LP 2 AMG

Dozarea proteinelor totale. Proteina C reactiva – CRP –metoda

latex/2 ore

Proteine Plasmatice

Introducere

Plasma umană cuprinde între 6-8 g proteine la 100 ml. Proteinele plasmatice
constituie un amestec heterogen de componenţi, cu greutăţi moleculare
variind între 70 – 1500 kdal. (alfa1globulina=cateva zeci de mii de daltoni, la
cateva sute de mii de daltoni, macroglobulinele)

Proteinele plasmtice= proteinele care au o concentratie mai mare in

plasma decat in spatial extravascular si care isi desfasoara principala functie
in plasma.
Sinteza
 Marea majoritate sunt sintetizate in hepatocite(albumina, factori de
coagulare)
 Limfocite (Ig)
 Enterocite (apolipoproteine)
 Macrofage(citokine, factori de complement)
 Adipocite (factorul properdinic D)

Exemple de proteine plasmatice:

1. Transportoare:
1.1. Albumine
1.2. Transferina (siderofilina)
1.3. Feritina (metaloproteina de depozit a fierului)
1.4. Haptoglobina(a Hb)
1.5. Apoproteinele (ale lipidelor pasmatice)

2. Proteine de faza acuta

2.1. PCR
2.2. Ceruloplasmina
2.3. Factorii C3 si C4 ai complementului

Pentru determinarea /fractionarea proteinelor din plasma se utilizeaza mai

multe metode: precipitarea salina a albuminelor si globulinelor,
ultracentrifugarea, electroforeza, cromatografia, tehnici imunologice.
Cel mai vechi procedeu de separare, aplicat proteinelor plasmatice serice,
este salifierea, precipitarea proteinelor din soluţii prin adăugarea de cantităţi
mari de săruri neutre: (NH4)2SO4, MgSO4, NaCl, Na2SO4. Prin adăugarea
de sulfat de amoniu se deosebesc două fracţiuni majore: globulinele care
precipită când concentraţia în sulfat de amoniu a soluţiei care le cuprinde a
atins semisaturaţia şi albumina care precipită când soluţia este saturată cu
sulfat de amoniu.
Prin aplicarea unor metode mai fine de separare s-au individualizat în
plasmă până la 35 fracţiuni proteice iar din aceste fracţiuni puţine sunt
omogene din punct de vedere fizico-chimic.

Activitatea Experimentală
Dozarea proteinelor totale (metoda colorimetrică bazată pe reacţia
biuretului)

Principiul metodei
În soluţie alcalină grupările peptidice ale proteinelor plasmatice complexează
ionii de Cu din reactivul biuret, dând naştere unui compus colorat albastru -
violet. Alături de proteine se dozează şi peptidele mai mici prezente în ser.

Reactivi:
1.Sulfat de cupru 12 mmol/L
2. Tartrat de sodium si potasiu 30 mmol/L
3. Iodura de potasiu 30 mmol/L
4. Hidroxid de sodium 200mmol/L

Standard Proba
Standard 20 μL -
Ser - 20 μL
Reactiv Weichselbaum 2 mL 2 mL

Se agită. Se lasă în repaus 6 minute. Se citesc extincţiile probei Ep şi

standardului Es faţă de blanc la lungimea de undă 546 nm.
Calcul:

Cp = Ep/ Est x Cst = g proteine/dL ser.

Proba în alb (B) corespunzătoare fiecărei probe de analizat (P), ce serveşte

la eliminarea unei coloraţii proprii a serului cu proprietăţi de absorbţie
asemănătoare complexului colorat al proteinelor, este necesara numai
pentru serurile icterice sau hemolitice.
Valori normale
Varsta Valori (g/dL)

Prematur 3.6-6

Nou nascut la 4.6-7

termen

Prima 4.4-7.6
saptamana de
viata – 7 luni

7 luni-1 an 5.1-7.3

1-3 ani 5.6-7.5

Copii > 3 ani 6.0-8.0

Adulti 6.4-8.3

Serul si plasma difera in ceea ce priveste concentratia de proteine si tipul de

molecule. Astfel, serul (obtinut dupa incheierea procesului de coagulare) nu
contine fibrinogen si majoritatea factorilor implicati in „cascada” coagularii.
Acest test detecteaza suma proteinelor serice circulante, care poate suferi
variatii atat in conditii fiziologice cat si patologice.

