea
urmată de o digestie cu tripsină.
Determinarea capătului COOH-terminal al AAG a avut ca primă observaţie
similitudinea structurii ultimelor 22 de resturi de aminoacizi cu o parte din lanţul 
al haptoglobinei (Figura 8) (omologie în valoare de 36% cu lanţul al
haptoglobinei) şi în mod particular cu imunoglobulinele, ultimele 48 de resturi
conţinând 13 resturi identice cu o anumită regiune din lanţul H (lanţul greu al
imunoglobulinelor) (Figura 9).20
1
- CNBr-II fragment al
LA FD V N D EK N W GLS VYA DKP E - acid glicoproteinei
D G V Y T L N N E K Q W I N K A V G D K L P E - Lanţul α al
Haptoglobinei
68

Figura 8 . Omologia dintre resturile 1-21 a capătului CNBr – COOH- terminal din
structura AAG cu lanţul al haptoglobinei

Figura 9. Omologia dintre resturile 22-70 a capătului CNBr- COOH- terminal din
structura AAG cu lanţul H al imunoglobulinei

91
 Florentina Cutaş, G.L.Radu, Danoiu Claudiu

AAG este prima proteină din categoria proteinelor cu un singur lanţ

polipeptidic care posedă similarităţi cu două alte proteine plasmatice. Dacă la
această constatare s-ar lua în considerare un singur set de mutaţii atunci omologia
AAG cu imunoglobulinele ar creşte la 75%. Studiile efectuate au arătat că resturi
de aminoacizi cum ar fi : cisteina, triptofanul lizina, leucina şi acidul aspartic din
partea COOH terminală sunt supuse unui grad înalt de mutaţii.
Structura completă a lanţului de aminoacizi a fost elucidată de Karl
Schmid în anul 1973 [41].
Caracterizarea capătului NH2- terminal al AAG a fost posibilă în urma
realizării următoarelor experimente: clivarea enzimatică cu pirolidoncarboxilil
peptidază a fragmentului I-CNBr; reducerea şi carboximetilarea fragmentului
I-CNBr urmată de digestie cu tripsină. Fragmentele obţinute în urma acestor
experimente au fost separate prin cromatografie şi analizate din punct de vedere a
conţinutului de aminoacizi utilizând metoda Edman (Figura 10).
Secvenţa de aminoacizi a capătului NH2- terminal este caracterizată de
prezenţa unui număr mare de resturi aromatice şi alifatice.
Schmid a observat de asemenea 11 posibile substituţii ale aminoacizilor
[41]. Unele din aceste substituţii pot reprezenta markeri genetici pentru cercetările
de imunologie. Nici o altă proteină ci excepţia imunoglobulinelor nu posedă un
grad atât de mare de substituţii. Este interesant de menţionat că distribuţiile
substituţiilor în lanţul polipeptidic sunt simetrice într-un număr foarte mare faţă de
mijlocul lanţului.
Figura 11 prezintă schematic substituţiile resturilor de aminoacizi din
molecula AAG.
Datorită acestui număr mare de mutaţii structura lanţului polipeptidic este
discutabilă. Luându-se în consideraţie majoritatea substituţiilor posibile s-a obţinut
secvenţă a lanţului polipeptidic similar cu cea definită de Schmid. Totuşi,
comparaţia între structura calculată pe baza posibilelor substituţii şi cea obţinută
experimental indică un grad de substituţie mai mic de 50% [42].
Şapte dintre aceste substituţii au fost au fost întâlnite în fragmentul omolog
cu lanţul al haptoglobinei. Apariţia acestor substituţii este rezultatul modificării
unei singure sau a cel mult două baze din tripletul unui codon. În aceste
reamplasări restul de arginină este implicat de patru ori , ceilalţi aminoacizi: Thr
(treonină), Ala (alanină), Leu (leucină), Ile (izoleucină), Ser (serină), Gln
(glutamină) şi Asn (asparagină) fiind implicaţi de două ori ca dealtfel şi substituţia
următoarelor perechi: Phe-Val (fenilalanină-valină), Ser-Thr şi Arg-Gln. Cu
excepţia triptofanului şi prolinei toţi aminoacizii sunt implicaţi în aceste modificări.
Analizându-se omologia fragmentului I-CNBr cu imunoglobulinele s-a
găsit că 43 de resturi sunt omologe regiunii NH2- terminale ale lanţului L din
imunoglobulina G umenă (Figura 12) [43]. Toate aceste omologii din structura
acidului AAG cu imunoglobulinele duc la ipoteza unei origini comune a genelor
care codifică sinteza acestor proteine.

92
 Proteine plasmatice implicate în legarea substanţelor chimico - farmaceutice

Figura 10. Secvenţa capătului NH2- terminal al AAG şi secvenţa peptidelor triptice (T),
chimitriptice (Ch), peptice (P) şi a glicopeptidelor (G).

