LP1 - RECOLTAREA SI CONSERVAREA SANGELUI -pt efectuarea dozarilor unor markeri biochimici, sangele se recolteaza dimineata pe nemancate prin

punctie venoasa. Micul dejun influenteaza rezultatul determinarilor in cazul: dozarii glucozei,a lipidelor serice ,fosforul anorganic , ph`ului sanguine , in timp ce restul dozarilor biochimice se pot efectua cu mic dejunul luat. Folosirea serului sau a sangelui integral se poate face numai daca substanta de analizat are aceiasi concentratia in eritrocite si in plasma. Plasma faza sau componenta sanguina lichida formata din ser, fibrinogen si factori de coagulare. Se obtine prin recoltarea sangelui pe anticoagulant.(heparina). Prin centrifugare elementele figurate din sangele recoltat pe anticoagulant sedimenteaza, separandu`se de plasma. Ser- e o componenta sanguina lichida care se obtine dupa coaguluarea sangelui recoltat. Dozarile trebuie sa se efectueze cat mai rapid dupa recoltarea sangelui . Daca acest lucru nu e posibil , plasma sau serul se coaguleaza. Nu se pastreaza la 4 grade Celsius. RECOLTAREA SI CONSERVAREA SALIVEI Cercetarile efectuate in ultima perioda au stabilit ca saliva poate fi considerata ca o oglinda a starii de sanatate a organismului. Este de preferat sa se foloseasca saliva ca material biologic deoarece metoda de recoltarea e mai simpla , non-invaziva . Ceea ce face ca saliva sa nu fie introdusa official ca material biologic pt stabilirea unui diagnostic se datoreaza variatilor fiziologice mari. In general es lucreaza pe saliva totala nestimulata. Se cunosc 2 tehnici de recoltare a salivei : prin drenaj si prin suctiune. Prin drenaj se recolteaza saliva care se prelinge peste buza inf , cu nacinele pensate. Prin suctiune- absorbtia de saliva cu o pompa de vid. FACTORI CARE INFLUENTEAZA REZUTLATE DOZARILOR BIOCH In functie de starea de sanatate a pacientului , se pot obtine valori diferite ale concentratiilor markerilor biochimici. In interpretarea unui examen de laborator trebuie sa se tina cont si de variatiile fiziologice. Pentru stabilirea corecta a unui diagnostic pe baza examenului de laborator e necesara precizarea riguroasa a limitelor in care se incadreaza populatia sanatoasa . Pentru interpretarea corecta a rezultatelor de lab tre sa se tina cont de factorii care le pot influenta . Se disting 2 surse de variatii ale rez: 1.variatii analitice si 2 variatii biologice. VARIATII ANALITICE SI VARIATII BIOLOGICE Variatiile analitice au 2 component principale : a)eroarea preinstrumentala pregatirea materialelor pt recoltarea probelor biologice. b)eroarea insrumentala e datorata metodelor si tehnicilor folosite pt dozare care implica cantarire,pipetare etc.

Variatiile biologice Factorii de variatii biologice se clasifica cu greu: -factori de variatii intraindividuale si interindividuale -factori de variatii genetice si dobondite -variatii datorate mediului ambient -variatii dat factorilor endogeni si exogeni. In procesul de reglare interna , se pot distinge 3 categorii de constituienti: -constituienti cu prop reglatorii. -constituienti cu variatii importante : urea, acidul uric. -constituienti implementati partial in procesele de biosinteza. E f important sa se cunoasca mecanismele biochimie de fizice care stau la baza variatiilor biologice cum ar fi : mecanismul de eliminare a enzimelor. ALTI FACTORI CARE INFLUENTEAZA REZULTATE DOZARILOR MARKERILOR BIOCHIMICI 1. Varsta 2. Sexul- M/F numeroase componente plasmatice se gasesc in concentratii diferite: hemoglobina ,acid uric.. 3. Alimentatia- datorita continutul in probe biologice . Exista alimente care consumate in cantitate mare au effect asupra unor constituienti biologici : spanac ,salata. 4. Efortul fizic creste concentratia de albumine. 5. Stresul 6. Concentratia plasmatica a Fe.