Recomandari pentru determinarea proteinelor serice totale

– evaluarea statusului nutritional
- investigarea sindroamelor edematoase
Interactiuni:
Contraceptivele orale si medicamentele hepatotoxice pot determina
hipoproteinemie.
Androgenii, corticosteroizii, dextranul, hormonal de crestere, insulina,
progesteronul si steroizii anabolizanti pot creste nivelele.
Variatii fiziologice: scaderi ale proteinelor totale se inregistreaza in sarcina
(in special in ultimul trimestru).

Hipoproteinemiile sunt cauzate

A. de pierderi de proteine prin:
1. rinichi: pot fi eliminate cantităţi mari de proteine, în special albumina,
în afectiuni ca sindrom nefrotic, glomerulonefrite, infecţii acute sau
cronice, tulburări circulatorii, intoxicaţii;
2. tubul digestiv: enteropatii diverse (colite, enterite);
3. piele: arsuri şi inflamaţii exudative severe.
4. Hemoragii

B. în stările de subnutriţie, (inanitie sau malabsorbtie);

C. Sinteza hepatica deficitara: ciroza hepatica

D. Boli consumptive cu distrugeri tisulare : tumori maligne

Hiperproteinemiile
A. Relative( ca urmare a pierderii de lichide):
1. Stari de deshidratare
2. Diabet insipid
3. Pierderi de apa in exces pe cale intestinala: diaree, varsaturi
4. Boli infectioase cronice
B. Absoluta( survine pe seama sintezei de proteine anormale:
1. Boala Waldenstrom
2. Mielom multiplu

PROTEINA C REACTIVA – CRP

-este astfel denumita, deoarece precipita polizaharidul C (un acid teichoic cu

ribitol, care contine fosforil-colina) al celulelor de Streptococcus pneumoniae.
- se leaga pe suprafata acestor bacterii si mediaza fagocitoza

-activitatea opsonica a CRP este dependenta de capacitatea de a activa calea

clasica si alterna a complementului.

- este o proteină de fază acută de origine hepatică fiind indusa de citokinele

proinflamatoare Il-6 Il-1β si TNF-α
-timpul de injumatatire plasmatica este de 12-24 ore.
- este utilizat în principal ca marker al inflamației.

Recomandări pentru determinarea CRP

– evaluarea gradului de activitate a afecţiunilor inflamatorii;
– detectarea precoce a complicaţiilor postoperatorii (infecţii oculte);
– detectarea rejetului grefelor;
– depistarea de infecţii intrauterine asociate cu ruptura prematură de
membrane;
– evaluarea extinderii sau reinfarctizării după IMA;
– monitorizarea tratamentului antibiotic în infecţii bacteriene;
– monitorizarea terapiei antiinflamatorii în boli reumatice

Principiul metodei (latex) Este un test calitativ sau semicantitativ.

PCR serica produce , la o concentratie de 6 mg/L sau mai mare aglutinarea
vizibila pe slide a particulelor de latex acoperite cu anticorpi anti-PCR
umana.

Reactivi şi materiale
- Reactiv CRP Latex:
- Control pozitiv: ser uman, CRP>20mg/L
- Control negativ: ser uman, CRP<6mg/L
- Carduri test (cu slide-uri)
- Betisoare amestecatoare de unica folosinta

Modul de lucru
-Se aduc reactivii la temp camerei
-Se plasea 50 μLde proba si cate o picatura din fiecare control in cercuri
separate pe suprafata cardului de test
- Se agita flaconul cu test si se adauga o picatura de reactiv in fiecare cerc,
langa picatura de proba ce urmeaza a fi testate.
-Se amesteca cele 2 picaturi cu betisoarele, distribuind amestecul pe
intreaga suprafata a cercului, fara a depasi marginea
-Se roteste cardul la 100 rpm, timp de 2 minute.

Citirea

-Rezultat pozitiv: prezenta aglutinarii vizibile indica o concentratie de CRP in

proba mai mare sau egala cu 6mg/L. Pentru titrare se realizeaza dilutii
seriale(prin injumatatirea concentratiei) cu NaCl 9g/L. Titrul serric este
definit ca fiind cea mai mare dilutie la care se obtine rezultat pozitiv.
-Rezultat negativ: absenta aglutinarii vizibile indica un continut de CRP
<6mg/L.

Creşterile CRP reprezintă un răspuns nespecific la inflamaţii şi infecţii. Pentru

estimarea riscului cardiac se recomandă folosirea unui alt tip de test – CRP
ultrasensibil (“high sensitive-CRP”), care poate detecta niveluri mai mici de
CRP