Figura 11

93
 Florentina Cutaş, G.L.Radu , Danoiu Claudiu
Elucidarea structurii primare a AAG a permis trecerea la următorul pas de
determinarea structurii secundare şi apoi a structurii terţiare. Structura secundară a
AAG este alcătuită din porţiuni de helix , dar nu se cunoaşte încă
întreaga structură a proteinei.

Figura 12. Omologia dintre 43 de resturi a capătului amino terminal al AAG şi lanţul L al
imunoglobulinei G.

Studiile de dicroism circular asupra AAG la un domeniu de pH cuprins

între 4 şi 12 au relevat faptul că proprietăţile proteinei se modifică foarte puţin în
domeniul de pH 4-10 iar în domeniul de pH 10-11,5 modificările sunt foarte mici
[42]. Modificările importante au loc în intervalul de pH 11,5-12,0 acestea fiind
ireversibile, având ca rezultat pierderea unei părţi importante din structura
secundară. Resturile de aminoacizi răspunzătoare de aceste modificări sunt cele de
tirozină care joacă un rol important în stabilirea structurii secundare a proteinei.

2.3. Structura părţii glucidice

Lanţul polipeptidic al orosomucoidului uman are o masă moleculară

relativă egală cu 21000 Da, de el ataşându-se un număr diferit de lanţuri de glicani.
Dintr-o familie de molecule de orosomucoid 10-15% posedă numai două lanţuri de
glicani şi 85-90% prezintă tri/tetra/penta lanţuri [44].
Studiile au arătat că prezenţa lanţurilor de glicani influenţează interacţiile
proteine-proteină, sunt implicate în recunoaşterea proteinei de către o varietate de
sisteme fiziologice şi menţin stabilitatea conformaţională a proteinei.
În ceea ce priveşte existenţa celor trei tipuri de grupări funcţionale au fost
emise următoarele supoziţii:
- locul de ataşare a lanţurilor de glicani sializate conferă o anumită conformaţie
funcţională lanţului polipeptidic;
- funcţia fiziologică a moleculei implică atât lanţurile de glicani sializate cât şi
lanţul polipeptidic;
- nu există nici o legătură funcţională între lanţurile nesializate sau sializate şi
lanţul polipeptidic.
AAG conţine cinci lanţuri de heteropolizaharide ceea ce îi conferă statutul
de una din cele mai glicozilate proteine din ser. Grupurile de heteropolizaharide ale
acidului glicoproteic sunt legate de miezul proteic prin lanţuri N-glicozidice de
94
 Proteine plasmatice implicate în legarea substanţelor chimico - farmaceutice
resturile de asparagină care sunt situate în zonele cu structură ale lanţului
polipeptidic. Fiecare lanţ glicozidic se termină cu un rest de acid N-acetil
Neuraminic. Lanţurile glicozidice sunt alcătuite din: galactoză, manoză, glucoză,
N-acetil glucozamină, fucoză, între care se realizează legături de tipul 
[45-46]. Studiile privind structura lanţurilor de carbohidraţi
au arătat că moleculele de AAG prezintă heterogenitate şi din punct de vedere a
conţinutului în structura glucidică (Figura 13).
Aceste lanţuri de heterozaharide conferă o mare heterogenitate moleculelor
de AAG. Studii efectuate au demonstrat că există o mare heterogenitate şi în ceea
ce priveşte glicozilarea aceluiaşi situs [47].
AAG poate fi fracţionat în trei fracţii pe baza variaţiei în structura
lanţurilor de glicani. Aceste fracţii pot fi separate prin cromatografie de afinitate cu
concanavalina A. În urma separării au rezultat trei fracţii denumite: fracţia Con A
nereţinută (46%),fracţia uşor reţinută 39,1%, fracţia reţinută (14.9%) şi alte
molecule din plasmă.

+R Gal +R Gal
β 1,4 β 1,4

+R +R’
GlcNAc +R’ GlcNAc +R’
β 1,2 β 1,2

β 1,4 β 1,4 α 1,3(6) α 1,3(6)