LP2 - METODE FIZICO-CHIMICE DE ANALIZA Sunt folosite pe scara larga deoarece se caracterizeza in primul rand prin rapiditate, selectivitate si sensibilitate marita. Aceste metode permit realizarea unor dispozitive pentru indicarea concentratiei unei substante dintr-un amestec/ Clasificare: Metode optice Metode electrochimice Metode radiochimice Metode cromatografice/ 1. Metode optice Se bazeaza pe interactiunea energiei radiante cu material determinand spectrele de absorbtie si emisie. In functie de proprietatile optice folosite met optice se clasifica in: a) metode optice de absorbtie: calorimetrie, spectrofotometrie b) metode optice de emisie: spectometrie, fotometria in flacara, fotoluminiscenta. Metodele optice de absorbtie Majoritatea substantelor au proprietati de a absorbi in mod selective radiatiile electromagnetice de o anumita lungime de unda cu degregare simultana de energie. Aceste proprietati constituie baza metodei fotometrice de analiza.. Cele mai importante sunt radiatiile electromagnetice cu lungime de unda cuprinsa untre 200 2000 nm. In fotometria de absorbtie sunt folosite radiatiile incidente, complementare culorii substantei de analizat. Spectrofotometria utilizeaza un monocromator capabil sa selecteze fasciculul de raze monocromatice si include domeniile de ultraviolete si infrarosii Metoda curbei de etalonare In cazul in care se foloseste o metoda de analiza pentru prima data, se recomanda sa se execute o curba etalon, folosindu-se solutie de concentratie cunoscuta, (etalon) ale substantei respective. Stabilirea curbei etalon e necesara pentru a determina concentratia unor substante in medii biologice, se ia in lucru cantitati de substanta etalon care sa se incadreze sub sau deasupra valorii normale a substantei respective in mediul biologic studiat. Metoda solutiei standard. In acest caz se foloseste o singura solutie etalon, standard, care e de concentratie cunoscuta, care se prelucreaza la fel ca proba biologica iar la sfarsitul procedurii se citesc la spectofotometru absorbantele probei si standardele fata de martor, apoi se calculeaza concentratia substantei din proba biologica.

LP3 - DOZAREA GLUCOZEI Dozarea de glocoza s-a bazat multa vreme pe proprietattile reducatoare ale acestei aldohexoze. In sange in afara de glucoza exista si alte substente cu proprietati reducatoare cum ar fi: glutationul si acidul ascorbic. Din acest motiv, valorile glicemiei obtinute cu ajutorul metodelor bazate pe proprietatile reducatoare sunt cu aproximativ 10-20 mg/dl mai mari decat rezultatele obtinute prin metoda enzimatica. Principiul metodei Glucoza in prezenta glucozoxidazei formeaza acid gluconic si apa oxigenata. Apa oxigenata va forma in prezenta fenolului o substanta cromogena 4/amino/antipirina, un compus colorat in rosu numit CHINONIMINA. Se citeste la spectofotometru la 510 nm absorbanta probei fata de martorul reactivilor. LP4 - LIPIDE DOZAREA LIPIDELOR TOTALE SERICE (METODA KUNKEL) Lipide plasmatice Lipidele vehiculate de plasma sanguina sufera oscilatii ample cantitativ in raport cu diversi factori nutritionale, metabolici sau hormonali, prin modificarea influxului sau efluxului lor plasmatic. Nivelele plasmatice ridicate de colesterol si trigliceride sunt considerate factori de risc in ateroscleroza. Lipidele plasmatice cantitativ mai importante sunt: trigliceridele, fosfolipidele si colesterolul. Lipidele greu solubile in apa, in mediu apos plasmatic sunt associate intre ele si impreuna cu proteinele formeaza complexe lipoproteice Lipidele serice se analizeaza d.p.d.v. cantitativ prin 2 proceduri: 1. Dozarea lipidelor totale si a unora dintre fractiunile distincte chimic: triglyceride, fosfolipide, colesterol, acizi grasi liberi. 2. Electroforetica prin care se separa fractiunile lipoproteice in functie de incarcatura electrica. Prin aceasta metoda se stabilesc si proportiile in care se afla diferitele fractiuni. Lipidele plasmatice sufera variatii diverse foarte pronuntate si din acest motiv e foarte important momentul recoltarii sangelui pentru analiza. DOZAREA Lipidelor Serice prin metoda KUNKEL Determinarea concentratiei lipidelor totale in ser e utilizata ca test de triere sau screening (pentru a depista dislipidemiile).