Gal GlcNAc Man Man Man

β 1,4

GlcNAc
1,6
(+R = Fuc ) β 1,4

β 1,3
(+R’= Gal GlcNAc) GlcNAc

+R

Asn

Figura 13. Prezentarea unui lanţ hidrocarbonat din structura AAG

95
 Florentina Cutaş, G.L.Radu, Danoiu Claudiu

S-a sugerat că, fiecare moleculă de AAG conţine o singură formă de

glicani. Ulterior, s-a ajuns la concluzia că fracţia reţinută conţine o formă
biantenară de glican, numai la situsurile de legare I şi II. S-a sugerat că situsul II
este biantenar şi este comun pentru fracţiile uşor reţinute şi reţinute care sunt
implicate în interacţiunea cu concanavalina A. Totuşi, deoarece prin calcularea
numărului de lanţuri biantenare în fracţia reţinută numărul lor a fost mai mare decât
doi, şi nu se exclude existenţa unor molecule de AAG care conţin mai mult de două
lanţuri biantenare [43].
În scopul descrierii structurii glicanilor prezenţi în situsurile de glicozilare
a mai multor variante de AAG, s-a procedat la clivarea cu CNBr (asemănător cu
Tokugi Ikenaka [40]), dializarea fracţiilor obţinute, clivarea lor cu endoproteinază
Glu-C (V8- proteinaza) şi separarea fragmentelor glicopeptidice prin RPLC [43].
Conţinutul de acid sialic al glicopeptidelor obţinute a fost determinat printr-o
tehnică cu acid barbituric. Glicopeptidele au fost supuse şi unei clivări cu
fucozidază şi hidrolizate cu acid sulfuric. Proteinaza V8 dă un clivaj extrem
de reproductibil pentru fiecare situs de glicozilare; ea nu afectează AAG nativ,
clivajul primar având loc la resturile de acid glutamic. Analiza secvenţelor de
aminoacizi a glicopeptidelor obţinute prin clivare a putut face posibilă identificarea
celor cinci situsuri de glicozilare (Tabelul 2).

Tabelul 2. Situsurile de glicozilare ale AAG

PEPTID SECVENTA DE AMINOACIZI (* POZITIA

SITUS
A RESTURILOR DE ARGININA
II 1 Y-N*-K-S-V-Q-E
3743
*N -G-T-V-S-R-Y-E
V(GPII) 2
8592
N*-G-T-I-S-R-Y-U-G-G-Q-E
V(GPI) 3 8596

IV 6 NFS-S
*Y-Q-T-R-Q-D-Q-C-I-Y-N
-T-T-Y-L-N-V-Q-R-E
6584
III 11 I-Q-A-T-F-F-Y-F-T-P-N*-K-T-E
4457
E-I-P-L-C-A-N-L-V-P-V-P-I-T-N*-A-T-L-D
I 14 119

96
 Proteine plasmatice implicate în legarea substanţelor chimico - farmaceutice
AAG se prezintă sub două variante genetice. Substituţia acidului glutamic
în poziţia 92 duce la varianta genetică de AAG II ( fragmentul glicopeptidic GPII),
putându-se izola astfel cele două forme ale situsului V. Substituţia a numeroşi alţi
aminoacizi situaţi între resturile 65-84, permite identificarea situsului V, ceea ce
indică faptul că GPI şi GPII sunt glicozilate diferit. Diferenţa între cele două tipuri
de glicopeptide constă în prezenţa unui rest de fucoză în plus la GPII. În urma
acestor studii a putut fi determinată structura lanţurilor de glicani care se leagă la
cele cinci situsuri de glicozilare a AAG (Tabelul 3).

Tabelul 3. Tipurile de lanţuri de heterozaharide posibile pentru cele cinci situsuri

de glicozilare al AAG

TIPURILE DE LANTURI DE
SITUS
HETEROZAHARIDE
I - biantenar
- triantenar
- triantenar-fucoza
- biantenar
II triantenar
-
- tetrantenar
- biantenar
III - triantenar
- triantenar-fucoza
- tetraantenar
- tetrantenar- fucoza
- biantenar
- triantenar
IV tetrantenar-fucoza
-
- tetrantenar
- tetrantenar-fucoza
- tetrantenar-2xfucoza
- triantenar (GPI),(GPII)
- triantenar (GPI),-fucoza
- triantenar(GPII)- fucoza
V
- tetrantenar(GPI), (GPII)
- tetrantenar- fucoza (GPI)
- tetrantenar- fucoza(GPII)
- tetrantenar- 2xfucoza(GPI)
- tetrantenar – 2x fucoza (GPII)
- tetrantenar – Gal-Glc (glucoză N-acetil)-NAc