Valori mai mari de 800-1000 mg/dl ser, indica o stare patologica. In aceste cazuri se impune o analiza a diverselor fractiuni lipidice pentru a se stabili patogenia acestor dereglari. Metoda se bazeaza pe precipitarea lipoproteinelor cu densitate joasa (LDL) si foarte joase (VLDL) in prezenta fenolului. Turbiditatea obtinuta e proportionala cu concentratia lipoproteinelor din proba. Dozarea BETA LIPOPROTEINELOR SERICE prin metoda BURNSTEIN Principiul metodei BETA lipoproteinele din ser sunt precipitate selective de heparina, in solutie de clorura de calciu (CaCl2), de tarie ionica joasa (concentratie mica). Se poate masura turbiditatea solutiei, care se exprima in unitati Burnstein sau, se poate doza colesterolul total din precipitatul obtinut, si de asemena, cunoscandu-se ca 35% din Beta-lipoproteine este reprezentat de cholesterol, se poate calcula concentratia Beta-lipoproteinelor. LP5 PROTEINE 1. Proteine plasmatice Plasma sanguina cuprinde 6-8 grame proteine in 100 ml ser. Proteinele plasmatice un amestec heterogen de componente proteice cu greutate moleculara variind inre 70.000 1.500.000 daltoni. Proteinele plasmatice se reinnoiesc in permanenta, prezentand o seri de particularitati in ceea ce priveste metabolismul lor. Utilizandu-se diferite metode, proteinele plasmatice au fost separate in fractiuni mai mult sau mai putin omogene, dupa gradul de rezolutie al metodei utilizate. Salifierea cea mai veche metoda de separare a proteinelor care consta in precipitarea proteinelor din solutii (metode biologice), prin adaugarea de cantitati mari de saruri neuter, ca: sulfat de amoniu, sulfat de Mg, clorura de sodium, sulfat de sodiu. 2. Proteine salivare Cea mai mare parte a compusilor organici din saliva e constituita din proteine, continutul total de azot proteic fiind cuprins intre 62 si 104 mg%. Metode electroforetice si imunochimice au evidentiat prezenta in saliva a unor proteine de origine serica (alfa, beta, gama globuline). Dintre glicoproteinele salivare, categoria cea mai importanta este constituita din MUCINE care reprezinta un procent de 200 mg %. Proteinele din aceasta categorie precipita sub actiunea acizilor slabi si la rece. Mucinele au proprietati de a conferi vascozitate salivei, unele dintre proteinele salivare sunt reprezentate de enzyme, dintre care cea mai importanta este Alfaamilaza salivara.