97
 Florentina Cutaş, G.L.Radu, Danoiu Claudiu

Studiul influenţei acidului N- acetil neuraminic asupra proprietăţilor AAG

a fost realizat pe molecule de AAG care conţin cantităţi diferite de NANA [48].
Acest acid pare a fi implicat în interacţiile dintre AAG şi o varietate de
macromolecule biologice şi de asemenea determină creşterea cantităţii de AAG în
anumite stări patologice a organismului. Îndepărtarea acidului N- acetil neuraminic
creşte imunogenitatea AAG, dar scade abilitatea AAG de a inhiba heparina şi a
iniţia formarea fibrelor de colagen. Printre modificările observate în moleculele de
AAG ca urmare a îndepărtării acidului N-acetil neuraminic se numără scăderea
coeficientului de partitiţie la gel filtrare şi a coeficientului de sedimentare. Aceste
modificări par a fi rezultatul scăderii coeficientului de hidratare a moleculei şi ele
determină modificări conformaţionale induse de resturile de triptofan şi conţinutul
de acid N- acetil neuraminic.
Prin cuplarea moleculelor de AAG cu conţinut diferit de acid N- acetil
neuraminic cu diferite substanţe chimico - farmaceutice s-a evidenţiat faptul că
procentul de NANA poate afecta capacitatea de legare numai prin scăderea
hidrofobicităţii moleculei.
Un rol esenţial al AAG este participarea sa la formarea fibrelor de colagen
[49]. S-a observat că adăugarea de AAG la o soluţie dializată de colagen produce o
scădere a intensităţii spectrului de dicroism circular al colagenului. Rezultatul
constă în formarea de spaţii mari între fibrele de colagen. Îndepărtarea resturilor de
acid sialic din structura AAG cu neuraminidaza previne formarea acestor spaţii.
Îndepărtarea a mai mult de 35 % din resturile de acid sialic anulează efectul
interacţiei dintre AAG şi colagen. Analizele compoziţiei în resturi de aminoacizi şi
studiile de radioactivitate sugerează ca 45-55% din spaţiul interfibrilar este
constituit de AAG.

2.4. Cuplarea liganzilor la Acidul -1 glicoproteic (AAG)

AAG la pH fiziologic este încărcat negativ. El reacţionează cu o varietate de

liganzi, medicamente acide, steroizi şi în mod particular cu medicamente bazice [50-53].
Experimentele au demonstrat că liganzii bazici se leagă mult mai puternic
decât formele protonate. Legarea liganzilor la AAG pote fi rezultatul unor
interacţiuni hidrofobe dintre zona apolară a proteinei şi ligandul neionizat. Totuşi,
legarea poate fi privită ca rezultat al formării legăturilor de hidrogen între ligand
(donor de H) şi proteină (aceptor de hidrogen).
Realizându-se curbele de titrare pentru AAG s-a demonstrat că constanta
de ionizare a speciilor de AAG implicate într-o legătură este de 7,71. Este cunoscut
că secvenţa hidrofobă cuprinsă între resturile de aminoacizi 21-31 joacă un rol
important în legarea progesteronului. Această secvenţă include şi următoarele
resturi de aminoacizi: Lys, Trp, Tyr.
Cu ajutorul tehnicilor de fluorescenţă a fost posibilă studierea
accesibilităţii şi poziţiei resturilor de triptofan din molecula AAG. AAG conţine

98
 Proteine plasmatice implicate în legarea substanţelor chimico - farmaceutice
trei resturi de triptofan care sunt sensibile la variaţiile de pH şi determină
modificări în conformaţia AAG. S-a putut observa că triptofanul este sensibil la
domeniul de pH cuprins între pH acid până la pH =6. O modificare dramatică în
conformaţia proteinei intervine la pH = 4 precum şi la pH=7,4 [54,55].
Folosind tot o tehnică de fluorescenţă Friedman (1986) a presupus un
model în care domeniul de legare a AAG include două resturi de Trp, cu al treilea
rest de Trp al AAG situat la periferia domeniului de legare [48]. Constanta de
ionizare pentru acest fragment implicat în legarea liganzilor este de 7,71 , valoare
situată între valoarea constantei de ionizare a grupării imidazol a histidinei din
proteina (pK=6,3) şi constanta de ionizare a tirozinei (pK=9,6) şi lizinei (pK=10,4).
Aceste resturi de triptofan sunt localizate în poziţiile 127,130 şi 171 (Schmid [45]).
Este posibil ca un rest din cele trei de triptofan să se apropie foarte mult de
domeniul de legare a AAG datorită structurii tridimensionale pe care o adoptă
conformaţia proteică [56,57]. Totuşi, determinările arată că AAG se poate lega atât
de liganzi bazici cât neutri şi acizi.
Experienţele de determinare a situsurilor de legare a AAG au inclus şi
evidenţierea diferenţei de legare avariantelor genetice ale moleculelor de AAG.
Studiile privind diferenţele de legare a anumitor liganzi între variantele genetice de
AAG au arătat că AAG – A prezintă o capacitate de legare mult mai mare decât
variantele F1 sau S. Se presupune că această diferenţă de legare se datorează
absenţei în structura AAG –F1 şi S a unor liganzi cu capacitate înaltă de legare
deoarece liganzii au fost legaţi le acelaşi tip de situs pentru fiecare tip de moleculă
[58-60].
Totuşi, deoarece nivelele plasmatice ale acestei proteine sunt relativ mici
comparativ cu albumina şi alte proteine plasmatice majore, legarea medicamentului
poate fi saturabilă la concentraţii mai mari ale intervalului terapeutic.
Este bine demonstrat faptul că numeroşi factori pot altera în mod
semnificativ legarea proteinelor plasmatice de medicamente. Stadiile bolii cum ar
fi afecţiunile renale, hepatice şi tiroidiene pot altera semnificativ caracteristicile de
legare ale unui medicament. S-a arătat că şi starea de graviditate are un efect
semnificativ asupra legării proteinelor de medicamente. De asemenea, la pacienţii
pediatrici şi geriatrici sunt modificate caracteristicile de legare. Prin urmare,
determinarea parametrilor de legare proteină - medicament precum şi a cantităţii de
medicament nelegat în aceste situaţii clinice poate fi esenţială pentru
individualizarea dozelor terapeutice de medicament.

Concluzii

Dintre proteinele plasmatice implicate în legarea şi transportul

medicamentelor în fluxul sanguin un loc aparte îl ocupă acidul 1-glicoproteic şi
în special albumina serică.

99
 Florentina Cutaş, G.L.Radu, Danoiu Claudiu

Albumina serică prezintă o structură complexă care rezultă atât din

marimea lanţului peptidic (585 resturi de aminoacizi) cât mai ales din proprietăţile
sale fizico-chimice.
Numărul mare de resturi de aminoacizi din structura albuminei şi
modificările care apar în poziţionarea acestora determină existenţa a mai multor
tipuri de albumine denumite aloalbumine.
Capacitatea de legare şi transport a medicamentelor de către albumină este
influenţată de:
i) proprietatea de tranziţie a acesteia de la o formă neutră la una bazică în funcţie de
pH-ul mediului;
ii) heterogenitatea structurală şi reactivitatea albuminei, aceste proprietăţi fiind
legate de modificări ale poziţei şi structurii resturilor de aminoacizi şi de gradul de
glicozilare al albuminei.
Albumina posedă o sarcină cationică netă datorită careia atrage rapid
medicamentele acide cu care formează un complexe tranzitorii. Abilitatea
albuminei de a fluctua în soluţii apoase între forme izomere pare să fie un avantaj
permiţând adoptarea unei conformaţii cu afinitate maximă pentru liganzi.
Albumina leagă de compuşii lipofilici prin forţe hidrofobice. Anumite clase de
medicamente se asociază cu albumina la situsuri specifice de legare cum ar fi:
i) situsul de legare pentru acizii graşi, localizat în subdomeniul 1;
ii) situsul de legare pentru octanoat, triptofan, clorozepat, tiroxină, p-iodobenzonat
şi alţi compuşi cloridici este situat în subdomeniul 2 - mai puţin specific;
ii) situsul pentru legarea bilirubinei, Phenol Red, Bromphenol Blue şi iopanoat
situat în subdomeniul 3;
iii) situsul de legare a ionilor metalici cum ar fi Cu2+, Ni2+situat în subdomeniul 4;
iv) situsul pentru legarea hemului situat în subdomeniul 5 al moleculei.
Legarea medicamentelor la aceste situsuri specifice este caracterizată în
mod obişnuit printr-o asociere cu afinitate mare şi poate fi saturată peste
concentraţiile terapeutice de medicamente.
Mulţi compuşi se adsorb de asemenea la albumină într-o manieră
nespecifică, cu afinitate mică şi nesaturabilă. În mod sigur, medicamentele se pot
asocia cu albumina atât la situsuri specifice de legare cât şi la situsuri nespecifice.
Acidul (AAG) prezintă alături de celelalte glicoproteine, o
structură complexă dată de existenţa în moleculă a trei tipuri de funcţiuni: corpul
peptidic, lanţurile de glicani şi acidul sialic terminal al acestor lanţuri.
Au fost evidenţiate mai multe tipuri de AAG, respectiv AAG F1 şi – sau S
şi A, tipuri ce se diferenţiază prin sarcina totală a moleculei.
O sursă importantă de heterogenitate pentru AAG o reprezintă conţinutul
diferit în cantitatea şi compoziţia lanţurilor de glicani din structura moleculei.
Această sursă de heterogenitate influenţează proprietăţile AAG din punct de vedere
al hidrofobicităţii, a accesibilităţii la situsurile de legare precum şi a recunoaşterii
moleculelor de AAG de către alte componente celulare.

100
 Proteine plasmatice implicate în legarea substanţelor chimico - farmaceutice
O caracteristică importantă a AAG este dată de posibilitatea existenţei unui
număr mare de substituţii ale aminoacizilor din structura lanţului peptidic. Această
caracteristică, pecum şi analogiile structurale cu imunoglobulinele sugerează
originea comună a acestor proteine.
Un rol esenţial al AAG este participarea sa la formarea fibrelor de colagen
prin formarea de spaţii mari între fibrele de colagen.
AAG la pH fiziologic este încarcat negativ. El reacţioneaza cu o varietate
de liganzi, medicamente acide, steroizi şi în mod particular cu medicamentele
bazice.
Legarea liganzilor la AAG poate fi rezultatul unor interacţiuni hidrofobe
dintre zona apolară a proteinei şi ligandul neionizat. Se presupune ca, în legarea
liganzilor sunt implicate resturile de triptofan situate în vecinatatea situsurilor de
legare.
Deoarece nivelurile plasmatice ale AAG sunt relativ mici comparativ cu
albumina şi alte proteine plasmatice majore, legarea medicamentului poate fi
saturabilă la concentraţii mai mari ale intervalului terapeutic.