3. Metodele de analiza calitativa si cantitativa Aceste metode pentru determinarea proteinelor serice si salivare se impart in 3 categorii: - de identificare a proteinelor - pentru determinarea cantitatii proteinelor totale serice si salivare - de determinare cantitativa a unor proteine specifice prin metode electroforetice si metode imunochimice. Dintre metodele calit. si cantit. de determinare a proteinelor totale serice si salivare, metoda biuretului este cea mai utilizata. Metoda face parte din categoria de metode recomandate de Federatia Intern de Chimie Clinica (IFCC). LP6 ALFA amilaza serica Determinarea actiunii enzimatice a Alfaamilazei serice (Metoda Smith Rol) Principiul metodei Activitatea Alfaamilazei serice se obtine spectofotometric prin dezvoltarea coloratiei dintre iod si amidonul solubil (ramas nehidrolizat) O unitate amilaza corespunde actiunii enzimatice care degradeaza 10 mg amidon in vitro, in 30 minute. Amilazele sunt glicizidaze care catalizeaza degradarea hidrolitica a amidonului si a glicogenului. Actioneaza asupra legaturii Alfa 1-4 glicozidice si rezulta oligiglucide reducatoare. Amilaza care actioneaza in tubul digestive al omului este o Alfaamilaza cu specificitate pentru legaturi Alfa 1-4 glicozidice din interiorul lanturilor amilozice pe care le scindeaza in fragmente din ce in ce mai mici. Actiunea catalidica a enzimelor e dependenta de urmatorii factori: - concentratia ionilor de H2 - variatia temperaturii - prezenta sau absenta unor ioni Activitatea optima a Alfaamilazei e la PH = 7,1, temp de 38 grade C si prezenta ionilor de Cl. LP8 Transaminazele serice Alaninaminotransferaza (ALAT) sau GlutamatPiruvatTransaminaza (GPT) si ASpartatAminoTransferaza (ASAT) sau GlutamatOxaloacetatTransaminaza (GOT) sunt cele mai importante enzyme din clasa transaminazelor. Aceste enzyme catalizeaza r. (relatia) de transfer a gruparii . Cele 2 enzime le gasim in celula hepatica, ALAT, cu preponderenta, iar ASAT cu preponderenta in muschii scheletici si muschiul cardiac. ALAT are valori considerabil crescute in afectiunile hepatobiliare ASAT are valori considerabil crescute in afectiuni ale muschiului inimii (infarct) si la nivelul muschilor scheletici.

Determinarile in parallel cele ALAT + ASAT se realizeaza ptr a distinge separate afectiunile hepatice de cele ale inimii si ale muschilor scheletici. Raportul activitatii enzimatice ASAT/ALAt numit raportul DERITIS e folosit in diagnostica diferentiala, fie la : - rap. > 1 afectiuni ale inimii + muschii scheletici - rap. < 1 afectiuni ale ficatului. Principiul metodei. Determinarea activitatii enzimatice a ALAT se bazeaza pe reducerea piruvatului obtinut in urma transaminarii care e redus sub actiunea lactat dehidrogenaza la acid lactic. LP7 Fosfataza alcalina Fosfatazele sunt monoesteraze specifice care catalizeaza hidroliza esterilor fosforici eliberand acidul fosforic si fenolul sau alcoolul respective. Termenul de fosfataza alcalina sau acida se refera la PH-ul la care enzimele prezinta maxim de actiune. Fosfataza alcalina are PH optim de actiune de 10,4 iar cea acida de 4,9. Termenul de fosfataza alcalina este un grup care cuprinde fosfataza alcalina osoasa si hepatica. Actiunea enzimatica a fosfatazei alkaline osoase creste in ser si salivaori de cate ori are loc r. osteoblastica (adica formarea si repararea tesutului osos. La varsta copilariei fosfataza alcalina are valori duble, triple comparative cu valoarea adultilor. Principiul metodei Fosfataza alcalina serica/salivara catalizeaza hidroliza parametrofenolfosfat cu obtinere de paranitrofenol + acid fosforic. In mediu alcalin, paranitrofenolul are culoarea galbena si are max. de absorbtie la Lamda=405nm. Activitatea enzimei e direct prop/ cu intensitatea culorii paranitrofenolului. Testul kinetic masurarea cineticii de aparitie a paranitrofenolului, urmarim cresterea absorbantei la 405 nm intr-un interval de timp. LP9 Determinarea activitatii enzimatice a ALFA amilazei salivare in functie de dilutia salivei. ALFA amilaza salivara catalizeaza r. de hidroliza a legaturii Alfa 1,4 glicozidice dintre resturile de Alfa glucoza aflate in amilaza si amilopectina, care sunt cele 2 componente ale amidonului. Produsii fenoli de degradare sunt: - maltoza, molecule de glucoza din amilopectina PH-ul optim de actiune al ALFA amilazei salivare e 6,8 iar enzima e activate de clor si cation de Ca.