Bibliografie

1. ZAMFIRESCU M.G., AURORA POPESCU, Tratat de biochimie medicală,

Vol.II, Ed. Medicală, 67-89, 1991.
2. ŞERBAN M., CÂMPEANU G., IONESCU E., Metode de laborator în
biochimia animală, Ed. Didactică, 130-139, 1993.
3. HAWKINS J.W., DUGAICZYK A., Gene responsable for human serum
albumin sintetis, 19, 55-58, 1982.
4. MINGHETTI P.P., RUFFNER D.E. KUANG W.J. DENISON E.O.,
HAWKINS J.W. Beattie W. G., and Dugaiczyk A., Genetic variantes of human
serum albumine , J. Biol. Chem., 261, 6747-6757, 1986.
5. GALLIANO M, ROSSI A, PORTA F., Genetic variants of human serum
albumin : molecular defects and biological stability, Int. J. Clin Pharmacol
Res., 15(2) : 45-55, 1995.
6. MINCHIOTI L., MONICA GALLIANO, The molecular defect in a COOH –
terminal- modified and shortened mutant of human serum albumin, J. Biol.
Chem, 264 (6), 3385-3389, 1989.
7. BROWN J.R., Structure of human serum albumin, Fed. Proc., 35, 2141-2144,
1976.
8. KRAGH- HANSEN U, Structure and ligand binding properties of human
serum albumine, Dan Med Bull, 37 (1), 57-84, 1990.
9. MELOUN B., MORAVEK L., KOSTKA V., Complete sequence of human
serum albumin, FEBS Lett., 58(1) , 134-137, 1975.
10. DARCEL C.L., On the heterogeneity of serum albumin, Int. J. Biochem., 19
(4), 295-301, 1987.

101
 Florentina Cutaş, G.L.Radu, Danoiu Claudiu

11. HOOP T.O., WOODS K.R., Characterisation of COOH terminal region of

human serum albumine, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 78, 3824-3828, 1981.
12. HE XM, CARTER D.C., Atomic and chemistry of human serum albumin,
Nature, 358(6383) , 209-215, 1992.
13. DROGE J.H., ET ALL, The fatty- acid- induced conformational states human
serum albumin investigated by means of multiple co- binding protons and oleic
acid, Biochem. J., 250(2), 443-446, 1988.
14. MICHAEL J.G., BEAVEN G.H., Physical binding properties of large
fragments of human serum albumin, Biochem. J., 163, 477-484, 1977.
15. HE X.M., CARTER D.C., Diazepan binding site II of human serum albumine,
Nature, 358, 209-216, 1996.
16. CARTER D.C., HO J.X., Ligands binding site Iiof human serum albumine,
Adv. Protein Chem, 45, 153-159, 1994.
17. EMILIA BRAMANTI, BENEDETTI E., Determination of the secondary
structure of isomeric forms of human serum albumin by a particular frequency
deconvolution procedure applied to fourier transform IR analysis, Biopolymers,
38(5), 545-549, 1996.
18. GAMBIR K.K., MCMENAMY R., Covalent binding between human serum
albumin residues and bromiacetyl-L- tryptofan, J. Biol. Chem., 250, 6711-
6719, 1975.
19. MICHAEL J.G., BEAVEN G.H., Large fragments of human serum albumin,
Biochem. J., 161, 619-625, 1977.
20. BOS O.J., LABRO J.F., The molecular mechanism of the neutral- to- base
transition of human serum albumin. Acid/base titration and proton nuclear
magnetic resonance studies on a large peptic and large tryptic fragment of
albumin, J.Biol. Chem., 2, 953-959, 1989.
21. WILTING J., VAN DER GIESEN W.F., LAMBERT H. M., The effect of
albumin Conformation on the Binding of Warfarin to human serum albumin, J.
Biol. Chem., 255(7),1980.
22. DROGE J.H., WILTING J., JANSSEN L.H., A comparative study of some
physico-chemical properties of human serum albumin sample from different
sources. The caracteristics of the N-B transition and the binding behaviour with
regard to warfarin and diazepan, Biochem. Pharmacol, 31(23), 3781-3786,
1982.
23. GEISOW M.J., STUCHBURY T., Large fragments of human serum albumin,
Biochem. J., 161 (3), 619-625, 1977.
24. TERAOKA JUNJI, ALSDAIR F.B., HECHT L., BARRON L.D., Loop
structure in human serum albumin from Raman optical activity, Journal of
Raman Spectroscopy, 29, 67-71, 1998.
25. LAPRESLE C., DOYEN N., Isolation and properties of a fragment of human
serum albumin demonstrating the absence of a methionine residue from some
of the albumin molecules, Biochem. J., 151, 637-643, 1975.

102
 Proteine plasmatice implicate în legarea substanţelor chimico - farmaceutice
26. RAHIM S., AUBRY A.F., Location of binding sites on immobilized human
serum albumine for some nonsteroidal anti- inflammatory drugs, J. Pharm.
Sci., 84(8), 949-952, 1995.
27. NARAZAKI R., HAMADA M., HARADA K., Covalent binding between
bucillamine derivates and human serum albumin, Pharm. Res., 13(9), 1317-
1312, 1996.
28. BOS O.J., FSHER M.J., Mechanism by which warfarin binds to human serum
albumin. Stopped- flow kinetic experiments with two large fragments of
albumine, Biochem. Pharmacol., 38(12), 1979-1984, 1989.
29. LOUN B., HAGE D.S., Characterization of thyroxine- albumin binding using
high- performance affinity chromatography. Interaction at the warfarin and
indole sites of albumin, J. Chromatogr., 579(2), 225-235, 1992.
30. KONGSHAUG M., MOAN J., CHENG L.S., Binding of drugs to human
plasma protein, exemplified by Sn(IV)- etiopurpurin dichloride in cremophor
and DMSO, Int. J. Biochem., 25 (5), 739-760, 1993.
31. KUNIKO K., CHIAKI I., MASAE I., Influence of glycosilation on drug
binding of human serum albumin , J. Biomed. Chromatogr., 12, 203-210, 1998.
32. HIKARU KOYAMA, SUGIOKA N., Effects of Glycosylation of
hypoglicaemic drug binding to serum albumin, Biopharmaceutics & Drug
disposition, 18:9, 791-801, 1997.
33. SHAKLAI N., GARLIK R.L., Nonenzymatic glycosylation of human serum
albumin alters its coformation and function, J. Biol. Chem., 259, 3812-3817,
1984.
34. HERVE F., DUCHE J.C., SPORTES N., TILLEEMENT J.P., High-
performance anion- exchange chromatographic study of desialylated human
alpha (1)- acid glycoprotein variants. Development of a fraction method for the
protein slow variants., J. Chromatogr., 539 (2) , 405-416, 1991.
35. HERVE F., MILLOT M.C., EAP C.B., DUCHE J.C., TILLEMENT J.P., Two-
steps chromatographic purification of human plasma alpha (1)- acid
glycoprotein : its application to the purification of rare phenotype sample of the
protein and their study by chromatography on immobiliyed metal chelate
affinity adsorbent , J. Chromatogr. B. Biomed Appl., 678 (1), 1-14, 1996.
36. HERVE F., GOMAS E., DUCHE J.C., TILLEMENT J.P., Fraction of the
genetic variants of human alpha 1 – acid glycoprotein in the native form by
chromatography on an immobilized copper (II) affinity adsorbent.
Heterogenity of the separate variants by isoelectrofocusing and by concavalin.
A affinity chromatography, J. Chromatogr., 615 (1), 47-57, 1993.
37. HERVE F., DUCHE J. C., BARRE J., MILLOT M.C., TILLEMENT J.P., PH
titration curves of the desialylated human alpha 1- acid glycoprotein variants
by combined isoelectrofocusing – electrophoresis : utilization in the
development of a fraction method for the protein variants by chromatography
on immobilization metal affinity, J. Chromatogr., 577(1), 43-59, 1992.