Principiul metodei Se incubeaza la 37 grade Celsius, enzima de saliva cu substratul de amidon timp de 30 min. Sub actiunea enzimei amidonul va fi hidrolizat pana la compusi care nu vor da coloratie ca iodul (I2 punct chromatic). Se lucreaza cu probe de saliva diluata. Rezultatul determinarii se exprima in unitati diastazice. O unitate diastazica este cantitatea de enzyme care hidrolizeaza 2 ml solutie amidon 0,1% la 37 grade Celsius sit imp de 30 min. LP10 Dozarea acidului uric in ser/saliva Acidul uric e termenul final al catabolismului urinelor (numai la om si la maimutele antropoide), e acid cu tarie apreciabila si la PH-ul fiziologic al sangelui se gaseste sub forma de urat (monourat de Na). Acidul uric este un captator de specii reactive ale oxigenului, fiind aproape ca si Vit. C. In ceea ce priveste saliva acidul uric e antioxidant major, albumina si Vit. C avand o contributie minora. Crestera fondului de acid uric duce la depunerea compusului in articulatiile extermitatilor (artrita gutoasa), rinichi si alte tesuturi. Hiperuremia poate fi rezultatul unor tulburari genetice ale metabolismului nucleotidelor purinice (guta primara metabolica) sau efectul secundar al unor maladii (guta secundara). Principiul metodei Acidul uric in prezenta uricazei formeaza alantonina de CO2 si apa oxigenata. Sub actiunea catalitica a peroxidazei, apa oxigenata reactioneaza cu 4 aminofenaze si acid 2-4 diclorofenol sulfonat cu obtinerea unui compus de culoare rosie care se numeste Quinokimina. Intensitatea culorii e direct proportionala cu concentratia acidului uric in ser sau saliva. LP11 Dozarea vitaminei C in ser/saliva Vitaminele sunt indispensabile vietii deoarece nu sunt biosintetizate in organismul uman au rol essential in mentinerea stabilitatii normale. Nu au aport caloric, sunt cofactori in diverse sisteme enzimatice si sunt eficiente in cantitati mici Importanta vitaminelor a fost in mod deosebit evidentiata in urma carentei lor. Vitaminele sunt furnizate de ratia alimentara sau sub forma de precursori numiti provitamine care in organism sunt transformati in vitamine. Vitaminele distincte d.p.d.v. chimic dar care indeplinesc aceleasi functii si a caror carenta are aceleasi simptome. Datorita diversitatii s-au clasificat in: - vitamine hidrosolubile: B1, B2, B6, B12, C, PP, , biotina, acizi folici - vitamine liposolubile: K, A, D, E, F.

Vitamina C se numeste si acid ascorbic, se gaseste sub 2 forme redusa si oxidata. Are caracter reducator si e indispensabila metab. Glucidelor colagenului, glucocorticoizilor si fe. Se gaseste in legume fructe in special in citrice. Principiul metodei Vit. C este oxidata cu iod 2 la acid dehidroascorbic in mediu acid. Ca indicator ptr determinarea sf. Reactiei se foloseste amidon care se coloreaza in albastru in momentul in care toata Vit C a fost oxidata. Iodul necesar reactiei de oxidare a Vit C , rezulta in urma reactiei dintre iodatul de potasiu si Iodura de potasiu, in mediu acid. Cu ajutorul probei martor se dozeaza intraga cantitate de Iod rezultyat in urma reactiei dintre iodatul de potasiu si iodura de potasiu. In acest mod prin diferentiere se poate determina volumul de iod 2 necesar oxidarii vitaminei C de proba de analizat.