103
 Florentina Cutaş, G.L.Radu, Danoiu Claudiu

38. HERVE F., FOUACHE F., MARCHE C., TILLEMENT J.P., Abnormal
michroheterogenity detected in one commercial alpha 1- acid glycoprotein
preparation using chromatography on immobilized metal affinity adsorbent on
hydroxyapatite, J. Chromatogr.B. Biomed. Sci. Appl., 688(1), 35-46, 1997.
39. JOLLIET – RIANT P., BOUKEF M.F., DUCHE J.C., SIMON N.,
TILLEMENT J.P., The genetic variant A of human alpha 1 – acid glycoprotein
limits the blood transfer of drugs it binds, Life Sci., 62(14), 219-226, 1998.
40. TOKUJI IKENAKA, MASATSUNE ISHIGURO, Isolation and partial
characterization of the cyanogen bromide fragments of alpha (1)- acid
glycoprotein and the elucidation of the amino acid sequence of the carboxyl-
terminal cyanogen bromide fragment, Biochemistry, 11(20), 3817-3829, 1972.
41. SCHMIDT K., KAUFMANN H., ISEMURA S., Structure of alpha 1- acid
glycoprotein .The complete amino acid sequence, multiple amino acid
substitutions , and homology with the immunoglobulin, Biochemistry, 12(14),
2711-2719, 1973.
42. SCHMIDT K., CHEN L.H., OCCHINO J.C., Topography of human plasma
alpha 1- acid glycoprotein, Biochemistry, 15(11), 2245-2253, 1976.
43. TOH H., HAYASHIDA H., KIKUNO R., YASUNAGA T., Sequence
similarity between EGF receptor and alpha 1- acid glycoprotein, Nature,
314(14), 199-200, 1985.
44. SCHMID K., Human plasma 1- acid glycoprotein – biochemical properties, the
amino acid sequence and the structure of carbohydrate moiety, variants and
polymorphism, Prog. Clin. Biol. Res., 300, 7-22, 1989.
45. SCHMIDT K., NIMERG R.B., KIMURA A., YAMAGUCHI H., BINETTE
J.P., The carbohydrate units of human plasma alpha 1- acid glycoprotein,
Biochim. Biophis. Acta., 492(2), 291-302, 1997.
46. WAGH P. W., BORNSTEIN I., WINZLER R.J., The structure of a
glycopeptide from human orosomucoid (alpha 1- acid glycoprotein), J. Biol.
Chem., 244(3), 658-665, 1969.
47. KISHINO S., NOMURA A., SAITOH M., SUGAWARA M., ISEKI K.,
KITABATAKE A., MIYAYAKI K., Single-step isolation method for six
glycoforms of human alpha (1) – acid glycoprotein by hydroxylapatite
chromatography and study of their binding capacities for disopzramide, J.
Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 703(1-2), 1-6, 1997.
48. FRIEDMAN M.L., WERMELING J.R., HALSALL H. B., The influence of N-
acetylneuraminic acid on the properties of homan orosomucoid, Biochem. J.,
236, 149-153, 1986.
49. Frayblau C., Schmid K., Faris B., Beldekas J., Garvin P., Kagan H.M., Baum
B. J., The interaction of collagen with alpha 1 – acid glycoprotein, Biochim.
Biophis. Acta , 427(1), 302-314, 1976.
50. ALBANI J.R., Binding effect of progesterone on the dynamicsof alpha 1- acid
glycoprotein , Biochim. Biophis. Acta , 1336(2), 349-359, 1997.

104
 Proteine plasmatice implicate în legarea substanţelor chimico - farmaceutice
51. KUTE T., WESTPHAL U., Steroid-protein interactions. XXXIV. Chemical
modification of alpha 1- acid glycoprotein for characterization of the
progesteron binding site, Biochim. Biophis. Acta, 420(1), 195-213, 1976.
52. URIEN S., BREE F., TESTA B., TILLEMENT J.P., pH- dependence of
warfarin binding to alpha- 1- acid glycoprotein (orosomucoid), Biochem. J.,
289(Pt.3), 767-770, 1993.
53. HERVE F., CARON G., DUCHE J.C., GAILLARD P., ABD RAHMAN N.,
Ligand specificity of the genetic variants of human alpha (1)- acid
glycoprotein : generation of a three- dimensional quantitative structure- activity
relationship model for drug binding to the A variant, Mol. Pharmacol., 54(1),
129-138, 1998.
54. KALISZAN R., NASAL A., TUROWSKI M., Binding site for basic drugs on
alpha 1- acid glycoprotein as revealed by chemometric analysis of
biochromatographic data, J. Biomed. Chromatogr., 9(5), 211-215, 1995.
55. MARUYAMA T., OTAGIRI M., TAKADATE A., Characterization of drug
binding sites on alpha 1-acid glycoprotein , Chem. Pharm. Bull., 38(6), 1688-
1691, 1990.
56. URIEN S., GIROUD Y., TSAI R.S., CARRUPT P.A., Mechanism of ligand
binding to alpha 1- acid glycoprotein from human plasma using high-
performance liquid chromatography, Anal. Biochem., (2), 366-371, 1985.
57. DUCHE J.C., HERVE F., TILLEMENT J.P., Study of the expression of the
genetic variation of human alpha 1- acid glycoprotein in healty subjects using
isoelectrofocusing and immunoblotting, J. Chromatogr.B. Biomed. Sci. Appl.,
715(1), 103-109, 1998.
58. HERVE F., CARON G., DUCHE J.C., GAILLARD P., Ligand specificity of
the genetic variants of human alpha 1- acid glycoprotein : generation of a
three- dimensional quantitative structure- activity relationship model for drug
binding to the A variant, Mol. Pharmacol., 54(1), 129-131, 1998.
59. HERVE F., DUCHE J.C., DATHIS P., MARCHE C., BARRE J.,
TILLEMENT J. P., Binding of disopyramide , methode dipyridamole ,
chlorpromazine , lignocaine and progesterone to the two main genetic variants
of human alpha 1- acid glycoprotein : evidence for drug- binding differences
betwen the variants and for the presence of two separate drug- binding sites on
alpha 1- acid glycoprotein, Pharmacogenetics, 6(5), 403-415, 1996.
60. HERVE F., GOMAS E., DUCHE J.C., TILLEMENT J.P., Evidence for
differences in the binding of drug to the two main genetic variants of alpha 1-
acid glycoprotein, Br. J. Clin. Pharmacol., 36(6), 241-249, 1993.

105